專利名稱：利用抗cd20抗體治療移植物抗宿主疾病的制作方法
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及利用抗不存在于正常人T淋巴細(xì)胞上的外源表面抗原的抗體，制備治療移植物抗宿主疾病的組合物，用以治療接受了被該外源表面抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的患者。
盡管利用目前的標(biāo)準(zhǔn)免疫篩選技術(shù)已能夠很容易地生產(chǎn)出大量的純化的供體T淋巴細(xì)胞，并通過其服用達(dá)到體內(nèi)誘導(dǎo)GVL的效果，但目前仍缺乏適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，從藥學(xué)上誘導(dǎo)服用的T淋巴細(xì)胞的選擇性死亡，從而達(dá)到一旦臨床上不需要時(shí)能夠消除GVHD作用。
過去已生產(chǎn)出許多抗人表面分子的多克隆和單克隆抗體。在許多情況下，生產(chǎn)抗體的直接目的在于在體內(nèi)殺死對那些用于免疫治療方案的分子呈陽性的細(xì)胞。例如，在B淋巴瘤領(lǐng)域已生產(chǎn)和鑒定出抗CD20、CD19、CD40、CD22、CD52、CD38分子及其它分子的有效抗體(P.S.Multani等，J.Clin.Oncol.，16，3691-3710，1998)。在某些情況下，抗這類分子的抗體顯示出體內(nèi)細(xì)胞毒性作用，可能是因?yàn)樗麄兿驝D20、CD38和C廝2一樣，能夠激活靶細(xì)胞表面的補(bǔ)體系統(tǒng)。在其它一些情況下，是將抗體與放射活性分子結(jié)合以誘導(dǎo)靶輻解，就如同CD20、Lym-1等一樣。其它一些抗體則是與細(xì)菌或植物來源的毒素結(jié)合，用于同樣目的，就如同CD19、CD40和CD22一樣。還有一些抗體則被嵌合以獲得雙特異性，從而使兩種細(xì)胞充分接近。最后，還存在許多這些抗體的人工改造的和/或人源化的形式，它們的體內(nèi)給藥既降低了抗原性危險(xiǎn)，又增強(qiáng)了其效力。
發(fā)明詳述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過利用本發(fā)明的方法可有效地控制移植物抗宿主疾病問題，該方法包括將外源表面抗原引入供體的T淋巴細(xì)胞，然后給受體患者服用抗該外源抗原的抗體。
外源抗原意指不存在于正常T淋巴細(xì)胞上的任何表面抗原，如CD20、CD19、CD40、CD22、CD52等表達(dá)在B淋巴細(xì)胞表面的抗原。顯然，在與相應(yīng)抗體反應(yīng)后將對該抗體進(jìn)行篩選，以便不在有組織地表達(dá)抗原的細(xì)胞群體水平上產(chǎn)生負(fù)面或不良效果。
尤其優(yōu)選的是人B淋巴細(xì)胞的CD20表面抗原，抗該抗原的人源化單克隆抗體可從市場上買到(Rituximab，Roche)，它用于治療非霍奇金B(yǎng)淋巴瘤(B non Hodgkin lymphomas)。
根據(jù)本發(fā)明，首先通過適當(dāng)技術(shù)用選擇的抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)供體T淋巴細(xì)胞，通過免疫親和方法使其富集后將其注射到受體。如果有移植物抗宿主疾病形成，則給患者服用抗該抗原的抗體，以便通過例如補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性機(jī)制體內(nèi)滅活T淋巴細(xì)胞。
所用抗體優(yōu)選為單克隆抗體，更優(yōu)選人源化的單克隆抗體。其劑量和給藥途徑取決于多種因素，包括患者的整體健康狀態(tài)、體重、性別和年齡。一般地，該抗體通過靜脈內(nèi)途經(jīng)給藥，其劑量范圍約為50-500mg/m2體表，每日1-3次，直至循環(huán)T淋巴細(xì)胞幾乎完全消失。
Rambaldi等人(Blood，91，2189-2196，1998)已描述過T淋巴細(xì)胞的分離。
用所需抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的方法是熟知的。可參見Verma.I.M和Somia的綜述(Nature，389，239-242，1997)。具體地，可使用適宜的載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、慢病毒(Lentiviruses)等。
這些載體中的每一種均包括許多不同的生物類型。對于逆轉(zhuǎn)錄病毒，其例子有兼嗜性載體、親嗜性載體和異嗜性載體。而且，多年來還使用了許多不同的包裝細(xì)胞系，以便優(yōu)化這類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)，并確保易于操作和生產(chǎn)者的安全(I.M.Verma等，Nature，389，239-242，1997；M.A.Kay等，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。
最近，通過與多聚陽離子或脂質(zhì)體復(fù)合物結(jié)合、電穿孔、在鹽緩沖液中沉淀及其它技術(shù)，也已將裸DNA引入靶細(xì)胞中。
許多不同細(xì)胞類型已被定向遺傳轉(zhuǎn)移T和B淋巴細(xì)胞、未成熟造血前體、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和其它細(xì)胞類型(I.M.Verma等人，Nature，389，239-242，1997；M.A.kay等人，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。
對于CD20抗原，已使用了一種兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒來源于莫洛尼鼠類白血病毒并被包裝在胚腎人細(xì)胞(293T)中，而該胚腎人細(xì)胞已經(jīng)過人工改造，含有分散在不同質(zhì)粒中的逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)單元(Human Gene Therapy，7，1405-1413，1996)。這類載體以及用外源抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞(尤其是CD20+T淋巴細(xì)胞)是本發(fā)明的目標(biāo)之一。
經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)移之后，顯著表達(dá)外源基因的細(xì)胞僅占到總細(xì)胞群中的少部分。利用能夠給細(xì)胞帶來選擇性優(yōu)勢的外源基因，可對轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞實(shí)施篩選。也可采用其它方法如用抗外源抗原的抗體進(jìn)行FACS分類，篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(K.Phillips等人，Nature Medicine，2，10，1154-1155，1996)。其它方法還包括用于篩選方法中的免疫親和層析柱或預(yù)吸附的培養(yǎng)板等。
圖2用CD20感染CEM細(xì)胞系及免疫篩選。
其中上圖A利用熒光對照IgG1抗體，通過細(xì)胞熒光測定儀分析病毒感染后的CEM細(xì)胞系。
中圖B利用熒光抗CD20抗體分析同樣的細(xì)胞群。
下圖C利用熒光抗CD20抗體分析經(jīng)親和柱免疫篩選后的同樣細(xì)胞群。
圖3用CD20病毒感染人新鮮T淋巴細(xì)胞上圖A感染后淋巴細(xì)胞用PEIgG2a和FITC IgG1對照抗體標(biāo)記。
下圖B同樣細(xì)胞群用抗CD20 PE和抗CD3 FITC抗體標(biāo)記。在所示情況下，23％的細(xì)胞為雙陽性。
下面的實(shí)施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
為了放大，在含2.5mM dNTP、500ng“有義”引物(CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC)、500ng“反義”引物(CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT)和5u pfu DNA聚合酶(購自Stratagene，La Jolla，CA，USA)的0.8μl溶液存在的情況下，將40ng質(zhì)粒加至由10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/ml BSA組成的溶液中，至反應(yīng)終體積100μl。按下述方案將反應(yīng)在循環(huán)器中進(jìn)行26次循環(huán)95℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃2分鐘。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，加入25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇溶液100μl。萃取后，在乙醇存在下于20℃過夜沉淀DNA。離心后，將DNA重懸于100μl水中，然后按附帶在“pMOS平末端克隆盒“中的生產(chǎn)商指示將其亞克隆至PMOS載體(AmershamItalia，srl，Italy)。將所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒放大并測序，然后用BamHI消化。該酶的識別位點(diǎn)(G/GATCC)存在于兩種PCR引物的末端。因此，該片段被亞克隆在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PINCO VUOTO的BamH1位點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PINCO VUOTO已通過下列方法預(yù)先獲得用RcoRI和NotI從質(zhì)粒PINCO(F.Grignani等，Cancer Res.，58，14-19，1998)中切除1441bp的片段，該片段含有CMV啟動(dòng)子(巨細(xì)胞病毒)和EGFP(增強(qiáng)的綠色熒光蛋白)，切除EcoRI-Not I片段后用klenow片段鈍化末端并將質(zhì)粒環(huán)化，所得質(zhì)粒稱作PINCO VUOTO。該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的長度為11448bp。
PINCO VUOTO與CD20 cDNA間的重組體稱為LTR-CD20-LTR，對其測序以檢測CD20 cDNA的克隆及完整性以及第一個(gè)ATG上游終止密碼子的缺失(


圖1)。
因此，對于逆轉(zhuǎn)錄病毒部分，構(gòu)建體LTR-CD20-LTR由得自莫洛尼鼠類白血病毒(MOMLV)的LTR、得自莫洛尼病毒的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒序列、BamHI位點(diǎn)的CD20 cDNA以及附
圖1中詳細(xì)給出的第二個(gè)LTR組成。該質(zhì)粒的其余部分相同個(gè)PINCO質(zhì)粒(F.Grignani等，Cancer Res.，58，14-19，1998)。如附圖所示，該質(zhì)粒含有EB病毒的EBNA-1和Orip元件，復(fù)制起點(diǎn)(pUC)、氨芐青霉素抗性基因以及處于PGK-1啟動(dòng)子控制下的嘌呤霉素抗性基因。
Phoenix-Ampho細(xì)胞得自人胚腎293細(xì)胞系，但經(jīng)過了如下改造首先用腺病毒的EIA基因?qū)ζ溥M(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后再用兩個(gè)單獨(dú)的質(zhì)粒對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該兩種質(zhì)粒編碼位于羅氏肉瘤病毒啟動(dòng)子控制之下的莫洛尼MLV的結(jié)構(gòu)基因gag和pol，以及位于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制下的莫洛尼MLV的env基因。
于實(shí)驗(yàn)前一天，將1.5×106細(xì)胞在直徑10cm的平皿中倒平板，其中含10ml DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Seromed，Berlin，Germany)，并添加了10％FCS(Hiclone Laboratories，Steril System，Logan，UK)，然后放置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，加入16μl氯奎(原液25mM于PBS)，1分鐘后加入10μg質(zhì)粒DNA溶液1ml。為獲得該DNA溶液，將500μl 2xHB5溶液(50mM HEPES，pH7.05，10mMkCl，12mMDextrose，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(FW141.96))加至一15ml圓形試管中，在第二個(gè)15ml圓形試管中制備含10μgDNA、61μlCaCl 2M和無菌水的溶液500μl。然后將該DNA混合物滴加至第一試管中，并將所得沉淀物加至細(xì)胞中。
8小時(shí)后用10ml新鮮DMEM置換培養(yǎng)基。
第二天，用添加了10％FCS的5ml新鮮RPMI1640培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基。
第三天，通過移出5ml含有在培養(yǎng)過程中釋放的逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基而感染。
然后將平板在室溫下以1800rpm離心45分鐘，除去上清液，用1ml添加了10％FCS的新鮮RPMI1640替換，接著再培養(yǎng)6小時(shí)。
培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，利用前面制備的包裝細(xì)胞的不同平皿，第二次重復(fù)感染步驟。
將0.1×106細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管中，以4000rpm離心3分鐘后重懸于50μl熒光抗CD20 1F5抗體(Becton Dickinson)溶液中，并于4℃維持30分鐘。然后加入含0.9％NaCl、5％FCS、0.02％疊氮化鈉的溶液500μl。以4000rpm離心細(xì)胞5分鐘后，將樣品重懸于含1％甲醛的100μl PBS溶液中，于4℃放置，直到在熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上讀數(shù)。
在多次實(shí)驗(yàn)中，該感染方法總是產(chǎn)生從30％到60％不同范圍的CEMCD20+細(xì)胞，而非感染的細(xì)胞系則對CD20表達(dá)呈完全陰性(如見附圖2，其中間圖中顯示CEM群體變?yōu)?0％CD20+)。
最后將細(xì)胞重懸于KPMI1640培養(yǎng)基中，并通過在SuperMACS系統(tǒng)(Milteny Biotech)中的XS+柱進(jìn)行篩選。然后用添加了2.5％白蛋白生理溶液洗柱，從Super MACs中取出柱并洗滌，以回收陽性級分。
按照前面所述的免疫熒光方法進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后，在細(xì)胞熒光測定儀上對陽性級分作進(jìn)一步分析。
該方法結(jié)束時(shí)CD20+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)始終在90％以上。如圖2中下圖所示，在通過免疫親和富集后CD20+陽性的CEM群體為98％。
最后將CEM CD20+細(xì)胞群懸浮并平展于添加10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期研究該細(xì)胞群中CD20標(biāo)記物在表面的表達(dá)。結(jié)果顯示，標(biāo)記物的穩(wěn)定性大于2個(gè)月，且90％以上的選擇細(xì)胞陽性。
第二天，加入人重組IL-2(Proleukin，ChironItalia，Milan，Italy)至終濃度100μ/ml。
第三天，經(jīng)洗滌和細(xì)胞計(jì)數(shù)后，于24孔平板中一個(gè)平底孔中的1ml培養(yǎng)基中感染1×106細(xì)胞。以1200rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘后，去上清，并在Polybrene存在下用1ml過濾病毒置換，然后按前述方法于室溫下以1800rpm離心45分鐘。
最后，去除病毒上清液，用完全培養(yǎng)基替換，并保溫6小時(shí)。重復(fù)離心感染步驟后，在I1-2存在下將細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基中，并于培養(yǎng)箱中過夜移置。
在隨后2天重復(fù)整個(gè)過程，最后在培養(yǎng)箱中將細(xì)胞于培養(yǎng)基中再保持兩天。
然后按前面所述同樣方法，用抗CD20 FITC、抗CD3PE、抗CD4 PE和抗CD8 FITC單克隆抗體(Becton Dickinson)標(biāo)記細(xì)胞，并在細(xì)胞熒光測定儀上進(jìn)行分析。
在正常供體上進(jìn)行的多次實(shí)驗(yàn)顯示，約5％-25％的CD3+T淋巴細(xì)胞在雙熒光分析中獲得了CD20標(biāo)記。該實(shí)驗(yàn)之一如圖3所示，在該具體實(shí)例中獲得了23％的CD3/CD20雙陽性。
或者，加入人AB血清至終濃度30％以作為補(bǔ)體來源。在連續(xù)攪拌下，將細(xì)胞于37℃恒溫水溶中放置1小時(shí)。向細(xì)胞懸液中加入等體積的1x吖啶橙的PBS溶液(原液100x溶液含30mg于100ml蒸餾水中)，然后通過細(xì)胞熒光測定儀評估細(xì)胞懸液活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，算出其占所分析的總細(xì)胞群的百分?jǐn)?shù)。利用這一快速方法，通過比較雙陽性CD3/CD20細(xì)胞在各個(gè)研究細(xì)胞群中的百分比與加入Rituximab后死亡細(xì)胞的百分比，可評估Rituximab對CD20+細(xì)胞的致死效力。如下表所示，對照細(xì)胞群為單獨(dú)暴露于抗體或單獨(dú)暴露于補(bǔ)體的同樣細(xì)胞。表中數(shù)據(jù)表明，暴露于Rituximab 1小時(shí)誘導(dǎo)約90％CD3/CD20+細(xì)胞死亡。
表CD20轉(zhuǎn)導(dǎo)的新鮮人T淋巴細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性具體裂解％％CD3/CD20+ Rituximab補(bǔ)體 Rituximab淋巴細(xì)胞 單獨(dú)單獨(dú) +補(bǔ)體供體1 300 14 33供體2 230 11 35供體3 150 5 18經(jīng)吖啶染色后在FACS中測定裂解百分比。
權(quán)利要求
1.利用抗正常人T淋巴細(xì)胞中不存在的外源表面抗原的抗體制備組合物，用于對已接受了被該外源表面抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的患者進(jìn)行移植物抗宿主疾病的治療。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中使用抗CD20表面抗原的抗體和被CD20抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中抗CD20抗體為人源化的單克隆抗體。
4.一種載體，用于用外源表面抗原轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其中包括編碼人CD20抗原的基因。
6.用外源表面抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)的人T淋巴細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的T淋巴細(xì)胞，它被人CD20抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明描述了用抗不存在于正常人T淋巴細(xì)胞上的外源表面抗原的抗體制備組合物,用于對已接受了被該外源表面抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的患者進(jìn)行移植物抗宿主疾病的治療。
文檔編號C12N15/85GK1355712SQ00808833
公開日2002年6月26日 申請日期2000年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月11日
發(fā)明者J·高雷, M·因特拿, A·倫巴迪, A·比翁迪 申請人:國家研究委員會