專利名稱：用于預防與治療慢性移植物抗宿主病的干細胞制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于干細胞與免疫學領域，涉及一種新的干細胞制劑，尤其是涉及用于預防與治療慢性移植物抗宿主病的干細胞制劑。
背景技術：
骨髓移植是目前治療許多惡性血液疾病和自身免疫性疾病的其中一種有效的方法，由于異基因骨髓移植日益普遍，使異基因骨髓移植后移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的發(fā)生率和致死率不斷升高，GVHD的發(fā)生主要是由于供、受者之間除主要組織相容性抗原一致外，還存在免疫遺傳學的差異，供者淋巴細胞(主要是T淋巴細胞)對受者產(chǎn)生的免疫攻擊反應所造成的，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，并成為導致移植后非復發(fā)相關死亡的主要原因。為了降低GVHD，通常采用去除T細胞的造血細胞移植，但不利于免疫重建，更容易發(fā)生移植后感染。由于上述問題相互交織，至今也難于找到各方面均可兼顧的綜合處理方案，因此嚴重影響了同種造血干細胞移植的治療效果。
慢性移植物抗宿主病(cGVHD)是異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)晚期最常見的并發(fā)癥之一和主要死亡原因，約30～50％存活半年以上受者可出現(xiàn)cGVHD，相關死亡率高(約50％)。近年來研究認為，cGVHD是與異體免疫反應和自身免疫反應現(xiàn)象相關的重度免疫性疾病。經(jīng)典的免疫抑制劑、單抗、反應停等療法未有令人滿意的療效，且相關毒副作用大。因此，尋找一種安全、有效的療法成為研究焦點之一。
骨髓間質(zhì)干細胞(mesenehymal stem cells，MSCs)是骨髓中具有強大的體外增殖和分化能力的干細胞。近年更發(fā)現(xiàn)MSCs具有獨特的免疫學特征。Klyushnenkova等發(fā)現(xiàn)人MSCs在體外同樣可抑制同種異體混合淋巴細胞反應。而Bartholomew等率先報道了靈長類動物的MSCs可抑制同種異體混合淋巴細胞反應，體內(nèi)注射供者來源的體外擴增MSCs可延長同種異體移植皮膚的壽命，顯示MSCs具有獨特的免疫學特性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)骨髓間質(zhì)干細胞(MSCs)的免疫學特性與慢性移植物抗宿主病(cGVHD)發(fā)生機制，設計并提供一種用于預防與治療慢性移植物抗宿主病的干細胞制劑，將該干細胞制劑應用于骨髓移植后的病人，可避免或者降低慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的發(fā)生率，并且明顯降低cGVHD嚴重程度，從而為綜合解決造血干細胞移植后的問題提供了新的解決方案。
本發(fā)明所述的一種用于預防與治療慢性移植物抗宿主病的干細胞制劑，為間質(zhì)干細胞與造血干細胞的聯(lián)合移植的干細胞制劑； 所述的間質(zhì)干細胞的制備方法是取同種異體健康骨髓，收獲單個核細胞進行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細胞的貼壁特性，反復換液、棄懸浮細胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細胞；通過形態(tài)學觀察、流式細胞術分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細胞為間質(zhì)干細胞，并不斷傳代擴增，移植前細胞活度檢測＞95％；所述的造血干細胞的準備同常規(guī)骨髓移植方案；所述的干細胞制劑經(jīng)靜脈輸入人體受體，間質(zhì)干細胞的輸入劑量為0.5-1.5×106細胞/Kg體重，造血干細胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。
發(fā)明人是在參考造血干細胞移植劑量(CD34+細胞＞3×106/kg體重，單個核細胞＞3×108/kg體重)的基礎上，確定上述間質(zhì)干細胞的輸入劑量，經(jīng)實驗證明，輸入上述劑量的間質(zhì)干細胞后，受體無不良反應，而且療效確切。
應用本發(fā)明所述的干細胞制劑，即間質(zhì)干細胞與造血干細胞的聯(lián)合移植的干細胞制劑，可預防骨髓移植(BMT)后慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的出現(xiàn)，不僅明顯降低GVHD的發(fā)生率，而且一旦出現(xiàn)GVHD時可明顯降低其嚴重程度，去除病人痛苦，減少免疫抑制藥物使用，減少合并感染，減輕患者醫(yī)療費用。
具體實施例方式 (一)骨髓間質(zhì)干細胞(MSCs)供體的來源 一般選取20歲或20歲以下的健康移植供體或患者親屬，也可用胎兒骨髓源性MSCs。采集骨髓前供體需作必要體檢及檢測HIV、肝炎病毒及CMV等。
(二)骨髓間質(zhì)干細胞(MSCs)的培養(yǎng)擴增 供體局部麻醉后，從髂前或髂后采集骨髓20-50ml，在GMP標準的細胞培養(yǎng)室處理，分離、培養(yǎng)MSCs，經(jīng)3周左右傳3-5代獲得相應MSCs細胞量，約2-10×106/kg，并將部分標本送質(zhì)控及病原學檢測合格后應用于臨床。
MSCs的具體分離培養(yǎng)方法取同種異體健康骨髓，收獲單個核細胞進行培養(yǎng)，借助MSCs的貼壁特性，反復換液、棄懸浮細胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細胞。通過形態(tài)學觀察、流式細胞術分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細胞為間質(zhì)干細胞，并不斷傳代擴增，通常經(jīng)3周左右傳3-5代獲得相應MSCs細胞量。
(三)造血干細胞的準備 造血干細胞的準備同常規(guī)骨髓移植方案。
(四)本發(fā)明所述的干細胞制劑的臨床研究 對于移植后的病人(受體)，在常規(guī)骨髓移植的基礎上加入MSCs，同時經(jīng)靜脈輸入受體。移植前處理造血干細胞的準備同常規(guī)骨髓移植方案；MSCs細胞活度檢測＞95％。將MSCs懸浮于生理鹽水30ml，與造血干細胞同時經(jīng)靜脈快速(約20分鐘)輸注入病人體內(nèi)。輸注完畢，觀察30分鐘，如無不良反應，可回家。盡可能輸注2-3次，間隔2-8周。
追蹤觀察病人輸注后1-2個月可起效，每4-8周隨診一次。
病人在輸注前后定期作必要的血液生化、免疫學及組織病理檢查，作為療效觀察指標。
治療反應包括(1)臨床表現(xiàn)；(2)實驗室檢查；(3)其他指標。
(五)臨床研究結(jié)果 1、臨床病例提供南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液科、廣東省人民醫(yī)院血液科 2、臨床病例觀察 應用本發(fā)明所述的干細胞制劑，即間質(zhì)干細胞與造血干細胞的聯(lián)合移植的干細胞制劑，對移植后的病人(受體)進行輸注處理后，大多數(shù)病例不會出現(xiàn)慢性移植物抗宿主病(cGVHD)，延緩了GVHD的出現(xiàn)，少數(shù)病例仍出現(xiàn)cGVHD。以下為發(fā)明人所觀察的六例病人的情況
上表中“+”表示有癥狀，“-”表示無癥狀。
效果評價 根據(jù)上述臨床病例的觀察，應用本發(fā)明所述的干細胞制劑，即間質(zhì)干細胞與造血干細胞的聯(lián)合移植的干細胞制劑，可預防骨髓移植(BMT)后慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的出現(xiàn)，不僅明顯降低GVHD的發(fā)生率，而且一旦出現(xiàn)GVHD時可明顯降低其嚴重程度，去除病人痛苦，減少免疫抑制藥物使用，減少合并感染，減輕患者醫(yī)療費用。
權利要求
1. 一種用于預防與治療慢性移植物抗宿主病的干細胞制劑，其特征在于為間質(zhì)干細胞與造血干細胞的聯(lián)合移植的干細胞制劑；
所述的間質(zhì)干細胞的制備方法是取同種異體健康骨髓，收獲單個核細胞進行培養(yǎng)，借助間質(zhì)干細胞的貼壁特性，反復換液、棄懸浮細胞，逐步獲得純的骨髓間質(zhì)干細胞；通過形態(tài)學觀察、流式細胞術分析、向成骨、成脂、神經(jīng)樣細胞分化的多向分化潛能鑒定，證實分離到的細胞為間質(zhì)干細胞，并不斷傳代擴增，移植前細胞活度檢測＞95％；
所述的造血干細胞的準備同常規(guī)骨髓移植方案；
所述的干細胞制劑經(jīng)靜脈輸入人體受體，間質(zhì)干細胞的輸入劑量為0.5～1.5×106細胞/Kg體重，造血干細胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。
全文摘要
本發(fā)明屬于干細胞與免疫學領域，涉及用于預防與治療慢性移植物抗宿主病的干細胞制劑。本發(fā)明所述的用于預防與治療慢性移植物抗宿主病的干細胞制劑，為間質(zhì)干細胞與造血干細胞的聯(lián)合移植的干細胞制劑；所述的干細胞制劑經(jīng)靜脈輸入人體受體，間質(zhì)干細胞的輸入劑量根據(jù)受體而調(diào)整，造血干細胞的輸入劑量同常規(guī)骨髓移植方案。將本發(fā)明所述的干細胞制劑應用于骨髓移植后的病人，可預防骨髓移植(BMT)后慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的出現(xiàn)，不僅明顯降低GVHD的發(fā)生率，而且一旦出現(xiàn)GVHD時可明顯降低其嚴重程度，從而為綜合解決造血干細胞移植后的問題提供了新的途徑。
文檔編號A61P37/06GK101269088SQ200710027278
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月23日 優(yōu)先權日2007年3月23日
發(fā)明者鵬 項, 張金麗 申請人:中山大學