在胃腸道移植物抗宿主病的治療中使用il-22的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于使用IL?22來治療如移植物抗宿主病的腸損傷炎性病癥的方法和組合物。具體而言，IL?22可以用來增強(qiáng)腸干細(xì)胞（ISC）恢復(fù)，并且用于增強(qiáng)同種異體造血移植后的免疫重建。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在治療組合物中使用治療性的IL?22，包括二聚體形式的IL?22，所述治療組合物用來治療在造血干細(xì)胞移植患者和在患有炎癥性腸道疾病患者中的移植物抗宿主病，包括肝，胸腺，胃腸或其它移植物抗宿主病。
【專利說明】在胃腸道移植物抗宿主病的治療中使用IL-22的方法
[0001]交叉引用相關(guān)申請
[0002 ] 本申請請求2013年11月7日提交的美國臨時(shí)申請N0.61 /901，151的優(yōu)先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容全部并入本文。
[0003]政府權(quán)利聲明
[0004]根據(jù)美國國立衛(wèi)生院授予的授權(quán)號K08KHL115355A和P01CA023766，本發(fā)明是在美國政府支持下進(jìn)行的。美國政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明提供了使用IL-22來治療例如移植物抗宿主病的腸道損傷病癥和炎性病癥的方法和組合物。具體而言，IL-22可以用來增強(qiáng)腸干細(xì)胞(ISC)的恢復(fù)，并且在同種異體造血移植后用于增強(qiáng)免疫重建。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在治療組合物中使用治療性IL-22，包括二聚體形式的IL-22來治療在造血干細(xì)胞移植患者中和在患有炎癥性腸道疾病的患者中的移植物抗宿主病，包括肝，胸腺，胃腸或其它移植物抗宿主病。
【背景技術(shù)】
[0006]在胃腸道移植物抗宿主病(G1-GVHD)中從免疫介導(dǎo)損傷調(diào)節(jié)宿主組織恢復(fù)的機(jī)制尚未完全明了。目前降低臨床GVHD的策略具有限制移植后免疫功能和治療的(有利)移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)反應(yīng)的不良影響。特別值得關(guān)注的是在患有移植物抗宿主病(GVHD)期間腸上皮組織的維護(hù)和再生，因?yàn)镚VHD導(dǎo)致腸道細(xì)胞病態(tài)，其干擾腸道功能。
[0007]GI GVHD是同種異體造血干/祖細(xì)胞移植后導(dǎo)致急性GVHD相關(guān)死亡的主要因素。
[0008]因此，仍然需要移植后的對策用來在同種異體造血干/祖細(xì)胞移植(allo-HCT)后選擇性地促進(jìn)腸上皮再生以降低GVHD而不限制治療性移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)的響應(yīng)。
[0009]發(fā)明簡述
[0010]本發(fā)明是基于以下觀察，在同種異體骨髓移植(BMT)后在體內(nèi)施用IL-22增強(qiáng)了腸干細(xì)胞(ISC)的恢復(fù)，減少了來自移植物抗宿主病(GVHD)的腸病態(tài)并且改善了移植后的整體存活率而不增強(qiáng)干細(xì)胞區(qū)位(niche)的功能或改變同種異體反應(yīng)(al 1reactive)免疫。IL-22從免疫介導(dǎo)病理方面通過加速ISC池的再生增強(qiáng)了 ISCs的恢復(fù)。IL-22直接增加了Lgr5+ISCs在體內(nèi)和體外的增殖。這導(dǎo)致了成熟上皮的加速恢復(fù)，而不通過干細(xì)胞區(qū)位增加生長因子的產(chǎn)生。
[0011]因此，本發(fā)明在一個(gè)方面涉及一種用于提高腸干細(xì)胞(ISC)生長/增殖的方法，該方法包括用外源或重組白介素-22(IL-22)或二聚體、融合蛋白或其綴合物，在一定條件下接觸ISC以促進(jìn)ISC在體內(nèi)或體外的生長。在一些實(shí)施方式中，ISC是Lgr5+細(xì)胞。
[0012]在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及到一種在受試者的胃腸道(GI)的上皮層受到損害后用于促進(jìn)胃腸上皮細(xì)胞的恢復(fù)/再生的方法，該方法包括用IL-22或二聚體，融合蛋白(例如Fe融合蛋白)或其綴合物接觸受試者的腸干細(xì)胞。對胃腸道的損害可能由于炎癥性腸疾病，(例如炎性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎，克羅恩病)輻射，腸自身免疫性疾病或移植(GVHD)。
[0013]在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療移植后的受試者中GVHD的方法，該方法包括將治療有效量的IL-22或二聚體，融合蛋白或其綴合物給藥至受試者。該方法并不需要免疫抑制以達(dá)到其治療效果。
[0014]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種方法，其中本領(lǐng)域的技術(shù)人員一旦觀察到與腸損傷相關(guān)的癥狀發(fā)作，就開始給藥IL-22。在一個(gè)實(shí)施方式中，移植后從I天開始至6個(gè)月將IL-22給藥到受試者;在一個(gè)實(shí)施方式中，移植后從I周開始至4個(gè)月將IL-22給藥到受試者。
[0015]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在腸上皮細(xì)胞的恢復(fù)/再生中使用的或在GVHD的治療或預(yù)防/抑制中使用的IL-22或二聚體，融合蛋白或其綴合物。
[0016]術(shù)語
[0017]為了便于理解本發(fā)明，許多術(shù)語和短語定義如下:
[0018]本文所用的術(shù)語“IL-22多肽”或“IL-22”或“IL22”或“IL-22蛋白質(zhì)”是指能夠產(chǎn)生本文所述的生物活性的生物活性多肽。本發(fā)明的IL-22包括但不限于人IL-22，重組人IL-22，小鼠IL-22和/或重組小鼠IL-22。特定多肽序列在美國專利申請N0.US2003/0100076，美國專利7，226，591和美國專利6，359，117中進(jìn)行了描述，并且其全文以引證的方式并入本文。IL-22還包括修飾IL-22，例如聚乙二醇化的IL-22和共價(jià)修飾IL-22蛋白質(zhì)。本文所用的IL-22多肽可以從多種來源，例如人類組織類型或從其它來源中分離出來，或通過重組或合成方法進(jìn)行制備。例如，抗體的制備、純化、獲得、形成的描述，給藥、組合物、疾病的治療等單獨(dú)涉及到本發(fā)明的每個(gè)多肽。此外，在本發(fā)明中使用的IL-22可以是重組方法的產(chǎn)物，其中將編碼DNA的IL-22給藥到受試者，例如，乳桿菌表達(dá)IL-22。術(shù)語“IL-22多肽”還包括IL-22多肽的變體。本發(fā)明的IL-22也可以以一種方式進(jìn)行修改以形成包括彼此融合的IL-22，異源多肽或氨基酸序列的嵌合分子。如本文所用的術(shù)語IL-22包括單體形式和二聚體形式的IL-22。然而，除非本文另有規(guī)定，在這些方法中使用rIL-22。IL-22也被稱為白介素-10相關(guān)的T細(xì)胞來源的誘導(dǎo)因子(IL-TIF)。
[0019]本文所用的術(shù)語“IL-22單體”是指一個(gè)IL-22蛋白質(zhì)單元。
[0020]本文所用的術(shù)語“IL-22二聚體”是指具有多于一個(gè)IL-22分子單元的蛋白質(zhì)，例如，IL-22 二聚體可以具有使用如短多肽，化學(xué)鍵和共價(jià)鍵的鏈接連接在一起的兩個(gè)IL-22分子。在一些實(shí)施方式中，IL-22 二聚體包含兩個(gè)重復(fù)的IL-22分子，在其它實(shí)施方式中，IL-22 二聚體由不同的IL-22蛋白質(zhì)組成?？梢园l(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中使用的IL-22 二聚體的進(jìn)一步的示例在美國專利申請20130171100中進(jìn)行了描述，在此其全文以引證的方式并入本文。一種合適的IL-22 二聚體是含有人白介素22(IL-22)并且在由Generon(上海)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)化的中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞中產(chǎn)生的重組IL-22二聚蛋白。例如在美國專利申請20130171100中對IL-22二聚體進(jìn)行了描述，包括序列信息，美國專利申請20130171100在此通過引用全部并入本文。本文所用的形成多肽的IL-22可以從多種來源例如人組織類型或從其它來源中分離出來，或通過重組和合成方法制備。在一些實(shí)施方式中，IL-22二聚體包括載體蛋白，其包括但不限于人lgG(1,2,3，4)的Fe片段或人白蛋白。IL-22可以位于載體蛋白的C末端或N末端。
[0021]在一些實(shí)施方式中，以本文所述的任何一個(gè)方法使用的IL-22二聚體包括兩個(gè)單體單元，其中每個(gè)單體單元包括IL-22結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，IL-22 二聚體的每個(gè)單體單元包括通過任選的連接序列連接到二聚化結(jié)構(gòu)域的IL-22結(jié)構(gòu)域，例如為約5至約50個(gè)氨基酸的連接序列。在一些實(shí)施方式中，二聚化結(jié)構(gòu)域包括至少兩個(gè)能夠形成分子間二硫鍵的半胱氨酸。在一些實(shí)施方式中，二聚化結(jié)構(gòu)域包括至少一部分Fe片段。在一些實(shí)施方式中，F(xiàn)c片段包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，IL-22二聚體包括兩個(gè)單體單元，如美國專利申請20130171100所述，其全文以引證的方式全部并入本文。在一些實(shí)施方式中，IL-22 二聚體在經(jīng)脈內(nèi)給藥。
[0022]本文所用的術(shù)語“移植物抗宿主”或“GVH”是指移植(供體)細(xì)胞抗宿主細(xì)胞和組織的免疫反應(yīng)。
[0023]本文所用的術(shù)語“移植物抗宿主病”或“GVHD”是指一種狀態(tài)，包括急性和慢性，是由于由GVH所產(chǎn)生的移植(移植物)細(xì)胞對宿主細(xì)胞和組織的影響所帶來的。換言之，在從干細(xì)胞發(fā)育的移植物或供體免疫細(xì)胞內(nèi)輸入的供體免疫細(xì)胞，可能看到患者的(宿主)細(xì)胞作為外來細(xì)胞并且由于免疫反應(yīng)對抗它們。作為示例，從他人獲得血液或骨髓移植的患者具有患急性GVHD的風(fēng)險(xiǎn)。甚至是與接受者HLA-匹配的供體可以引起GVHD，因?yàn)楣w細(xì)胞還可以潛在地對受體的次要抗原差異做出免疫反應(yīng)。急性移植物抗宿主病(GVHD)是一種特別由供體免疫細(xì)胞引起的在有同種異體骨髓或血液細(xì)胞移植患者中的病癥。常受影響的組織是腸表皮和肝臟。在嚴(yán)重的情況下，GVHD可以引起皮膚的起泡或過度腹瀉和消瘦。而且，由供體免疫細(xì)胞引起的在肝臟中的炎癥可以導(dǎo)致引起黃疸的阻塞。其它組織例如肺和胸腺也可能受到影響。診斷通常是通過使用顯微鏡查看一小片皮膚，肝，胃或腸以對特定炎性特征進(jìn)行觀察來證實(shí)的。在嚴(yán)重的情況下，肝不能正常發(fā)揮功能來從體內(nèi)消除廢物。急性GVHD通常在移植后的前三個(gè)月開始。在某些情況下，它能夠堅(jiān)持，反復(fù)或在移植后三個(gè)月以上開始。強(qiáng)的松和/或其它免疫抑制藥物用來治療急性移植物抗宿主病。如果用強(qiáng)的松治療不成功，就使用其它免疫抑制藥物，即使很大比例的患者難以用免疫抑制藥物治療并且死亡。
[0024]患有急性GVHD并且存活下來的患者具有更大的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展為慢性GVHD。老年患者，接受了外周血(代替骨髓)移植的患者和具有不匹配或不相干供體的患者有更大的風(fēng)險(xiǎn)患有慢性GVHD ο慢性GVHD通常在移植后后期開始，并且比急性GVHD持續(xù)更長?；加新訥VHD的患者可以呈現(xiàn)出各種癥狀。皮疹和/ 口腔潰瘍是本病最常見的初步跡象。不像急性GVHD，慢性GVHD可能導(dǎo)致在眼睛中產(chǎn)生眼淚和在口腔中產(chǎn)生唾液的腺體的損傷，這會(huì)導(dǎo)致干眼癥或口腔干燥癥?；颊呖赡芑加锌谇粷?，這會(huì)在進(jìn)食時(shí)引起疼痛，皮疹或肝炎。慢性GVHD也可能導(dǎo)致許多其它問題。其中一個(gè)問題就是在皮膚(皮膚硬化)和關(guān)節(jié)中形成疤痕組織。其它這樣的問題就是對肺部中的空氣通道的慢性損傷(閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征)。強(qiáng)的松或其它類似的抗炎或免疫抑制藥物用于治療慢性移植物抗宿主病。如果用強(qiáng)的松進(jìn)行治療沒有成功，可以使用其它免疫抑制藥物。正如在急性GVHD中，大部分患者是無法治愈慢性GVHD的。
[0025]如本文所用，術(shù)語“移植物抗白血病”或“GVL”或“移植物抗腫瘤作用”或“GVT”是指移植供體T淋巴細(xì)胞對接受者的患病骨髓和殘余腫瘤細(xì)胞有益的治療性免疫反應(yīng)。
[0026]本文所用的術(shù)語“胃腸移植物抗宿主病”和“G1-GVHD”是指由供體免疫細(xì)胞引起的對胃和小腸的宿主組織的損傷，其作為GVHD的一部分可能導(dǎo)致食欲不振，惡心，嘔吐或腹瀉的損傷，無論是急性或慢性的。在嚴(yán)重的情況下，G1-GVHD可以導(dǎo)致腹部疼痛和胃或腸出血。
[0027]如本文所用，術(shù)語“同種異體移植”是指從供體到宿主患者的供體血液輸注或骨髓干細(xì)胞移植。換言之，患者從組織匹配或接近匹配的供體接受骨髓或血液的干細(xì)胞，即在主要的HLA基因位點(diǎn)相匹配，其可能是親戚或不是親戚。同卵雙胞胎同種異體移植被稱為同基因移植。
[0028]本文所用的術(shù)語“造血干細(xì)胞移植”或“HSCT”或“造血細(xì)胞移植”或“HTC”是指多能造血細(xì)胞的移植，包括干細(xì)胞，通常是來自于骨髓，外周血或臍帶血。
[0029]本文所用的術(shù)語“同種異體HSCT”是指從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體的多能造血干細(xì)胞的移植。這種同種異體HSCT是在患有血液或骨髓的某些癌癥患者中進(jìn)行的，例如多發(fā)性骨髓瘤或白血病，先天性免疫缺陷和骨髓衰竭或其他血液疾病。在這些情況下，接受者的免疫系統(tǒng)通常在移移植前被輻射或化療破壞。感染和移植物抗宿主病是HSCT的主要并發(fā)癥。
[0030]如本文所用，術(shù)語“腸干細(xì)胞”和“ISC"是指多能干細(xì)胞，諸如Lgr5+細(xì)胞。
[0031]在提到腸細(xì)胞時(shí)，本文所用的術(shù)語“祖細(xì)胞”是指可能引起小腸或大腸的細(xì)胞分化的多能細(xì)胞，例如柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。
[0032]在提到細(xì)胞時(shí)，本文所用的術(shù)語“隱窩基”是指在腸的隱窩區(qū)中發(fā)現(xiàn)的多能干細(xì)胞。
[0033]本文所用的術(shù)語“潘式細(xì)胞”或“杜夫細(xì)胞”是指在小腸和闌尾發(fā)現(xiàn)的一種特殊類型的上皮細(xì)胞。潘式的細(xì)胞或潘式細(xì)胞是從腸道干細(xì)胞衍生而來。
[0034]在提到腸類器官時(shí)，本文所用的術(shù)語“類器官”包括從在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的上皮干細(xì)胞或分離的隱窩中得到的粘附有絨毛狀上皮細(xì)胞的中心腔。隱窩是指在上皮細(xì)胞基上的腸干/祖細(xì)胞區(qū)位。
[0035]本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”是指由半滲透細(xì)胞膜包圍的核和細(xì)胞器組成的生物體的結(jié)構(gòu)單元。它并不旨在限于活的或發(fā)揮功能的細(xì)胞。
[0036]本文所用的術(shù)語“接觸”或“治療”或“施用”化合物到細(xì)胞或組織，例如IL-22蛋白質(zhì)或IL-22蛋白質(zhì)組合物或細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合物等，是指將化合物放置在允許其接觸細(xì)胞的位置以產(chǎn)生“接觸”或“治療”細(xì)胞。所述接觸可以任何合適的方法來完成。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，接觸是通過將化合物添加至裝有細(xì)胞的管來完成的。接觸也可以是通過在微量滴定板中將化合物添加至細(xì)胞來完成的。接觸也可以通過將化合物添加至細(xì)胞的培養(yǎng)或類器官培養(yǎng)來完成的。它并不意味著限制化合物如何接觸細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，接觸可以是通過在動(dòng)物體內(nèi)施用化合物，例如IL-22分子組合物來完成的。
[0037]本文所用的術(shù)語“培養(yǎng)基”和“細(xì)胞培養(yǎng)基”是指適合于支持細(xì)胞的體外生長(即，細(xì)胞培養(yǎng)物)的介質(zhì)。它并不意味著該術(shù)語是限于任何特定的細(xì)胞培養(yǎng)基的。例如，意在定義包括生長物以及維持培養(yǎng)基。事實(shí)上，意在該術(shù)語包括任何適于感興趣的細(xì)胞培養(yǎng)物的生長的培養(yǎng)基。
[0038]術(shù)語“樣品”例如“測試樣品”以其最廣義使用。在一種意義上它是指包括人細(xì)胞或組織的動(dòng)物細(xì)胞或組織。在另一種意義上，它是指包括從任何來源獲得的標(biāo)本或培養(yǎng)，特別是作為生物樣品。生物樣品可以從動(dòng)物(包括人)中獲得，并且包括液體，固體，氣體，組織，細(xì)胞，血液骨髓和骨骼。
[0039]如本文所用，術(shù)語“初級隔離”是指從樣品中直接獲得細(xì)胞的過程。因此，細(xì)胞初級隔離，例如直接從小鼠或人類分離用于流式細(xì)胞分析的細(xì)胞的初級隔離涉及從受試者去除組織的方法，例如骨髓樣品或腸樣品等，隨后在例如分散酶的酶中消化。初級隔離可以使用固體或半固體瓊脂培養(yǎng)基或在液體中完成。
[0040]當(dāng)提到細(xì)胞群時(shí)，本文所用的術(shù)語“部分”(如在“部分腸細(xì)胞中”或“部分骨髓細(xì)胞中”)是指至少一個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞高達(dá)99%的群。例如，其中接觸導(dǎo)致至少一“部分”的所述細(xì)胞群，應(yīng)該明確的是部分是關(guān)于細(xì)胞群的。
[0041]本文所用的術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”是指一種氨基酸，氨基酸序列，寡肽，肽或蛋白質(zhì)或它們的一部分，無論天然存在的還是合成的。
[0042]當(dāng)提到蛋白質(zhì)時(shí)，本文所用的術(shù)語(如“在一部分給定蛋白質(zhì)中部分”是指該蛋白質(zhì)的片段。所述片段在大小上可以在從四個(gè)氨基酸殘基到整個(gè)氨基酸序列減去一個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。
[0043]本文所用的術(shù)語“TBI”是指如本文所述的“全身照射”。
[0044]在提到細(xì)胞時(shí)，本文所用的術(shù)語“淋巴”是指這些淋巴譜系，例如T細(xì)胞，B細(xì)胞和NKT (天然殺傷T)細(xì)胞。
[0045]在提到細(xì)胞時(shí)，本文所用的術(shù)語“髓系”是指髓樣細(xì)胞譜系的這些細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞(和單核細(xì)胞)，粒細(xì)胞(包括嗜中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)。
[0046]本文所用的術(shù)語“所改變的功能”是指功能上的改變，或者是增加一種功能或者是減少一種功能，例如在細(xì)胞數(shù)量上的改變，例如總胸腺細(xì)胞，在細(xì)胞類型上的改變，例如前B細(xì)胞數(shù)量的改變，在CD8+細(xì)胞數(shù)量上的改變，在功能上的改變，例如能夠分泌特定細(xì)胞因子或誘導(dǎo)特定細(xì)胞類型的存活或成熟的上皮細(xì)胞等。
[0047]出于本發(fā)明的目的，“增加”或“增加的”或“上調(diào)”或“增強(qiáng)”或“顯示增加的功能”或“增加的功能”，或相對于功能的“增強(qiáng)”是指相對于對照或野生型，作用或細(xì)胞類型的更高水平，例如增加數(shù)量的特定細(xì)胞類型，即成熟功能性腸細(xì)胞，成熟的功能性T細(xì)胞或一定量的化合物。增加的功能可能會(huì)增加細(xì)胞類型，例如當(dāng)“潘式細(xì)胞產(chǎn)量增加”時(shí)或當(dāng)“淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)量增加”時(shí)等，例如如本文所述用IL-22治療腸細(xì)胞增加基底隱窩細(xì)胞，潘式細(xì)胞等的產(chǎn)量，和當(dāng)在體內(nèi)治療骨髓細(xì)胞時(shí)，骨髓細(xì)胞增加的細(xì)胞功能增加淋巴樣細(xì)胞，例如增加未成熟的B細(xì)胞，前B細(xì)胞等，髓樣細(xì)胞類型例如粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等。因此，在GVL期間從骨髓增加成熟功能性淋巴樣細(xì)胞的示例增加了(增強(qiáng))至少一種淋巴細(xì)胞類型的數(shù)量，例如未成熟的B細(xì)胞，前B細(xì)胞等。此外，預(yù)期增強(qiáng)的或增強(qiáng)免疫功能的示例也可以指增強(qiáng)免疫能力，例如方法，其中用包含促使免疫功能增加的IL-22的組合物治療患有降低的免疫功能的免疫功能不全的患者，例如降低的T-細(xì)胞抗原受體譜，降低的細(xì)胞因子的分泌，降低的對抗原的增殖反應(yīng)等。增加的免疫功能可以作為T-細(xì)胞抗原受體譜，細(xì)胞因子分泌，對抗原的增殖反應(yīng)，對感染的反應(yīng)能力等中的任何一項(xiàng)中的增加進(jìn)行測定。
[0048]出于本發(fā)明的目的，“減少”或“減少的”或“降低”或“降低的功能”或“下調(diào)”或“具有降低功能”是指相對于對照或野生型，產(chǎn)量的較低水平，使得“細(xì)胞具有降低的功能”例如減少的細(xì)胞分裂，減少的分化為分化的細(xì)胞類型的子代細(xì)胞的數(shù)量，例如減少的從腸干細(xì)胞和腸祖細(xì)胞等產(chǎn)生的潘式細(xì)胞的數(shù)量。降低功能的其它示例可以是細(xì)胞因子生產(chǎn)的降低，S卩IL-22在敲除(KO)小鼠相對于IL-22+/+或野生型小鼠。作為其它示例，降低的功能是產(chǎn)生更少數(shù)量的成熟功能性胸腺細(xì)胞的胸腺上皮細(xì)胞，減少的功能是產(chǎn)生降低數(shù)量的成熟功能性淋巴樣細(xì)胞的骨髓細(xì)胞，骨髓來源的干細(xì)胞減少了淋巴樣細(xì)胞的數(shù)量。換言之，降低的功能也可以是改變的功能，例如，改變的骨髓免疫細(xì)胞的產(chǎn)生可能顯示出骨髓來源的干細(xì)胞具有(或產(chǎn)生)降低的淋巴樣細(xì)胞。具有降低的功能并不意味著是靜態(tài)結(jié)果。在一些實(shí)施方式中，接觸或施用本發(fā)明的IL-22組合物可能改變功能，例如當(dāng)IL-22誘導(dǎo)具有降低功能的細(xì)胞以顯示增加的功能時(shí)，參見實(shí)施例。
[0049]本文所用的術(shù)語“體外測定”是指任何用于測定細(xì)胞或細(xì)胞亞型功能或數(shù)量的增加或減少的體外測定。對于類器官培養(yǎng)物的體外測定的讀數(shù)可以包括例如腸干細(xì)胞子代的流式細(xì)胞術(shù)測量，例如基底隱窩細(xì)胞。對于免疫功能的體外測定的讀數(shù)可以包括例如T細(xì)胞功能測定法，包括細(xì)胞因子產(chǎn)量，T細(xì)胞亞型，粒細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，增殖，凋亡的程度等，參見在示例中使用的測定。
[0050]本文所用的術(shù)語“受試者”是指任何包括但不限于人類，非人靈長類動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物等的動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)，其成為特定治療的接受者。通常，術(shù)語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，特別是相對于“人類受試者”。出于本發(fā)明的目的，受試者可以是免疫功能不全的，即不能夠抵抗感染或控制異常細(xì)胞生長。免疫功能不全的受試者的示例包括具有以下任一條件的受試者，化療，暴露于輻射，蓄意照射，人免疫缺陷病毒感染，移植等。
[0051]術(shù)語“治療(treatment)”，“治療(treating)”等在本文中用來一般性意指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。相對于受試者的治療性治療，就完全地或部分地預(yù)防疾病或其癥狀而言，其效果可能是預(yù)防性的，和/或就部分地或完全地治療疾病和/或歸因于該疾病的不利影響而言，其效果可能是治療性的。因此，“治療”是指治療性治療和預(yù)防性或防范性措施，其中目的是防止或減緩(減輕)靶向病態(tài)狀況或病癥。需要治療的受試者包括那些已經(jīng)患有病癥以及那些傾向于患有病癥或那些要防止疾病的受體。
[0052]當(dāng)參照本發(fā)明的方法時(shí)，本文所用的術(shù)語“治療”涵蓋在哺乳動(dòng)物特別是人中的疾病的任何治療，并且包括(a)預(yù)防疾病在受試者中發(fā)生，受試者可以是易患疾病但還尚未診斷為患病的；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展;或(C)減輕疾病，即使疾病消退。本發(fā)明針對治療具有醫(yī)學(xué)病癥的患者，醫(yī)學(xué)病癥涉及來自與例如輻射，化學(xué)療法，免疫抑制等疾病的相關(guān)的治療的免疫能力的損傷。因此，本發(fā)明的治療將涉及預(yù)防，抑制或減輕任何醫(yī)學(xué)病癥，其中免疫活性的所需水平將通過使用本發(fā)明的IL-22化合物來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方式中，治療是指將受試者暴露于針對治療一種疾病的治療，例如輻射，化學(xué)療法等。
[0053]本文所用的術(shù)語“施用”或“給藥”是指給予藥物，前藥，藥物組合物或其它藥劑或治療性治療(例如，本發(fā)明的組合物)到生理系統(tǒng)(例如，在受試者的體內(nèi)，體外或離體細(xì)胞，組織和器官中)的行為。施用到人體上的可接受是途徑是通過眼睛(眼)，口腔(口)，皮膚(透皮)，鼻(鼻內(nèi))，肺(吸入劑)，粘膜(例如，口腔粘膜或頰)，直腸，耳，通過注射(例如，靜脈內(nèi)，皮下，瘤內(nèi)，腹膜內(nèi)等)等。施用“結(jié)合”一種或多種其它治療劑包括以任何順序同時(shí)(共同)和連續(xù)施用。
[0054]在提到組合物時(shí)，本文所用的術(shù)語“藥物”或“治療的”是指活性劑(例如，以有效量)(例如，IL-22蛋白或IL-DNA)與惰性或活性載體的組合物，這使組合物特別適合用于在體外、體內(nèi)或離體(體外)診斷或治療。
[0055]本文所公開的多肽或興奮劑或其拮抗劑的“有效量”是其量足以進(jìn)行一個(gè)具體說明的目的。相對于所闡述的目的，“有效量”可以憑經(jīng)驗(yàn)并且以常規(guī)方式來確定。在使用該藥物組合物時(shí)有效量的示例，將本發(fā)明的IL-22二聚體的安全且有效的量施用到有需要的哺乳動(dòng)物(例如人)，在其中給藥劑量是藥學(xué)上可接受的有效給藥劑量。作為一個(gè)示例，適用于60kg的人的給藥劑量通常是0.01-300mg，在優(yōu)選實(shí)施方式中給藥劑量是0.5-100mg，參見例如美國專利20130171100，其全部內(nèi)容以引證的方式并入本文。
[0056]本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，包括但不限于磷酸鹽緩沖鹽水溶液，水，乳劑(例如，如油/水或水/油乳劑)，和各種類型的潤濕劑，任何和所有溶劑，分散介質(zhì)，包衣，月桂基硫酸鈉，等滲和吸收延遲劑，崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)等。該組合物還可以包括穩(wěn)定劑和防腐劑。載體，穩(wěn)定劑和助劑的示例在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述(參見例如Mar tin, Remington ’ s Pharmaceutical Sciences , 15thEd.,Mack Publ.C0.,Easton,Pa.(1975)，其全部內(nèi)容以引證的方式并入本文)。
[0057]本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”或“藥理學(xué)可接受的”是指當(dāng)施用到受試者時(shí)基本上不產(chǎn)生不良反應(yīng)(例如，毒性，過敏，或免疫反應(yīng))的組合物。本發(fā)明的用于施用的IL-22 的形式的示例包括油膏，粉劑，貼片，噴霧劑，和吸入劑。
[0058]本文所用的術(shù)語“細(xì)胞因子”是指在生物體中作為信號化合物使用的蛋白或糖蛋白。它旨在包括同系物和合成版本。示例包括IL-22，IL-23，IL-21，IL-10家族，IL-7，干擾素(IFN)家族，CC趨化因子，CXC趨化因子等。
[0059]本文所用的術(shù)語“生物活性多肽”是指保持所需生物活性的任何多肽，如本文所述的生物IL-22活性物質(zhì)，例如增加腸干細(xì)胞和腸祖細(xì)胞分裂，成熟等。
[0060]其中本文中列舉的“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”和類似術(shù)語，例如“多肽”和“蛋白質(zhì)”并不意味著將氨基酸序列限制為與列舉的蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的，天然氨基酸序列。如本文所用術(shù)語“重組蛋白”或“重組多肽”是指由重組DNA分子(例如，由含有表達(dá)人IL-22基因的質(zhì)?；虿《镜募?xì)胞表達(dá)的人IL-22)表達(dá)的蛋白分子。
[0061]本文所用的術(shù)語“重組DNA分子”是指包含通過分子生物學(xué)技術(shù)的方式接合在一起(例如，連接到質(zhì)粒DNA序列或病毒序列的人IL-22基因)的DNA的片段的DNA分子。
[0062]本文所用的術(shù)語“核酸分子編碼”，“DNA序列編碼”，和“DNA編碼”是指脫氧核糖核苷酸沿著脫氧核糖核酸的鏈的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定氨基酸沿著多肽(蛋白質(zhì))鏈的順序。因此DNA序列編碼氨基酸序列。
[0063]術(shù)語“基因”是指一種核酸(例如，DNA)序列，其包括產(chǎn)生多肽或前體所需的編碼序列。它意在術(shù)語包括通過全長編碼序列以及編碼序列的任何部分編碼的多肽，只要保留全長或片段化多肽所需活性和/或功能特性(例如，IL-22活性，配體結(jié)合，酶活性等)。該術(shù)語還包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和在5’和3’端位于臨近編碼區(qū)在任一端為約IKb的距離的序列，使得基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)5’并且存在于mRNA上的序列被稱為“5’非翻譯序列”。位于編碼區(qū)3’并且存在于mRNA上(即，“下游”)的序列被稱為“3’非翻譯序列”。
[0064]術(shù)語“基因”包括cDNA和基因的基因組形式?；蚩寺〉幕蚪M形式包含通過被稱為“內(nèi)含子”或“插入?yún)^(qū)域”或“插入序列”的非編碼序列中斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄為核RNA(hnRNA)的基因的片段；內(nèi)含子可以包含例如增強(qiáng)子的調(diào)控元件。將內(nèi)含子從核或最初轉(zhuǎn)錄物除去或“剪接掉”;因此在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中缺乏內(nèi)含子。在翻譯過程中mRNA發(fā)揮功能以指定在新生多妝中的氣基酸的序列或順序。
[0065]本文所用的術(shù)語“PCR產(chǎn)物”，“PCR片段”和“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指完成變性，退火和延伸的PCR步驟的兩個(gè)或多個(gè)循環(huán)后化合物的合成混合物。這些術(shù)語包括存在一個(gè)或多個(gè)靶序列的一個(gè)或多個(gè)片段的擴(kuò)增的情況。
[0066]本文所用的術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCR” )指的是在美國專利4,683,195,4,683,202和4，965，188中所描述的方法，其全部內(nèi)容以引證的方式并入本文，其描述了一種用于提高未經(jīng)克隆或純化的基因組DNA的混合物中的靶序列片段濃度的方法。這個(gè)用于擴(kuò)增靶序列的方法包括引入大大過量的兩種寡聚核苷酸引物到含有所需靶序列的DNA混合物，隨后在DNA聚合酶的存在下熱循環(huán)的精確序列。兩個(gè)引物與它們各自的雙鏈靶序列的鏈互補(bǔ)。為了影響擴(kuò)增，將混合物變性，然后引物退火到靶分子內(nèi)的互補(bǔ)序列。然后退火，用聚合酶延伸引物，以便形成一對新的互補(bǔ)鏈。變性，引物退火和聚合酶延伸的步驟可以多次重復(fù)(即，變性，退火，延伸構(gòu)成一個(gè)“循環(huán)”；可以有許多次“循環(huán)”)以獲得高濃度的所需靶序列的擴(kuò)增片段。所需靶序列的擴(kuò)增片段的長度由相對于彼此的引物的相對位置來確定，并且因此，該長度是可控參數(shù)。憑借該過程的重復(fù)方面，將該方法稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”(下文“PCR”)。因?yàn)榘行蛄械乃钄U(kuò)增片段成為混合物中的主要序列(就濃度而言)，將它們稱為“PCR擴(kuò)增”。除了基因組DNA，可以用適當(dāng)?shù)囊唤M引物分子擴(kuò)增任何寡核苷酸或多核苷酸序列。特別地，通過PCR方法本身產(chǎn)生的擴(kuò)增片段是它們本身，是隨后的PCR擴(kuò)增的有效模板。用PCR能夠擴(kuò)增在基因組DNA中的特定靶序列的單獨(dú)拷貝到由本發(fā)明的設(shè)備和系統(tǒng)可檢測出的水平。
[0067]本文所用的術(shù)語“擴(kuò)增試劑”是指除引物，核酸模板和擴(kuò)增酶之外的擴(kuò)增所需的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸，緩沖液等)。通常情況下，擴(kuò)增試劑與其它反應(yīng)成分放置在一起并且包含在反應(yīng)容器(試管，微孔等)中。
[0068]本文所用的術(shù)語“反轉(zhuǎn)錄酶”和“RT-PCR”是指PCR的一種類型，其中起始原料是mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將起始mRNA酶促轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA或“cDNA”。然后該cDNA用于“PCR”反應(yīng)的“模板”。
[0069]本文所用的術(shù)語“實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“定量聚合酶鏈反應(yīng)”或“qPCR”是指測量在用于測定組織樣品中的特定的DNA或RNA序列水平的mRNA的變化。它是基于在PCR產(chǎn)物擴(kuò)增期間檢測按比例產(chǎn)生的熒光信號的檢測。例如，實(shí)時(shí)PCR測量mRNA是通過用于使用Perkin Elmer/Applied B1systems Divis1n 7700序列檢測儀測量mRNA的變化的定量RT-PCR的Taqman?方法來完成。
[0070]本文所用的術(shù)語“引物”是指寡核苷酸，無論是天然存在的作為純化的限制性消化或合成產(chǎn)生，當(dāng)該引物處于與核酸鏈互補(bǔ)的引物擴(kuò)展產(chǎn)物合成被誘導(dǎo)的條件下(即在存在核苷酸和如DNA聚合酶的誘導(dǎo)劑且在合適的溫度和pH的情況下)，其能夠作為合成的起始點(diǎn)。引物優(yōu)選為用于最大效應(yīng)的擴(kuò)增的單鏈，但是可選擇雙鏈。如果是雙鏈，引物在用于制備延長產(chǎn)物之前首先會(huì)經(jīng)過拆鏈處理。優(yōu)選地，引物是脫氧寡核苷酸。引物應(yīng)足夠長以在誘導(dǎo)劑存在時(shí)引導(dǎo)延長產(chǎn)物的合成。引物的確切長度取決于很多因素包括:溫度、引物來源和使用方法。
[0071]本文所用的術(shù)語“樣品模板”是指源于被分析為用于例如腸細(xì)胞中產(chǎn)生的IL-22的“革巴”存在的樣品的核酸。與此相反，“背景模板”用來指核酸，而不是可能存在或不存在于樣品中的樣品模板。背景模板是通常是不被注意到的。它可能是攜帶的結(jié)果，或者它可以是由于存在尋求純化來遠(yuǎn)離樣品的核酸污染。例如，來自類器官的核酸而不是那些待檢測的核酸可能在測試樣品中作為背景存在?！靖綀D說明】:
[0072]圖1.同種異體BMT/HCT后缺乏宿主衍生的IL-22增加死亡率。Α，Κ0受體，輕微抗原不匹配。Β，Κ0受體，MHC不匹配。C，抗IL-22中和抗體，MHC不匹配。D，K0骨髓，MHC不匹配。Ε，Κ0供體T細(xì)胞，MHC不匹配。F，造血KO受體，輕微抗原不匹配且BMT強(qiáng)度減小(3個(gè)月后，通過用IL-22K0或WT同系的CD45.1B6骨髓修復(fù)WT B6小鼠產(chǎn)生造血嵌合體)。數(shù)據(jù)為代表性數(shù)據(jù)(D)或2-4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合。
[0073]圖2.A，WT 或 IL-22K0 受體 LP—B6BMT/HCT 的 GVHD 評分 Jn = 4-5BM 無 T 細(xì)胞，且 η =10ΒΜ+Τ小鼠/組hB’Be—BALB/c BMT兩周后小腸和大腸器官培養(yǎng)上清液的ELISA結(jié)果。C，B10.BR—B6BMT兩周后固有層細(xì)胞的qPCR結(jié)果。D，未進(jìn)行BMT或B6—BALB/C BMT的經(jīng)亞致死性輻射2周后胸腺ELISA結(jié)果。E，同種異體BMT后有或沒有GVHD的血清IL-22 J，B6小鼠腸勻漿的ELISA結(jié)果(結(jié)合兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)hG’Be—BALB/c BMT 2周后，SI固有層中的宿主CD45+⑶3—ROR γ t+細(xì)胞，體外經(jīng)IL-23刺激，代表三個(gè)獨(dú)立的移植實(shí)驗(yàn)。
[0074]圖3.A，SI隱窩示意圖。B-C，IL_22R染色:括號表示祖細(xì)胞，綠色箭頭表示ISC，紅色箭頭或紅色I(xiàn)F表示潘式細(xì)胞。B，IL-22R IHCX，用于IL-22R的IF(綠色)，潘式細(xì)胞溶菌酶(紅色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)。D-G，LP—B6，BMT/HCT之后3周。D，Lgr5_LacZ受體。Lgr5標(biāo)記了 CBC/ISC，且β-半乳糖苷酶報(bào)道基因通過正常腸隱窩基底染成深色表示(右上)。染色和ISC存活在沒有GVHD的情況下仍然存在(左下)，而染色和干細(xì)胞在GVHD過程中明顯丟失(右中)。同時(shí)也展示了CBC計(jì)數(shù)結(jié)合的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(左上)οΕ，基于WT或IL-22K0的小鼠中潘式細(xì)胞之間的隱窩基底的區(qū)位，從組織學(xué)上評價(jià)13(:<^，在訂或11^-221(0的受體中811'/!1(^ 3周后的組織學(xué)細(xì)胞凋亡。G，對WT或IL-22K0的受體中ΒΜ+Τ細(xì)胞口腔灌胃后的血漿FITC-葡聚糖。FITC-葡聚糖從上皮進(jìn)入血液表明屏障完整性遭到損壞。*Ρ〈.05，**p〈.01，***ρ〈.001
[0075]圖4.給藥rIL-22降低內(nèi)臟GVHD病理反應(yīng)，加強(qiáng)ISC恢復(fù)，但是不影響潘式細(xì)胞恢復(fù)或發(fā)揮功能。LP—B6BMT之后3周，從BMT后第7天開始每天給藥rIL-22^，給藥rIL-22后降低了內(nèi)臟GVHD病理反應(yīng)。B，給藥rIL-22后皮膚GVHD未觀察到明顯變化。C，給藥rIL-22后降低了隱窩細(xì)胞凋亡。D.Lgr5-LacZ受體顯示給藥IL-22后LacZ+隱窩基底ISCs恢復(fù)增強(qiáng)。E.潘式細(xì)胞在GVHD中有所減少，并且給藥IL-22后并沒有增加。F-G.小腸mRNA的qPCR結(jié)果。F.給藥IL-22后潘式細(xì)胞衍生的分子表達(dá)沒有明顯變化。G.1L-22處理后GVHD中先天抗菌基因增強(qiáng)。所有數(shù)據(jù)均為代表性數(shù)據(jù)或至少兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合，并且每組至少5只小鼠。**p〈.01，***ρ〈.001ο
[0076]圖5.小腸隱窩間接體內(nèi)培養(yǎng)類器官。隱窩從Β6小腸中分離，使用R-脊椎蛋白I，EGF和頭蛋白在基質(zhì)膠上培養(yǎng)。A.培養(yǎng)第I天，隱窩腔開始閉合。B.培養(yǎng)24h后隱窩形成球體。C.培養(yǎng)7天后形成有新隱窩芽的類器官。
[0077]圖6.1L-22二聚體增強(qiáng)ISC功能。A.從Lgr5-GFP報(bào)道小鼠中分離的SI ISCs對IL-22受體的表達(dá)，左側(cè)圖表示GFP+細(xì)胞的增殖，中間和右側(cè)圖表示IL-22R的表達(dá)。B.K1-67的增加表明IL-22處理后患有GVHD的報(bào)道小鼠中Lgr5-GFP+SI ISCs有所增殖。C.體外類器官的高倍放大顯示其周長蹤跡，用于測量類器官的周長和面積。D-E.與IL-22培養(yǎng)一周后SI類器官尺寸變大。D.代表性圖片。E.與鼠源IL-22培養(yǎng)后的類器官尺寸。F.與F-652人源IL-22二聚體培養(yǎng)后的類器官尺寸。*p〈.05，#p〈.0I，*#p〈.001
[0078]圖7.1L-22和先天淋巴樣細(xì)胞增強(qiáng)間接體內(nèi)培養(yǎng)的腸類器官的生長。a.在IL-22(5ng/ml)存在和不存在情況下ENR培養(yǎng)7天后的SI類器官明場顯微鏡圖片。b，類器官的顯微鏡可見蹤跡以測量周長及計(jì)算表面積。c-d，用0-5ng/ml的rmIL-22培養(yǎng)7天后類器官水平面的周長化111)和面積化1112):(3，51;(1兒1;6，11^22增加51(第4天)和1^1(第7天)類器官的新隱窩(肉芽)形成。f_g，在人源IL-22 二聚體F-652存在下培養(yǎng)的SI(f)和LI(g)類器官的尺寸(周長和表面積hh，在SI ILCs(隱窩:ILC比率=1:3)存在或不存在的情況下，使用ENR+/-1L-
2、IL-15、IL-7和IL-23在基質(zhì)膠上培養(yǎng)的SI類器官的尺寸。數(shù)據(jù)由至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合或?yàn)槠渲写硇詳?shù)據(jù)。*p〈0.05，#p〈0.0I，*#p〈0.001。
[0079]圖8.GVL模型。A-B.GVL抗A20淋巴瘤。A，WT與IL-22K0供體T細(xì)胞。沒有觀察到供體T細(xì)胞IL-22影響GVL抗A20淋巴瘤。WT和IL-22K0供體T細(xì)胞的受體在A20腫瘤情況下存活率相同。B，WT T細(xì)胞和日常IP PBS組與ril-22組。腫瘤生物發(fā)光證明給藥IL-22組并沒有干擾GVL抗熒光素酶+A20(A20TGL)<X.潛在可選擇的GVL模型:MLL-相關(guān)性白血病。供體T細(xì)胞調(diào)節(jié)GVT抗由MTT-AF9融合構(gòu)建子的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的AML。HCT與MLL-AF9白血病。圖示為MLL-AF9白血病的B64BALB/c 811'。艦1^為祖^4?9構(gòu)建子的841^八81的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生，然后轉(zhuǎn)移至次級受體中進(jìn)行GVL測試。
[0080]圖9.每日使用rIL-22蛋白的IP給藥。HTC后3周在受體小腸、大腸和肝中觀察到GVHD病情減弱。移植3周后IL-22給藥的LP—B6BMT GVHD組織病理學(xué)觀察。p〈.001。
[0081 ]圖10使用rIL-22蛋白治療的受體。HCT后3周，在活性GVHD期間，觀察到Lgr5+ISC數(shù)量的增加，未見免疫抑制。移植三周后給藥rIL-22的Lgr5+腸干細(xì)胞。p〈.05。
[0082]圖11.使用Rag2-GFP骨髓和WT T細(xì)胞進(jìn)行FVB到BALB/c MHC不匹配移植。HCT后4周，給藥rIL-22蛋白增加了供體骨髓衍生的CD4和CD8+胸腺輸出。移植4周后，給藥rIL-22的骨髓衍生的T細(xì)胞。p〈.01。
[0083]圖12.!1(:1'后給藥11^-22。1^486.(六-8)!1(:1'后3周每天給藥111^-221?，沒有1'細(xì)胞，81(白色)，BM+T細(xì)胞+PBS IP(黑色)，BM+T細(xì)胞+IL-22(灰色):A，腸GVHD病理反應(yīng)評分。B，腸隱窩細(xì)胞凋亡評分。C，體外乳酸桿菌培養(yǎng)后IL-22的ELISA結(jié)果，左邊欄為乳酸-22&D，調(diào)pH(粉色)和不調(diào)pH((藍(lán)色))情況下表面固定IL-22的乳酸桿菌的IL-22FACS和陰性對照組乳酸桿菌(綠色)C3DjCT后每天乳酸灌胃的存活情況(左)和GVHD評分(右)，沒有T細(xì)胞的，BM(黑色，圓圈)，BM+T+PBS(黑色，正方形)，BM+T細(xì)胞+乳酸-WT(綠色)，BM+T細(xì)胞+乳酸_22s(紅色)，BM+T細(xì)胞+乳酸-22a(藍(lán)色)*p〈.05，*#ρ〈.001。
[0084]圖13.1L-22給藥降低GVHD病理反應(yīng)。LP—B6，BMT后3周，IL-22:從第+7天開始，每天4呢。*** =卩〈.001。
[0085]圖14.1L-22給藥降低隱窩細(xì)胞凋亡。LP—B6，BMT后3周，IL-22:從第+7天開始，每天4呢。*** =卩〈.001。
[0086]圖15.1L-22給藥增加先天抗菌物質(zhì)的表達(dá)。LP—B6，BMT后3周。
[0087]圖16.1L-22在類器官中激活STAT-3信號并增加ISC再生。a-b，Wnt/i3_連環(huán)蛋白軸的Wnt3，f3-連環(huán)蛋白，和Axin 2基因(a)與使用O、I或5ng/ml rmIL-22培養(yǎng)的SI類器官中Reg3i3和Reg3 γ先天抗菌物質(zhì)的mRNA(b)的相對表達(dá)的qPCR結(jié)果。數(shù)據(jù)結(jié)合3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。C，ENR條件下培養(yǎng)的類器官細(xì)胞中磷酸-STAT3 (Y705)的細(xì)胞內(nèi)染色，然后用濃度為20ng/ml的IL-22，脈沖流沖洗20min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行評價(jià)。d，隱窩與ENR+/-STAT3抑制劑Stattic培養(yǎng)4天后，SI類器官明場圖像和表面積的測量。e，Lgr5-GFP+細(xì)胞中IL-22誘導(dǎo)的磷酸-STAT3(Y705)激活。f-g，在存在或不存在rmIL-22 (lng/ml)情況下，SI中單個(gè)Lgr5_GFP+I SCs被培養(yǎng)成類器官。f，IL-22增強(qiáng)類器官出芽(培養(yǎng)第4天)。早期萌芽的代表性照片按升序展示。*表示沒有出芽的早期類器官。▲表示出芽前的極化狀態(tài)，丨表示極化部位開始出芽。g，從單一干細(xì)胞(培養(yǎng)第13天)開始，IL-22能增加類器官的尺寸。h，IL-22(lng/ml)增加摻入EdU至SI類器官隱窩。111^-22(1-5呢/1111)增加1^的-6??高51 ISCs的數(shù)量。j，系列傳代移植表明，與IL-22(lng/ml)培養(yǎng)可以增加類器官數(shù)量。c-j數(shù)據(jù)均為至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合或?yàn)槠渲写硇詳?shù)據(jù)。*p〈0.05; **p〈0.0I; ***p〈0.001。
[0088]圖17.在不大幅改變同種異體反應(yīng)免疫力的情況下，IL-22可降低腸組織的病理反應(yīng)。B6受體小鼠只移植了 LP T細(xì)胞耗盡的骨髓或LP骨髓和T細(xì)胞(H-2b^H-2b)來引起GVHD，每天通過IP注射方式給藥PBS或4ug后3周對腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)評價(jià)。a，柱狀圖表示GVHD評分和細(xì)胞凋亡。b，PBS或IL-22處理的小鼠腸的Η/E染色代表性圖片。箭頭表示腸上皮的凋亡細(xì)胞。c，BMT后3周用流式細(xì)胞法分析受體的脾細(xì)胞，結(jié)果顯示有出現(xiàn)供體T細(xì)胞亞群頻率，活化標(biāo)志物⑶25表達(dá)和內(nèi)臟室分子α4β7整合素表達(dá)。d，BMT后3周，對受體組織中脾臟和小腸中的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行了分析。e，BMT后3周，給藥IL-22 增加了小腸中 Reg3i3 和 Reg3 YmRNA 的表達(dá) 。數(shù)據(jù)均為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合或?yàn)槠渲写硇詳?shù)據(jù)，每組至少9只小鼠。*噸〈0.01 ;***ρ〈0.001。
[0089]圖18.IL-22不依賴于ISC區(qū)位，直接增加了體內(nèi)的Lgr5+ISCs。a-f，LP4B6BMT(H-2b4H-2b)+/-T細(xì)胞;BMT后第7天開始，受體每日經(jīng)PBS或4ug rmIL-22IP處理。數(shù)據(jù)均為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合，每組至少7只小鼠。a，LP—B6BMT，以Lgr5_LacZ報(bào)道小鼠為受體。BMT后3周(每天給藥I3BS或rmIL-22兩周后)，對小腸Lgr5+CBC ISCs進(jìn)行了評估。b，LP—B6BMT，以Lgr5-GFP報(bào)道小鼠為受體。BMT后14天(每天給藥PBS或rmIL-22—周后)，用流式細(xì)胞法評價(jià)GFP+ISCs，用于K1-67的表達(dá)。c，BMT后3周，每個(gè)小腸隱窩中的溶菌酶陽性潘式細(xì)胞的數(shù)量。d，BMT后3周患有GVHD的小鼠小腸中WNT3和EGF的相對表達(dá)量(qPCR).e，用流式細(xì)胞法評價(jià)潘式細(xì)胞中IL-22R表達(dá)和STAT3磷酸化作用。圖示為側(cè)向散射所得潘式細(xì)胞的入口(gating)和CD24表達(dá)情況(左圖)，潘式細(xì)胞IL-22R在基線和全體輻照1200cGy5天后的表達(dá)量(中間)，經(jīng)20min的20ng/ml IL-22脈沖流后，類器官衍生的潘式細(xì)胞的STAT3磷酸化作用(右圖)。f，BMT后3周，患有GVHD的小鼠小腸R-脊椎蛋白_3mRNA的相對表達(dá)量(qPCR)。g，BMT后3周，從患有GVHD的小鼠小腸分離的隱窩中Wnt-激活的基因β-連環(huán)蛋白和Axin 2的相對表達(dá)量(9?00。11-丨，1^486811'后一周開始，每隔一天對小鼠皮下給藥1^3或100呢/1^ F-652，連續(xù)10周。對接受移植的小鼠進(jìn)行GVHD臨床癥狀(h)和GVHD相關(guān)死亡率⑴監(jiān)測。*ρ〈.05；**ρ〈0.01;***ρ〈0.001 ο
[0090]圖19.F-652給藥降低F0X3P缺失的嚴(yán)重程度。白喉毒素(DT)處理(50ug/Kg)F0X3P-DTR小鼠后T-reg缺失導(dǎo)致全身性自身免疫，包括胃腸自身免疫。這打亂了隱窩的體內(nèi)平衡并對腸干細(xì)胞隔室造成了消極影響，這些可從小腸(SI)類器官生長的損壞得到考證。DT處理后8天收集SI隱窩。與單獨(dú)DT處理(+PBS)相比，(DT處理后)每隔一天給藥F-625(100ug/KG)可保護(hù)ISC隔室遠(yuǎn)離T-regablat1n，培養(yǎng)7天后觀察到的類器官數(shù)量增加可以證明這點(diǎn)。每個(gè)檢測，在四個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)中隨機(jī)選擇20個(gè)視場進(jìn)行分析，所得數(shù)值取平均值+標(biāo)準(zhǔn)差。與對照樣相比*P〈0.01(單因素方差分析)。與DT+F-652相比**p〈0.05(單因素方差分析)。DT:白喉毒素。
[0091]圖20.F652處理提高整體存活率并減少體內(nèi)GVHD全身性標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):LP—B6MHC匹配的同種異體骨髓移植模型，1100cGy XRT分割劑量，BM+T細(xì)胞組用5 X 16TCD BM細(xì)胞和4\10%05+1'細(xì)胞，然后以10(^8/1^劑量每隔一天皮下給藥?-652或1^3^實(shí)驗(yàn)為MHC匹配同種異體骨髓移植模型，每個(gè)治療組10只小鼠，骨髓對照組5只小鼠。這些小鼠在骨髓移植后7天開始給藥F-652或PBS。然后以100yg/kg劑量皮下注射F-652或PBS，每隔一天注射一次，共10周。A:BMT后7天開始治療的實(shí)驗(yàn)組的全身GVHD評分。B:BMT后7天開始治療的實(shí)驗(yàn)組整體存活率。*表示P〈.05<X-D實(shí)驗(yàn)為MHC匹配同種異體骨髓移植模型，每組5只小鼠，每組小鼠僅在全身GVHD癥狀開始發(fā)展后(BMT后4周)進(jìn)行F-652或PBS治療。然后每隔一天對這些小鼠按100yg/kg劑量進(jìn)行皮下注射F-652或I3BSt3C:小鼠表現(xiàn)出GVHD癥狀后開始治療的實(shí)驗(yàn)組全身GVHD評分。D:小鼠表現(xiàn)出GVHD癥狀后開始治療的實(shí)驗(yàn)組整體存活率。
[0092]發(fā)明詳述
[0093]本發(fā)明提供了用于IL-22對腸損傷和炎癥的癥狀的治療的方法和組合物，癥狀例如移植物抗宿主疾病。具體地，IL-22可以用于加快同種異體造血移植后腸干細(xì)胞(ISC)恢復(fù)和增強(qiáng)免疫重建。在特定優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供了使用治療的組合物中的治療的IL-22，包括IL-22 二聚體形式，治療移植物抗宿主疾病的方法，包括例如肝臟、胸腺、胃腸的受影響的細(xì)胞或其他移植物抗宿主疾病對造血干細(xì)胞移植患者以及患有腸道感染癥狀的患者的影響。
[0094]IL-22被報(bào)道用于治療人體疾病，如胰腺病(如第6，551，799，號美國專利，全文以引證的方式并入本文中)和病毒性肝炎，包括促進(jìn)肝細(xì)胞存活和增殖(如申請?zhí)枮?0130171100的美國專利，全文以引證的方式并入本文中)。然而，目前IL-22還沒用于治療人GVHD。實(shí)際上，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用供體T細(xì)胞引導(dǎo)IL-22產(chǎn)生來治療GVHD可能引起一些不良反應(yīng)，如增加皮膚GVHD。
[0095]本發(fā)明方法中所用的IL-22不僅可以通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生，還可通過融合異種多肽產(chǎn)生。其它方法描述:合成本發(fā)明方法所用IL-22的載體和宿主細(xì)胞可以從Gething等，Nature，293:620-625 ;Mantei等，Nature ,281:40-46 ;EP117,060和EPl 17，058.中找到。重組IL-22，二聚體和融合蛋白可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法生產(chǎn)。更詳細(xì)信息參見申請?zhí)枮?013/0171100的美國專利，其內(nèi)容以引證的方式并入本發(fā)明中)。
[0096]編碼IL-22 二聚體或融合蛋白的DNA序列可以完全通過人工合成?；蛘?，編碼IL-22的DNA可以通過PCR擴(kuò)增或合成得到，然后連接起來形成編碼IL-22 二聚體的DNA序列。
[0097]簡要地，合適的宿主細(xì)胞與IL-22表達(dá)載體用已知方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，然后在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知條件下促進(jìn)生長;轉(zhuǎn)染技術(shù)更具體地描述參見，如分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊第三版，J.F.Sambrook和D.W.Russell編，Cold Spring Harbor Laboratory 2001 年出版。
[0098]適合表達(dá)IL-22的宿主細(xì)胞也為本領(lǐng)域已知，包括無脊椎動(dòng)物細(xì)胞，如昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)，COS細(xì)胞;特別地，SV40-轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細(xì)胞株(C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚胎腎細(xì)胞株293(Graham等 J.Gen Virol.,36:59(1997));CH0/-DHFR(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,77:4216(1980));鼠科睪丸滋養(yǎng)細(xì)胞(TM4, Mather ,B1l.Reprod.，23: 243-251) (1980));人肺細(xì)胞(MMT060562,ATCC CCL51);人肝臟細(xì)胞(Hep G2，HB 8065);鼠科乳腺癌細(xì)胞(MMT 060562,ATCCCCL51)0
[0099]包含核苷酸序列編碼IL-22的核酸可以嵌入可復(fù)制的載體中進(jìn)行基因克隆或蛋白表達(dá)。很多用于蛋白質(zhì)表達(dá)的載體都是本領(lǐng)域已知的。利用這些技術(shù)，將編碼IL-22的核酸序列嵌入一種合適的載體中，該載體可能進(jìn)一步包含以下任何物質(zhì):一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子，及轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0100]轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞和轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞的方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可能包括使用氯化鈣、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體或電穿孔。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠根據(jù)所選宿主細(xì)胞選擇合適的方法。
[0101]在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了從CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)中獲得的包含人IL-22的重組蛋白。
[0102]本發(fā)明方法使用的藥物組合物為安全且有效劑量的IL-22或其二聚體，融合蛋白或它們的結(jié)合體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體?！鞍踩矣行┝俊敝傅氖亲阋燥@著改善有需要的病人的病情而不引起嚴(yán)重的副作用的復(fù)合物的劑量。一般而言，IL-22藥物組合物為每劑量包含0.001-1，OOOmg的IL-22或其二聚物;在一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物為每劑量包含0.05-300mg的IL-22或其二聚物;另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物為每劑量包含0.5-200mg的IL-22或其二聚物。
[0103]藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體均為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可能包括纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、醋酸纖維素等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、丙三醇、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如，吐溫RTM)、濕潤劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱源水等。
[0104]IL-22、二聚體、融合蛋白或它們結(jié)合體常規(guī)的給藥方式包括口服、直腸給藥、胃腸外給藥(靜脈注射，肌肉注射或皮下注射)和局部給藥。
[0105]同種異體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一種強(qiáng)烈的移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)，但是這種有益的效應(yīng)受移植物抗宿主疾病限制。T細(xì)胞缺失會(huì)喪失GVHD和GVL效應(yīng)。因此，在IL-22敲除的小鼠和輻照的小鼠模型中，IL-22由受體先天淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并預(yù)期同種異體造血細(xì)胞移植(allo-HCT)實(shí)驗(yàn)后為上皮細(xì)胞的恢復(fù)提供信號。這些IL-22缺失的受體顯示GVHD死亡率增高且在GVHD過程中有非常嚴(yán)重的隱窩基底腸干細(xì)胞(ISCs)丟失。自相矛盾地，在輻照的野生型(WT)受體中，由于抗放射性腸道細(xì)胞(ILCs)的消除，GVHD也會(huì)導(dǎo)致胃腸(GI)IL-22水平的降低。因此，發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)，在allo-HCT后，施用IL-22可取消(降低)ILC消除并進(jìn)一步減少GVHD病理狀況，而不影響移植物抗白血病(GvL)響應(yīng)。
[0106]使用本發(fā)明的IL-22組合物和包括施用外源IL-22的方法的優(yōu)勢在于細(xì)胞在GVHD時(shí)的預(yù)防保護(hù)及疾病的恢復(fù)，包括但不限于小腸、大腸和肝細(xì)胞。
[0107]1.1L-22對腸上皮細(xì)胞生物學(xué)和GVHD的貢獻(xiàn)
[0108]A.移植后有GVHD和沒有GVHD情況下，體內(nèi)上皮細(xì)胞的保留情況
[0109]移植后，無GVHD情況下ISC和潘式細(xì)胞數(shù)量都保留較好，然而在有GVHD情況下，數(shù)量都有所減少(圖3D，4E) AVHD中ISC的丟失可能是由于它們區(qū)位的丟失所致，或者潘式細(xì)胞的丟失可能是由于其親代ISCs丟失所致。在正常的體內(nèi)平衡情況下，小腸SI絨毛上皮細(xì)胞每3-5天更新一次，而潘式細(xì)胞存活的時(shí)間要長很多，會(huì)存活3周或更長時(shí)間。在組織損傷及特定移植后，這些動(dòng)力學(xué)都可能被改變。
[0110]1.在無GVHD情況下，上皮細(xì)胞從小鼠Lgr5+ISCs恢復(fù)。
[0111]測量與ISC和潘式細(xì)胞功能相關(guān)的分子的GI表達(dá)以及上皮恢復(fù)的動(dòng)力學(xué)。所用小鼠為與MSKCC的同事合作所得的C57BL/6(B6)背景可誘導(dǎo)的Lgr5-LacZ譜系追蹤報(bào)道(reporter)小鼠。經(jīng)它莫西芬治療后，這些小鼠可在Lgr5+細(xì)胞及其后代中表達(dá)β-半乳糖苷酶報(bào)告分子。在移植當(dāng)天，對受體小鼠進(jìn)行它莫西芬治療，可以區(qū)分從移植后Lgr5+ISCs中新生的隱窩和絨毛。對小鼠LI和SI中的Lgr5+細(xì)胞再生上皮的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評價(jià)，應(yīng)特別注意SI對潘式細(xì)胞恢復(fù)的動(dòng)力學(xué)影響。對(a)未經(jīng)移植而進(jìn)行亞致死量(550cGy xl)和致死(550cGy x2)，(b)經(jīng)同系(B6—B6)TCD BMT和(c)經(jīng)同系T細(xì)胞的BMT后5，7和10天的小鼠進(jìn)行評價(jià)，以控制a)條件因素b)細(xì)胞移植和c)T細(xì)胞轉(zhuǎn)移對從ISCs新生潘式細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的影響。除了譜系追蹤外，還要通過定量(q)PCR和免疫印跡法收集腸組織，從而檢測報(bào)告ISC基因(1^技、810-1、!10?1、11^6^1^丨81)，與13(:功能相關(guān)的潘式細(xì)胞基因(￥1^3 36?)的1?熟和蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0112]2.有GVHD的小鼠的上皮細(xì)胞恢復(fù)、I SC丟失和潘式細(xì)胞丟失。
[0113]GVHD情況下ISC和潘氏細(xì)胞數(shù)量減少(圖3D，4E) AMT后，隱窩功能和潘式細(xì)胞的恢復(fù)會(huì)由于GVHD中潘式細(xì)胞的丟失而發(fā)生改變。可以確定該丟失是由于干細(xì)胞功能損傷或免疫介導(dǎo)的干細(xì)胞損失所導(dǎo)致。GVHD情況下，ISC和潘式細(xì)胞損失動(dòng)力學(xué)評價(jià)可以作為鑒別ISCs及其區(qū)位損傷的早期證據(jù)。對譜系追蹤報(bào)道小鼠Lgr5-LacZ中的上皮細(xì)胞進(jìn)行譜系追蹤可以按本文描述的方法進(jìn)行，然而只能在同種異體移植的設(shè)定中進(jìn)行?？梢詫P—B6(H-2b—H-2b)miHA和B10.BR—B6(H-2k—H-2b)MHC移植物不匹配的移植受體在BMT后隱窩、絨毛和潘式細(xì)胞恢復(fù)情況進(jìn)行評價(jià)，比較TCD BMT受試者(無GVHD)與骨髓和T細(xì)胞受試者(有GVHDhBMT后5天，7天和10天再進(jìn)行譜系追蹤，以評價(jià)從Lgr5+ISCs再生上皮的動(dòng)力學(xué)情況。可以再次檢測13(:和潘式細(xì)胞相關(guān)分子(1^技，811-1，!10?1，11^6^1^丨81，￥1^3 46?)的表達(dá)。
[0114]另外，通過對移植前和BMT移植1、3、5、7、10、14天后ISC和潘氏細(xì)胞數(shù)量的時(shí)序研究，可以確定ISC丟失和潘式細(xì)胞丟失之間存在時(shí)間相關(guān)性。這可以通過使用Lgr5-LacZ僅有干細(xì)胞的B6報(bào)道小鼠完成，其中該小鼠的β-半乳糖苷酶報(bào)告分子只在Lgr5+I SCs中結(jié)構(gòu)性地表達(dá)而不在小鼠后代中表達(dá)。因此，Lgr5+ISCs可以通過報(bào)道小鼠的使用來計(jì)數(shù)，而潘式細(xì)胞可以基于H&E染色后其特定的組織學(xué)外觀進(jìn)行計(jì)數(shù)?？梢越SC隔室損傷的最早直接證據(jù)，從而確定GVHD情況下ISC丟失或潘式細(xì)胞丟失發(fā)生在另一個(gè)之前。
[0115]按照小鼠模型標(biāo)準(zhǔn)，TBI可以作為移植前的條件作用的方法。另外，在接受非清髓性和消融劑量的化學(xué)治療后，可以通過評價(jià)臨床移植患者ISC隔室的損壞來評價(jià)GI上皮的恢復(fù)。所提議的研究強(qiáng)調(diào)以Lgr5的表達(dá)作為ISCs的標(biāo)志，ISCs的功能主要體現(xiàn)在Lgr5+細(xì)胞的體內(nèi)和間接體內(nèi)的干細(xì)胞功能。還有另一種干細(xì)胞表型分析的方法，如⑶44+⑶166+⑶24一細(xì)胞評價(jià)。潘式細(xì)胞構(gòu)成了 SI中的ISC區(qū)位，但是在LI中卻大量缺失，LI中Wnt信號是由區(qū)位支撐的kit+細(xì)胞提供給ISCs。因此，這里描述了研究方法和預(yù)期實(shí)驗(yàn)方法，以評價(jià)GVHD情況下，SI中潘式細(xì)胞?？梢酝ㄟ^ckit+LI區(qū)位細(xì)胞的組織學(xué)評價(jià)對LI進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
[0116]3.體外ISC功能模型中，GVHD造成的隱窩損傷。
[0117]可以通過培養(yǎng)移植后小鼠腸類器官評價(jià)BMT后ISCs。使用基因的、表型的和組織學(xué)的標(biāo)記物使得GVHD情況下ISCs減少(圖3D-E)。可以通過干細(xì)胞體外形成腸類器官的能力對干細(xì)胞進(jìn)行功能性評價(jià)。從大小腸上皮中分離隱窩然后在具有干細(xì)胞生長因子(R-spondinl、EGF、小腸noggin ;R_spondinl、EGF、noggin、HGF 和大腸 Wnt3a)的半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由于每種隱窩包含一種有ISCs和支持型區(qū)位細(xì)胞的功能性干細(xì)胞隔室，間接體內(nèi)培養(yǎng)隱窩生長為具有隱窩芽的類器官，包含了具有體內(nèi)腸道隱窩絨毛結(jié)構(gòu)和中央腔道的腸組織結(jié)構(gòu)(圖6)。另外，作為其ISC能力的有力證據(jù)，SI和LI的單一 Lgr5+細(xì)胞按照這種方式生長可以長出自身區(qū)位細(xì)胞，并由單一細(xì)胞形成類器官38，39。這里所述的allo-BMTs可以通過分離沒有GVHD (僅TCD骨髓)的移植受體和有GVHD (骨髓+T細(xì)胞)的移植受體的SI和LI隱窩進(jìn)行。通過收集BMT后1、3、5、7、10和14天的隱窩可以評價(jià)功能性干細(xì)胞/祖細(xì)胞區(qū)位損傷的動(dòng)力學(xué)。另外，在功能性去除GVHD情況下干細(xì)胞區(qū)位和特異性ISCs條件下，Lgr5-GFP報(bào)道小鼠可以用作移植受體，便于BMT后通過FACS分離單一 I SC，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，來評價(jià)GVHD情況下所分離的I SCs的功能。
[0118]4.GVH反應(yīng)抗干細(xì)胞區(qū)位的體外系統(tǒng)模型。
[0119]內(nèi)臟GVHD表現(xiàn)為腸道疾病，而這顯然是涉及T細(xì)胞激活和迀移的全身性疾病過程達(dá)到巔峰的表現(xiàn)。實(shí)際上，同種異體T細(xì)胞和移植受體上皮細(xì)胞之間出現(xiàn)的直接相互作用是不為所知的。在不將本發(fā)明限制在任何特定的T細(xì)胞介導(dǎo)的干細(xì)胞區(qū)位損傷的機(jī)制下，為了有效檢驗(yàn)其中的機(jī)制并將其形象化，間接體內(nèi)培養(yǎng)下可以進(jìn)行T細(xì)胞與GI上皮細(xì)胞直接相互作用的體外內(nèi)臟GVHD模型實(shí)驗(yàn)。在初步研究中，在同種異體T細(xì)胞存在下，降低了體外培養(yǎng)的隱窩生長為類器官的能力。
[0120]因此，小鼠SI和LI隱窩在同種異體T細(xì)胞存在下可被分離并培養(yǎng)成類器官。隱窩與原始T細(xì)胞、多克隆(抗CD3/抗-CD28)預(yù)活化的T細(xì)胞和隱窩背景小鼠APCs活化的T細(xì)胞一起培養(yǎng)。可以評價(jià)隱窩生長成類器官的能力。這考慮到了對預(yù)活化/抗原呈遞的要求，腸上皮細(xì)胞消除自身而直接激活T細(xì)胞的能力以及CD4和CD8T細(xì)胞功能差異進(jìn)行辨別。類器官可以在光鏡下計(jì)數(shù)，測量試直徑和面積。可通過共聚焦顯微鏡得到高分辨三維圖像。除了培養(yǎng)完整的隱窩，上述實(shí)驗(yàn)可以通過培養(yǎng)從Lgr5-GFP報(bào)道小鼠中分離的單一ISCs與同種異體T細(xì)胞以及測量類器官形成，重復(fù)進(jìn)行?？梢酝ㄟ^GFP表達(dá)直接反映培養(yǎng)的類器官中的ISC，也可以評價(jià)同種異體T細(xì)胞和ISCs之間的相互作用來確定同種異體T細(xì)胞是否可以直接消除I SCs或?qū)ζ涔δ茉斐蓳p傷。
[0121]可選擇地，基于⑶44+⑶166+⑶24—37表型的單一 ISCs可以通過FACS進(jìn)行分離。此外，這樣做的另一個(gè)好處是，可以培養(yǎng)具有額外背景小鼠的細(xì)胞。
[0122]B.評價(jià)干細(xì)胞在GVHD中的消除
[0123]1.評價(jià)BMT之前或之后死亡受體中ISC和區(qū)位細(xì)胞的表達(dá)。
[0124]GVHD中ISCs的缺失可能是由于其區(qū)位提供的潘式細(xì)胞的缺失，或者潘式細(xì)胞的缺失可能是由于其前體ISCs的缺失?？蛇x擇地，可能存在對由同種異體T細(xì)胞攻擊ISC和區(qū)位細(xì)胞介導(dǎo)的ISC隔室的綜合性非特異性損傷。我們假設(shè)ISCs和/或潘式細(xì)胞將表達(dá)在GVHD中其免疫介導(dǎo)消除所涉及的死亡受體。
[0125]在此subaim中，我們可以通過FACS從Lgr5-GFP報(bào)道小鼠和表型的這些細(xì)胞中隔離鼠科1308和潘式細(xì)胞來表達(dá)在6￥^中涉及的潛在死亡受體$&8、了即1?、1?^1?、和01?5)。表達(dá)可在TCD BMT后、在患有GVHD的小鼠內(nèi)的基線處進(jìn)行比較。ISCs和潘式細(xì)胞可以通過在ISCs中GFP表達(dá)和用于潘式細(xì)胞的顆粒狀(側(cè)向散射高)CD24+亮表型(參見圖18E)區(qū)分。我們也可以通過其MHC I型和II型的表達(dá)和其能夠?qū)?xì)胞凋亡提供抗性的分子的表達(dá)(BCL-
2、BCL-6和c-FLIP)比較ISCs和潘式細(xì)胞。
[0126]2.T細(xì)胞的細(xì)胞毒性分子在損傷ISC隔室中的功能。
[0127]T細(xì)胞的細(xì)胞毒性途徑可能涉及GVHD期間ISC隔室的損傷。我們可以測試缺乏以損壞ISCs和其體內(nèi)和體外區(qū)位的細(xì)胞毒性途徑的T細(xì)胞的能力。SI和LI隱窩可與來自缺乏分泌的或細(xì)胞表面死亡受體配體$&^即€[、1?~7、了1^11^)和穿孔素的小鼠同種異體1'細(xì)胞培養(yǎng)并如本文所述評估類器官發(fā)育的數(shù)量和尺寸。然后通過進(jìn)行帶有缺陷的T細(xì)胞的同種異體BMT并組織學(xué)評價(jià)用于ISC和潘式細(xì)胞消除后的BMT在體內(nèi)評估具有在體外損傷隱窩的損傷能力的T細(xì)胞。如果體外同種異體T細(xì)胞/隱窩培養(yǎng)體系是不可靠的，那么潛在死亡配體的影響可以在傳統(tǒng)體內(nèi)GVHD模型中進(jìn)行測試。
[0128]細(xì)胞毒性缺陷T細(xì)胞的使用主要需要使用B6小鼠作為同種異體T細(xì)胞來源，防止使用用于體內(nèi)Lgr5表達(dá)讀數(shù)和用于與缺陷T細(xì)胞一起培養(yǎng)的單個(gè)ISCs的選擇的B6背景Lgr5報(bào)道小鼠。因此，中和抗體可用于阻斷不管是T細(xì)胞還是使用的隱窩株的細(xì)胞毒性途徑，并可能通過FACS基于CD44+CD166+CD24—37表型和與B6背景缺陷T細(xì)胞一起培養(yǎng)隔離ISC。
[0129]3.在BMT后的患者中I SC分子和區(qū)位分子的表達(dá)
[0130]隱窩細(xì)胞凋亡是GIGVHD的標(biāo)志，而且我們已經(jīng)觀察到ISCs和潘式細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)GVHD模型中的缺陷，以及低潘式細(xì)胞計(jì)數(shù)與在患者中增漲的非復(fù)發(fā)死亡率有關(guān)。然而，對臨床GVHD中的ISC和區(qū)位細(xì)胞隔室的具體的損傷知之甚少。因此，我們可以評價(jià)BMT患者內(nèi)ISC相關(guān)分子的表達(dá)。
[0131]為了評估臨床GVHD中ISCs和其區(qū)位細(xì)胞，我們可以評估需要內(nèi)鏡檢查的患者的胃腸道中ISC相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)來評價(jià)移植后GI癥狀。用于研究目的的活檢標(biāo)本可以在MSKCC IRB協(xié)議下從承受臨床指示GI活檢移植后相關(guān)癥狀的患者上得到。對發(fā)現(xiàn)患有活檢證明是GI GVHD的患者和那些沒有GVHD的患者之間的樣品進(jìn)行對比，包括已經(jīng)接受T⑶移植的患者。組織標(biāo)本可以被評價(jià)以表達(dá)如上所述Lgr5、BMI_l、Hopx、mTert、Lrigl、Wnt3和EGF。另外，考慮到我們發(fā)現(xiàn)在GVHD實(shí)驗(yàn)中ISCs的IL-23依賴型IL-22介導(dǎo)型的支持，我們也可以評價(jià)活檢樣品中IL-22和IL-23的表達(dá)。我們還可以對這些樣品進(jìn)行IHC來識別人隱窩中IL-22R的表達(dá)。最后，上述分子的GI表達(dá)可以與他們的內(nèi)鏡檢查當(dāng)天抽的外周血中的表達(dá)對比以評估內(nèi)臟和全身表達(dá)之間的相關(guān)性。
[0132]活檢標(biāo)本也可以通過FACS來評估以識別與上面⑶44、CD166和⑶24染色一起描述的表型識別為ISCs和潘式細(xì)胞的IL-22R表達(dá)?？商娲?，ISCs可以通過原位雜交或用于Lgr5的IF來識別。
[0133]4.對患有GVHD的患者的ISC隔室的功能損傷
[0134]盡管ISC損傷被認(rèn)為是由于GIGVHD內(nèi)發(fā)現(xiàn)隱窩損傷而發(fā)生，且同時(shí)存在用于患有GVHD小鼠ISC損失的數(shù)據(jù)，但是這種類型的損傷沒有在患者中直接證明。我們考慮的是，患有GVHD的患者的可檢測I SCs比未患有GVHD的患者的更少。
[0135]為了評估患有GVHD的人類患者中ISCs的損失，SI和LI隱窩可以從經(jīng)受臨床指示的用于評估移植后GI癥狀的內(nèi)鏡檢查和活檢的患者中分離。從患者的活檢標(biāo)本中分離的隱窩然后可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)以如本文所述用于形成類器官，比較患有或未患有GVHD的患者的類器官子代，以及比較GVHD嚴(yán)重性階段。作為替代方案，我們還可以通過進(jìn)行如上所述的分離ISCs區(qū)位細(xì)胞的FACS來評估ISCs和區(qū)位細(xì)胞的損失。此外，來自MSKCC病理學(xué)系的正常GI組織因此可以被評價(jià)以作為用于對ISC隔室移植相關(guān)影響的陰性對照。
[0136]C.治療GVHD的I SC-支持方法
[0137]我們已經(jīng)確定了IL-22缺乏的小鼠，加劇了GVHD中的ISC損失并在此表明，外源性IL-22給藥增加ISC恢復(fù)。因此，IL-22可以在體外組織體上用作ISC生長因子并在患有GVHD的小鼠內(nèi)用作上皮靶向GVHD治療。
[0138]1.1L-22對體外類器官的影響。
[0139]雖然IL-22在損傷后可以維持上皮完整性，但I(xiàn)L-22對ISC隔室的影響很大程度上是未知的。我們的初步數(shù)據(jù)表明，IL-22R在I SCs上表達(dá)(圖7A)，并且表明對患有GVHD的小鼠給藥IL-22能增加ISCs的恢復(fù)(圖4D)。此外，我們觀察到，IL-22的給藥增加了 ISC的體外增殖(圖7B)，而且與l-5ng/ml rmIL-22共培養(yǎng)的SI和LI隱窩比沒有IL-22培養(yǎng)的隱窩生長形成的類器官大(圖7C-F)。
[0140]IL-22對ISC功能的影響可以通過在開始培養(yǎng)零天或兩天0.1-10ng/ml rIL的存在下培養(yǎng)如上所述的分離的隱窩和ISCs來觀察到。IL-22也可以在培養(yǎng)的第零天加入，然后第二天從培養(yǎng)基上除去。可以對類器官尺寸和數(shù)量進(jìn)行評估，并且還可以通過共聚焦顯微鏡高分辨率圖像進(jìn)行評估。在識別最佳的IL-22的培養(yǎng)條件之后，我們可以培養(yǎng)來自具有IL-22的Lgr5-GFP報(bào)道小鼠的類器官，然后可以通過FACS評估JAK/STAT通信、增殖和抗凋亡分子的表達(dá)。我們還評估了 IL-22對從移植患者分離的人隱窩的影響。
[0141]為開始評估IL-22在調(diào)節(jié)ISC隔室中的作用，鼠小腸(SI)隱窩被分離并與EGF、頭蛋白和R-脊椎蛋白-1 (ENR)—起在存在或不存在重組鼠(rm)IL-22的情況下培養(yǎng)。隱窩與rmIL-22—起培養(yǎng)七天導(dǎo)致類器官的生長實(shí)質(zhì)上比那些與ENR單獨(dú)培養(yǎng)的大(圖7A)。增加的類器官尺寸最早在培養(yǎng)5天之后變明顯。在三維培養(yǎng)條件下生長的類器官二維周長追蹤允許精確地測量類器官的尺寸(圖7B)。與0.5-5ng/ml rmIL-22—起培養(yǎng)導(dǎo)致SI類器官的生長以濃度依賴性方式增加，這可通過周長和表面積測定(圖7C)。雖然與>5ng/ml的rmIL-22—起培養(yǎng)也導(dǎo)致類器官尺寸的增加，但較高濃度的IL-22導(dǎo)致從培養(yǎng)隱窩生長的類器官數(shù)量的減少(數(shù)據(jù)未顯示)。這種毒性依賴于生長信號的累加效應(yīng)，隨著R-脊椎蛋白_l、Wnt3和EGF的濃度增加都進(jìn)一步減小IL-22作為放在培養(yǎng)中隱窩的百分比產(chǎn)生的類器官的植板率。
[0142]除了SI類器官尺寸的增加，與IL-22—起培養(yǎng)導(dǎo)致大腸(LI)類器官周長尺寸和表面積的增加(圖7D)<JSCs位于類器官發(fā)育過程中生長的隱窩芽內(nèi)。IL-22培養(yǎng)導(dǎo)致在SI和LI類器官中隱窩芽的顯著變大(圖7A，E)，表明干細(xì)胞隔室再生的結(jié)構(gòu)證據(jù)。此外，重組人IL-22 二聚體蛋白能夠增加 SI 和 LI 類器官的尺寸 (圖 7F，G)，表明該化合物的平移潛能。
[0143]組3ILCs是腸道細(xì)菌感染期間在腸炎中和在BMT13-16之后的GI IL-22的主要來源。為確定ILCs是否能夠調(diào)節(jié)ISC隔室并增強(qiáng)類器官的生長，CD45+CDllb-CDllc-B220-CD3-CD90+細(xì)胞從腸固有層分類，并在具有新鮮分離SI隱窩的基質(zhì)膠中培養(yǎng)。ENR為類器官發(fā)育提供基本信號，且包括IL-23的細(xì)胞因子混合物被包括來激活I(lǐng)LCsdLC激活細(xì)胞因子單獨(dú)的存在對SI類器官的生長沒有影響。然而，與ILCs共培養(yǎng)導(dǎo)致類器官尺寸的增加(圖7H)，證明ILCs體外調(diào)節(jié)ISC隔室和上皮再生的潛能。
[0144]我們接下來評價(jià)類器官中由IL-22激活的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。雖然Wnt/β-連環(huán)蛋白信號對ISC維護(hù)和體外12類器官功能是必不可少的，但是我們發(fā)現(xiàn)在與IL-22—起培養(yǎng)的SI類器官內(nèi)沒有分子產(chǎn)生以Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑增加的證據(jù)，包括在Wnt3、i3-連環(huán)蛋白或Axin 2方面的表達(dá)沒有差異(圖16A)。盡管最近發(fā)現(xiàn)Slit2和Robol可調(diào)節(jié)ISC從化療和輻射17誘導(dǎo)的損傷恢復(fù)，但是我們還發(fā)現(xiàn)與IL-22培養(yǎng)后，它們的表達(dá)無明顯差異(未示出)。然而，與rmIL-22—起培養(yǎng)的類器官導(dǎo)致用于Reg3f3和Reg3 γ的mRNA的增加(圖16Β)，表達(dá)依賴于STAT3信號的固有抗菌分子。
[0145]雖然已報(bào)道STAT3對ISC的維護(hù)是重要的，但對ISCs內(nèi)JAK/STAT信號的了解較少。我們通過光子流(phosflow)評價(jià)SI類器官中STAT3信號并發(fā)現(xiàn)IL-22導(dǎo)致STAT3Y705的磷酸化(圖16C)。此外，與STAT3抑制劑Stattic—起培養(yǎng)顯著損害SI類器官的生長(圖160)。1^5+ ISC可以在體內(nèi)和體外生成所有細(xì)胞類型的成熟腸上皮細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測從Lgr5-GFP報(bào)道小鼠分離的SI隱窩細(xì)胞表明GFP+ISCs內(nèi)STAT3Y705磷酸化響應(yīng)IL-22的體外刺激(圖16E)，從而證明在Lgr5+細(xì)胞內(nèi)IL-22的通信。
[0146]為確定在ISCs中的IL-22依賴型通信是否在功能上重要，我們通過熒光激活細(xì)胞分選分離Lgr5-GFP ISC，并在基質(zhì)膠中在標(biāo)準(zhǔn)條件+/-1L-22下培養(yǎng)單個(gè)ISCs。僅培養(yǎng)4天后，IL-22導(dǎo)致早期類器官的芽顯著變大(圖16F)，最終在IL-22的存在下開始培養(yǎng)單個(gè)ISCs之后，導(dǎo)致類器官尺寸增加(圖16G)。因此，IL-22可對單個(gè)ISCs起作用以激活STAT3磷酸化并加速類器官的生長。
[0147]因?yàn)镮L-22導(dǎo)致類器官尺寸增加、隱窩出芽和STAT3活化，所以我們接下來試圖確定這是否導(dǎo)致ISCs的膨脹。我們評估摻入與IL-22—起培養(yǎng)的類器官的5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(EDU)，是因?yàn)橛肊dU進(jìn)行一小時(shí)短孵育類器官已顯示標(biāo)記了快速循環(huán)CBC細(xì)胞的S-相。IL-22導(dǎo)致類器官EdU摻入的增加，表明類器官隱窩內(nèi)的增殖增強(qiáng)(圖16H)。此外，培養(yǎng)衍生自具有IL-22的Lgr5-GFP報(bào)道小鼠的類器官表明Lgr5_GFP高ISC膨脹以響應(yīng)IL_22(圖161)。最后，連續(xù)傳代證明與IL-22—起培養(yǎng)后可能產(chǎn)生類器官數(shù)量的增加，進(jìn)一步表明功能性的ISC隔室的膨脹(圖16J)。
[0148]從半固體培養(yǎng)基中純化的培養(yǎng)的類器官的FACS可能具有高的染色背景并可能難以解釋。在這種情況下，類器官生長+/_的IL-22可以通過基因表達(dá)對增殖和細(xì)胞凋亡進(jìn)行評估。此外，經(jīng)IL-22處理后，可以進(jìn)行微陣列來全面評估隱窩基因的表達(dá)。
[0149]2.給藥IL-22對體內(nèi)GVHD的影響
[0150]此處提到的ISC生物學(xué)發(fā)展成治療方法以改善ISC作為用于GVHD的上皮細(xì)胞靶向治療的功能。之前數(shù)據(jù)表明，由于IL-22-產(chǎn)物ILCs的缺失，IL-22產(chǎn)物在GVHD受到損傷(圖2)，并且當(dāng)通過給藥rmIL-22重新引入IL-22到患有GVHD的小鼠體內(nèi)可以降低腸道的GVHD病理及增加ISC的恢復(fù)(圖4)。此外，IL-22途徑似乎不顯示為GVL的組件，如給藥rIL-22治療的小鼠中IL-22K0 T細(xì)胞以及WT T細(xì)胞在抗A20淋巴瘤腫瘤細(xì)胞方面表現(xiàn)效果和GVL相當(dāng)。(圖8A，B)0
[0151]我們獲得了臨床級人類的IL-22 二聚體，F(xiàn)-652(Generon(上海)有限公司)，它可以和老鼠IL-22R進(jìn)行交叉反應(yīng)。與重組的IL-22相比使用IL-22 二聚體的潛在的好處包括臨床轉(zhuǎn)化的應(yīng)用還有增加的半衰期，如美國專利申請US2003/0100076描述，在此全文以引證的方式并入本文。我們發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)中F-652能夠促進(jìn)器官的生長(圖7F，G)。因此，除了進(jìn)一步對類器官生長的影響，在體外培養(yǎng)中我們還測試了 IL-22 二聚體在ISC恢復(fù)、GVHD病理和生存以及GVL等方面的效果。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，IL-22二聚體的使用是考慮具有涉及炎癥性胃腸組織癥狀的治療患者，該炎癥性胃腸組織包括但不限于照射、放射治療、化療、炎癥性腸病、結(jié)腸炎、克羅恩病、自身免疫疾病、傳染病和移植物抗宿主病。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，IL-22二聚體的使用是其對手術(shù)患者預(yù)防性的治療，其包括但不限于輻射照射、化療、組織移植、細(xì)胞移植，包括處于涉及胃腸組織炎癥的癥狀風(fēng)險(xiǎn)的患者，這類患者包括但不限于輻射患者、化療患者、傳染病患者、移植患者、自身免疫性疾病患者等。
[0152]Allo-BMT的表現(xiàn)可以如上述Lgr5LacZ報(bào)道小鼠作為miHA和MHC不匹配模型的受體一樣。受體可以在移植前和/或移植后通過F-652人的IL-22 二聚體移植治療，然后骨髓移植后三周將小鼠處死評價(jià)GVHD病理和ISC恢復(fù)。Allo-BMT WT受體可以用于并評估經(jīng)F-652治療后GVHD的生存差異，而且我們可以移植患有血液惡性腫瘤的小鼠(如圖8)來評價(jià)經(jīng)F-652治療后的GVL的療效。在免疫抑制劑存在的情況下給藥IL-22可能對提高ISC的功能最有效，我們也會(huì)評價(jià)F-652與靶向抗IL-23中和抗體一起給藥的結(jié)合。描述了 IL-23刺激同種異體T細(xì)胞介導(dǎo)GVHD的作用以及將IL-23阻擋在GVHD的潛在優(yōu)勢。然而，抗IL-23中和抗體是防止T細(xì)胞引起GVHD，我們將限制內(nèi)源性IL-22的表達(dá)產(chǎn)物。因此，這種組合的方法可以起到限制T細(xì)胞通過阻擋IL-23介導(dǎo)GVHD同時(shí)也會(huì)增加由于GVHD和IL-23中和而失去的IL-22來促進(jìn)ISC功能。雖然IL-23中和反應(yīng)是GVHD的潛在的治療方式，但它不是治療GVHD的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。
[0153]初步數(shù)據(jù)表明，IL-22可能通過直接刺激ISC增殖來減少GVHD，而不是通過靶向ISC支持潘式細(xì)胞來間接支持ISC(圖4，7)。這些發(fā)現(xiàn)并不限制本發(fā)明為任何具體機(jī)制。因此，另一種方法是如已在結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ兔枋龅耐ㄟ^將分離的I SC或完整隱窩轉(zhuǎn)移到患有GVHD的小鼠中來測試新的干細(xì)胞。
[0154]最近描述了患有GVHD的小鼠中減少的ISC和區(qū)位細(xì)胞形成的潘式細(xì)胞數(shù)量。IL-22治療后給出了穩(wěn)定的同種異體免疫，我們下一步直接評價(jià)了 IL-22對ISC隔室的影響。我們利用Lgr5-LacZ受體進(jìn)行了 LP—B6同種異體BMT以識別移植治療后的ISC AMT三周后，帶有T細(xì)胞的BMT導(dǎo)致GVHD而且導(dǎo)致Lgr5+SI ISC損傷嚴(yán)重(圖18a)。然而，rmIL-22的日常治療導(dǎo)致LGR5+ISC恢復(fù)增加甚至伴隨不間斷的同種異體免疫反應(yīng)而沒有免疫抑制(圖18A)。
[0155]為了了解IL-22如何導(dǎo)致患有GVHD的小鼠中ISCs的增加，我們用LP骨髓和T細(xì)胞移植了B6Lgr5-GFP報(bào)道小鼠。受體每天經(jīng)rmIL-22或者I3BS IP處理七天，然后分離SI隱窩并且通過流式細(xì)胞術(shù)在BMT后14天評價(jià)。與我們的體外發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，促進(jìn)細(xì)胞器的增長和EdU的摻入，rmIL-22體內(nèi)治療后Lgr5-GFP+細(xì)胞表達(dá)增加了 K1-67，這表明該治療方法增強(qiáng)了 ISC隔室的增殖(圖18B)。
[0156]潘式細(xì)胞通過向CBC干細(xì)胞傳遞Wnt和EGF信號為Lgr5+ISCs提供了良好的微環(huán)境。此外，IL-22被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)潘式細(xì)胞和天然抗菌分子的產(chǎn)物。因此，我們假定IL-22給藥可以通過提高干細(xì)胞區(qū)位和增強(qiáng)潘式細(xì)胞介導(dǎo)的ISC支持來支持BMT后ISC的恢復(fù)。與臨床GVHD和MHC不匹配的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯肯嘁恢?，LP—B6最小抗原錯(cuò)配BMT導(dǎo)致移植三周后潘式細(xì)胞減少(圖18C)。然而，盡管組織病理學(xué)減少(圖17A)，BMT后的rmIL-22給藥沒有促進(jìn)潘式細(xì)胞的恢復(fù)(圖18C)。此外，我們發(fā)現(xiàn)對于潘式細(xì)胞的傳遞分子Wnt3和EGF在SI mRNA中并沒有增加，而已知Wnt3和EGF是支持Lgr5+ISCs的(圖18D)。我們還發(fā)現(xiàn)在基線或輻射損傷后IL-22R在潘式細(xì)胞中表達(dá)的極少證據(jù)，而在其他情況下他們還可以對IL-22作出反應(yīng)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中潘式細(xì)胞響應(yīng)IL-22時(shí)沒有表現(xiàn)出STAT3磷酸化作用(圖18E)。
[0157]盡管IL-22沒有提高潘式細(xì)胞的區(qū)位-支撐能力，但是IL-22在體內(nèi)仍然可以間接通過增加基質(zhì)介導(dǎo)的干細(xì)胞來促進(jìn)I SC增殖。最近表明，即使在缺失潘式細(xì)胞衍生物Wnts33的情況下，基質(zhì)細(xì)胞可以有助于維持ISC區(qū)位，通過Wnts和R-脊椎蛋白-3支持體內(nèi)正常腸道平衡。但是，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)IL-22治療后，我們沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)位衍生的Wnt信號增加的證據(jù)(圖18F、G)，這表明免疫介導(dǎo)損傷后IL-22可以誘導(dǎo)ISC的增值，而不通過潘式細(xì)胞和基質(zhì)衍生的干細(xì)胞區(qū)位作用。
[0158]最后，明確給出了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中IL-22在促進(jìn)ISC再生和上皮細(xì)胞恢復(fù)方面的效果，我們評估了 IL-22給藥在全身性GVHD中的影響。已經(jīng)有人提出了GI損傷是主要的全身性GVHD發(fā)病機(jī)制。與最近的一篇關(guān)于IL-22被用在移植手術(shù)中的報(bào)道一致，我們發(fā)現(xiàn)F-652給藥到MHC未匹配BMT的受體后GVHD死亡率并沒有改善(未示出)。但是，我們發(fā)現(xiàn)MHC匹配的同種異體BMT后一周，F(xiàn)-652早期干預(yù)的模型可以減少GVHD的全身癥狀而且可以顯著提高總存活數(shù)(圖18H，I)。
[0159]I1.1L-22+乳酸桿菌作為新型的預(yù)防和治療臨床GVHD的靶向治療方法。
[0160]作為IL-22的藥物介入的替代方法，如外源性IL-22，我們開發(fā)了乳酸菌的益生菌的策略，可以不間斷的產(chǎn)生IL-22，如下面和實(shí)驗(yàn)部分所示。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，外源IL-22 用于和益生菌結(jié)合的治療方法。在另一個(gè)實(shí)施例中 ，給予患者外源性 IL-22 和益生菌。在初步研究中，對BMT后的小鼠施用本發(fā)明的益生菌可以減少全身性GVHD。
[0161]因此，IL-22+乳酸桿菌被設(shè)想作為一種新型的靶向治療方法用于預(yù)防臨床GVHD和移植相關(guān)的組織損傷，而不限制基本的供體免疫功能。施用乳酸桿菌可以降低實(shí)驗(yàn)性的GVHD。而且，副干酪乳桿菌(Lactobaci I Ius paracasei)是人體胃腸道菌群的正常組成部分。因此，發(fā)明人考慮使用工程副干酪乳桿菌傳遞外源性IL-22治療劑量以提供額外的治療效益。事實(shí)上，結(jié)合初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，接下來A部分介紹制備和使用IL-22表達(dá)細(xì)菌顯示內(nèi)源性IL-22產(chǎn)生的減少。在B部分詳細(xì)介紹了 IL-22+乳酸桿菌(包括成熟的實(shí)驗(yàn))的制備和使用的材料和方法。
[0162]A.HCT降低內(nèi)源性IL-22在小鼠體內(nèi)的表達(dá)
[0163]HCT的IL-22-/-K0受體證實(shí)輕微(圖1A)和較多(圖1B)抗原不匹配的HCT后增加死亡率，如同經(jīng)抗IL-22中和抗體全身性處理的野生型(WT)受體(圖1C)。移植到IL-22K0受體導(dǎo)致GI和肝GVHD的組織病理學(xué)證據(jù)的增加(圖2A)。因此，宿主來源的IL-22會(huì)影響死亡率和移植后GVHD的病理狀態(tài)。
[0164]IL-22的表達(dá)是同種異體HCT后在胃腸道(圖2B)和血清(圖2E)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。但是，IL-22的水平在GVHD中是降低的(圖2B、E)。腸的IL-23在HCT后也的得到了表達(dá)，IL-23為IL-22表達(dá)的樹突狀細(xì)胞衍生的調(diào)節(jié)子。IL-22產(chǎn)物CD45+CD3—RORyt+ILC是在T細(xì)胞耗盡(TCD)HCT后在固有層檢測出來的(圖2G)。這些ILC是宿主衍生物IL-7R+CCR6+NKp46—淋巴組織誘導(dǎo)物類細(xì)胞。盡管其抗輻射性，在GVHD期間IL-22生產(chǎn)ILC被迅速消除(圖2G)。因此，來自宿主的IL-22可以降低GVHD的死亡率，但是由于宿主ILC的消除IL-22對損傷的反應(yīng)在GVHD中得到了抑制。
[0165]盡管宿主IL-22缺乏增加GVHD(圖1A-C和2A)，在IL-22K0受體中供體淋巴細(xì)胞腸滲透或細(xì)胞因子的分泌中并沒有觀察到明顯的差別，這表明在GVHD的降低發(fā)生并不受同種異體反應(yīng)供體的免疫調(diào)控的影響。通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)測試腸IL-22R的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HCT后GI上皮細(xì)胞上IL-22R的增加。
[0166]免疫組化(IHC)和免疫熒光(IF)表明IL-22R在腸隱窩表達(dá)，ISC區(qū)位存在于腸隱窩(圖3A-C)。同種異體HCT移植到Lgr5LacZ報(bào)道小鼠，然后Lgr5下游產(chǎn)生β-半乳糖苷酶來鑒別ISC。作為ISC功能的證據(jù)，單個(gè)LGR5+隱窩基底柱狀細(xì)胞(CBC)能夠在體外和體內(nèi)生成整個(gè)隱窩結(jié)構(gòu)。在GVHD中觀察到了 I SC的急劇減少(圖3D)。此外，在非報(bào)道WT小鼠中通過IHC評價(jià)I SC區(qū)位，證實(shí)了在GVHD中CBC/1 SC損失(圖3Ε)。引人注目的是，在GVHD中，I L_2 2Κ0受體證明了 CBC/I SC的最大損失(圖3Ε)以及隱窩上皮細(xì)胞凋亡的增加(圖3F)，這表明IL-22保護(hù)I SC和祖細(xì)胞。最后，患有GVHD的IL-22K0小鼠證明降低IL-22調(diào)節(jié)的抗菌分子Reg3ya和Reg3f3的GI表達(dá)，還能增加口服后血清非吸收性碳水化合物FITC-葡聚糖易位(圖3G)，這表明增加了上皮屏障的損傷。
[0167]因此，GI損傷導(dǎo)致IL-23感應(yīng)。IL-23反過來又可以通過ILC刺激IL-22的產(chǎn)生。這種內(nèi)源IL-22保護(hù)上皮細(xì)胞和干/祖細(xì)胞而不受炎性組織損傷。然而，在GVHD中IL-22-產(chǎn)生ILC喪失了限制組織損傷的必要性。如本文所示，HCT后腹腔注射IL-22(例如，4ug/小鼠每日)扭轉(zhuǎn)ILC枯竭效應(yīng)和在腸道中IL-22在GHVD病理學(xué)中的損失并減少在ISC/祖細(xì)胞室位于的腸隱窩中細(xì)胞凋亡(圖12A-B)。但是，對于臨床使用全身細(xì)胞因子給藥是昂貴的，并可能會(huì)有不可預(yù)期的全身反應(yīng)。因此，發(fā)明人制備了兩株連續(xù)生產(chǎn)IL-22的副干酪乳桿菌(圖12C-D)。一株產(chǎn)生可分泌的IL_22(乳酸-22s)而另一株產(chǎn)生IL-22固定在細(xì)菌細(xì)胞表面(乳酸-22a)。
[0168]B.1L22+乳酸桿菌治療GVHD
[0169]如本文所述，發(fā)現(xiàn)這種IL-22缺乏可以導(dǎo)致GVHD的增加(圖1到3)，IL-22介導(dǎo)使GVHD減小(圖12)，!1(:1'后11^-22-依賴型誘導(dǎo)抗菌分子，幾-22使用在此描述的本發(fā)明的lacto-22s和lacto-22a細(xì)菌在HCT后給藥。兩株乳酸桿菌與HCT—起給藥(圖12E)。小鼠接受骨髓和T細(xì)胞al1-HCT以引發(fā)GVHD。從移植第一天開始，給小鼠灌胃18-1O9計(jì)量的再懸浮在PBS中的野生型副干酪乳桿菌(乳酸-WT)、乳酸-22s或乳酸-22a，或單獨(dú)灌胃I3BS直到HCT后30天。GVHD導(dǎo)致灌胃PBS的小鼠大量死亡。雖然乳酸-WT有提高小鼠存活率的趨勢，但由于GVHD這些小鼠的因死亡率依然很高。
[0170]相反，接受乳酸-22s或乳酸-22a的小鼠和沒有T細(xì)胞移植的小鼠相比沒有明顯不同的死亡率。此外，從重量，毛皮質(zhì)量，皮膚完整性，姿勢和活動(dòng)的評估來看接受lacto_22s的小鼠明顯降低了GVHD的臨床評分。而HCT后小鼠重量的改變可以作為GI GVHD的替代指標(biāo)，這些研究結(jié)果的系統(tǒng)性表明，GI保護(hù)可能是預(yù)防全身性疾病免受GVHD的關(guān)鍵。
[0171]如上所述方法，完成了 T細(xì)胞耗盡的MHC匹配的allo-HCT，而且每天給小鼠灌胃乳酸-WT、乳酸-22s和乳酸-22a。另外，用于IL-22的PCR技術(shù)被考慮用在受體腸道以證實(shí)在胃腸道內(nèi)存在乳酸-22。從病人臨床表現(xiàn)來看MHC相匹配的allo-HCT模型最符合移植，基于MHC移植供體優(yōu)先被選擇出來去匹配受體。另外，進(jìn)行了 HCT三周后將小鼠處死評估GVHD病理學(xué)和隱窩細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)。為了直接測試乳酸-22對ISC的影響，如上所述Lgr5-LacZ小鼠作為受體進(jìn)行移植將評價(jià)Lgr5+ISC的消除。施用乳酸-22比rIL-22安全而且能夠減小GI疾病，降低死亡率。
[0172]乳酸菌生產(chǎn)的IL-22對腸上皮細(xì)胞的影響
[0173]經(jīng)乳酸-22治療的小鼠可以降低GVHD死亡率及相應(yīng)的癥狀。因此完成通過ELISA檢測血清中全身性IL-22含量進(jìn)而確定乳酸-22對腸上皮細(xì)胞的影響的實(shí)驗(yàn)。通過ELISA檢測組織勻漿樣本中的IL-22以及通過IHC和western印記檢測腸磷酸化STAT-3方法評估IL-22在組織內(nèi)的后續(xù)影響。最后，如果灌胃乳酸桿菌可以滲透到上皮可以通過電鏡拍照。另外，培養(yǎng)來自移植小鼠血液或組織勻漿的乳酸菌以確定細(xì)菌是否進(jìn)入體循環(huán)。乳酸-22攜帶抗氯霉素基因在培養(yǎng)條件下可以幫助正確識別乳酸-22。
[0174]乳酸-22對供體T細(xì)胞和受體菌群的影響
[0175]BALB/c al lo-HCT中的B6HCT小鼠每天被灌胃乳酸-WT和乳酸-22。供體骨髓來自⑶45.1，且T細(xì)胞來自WT B6 (⑶45.2+)，以通過流式細(xì)胞術(shù)幫助鑒別供體T細(xì)胞。測量了脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和腸固有層內(nèi)供體T細(xì)胞的膨脹還包括效應(yīng)-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比率。我們也將評估活性/記憶標(biāo)記的供體T細(xì)胞表達(dá)和包括Fas配體的細(xì)胞毒性效應(yīng)分子。血清及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，我們將采用PCR檢測上皮組織IL-22(Reg3 γ和Reg3i3)誘導(dǎo)的天然抗菌分子的表達(dá)。IL-22作為抗菌劑后續(xù)可能對菌群有影響，而且施用的乳酸桿菌本身的存在對菌群也有深遠(yuǎn)的影響，為了評估給藥乳酸-22后的微生物多樣性我們將進(jìn)行如我們最近發(fā)表的16S rDNA測序。
[0176]乳酸-22對GVL的影響
[0177]鑒于IL-22R在非造血細(xì)胞的表達(dá)的限制，乳酸-22不能抑制GVL或促進(jìn)造血腫瘤的生長。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則對乳酸-22潛在的臨床移植是很重要的。體內(nèi)rIL-22治療后IL-22K0供體T細(xì)胞或者WT T細(xì)胞的初步實(shí)驗(yàn)在GVL能力方面沒有表現(xiàn)出明顯差異(圖8A-B)。因此，乳酸-22對GVL的影響可以通過標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行T細(xì)胞充滿HCT來測量(A20、EL4)?？梢员O(jiān)測小鼠的腫瘤進(jìn)展和相關(guān)的發(fā)病率/死亡率。此外，通過生物熒光監(jiān)測腫瘤的生長。
[0178]雖然實(shí)驗(yàn)有效，HCT與腫瘤細(xì)胞系代表一種與重新(denovo)惡性腫瘤臨床移植疑似直接相關(guān)的模型。因此，我們已開發(fā)了針對混合系白血病(MLL)相關(guān)的急性髓細(xì)胞白血病(AML)的GVL實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?圖8C)。涉及MLL基因的重排與移植的研究是非常相關(guān)的，因?yàn)樗鼈冊谥委烝ML相關(guān)疾病中是非常普遍的，攜帶一個(gè)不良臨床預(yù)后，并且是allo-HCT的暗示31。乳酸-22灌胃后，將通過由MLL-AF9轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)的AML測量GVL。該高風(fēng)險(xiǎn)繼發(fā)性白血病的模型比腫瘤細(xì)胞系更真實(shí)地反映臨床疾病。因此可以通過移植效果和在外周血、脾臟、骨髓內(nèi)GFP報(bào)道表達(dá)監(jiān)測腫瘤的發(fā)展。
[0179]實(shí)驗(yàn)
[0180]提供以下實(shí)施例是為了證明并進(jìn)一步說明某些優(yōu)選的實(shí)施方案和本發(fā)明的各方面，這不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制其范圍。
[0181 ]在下面的實(shí)驗(yàn)公開中，應(yīng)用以下縮寫:N(正常)；M(摩爾的)；mM(毫摩爾的)；μΜ(微摩爾的);mol (摩爾);mmol(毫摩爾);μπιο1(微摩爾);nmol(納摩爾);pmol(皮摩爾)；g(克)；mg(毫克);yg(微克)；ng(納克)；I或L(升);ml(毫升);μ1 (微升)；cm(厘米);mm(毫米);μπι(微米);nm(納米)；度.C.(攝氏度;Gy(戈瑞)和cGy(厘戈瑞)。
[0182]實(shí)施例1
[0183]此實(shí)施例描述了本文所用的材料和方法。
[0184]材料和方法:
[0185]C57BL/6(CD45.2B6，H_2b)、B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(CD45.lB6con_genic，H-2b)、11 12b-/-B6、BALB/c (H_2d)和LP (H_2b)小鼠是從 Jackson實(shí)驗(yàn)室獲得。B6和BALB/c1122-/-小鼠由Genentech提供，其是抗-1L-22中和抗體8E11 C3LgrS-LacZ和Lgr5-GFP B6小鼠由H.Clevers (Barker等人，2007)提供。如先前所述(Petrovi c等人，2004)進(jìn)行BMT過程，BALB/c宿主接受骨髓(5x 106)的分劑量致死輻射為850cGy，耗盡抗Thy-1.2和低-TOX-Mrabbi t補(bǔ)充體(Cedarlane實(shí)驗(yàn)室)的T細(xì)胞，或者也可以用I 10cGy分劑量致死輻射接受T細(xì)胞耗盡骨髓(5\106)的86宿主。供體1'細(xì)胞(一般為1\10686或知1061^，除非另有說明)，通過收集供體脾細(xì)胞并經(jīng)尼龍毛通道(通常>70%的T細(xì)胞純度)或經(jīng)⑶5的Miltenyi MACS純化(通常>90 %純度)使T細(xì)胞富集來制備，用于移植。對受體小鼠的生存和臨床GVHD癥狀進(jìn)行監(jiān)測并且如前所述處死受體小鼠用于盲人組織病理學(xué)和流式細(xì)胞分析(Petrovic等人，2004)。對于嵌合的實(shí)驗(yàn)，CD45.1B6同類系小鼠經(jīng)致死劑量照射并與野生型或IL22-/-⑶45.2骨髓重組。三個(gè)月后，供體重組是通過用于⑶45.1與⑶45.2對比的外周血的FACS來確定，且嵌合小鼠再次被照射(900cGy，分劑量)，并用LP骨髓(10X106)和T細(xì)胞(3 X 106)移植。
[0186]小鼠。
[0187]C57BL/6(CD45.2B6，H-2b)和 LP(H-2b)小鼠是從 Jackson 實(shí)驗(yàn)室(美國巴港)獲得。B6Lgr5-LacZ 和 B6Lgr5-gfp-1res-CreERT2 (Lgr5-GFP)小鼠由H.Clevers 提供。小鼠在 MSKCC無病原設(shè)施中每個(gè)籠子有5個(gè)的微隔離籠中飼養(yǎng)，并接受標(biāo)準(zhǔn)食物和蒸壓無菌飲用水。小鼠的維護(hù)和過程根據(jù)紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心(MSKCC)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的機(jī)構(gòu)協(xié)議指導(dǎo)完成。
[0188]隱窩隔離和細(xì)胞分離。
[0189]腸隱窩的隔離和用于流式細(xì)胞分析的細(xì)胞的分離很大程度上如前所述進(jìn)行。簡單地說，通過CO2窒息使小鼠安樂死后，收集小腸和大腸，將器官縱向打開并清洗。小腸已經(jīng)在5mM的乙二胺四乙酸(EDTA)中孵育60分鐘或在1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)中孵育25分鐘(4°C)以解離隱窩；大腸在4型膠原酶(Worthington)中孵育30分鐘(37°C)。收集含有隱窩的上清液。為使隱窩分解成單個(gè)細(xì)胞，隱窩沉淀物進(jìn)一步在補(bǔ)充有0.8KU/ml DNasel(羅氏藥業(yè))的IX trypLE快速(Gibco公司，生命技術(shù))中孵育。用于提取RNA的解離的隱窩在Iml試劑盒(英杰公司)中懸浮并在-80 0C中儲(chǔ)存。
[0190]類器官培養(yǎng)。
[0191 ] 每孔400隱窩于4°C在液化生長因子減少的基底膠(康寧公司)(25 %高級的DMEM/Fl2培養(yǎng)基(胎牛血清)；75%生長因子減少的基質(zhì)膠)中懸浮。然后，它們以50yL小腸液滴、30yL大腸液滴的方式在預(yù)熱的δ-表面Nunc 24孔板涂覆，每個(gè)液滴含有約100-500隱窩。基質(zhì)膠液滴聚合后，500μ1完整隱窩培養(yǎng)基加入到小腸隱窩培養(yǎng)物中(ENR-介質(zhì):先進(jìn)DMEM/卩12(3丨811^)、2111]\1的1^-谷氨酰胺(3丨811^)、10111]\1 HEPES(Sigma)、100U/ml青霉素/100yg/ml鏈霉素(Sigma)、lmM N-乙酰半胱氨酸(Sigma)、I XB27添加劑(英杰公司)、I XN2補(bǔ)充物(英杰公司)、50ng/ml mEGF(派普泰克)、100ng/ml的mNoggin(派普泰克公司制)和人源R-脊椎蛋白-1-轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的10%人源R-脊椎蛋白-1條件培養(yǎng)基。在一些評估芽的實(shí)驗(yàn)中，hR-脊椎蛋白-1的濃度降低到1.25-5%。大腸隱窩在除了上述的蛋白質(zhì)和1%牛血清白蛋白(Sigma),還含有50 %的Wnt3a條件培養(yǎng)基的WENR-培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對于大腸培養(yǎng)物，將1uM58202190(5丨81^，0311^.57067)和40(5抑制劑(483-01，1'0(^丨8)加入到'^謝中。所有孔板在37°C/5%⑶2下孵育，且培養(yǎng)基每隔2-3天更換。對照孔板不進(jìn)行處理，如果適用，處理孔板隨著培養(yǎng)基的變化，接收不同濃度的重組鼠(rm)IL-22(金斯瑞)。隱窩在第七天用血清移液管機(jī)械地破壞它們來傳代，通過在過量介質(zhì)中旋下隱窩來洗掉基質(zhì)膠，并在形成沉淀后在液化基質(zhì)膠上使它們連接起來。我們還測試了由中國Generon(上海)股份有限公司提供的F-652的影響，F(xiàn)-652是重組人源IL-22二聚體分子。在一些實(shí)驗(yàn)中，類器官在Stattic(STAT3三抑制劑化合物、6-硝基苯并[b]噻吩-1，1-二氧化物;Tocris生物科技)存在的情況下從隱窩培養(yǎng)。
[0192]使用修飾的隱窩解離協(xié)議將腸干細(xì)胞從LgR5-GFP小鼠中分離，該協(xié)議使用30mMEDTA3，4 20分鐘，然后若干過濾步驟和使用TrypLE孵育5分鐘并渦流0.8分鐘以下以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。Lgr5-GFP高細(xì)胞通過熒光激活細(xì)胞分選分離。5000ILCS在30yL生長因子減少的基質(zhì)膠液滴中涂覆并在介質(zhì)中含有1yM rho-激酶抑制劑Y-27632、在基質(zhì)膠中含有Ιμπι鋸齒狀I(lǐng)凹口配體(Anaspec)和rho激酶抑制劑(1ym)的WENR中培養(yǎng)。I SC培養(yǎng)物在沒有來自D4的Wnt的情況下培養(yǎng)。
[0193]對于先天淋巴樣細(xì)胞(ILC)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，腸淋巴細(xì)胞從小腸固有層分離。清洗小腸片段后，添加20ml/小鼠預(yù)熱EDTA/IEL溶液(含有5 %FBS的IxPBS，1mM Hepes緩沖液，I %青霉素/鏈霉素康寧，I %L-谷氨酰胺(Gibco)，ImM EDTA和ImM DTT溶液，隨后將樣品置于37°C震蕩培養(yǎng)箱中15分鐘。對樣品(ΙΟΟμπι)進(jìn)行染色并將其置于膠原酶溶液(RPMI 1640,5%FCS ,1 OmM 11叩^，1%?5，1%谷氨酰胺和11^/1111膠原酶4(羅氏)和仏8/1111 DNAse 1(羅氏)，并置于37°C震蕩培養(yǎng)箱中10分鐘。之后，將樣品在1500rpm下離心五分鐘，并用不含酶的RPMI溶液清洗。幾次清洗后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至40%PerColl溶液(RPMI包Percoll)，其在80%PerColl溶液上覆蓋。旋轉(zhuǎn)含有固有層界面后，吸出單核細(xì)胞并在介質(zhì)中清洗。然后用細(xì)胞外標(biāo)記物和用于生存的Topro 3對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行染色。ILCs經(jīng)挑選并分類為1'0?103-、8220-、001113-、0)11(3-、0)45+、0)3+和0)90.2+細(xì)胞。在基質(zhì)膠中每孔用400隱窩涂覆 lOOOILCs。為了與 ILCs 共培養(yǎng)，將 rmIL-2(1000y/ml)、rmIL-15(10ng/mlWPrmIL-7(50ng/ml)和rmIL-23(50ng/ml)添加到ENR培養(yǎng)基中。共培養(yǎng)物與在含有ENR且沒有ILCs存在的細(xì)胞因子中培養(yǎng)的隱窩對比。
[0194]骨髓移植。
[0195]如先前所述進(jìn)行骨髓移植(BMT)過程。使用少數(shù)組織相容性抗原-不匹配骨髓移植模型(1^—86，!1-2|3^1-2|3)。年齡為8到10周的雌性86￥1'小鼠典型地用作移植受體。隔離接受I 10cGy分次劑量致死照射3-4小時(shí)的受體小鼠(550cGy X 2)以減少胃腸道毒性。為從安樂死供體小鼠得到LP骨髓細(xì)胞，無菌收集股骨和脛骨并用無菌培養(yǎng)基洗出骨髓管。骨髓細(xì)胞是通過使用抗Thyl.2和低-TOX-M兔子補(bǔ)充體(Cedarlane實(shí)驗(yàn)室)孵育耗盡T細(xì)胞。通過剩余污染性T細(xì)胞的定量對T細(xì)胞耗盡的骨髓進(jìn)行純度分析。T細(xì)胞的污染通常約為單輪補(bǔ)充體消耗后所有白細(xì)胞的0.2%和第二輪后的0.1%。通過從安樂死供體小鼠無菌收集脾細(xì)胞來制備LP供體T細(xì)胞。使用MACS系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù))的具有CD5磁珠的正向選擇來純化T細(xì)胞。細(xì)胞的純度通過流式細(xì)胞術(shù)測定并且常規(guī)大約為90%。除非另有說明，受體在每只小鼠有或沒有4 X 106T細(xì)胞的情況下通常經(jīng)尾靜脈注射接受5 X 106骨髓細(xì)胞。
[0196]如前所述6，每天監(jiān)測小鼠存活率并用建立的臨床GVHD評分系統(tǒng)(包括體重、姿勢、活動(dòng)、皮毛起皺和皮膚完整性)每周檢測小鼠移植物抗宿主病(GVHD)的得分。最大可能得分10的臨床GVHD指數(shù)然后產(chǎn)生。得分5或以上的小鼠被認(rèn)為是垂死的并通過CO2窒息實(shí)施安樂死。
[0197]細(xì)胞因子給藥。
[0198]重組鼠IL-22從GenScript購買并按生產(chǎn)商所描述的重組成濃度為40yg IL-22/lOOOul磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。每只小鼠每日經(jīng)腹膜內(nèi)注射ΙΟΟμΙ PBS或含有4yg重組小鼠IL-22的10yL PBS處理。IL-22給藥在骨髓移植后第七天開始。此安排是基于未移植小鼠內(nèi)測試的rIL-22藥代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果。對于體內(nèi)F-652的給藥，小鼠在骨髓移植后第七天開始經(jīng)PBS或100yg/KGF-652隔天皮下注射10周處理。
[0199]GVHD靶器官的組織病理學(xué)分析。
[0200]使用⑶2窒息使小鼠安樂死，其被用于在BMT后21天進(jìn)行器官分析。對于GVHD的組織病理學(xué)分析，小腸和大腸在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片、并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。如先前所述，由19個(gè)不同的GVHD相關(guān)參數(shù)構(gòu)成的半定量得分被計(jì)算。
[0201 ] 潘式細(xì)和干細(xì)胞組織染色
[0202]對潘式細(xì)胞的染色，從安樂死的小鼠收集腸并在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片、并用多克隆兔抗人溶菌酶3.2.1.17(Dakocytoma1n)染色。為評價(jià)干細(xì)胞的數(shù)量，收集來自移植有LP骨髓(如果適用，還有T細(xì)胞)的Lgr5-LacZ受體小鼠的小腸。β半乳糖苷酶(LacZ)如先前Barker等人所述進(jìn)行染色。清洗的2.5厘米尺寸的小腸片段用冰冷固定液孵育，該固定液由I %甲醛、0.02 %NP40和0.2 %戊二醛構(gòu)成。除去固定液后，器官為LacZ的存在進(jìn)行染色。然后器官在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片并用核固紅(矢量)復(fù)染。
[0203]細(xì)胞因子多重測定。
[0204]脾和小腸從安樂死的BMT受體中收集。然后將器官混勻、離心，并將上清液在_20°C下儲(chǔ)存直到用于細(xì)胞因子的分析。細(xì)胞因子多重測定法使用小鼠Th I/Th2/Th 17/TH22 13倍FlowCytomix多重試劑盒(e生物科技)在解凍的樣品上進(jìn)行，并根據(jù)制造商的方案進(jìn)行。
[0205]流式細(xì)胞術(shù)。
[0206]為了在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中評估IL-22的影響，從安樂死小鼠中收集淋巴器官并加工成單細(xì)胞懸液。用抗體的合適的混合物對細(xì)胞染色。為了分析細(xì)胞內(nèi)分子，e生物科技固定/透化試劑盒根據(jù)用于細(xì)胞內(nèi)染色的制造商協(xié)議來使用。徹底清洗后，同時(shí)用細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外抗體對細(xì)胞染色。用于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外染色的焚光染料標(biāo)記抗體購自BD Pharmingen(⑶4、CD8、CD24、CD25、CD45、a407、K1-67 和 P-STAT3Y705)、e 生物科技(Foxp3)、R&D(IL-22R)和英杰公司(GFP) JAPI和可固定活/死細(xì)胞染色試劑盒(英杰公司)用于存活力染色。如Sato等7所述，潘式細(xì)胞可基于亮CD24染色和側(cè)向散射粒度來識別。
[0207]對于小腸類器官細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，ENR培養(yǎng)基被除去，且隱窩和基質(zhì)膠在TrypLE中懸浮約8分鐘。通過P200移液槍用力吸移造成機(jī)械破碎后，用1ml含有10%FBS和0.8KU/mlDNase I的DMEM/F12培養(yǎng)基清洗隱窩懸浮液。然后懸浮液用于評價(jià)GFP+細(xì)胞的百分比。當(dāng)適用時(shí)，將細(xì)胞直接染色或根據(jù)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)位置將細(xì)胞第一固定和透化。所有對活細(xì)胞的染色在沒有Mg2+和Ca2+，含有0.5 % BSA的PBS中進(jìn)行。5-乙炔基-2 ’ -脫氧尿苷(EdU)摻入實(shí)驗(yàn)，EdU在使用trypLE解離細(xì)胞之前，在完整類器官培養(yǎng)物的ENR培養(yǎng)基中進(jìn)行I小時(shí)預(yù)孵育。使用用于成像和流式細(xì)胞儀(美國生命技術(shù)公司)的Click-1t試劑盒對細(xì)胞染色。
[0208]用PFA4%(10分鐘37°C)固定之前用磷酸化-STAT3對類器官染色，用20ng/ml IL-22在37 °C 20分鐘將細(xì)胞刺激為機(jī)械破碎的隱窩(用于傳代)，或者刺激為單細(xì)胞(TrypLE)。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用產(chǎn)生自新鮮分離的隱窩(非類器官)的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行IL-22刺激。得到刺激和固定細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液后，過濾(40um)樣品并用冰冷的(_20°C)甲醇透化。固定/電燙細(xì)胞用PBS補(bǔ)充水份并在染色之前使用PBS充分清洗，使用抗-磷酸化-STAT3 JAGFP和/或細(xì)胞表面標(biāo)記物的染色在4°C下進(jìn)行30分鐘。所有流式細(xì)胞術(shù)使用FACSDiva(BD生物科技)在LSR II細(xì)胞儀(BD生物科技)上進(jìn)行，并且數(shù)據(jù)用Flowjo軟件(Treestar)進(jìn)行分析。
[0209]類器官測量。
[0210]每孔的類器官數(shù)目通過光鏡計(jì)數(shù)以評估在培養(yǎng)第七天的增長效率。對于尺寸評估，使用具有5x(0.25NA DRY)和10x(0.3NA DRY)Zeiss物鏡的MetaMorph廣角現(xiàn)場成像系統(tǒng)顯微鏡拍攝二維明視野顯微鏡照片，呈現(xiàn)每個(gè)類器官的最大橫截面。每個(gè)橫截面的面積和周長使用MetaMorph軟件測量。
[0211]qPCR
[0212]對于定量的(q)PCR，小腸片段或分離的隱窩從安樂死的小鼠中收集并在-80°C下保存。RNA從這些組織中提取并在-20 0C保存。可替代地，RNA在體外培養(yǎng)后從類器官中分離。逆轉(zhuǎn)錄-PCR使用Quant1-Tec逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIANGEN)進(jìn)行。用于實(shí)時(shí)PCR的從美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司得到的特異性引物如下:肌動(dòng)蛋白:Mm01205647_gl;HPRT:Mm00446968_ml;Reg30:MmOO44O616_gl；Reg3γ:Mm00441127_ml;WNT3:Mm00437336_ml和EGF:Mm00438696_ml;Rspo3:MmOO6611O5_ml;Axin2:MmOO44361O_ml;0-連環(huán)蛋白:Mm00483039_ml wPCR在具有TaqMan通用PCR主混合物(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)的Step-One Plus(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行。mRNA的相對量用β-肌動(dòng)蛋白或HPRT作為管家基因通過比較的AC(t)方法來計(jì)笪并ο
[0213]統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和軟件
[0214]所有柱狀圖及誤差柱狀圖代表用于各組+SEM的平均值。為比較兩個(gè)組，進(jìn)行t-檢驗(yàn)或非參數(shù)U檢驗(yàn)。方差分析用于兩組以上的比較。對所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算并使用GraphPad Prism生成顯示圖。所有實(shí)驗(yàn)用每組至少3_5小鼠進(jìn)行至少兩次。
[0215]GVHD靶器官的組織病理學(xué)分析。
[0216]犧牲GVHD小鼠，且小腸、大腸和肝臟被除去、在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。評分如先前所述(Petrovic等人，2004)進(jìn)行。
[0217]組織分析和流式細(xì)胞術(shù)。來自GVHD小鼠的淋巴器官被加工成單細(xì)胞懸浮液，且固有層淋巴細(xì)胞在上皮解離和在DNase 1(羅氏)和膠原酶D(羅氏)中消化后分離。表面染色用抗體的相應(yīng)混合物進(jìn)行，而且e生物科技的固定/透化試劑盒根據(jù)制造商協(xié)議用于細(xì)胞內(nèi)染色。用于IL-22R(大鼠-抗-小鼠IL-22R抗體496514，R&D系統(tǒng))的FACS包括表面和細(xì)胞內(nèi)染色。使用用于IL-22表達(dá)的BD GolgiPlug(lul/ml)和IL-23(40ng/ml)或用于IFN-G和TNF表達(dá)的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-醋酸酯(50ng/ml)和離子霉素(500ng/ml)重復(fù)刺激5小時(shí)后，使用抗-1L-22(lH8PWSR，eB1science)、抗-1FN-g(XMG1.2，m) PharMingen)或抗_TNF_a(MP6-XT22，BD PharMingen)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。IL-22和IL-23ELISA根據(jù)制造商協(xié)議(B1Legend)在每個(gè)來自上清液上小腸和大腸的勻漿上進(jìn)行，該上清液來自在含有FBS的RPMI中在37°下過夜培養(yǎng)的腸。免疫組化、免疫熒光、TUNEL、LacZ和ISC組織腸從正常小鼠中收集，在福爾馬林中固定，并用大鼠-抗-小鼠IL-22R染色，其是與同型對照和/或多克隆兔抗-人溶菌酶3.2.1.17(0&1?^7切111&-^011)對比的抗體496514(1?&0系統(tǒng))。免疫熒光二次染色使用用于IL-22R的AF488進(jìn)和用于溶菌酶的AF568進(jìn)行。如Gavrieli等人(1992)所述，TUNEL測定在福爾馬林中固定/石蠟包埋的組織上進(jìn)行。對于Lgr5-LacZ的移植，得到2.5cm的回腸片段，且用于半乳糖苷(LacZ)存在的染色按照Barker等人(2007)進(jìn)行。簡言之，小腸在I %甲醛、0.2 %戊二醛和0.02 %NP40的I3BS中固定，然后使用β_半乳糖苷底物孵育。組織然后再次在4%PFA的PBS中固定并石蠟包埋，且切片用核固紅(矢量)復(fù)染。為了評估非報(bào)道小鼠中的ISCs，隱窩基底柱狀腸干細(xì)胞如所報(bào)道的通過其形態(tài)和其在潘式細(xì)胞之間隱窩基底處的位置識別(Barker等人，2007)。定量PCR逆轉(zhuǎn)錄-PCR用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIANGEN)來完成。對于實(shí)時(shí)PCR，從美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司得到的特定引物和探針組如下:β-肌動(dòng)蛋白:Mm01205647_gl，Reg3b:Mm00440616_gl和在具有
TaqMan通用PCR主混合物(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)的ABI7500(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行。Reg3g和Reg3b mRNA的相對量通過比較直流DC(t)的方法來計(jì)算。
[0218]統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。柱狀圖和誤差柱狀圖分別代表各組的平均值+SEM。存活數(shù)據(jù)用Mantel-Cox log-rank測試分析。對于非存活逐點(diǎn)分析，非配對t檢驗(yàn)用于在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間對比，或非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)用于非高斯分布，且方差分析用于兩個(gè)以上的組的比較。存活移植用每組10-38只小鼠進(jìn)行，且所有其他實(shí)驗(yàn)用每組至少六只小鼠進(jìn)行至少兩次。
[0219]進(jìn)行MHC不匹配和次要組織相容性抗原(miHA)不匹配的移植來模擬高度侵略性GVHD和臨床相關(guān)移植方案。受體小鼠受致死TBI限制，是因?yàn)楦邉┝炕煹乃幋鷦?dòng)力學(xué)難以在實(shí)驗(yàn)中控制。受體然后用T細(xì)胞耗盡(TCD)的骨髓移植，其補(bǔ)充有磁珠純化的T細(xì)胞以控制GVHD的影響。按照MSKCC IACUC監(jiān)測移植后受體小鼠GVHD的臨床癥狀(包括體重、活動(dòng)、姿勢、皮毛和皮膚完整性)，且通常受體在移植后2-3周之間犧牲來評價(jià)T細(xì)胞功能和GVHD病理。統(tǒng)計(jì)分析將使用為MSKCC BMT服務(wù)的Sean Devlin，生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家來進(jìn)行。在一般情況下，對每組至少五只小鼠進(jìn)行移植，并且所有實(shí)驗(yàn)將至少重復(fù)一次。兩組之間的比較將用非參數(shù)U檢驗(yàn)進(jìn)行。兩組以上的實(shí)驗(yàn)將通過方差分析進(jìn)行評估。
[0220]類器官培養(yǎng)。從來自腸上皮細(xì)胞的小腸和LI分離的隱窩并在存在干細(xì)胞生長因子(用于SI的R-脊椎蛋白1、EGF、頭蛋白；用于LI的R-脊椎蛋白1、EGF、頭蛋白、HGF和Wnt3a)的半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。因?yàn)槊總€(gè)隱窩包含具有ISCs的功能性干細(xì)胞隔室和支持性區(qū)位細(xì)胞，體外培養(yǎng)的隱窩生長形成具有含隱窩絨毛結(jié)構(gòu)和中央腔的體內(nèi)腸組織的隱窩芽的類器官(圖6)。此外，作為它們ISC能力的證據(jù)，來自SI和LI的單Lgr5+細(xì)胞能夠以這種方式產(chǎn)生自身區(qū)位細(xì)胞并從單個(gè)細(xì)胞形成類器官38，39。同種異體-BMTs如描述進(jìn)行，SI和LI隱窩從未患有GVHD (單獨(dú)TCD骨髓)的受體和患有GVHD(骨髓+T細(xì)胞)的受體中分離。隱窩將在BMT后1、
3、5、7、10以及14天收集以評價(jià)對功能干/祖細(xì)胞區(qū)位的動(dòng)力學(xué)損傷。此外，Lgr5-GFP報(bào)道小鼠將作為移植受體，使得單個(gè)ISCs可以通過BMT后的FACS分離并在體外培養(yǎng)以評價(jià)GVHD中隔離的I SCs的功能。這將提供干細(xì)胞區(qū)位和GVHD內(nèi)特異性I SCs的功能性讀數(shù)。
[0221]實(shí)施例1I
[0222]宿主衍生IL-22對限制死亡率和移植后GVHD病理學(xué)是重要的。
[0223]受體IL-22的消除增長了移植后的死亡率:鑒于報(bào)道的IL-22在GI組織損傷中起保護(hù)作用，我們開始評估BMT后IL-22的功能。
[0224]IL-22敲除(KO)受體證明在輕微(圖1A)和較多(圖1B)抗原不匹配BMT后死亡率增加，如同經(jīng)抗-1L-22中和抗體全身性處理的野生型(WT)受體(圖lC)<JL-22在供體骨髓(圖ID)或T細(xì)胞(圖1E)中的缺乏對結(jié)果沒有可觀察的影響。造血嵌合體中BMT強(qiáng)度的減少(低T細(xì)胞和輻射劑量)表明，IL-22缺乏限制宿主造血隔室GVHD死亡率的增加(圖1F)，植入IL-22^) 受體導(dǎo)致 GI GVHD組織病理學(xué)證據(jù)的增加(圖2A)。
[0225]L-22在骨髓移植后表達(dá)并在GVHD中減少:我們接下來鑒定同種異體BMT后，IL-22在胃腸道(圖2B-C)、胸腺(圖2D)和血清(圖2E)內(nèi)的表達(dá)。然而，IL-22的水平在GVHD中降低(圖2B-E)。組織IL-22表達(dá)在未經(jīng)BMT的全身照射(TBI)后被誘導(dǎo)(圖2D，F(xiàn))，且腸IL-23，IL-22表達(dá)31—34的樹突狀細(xì)胞衍生3()調(diào)節(jié)子，也在BMT后和在沒有BMT的TBI后表達(dá)。IL-22產(chǎn)生CD45+CD3—ROR yt+ILCs在T細(xì)胞耗盡(TCD)BMT后在固有層被檢測到(圖2G)。這些ILCs是宿主衍生的IL-7R+CCR6+NKp46—類淋巴組織誘導(dǎo)物類細(xì)胞，并且甚至在BMT-T⑶后三個(gè)月，它們包括50%以上的固有層ILCs。其他腸道IL-22生產(chǎn)者未在BMT后檢測到。盡管其在BMT-TCD后的抗輻射性和長期持久性，生產(chǎn)ILCs的IL-22在GVHD中迅速消除(圖2G)。這些數(shù)據(jù)表明，a) IL-22 在BMT 后表達(dá) ，但由于宿主ILCs的消除在GVHD中減少和 b) 宿主衍生IL-22降低了BMT后的死亡率。
[0226]ISCs表達(dá)IL-22R:雖然宿主的IL-22缺乏使GVHD增加(圖1-2A)，在IL-22K0受體的供體淋巴細(xì)胞腸浸潤或細(xì)胞因子分泌中沒有發(fā)現(xiàn)可觀察的差異，表明GVHD內(nèi)的減少不是由于同種異體反應(yīng)供體免疫的操縱。為識別IL-22的直接靶標(biāo)，我們通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)評估腸的IL-22R表達(dá)并在BMT后的GI上皮細(xì)胞上觀察IL-22R的增加。
[0227]免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光(IF)表明在ISC區(qū)位位于其中的腸隱窩中IL-22R的表達(dá)(圖3A-C)<JL-22R的13(:表達(dá)通過來自1^5-6??報(bào)道小鼠的純化1308的?六03來確認(rèn)(參見圖7A)。
[0228]I SC在GVHD中消失，且I L_22的消除導(dǎo)致在GVHD過程中I SCs損失的增加:為確定是否ISCs可能是GVHD的目標(biāo)，我們在Lgr5-LacZ報(bào)道小鼠中進(jìn)行同種異體BMT，其在Lgr5下游產(chǎn)生β-半乳糖苷酶來識別ISCs8。作為ISC功能的證據(jù)，單個(gè)Lgr5+CBC細(xì)胞能夠在體外和體內(nèi)產(chǎn)生整個(gè)隱窩結(jié)構(gòu)。與報(bào)道的研究結(jié)果一致，我們觀察到GVHD過程中ISCs的顯著減少(圖3D)。此外，在非報(bào)道WT小鼠中通過IHC評估ISC區(qū)位確認(rèn)了GVHD過程中CBC ISC的損失(圖3E)。引人注目的是，IL-22K0受體證明在GVHD期間CBC I SC的巨大的損失(圖3E)和隱窩上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的增加(圖3F )，表明IL-22保護(hù)了 I SCs和祖細(xì)胞。最后，患有GVHD的IL-2 2小鼠證明IL-22調(diào)節(jié)的抗菌分子Reg3y和Reg3i3的GI表達(dá)的降低和口服(圖3G)后不可吸收碳水化合物FITC-葡聚糖血清易位的增加，表明對GI上皮細(xì)胞屏障的損傷增加。
[0229]IL-22的給藥保留了GVHD中的ISCs并降低了GVHD病理反應(yīng):考慮到GVHD中IL-22表達(dá)的減少和在IL-22缺乏的GVHD中ISCs損失的惡化，我們接下來檢測IL-22給藥在GVHD中的效果。我們發(fā)現(xiàn)BMT三周后每日給藥rmIL-22(第+7天開始4ug IP)導(dǎo)致受體的S1、LI和肝臟中GVHD病理反應(yīng)的降低(圖4A);在皮膚中沒有觀察到病理差異(圖48)^幾-22受體已經(jīng)在腸炎癥細(xì)胞因子水平?jīng)]有差異的情況下降低了腸隱窩的細(xì)胞凋亡(圖4C)。為了評估IL-22給藥對ISC隔室的影響，我們使用Lgr5-LacZ的ISC報(bào)道小鼠在B6同型異體BMT中進(jìn)行LP。經(jīng)rIL-22處理的受體證明BMT三周后在無免疫抑制的活性GVHD期間Lgr5+ISCs數(shù)量增加(圖4D)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在GVHD中經(jīng)IL-22治療后使用Lgr5-GFP報(bào)道因子增加了 ISC增殖(見圖7B)。
[0230]IL-22的給藥增強(qiáng)了 ISC功能而不改善ISC區(qū)位:考慮到我們在GVHD觀察到的ISCs損失，我們試圖評估在正常上皮細(xì)胞維護(hù)中構(gòu)建ISC區(qū)位的潘式細(xì)胞。與在侵略性MHC不匹配的GVHD中報(bào)道的一樣，我們在輕微不匹配GVHD模型中觀察到潘式細(xì)胞的減少(圖4E)。然而，雖然IL-22的給藥增加了 Lgr5+ISCs在GVHD中的恢復(fù)，但在IL-22的給藥后沒有觀察到潘式細(xì)胞數(shù)目上的差異(圖4E)。此外，在WNT3或EGF mRNA的表達(dá)無明顯差異，認(rèn)為IL-22的給藥后，干細(xì)胞益處并不是由于在ISC區(qū)位功能的改善(圖4F)。相反，IL-22的治療導(dǎo)致Reg3y和Reg3i3表達(dá)的增加(圖4G)，表明IL-22給藥的潛在抗菌的優(yōu)點(diǎn)。
[0231]總結(jié):我們的初步數(shù)據(jù)表明上皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的相互網(wǎng)絡(luò)，其中胃腸組織損傷導(dǎo)致IL-23的誘導(dǎo)，其可以通過ILCs刺激IL-22生產(chǎn)。這種IL-22保護(hù)來自炎性組織損傷的上皮細(xì)胞和ISC隔室。然而，必要地促進(jìn)ISC功能的IL-22生產(chǎn)的ILCs在GVHD期間丟失。這表明，GVHD導(dǎo)致ISC隔室的損傷以及其在組織損傷后調(diào)解上皮細(xì)胞再生的能力。這也表明在GVHD內(nèi)通過替換丟失的IL-22用于增強(qiáng)ISC功能的潛在治療方法。然而，這些研究結(jié)果的有效翻譯需要詳細(xì)了解移植后腸道正常穩(wěn)態(tài)、直接地在ISCs上和其潘式細(xì)胞區(qū)位上的損傷、及IL-22對ISCs和其祖細(xì)胞的影響。
[0232]實(shí)施例1II
[0233]每日IP給藥rIL-22
[0234]在具有T細(xì)胞耗盡骨髓和植入致死劑量照射小鼠的MACS純化T細(xì)胞的C57BL/6(B6)輕微抗原不匹配模型中臨床模仿LP13HCT后第七天開始受體每天通過腹腔內(nèi)(IP)注射給藥PBS或4ug鼠重組(r)IL-22。此安排是基于在未移植小鼠內(nèi)測試的rIL-22的藥物動(dòng)力學(xué)的結(jié)果O
[0235]在HCT三周后每日IP給藥rIL-22導(dǎo)致受體小腸、大腸和肝內(nèi)GVHD病理反應(yīng)的降低(圖9，P〈0.001)。在皮膚組織病理學(xué)中未觀察到差異，與我們先前的發(fā)現(xiàn)IL-22缺乏受體證明等價(jià)皮膚GVHD—致。腸道病理反應(yīng)的進(jìn)一步評估表明，在腸道淋巴細(xì)胞浸潤無差異的情況下，rIL-22受體在小腸和大腸中降低了腸隱窩細(xì)胞凋亡(P〈0.01)，表明GVHD中的減少是由于IL-22對上皮細(xì)胞的直接影響。此外，在脾T細(xì)胞膨脹或在GI細(xì)胞因子表達(dá)上沒有觀察到差異，包括炎癥細(xì)胞因子的復(fù)合面。
[0236]實(shí)施例1V
[0237]IL-22給藥對腸干細(xì)胞(ISC)隔室的影響。
[0238]使用Lgr5-LacZ的ISC報(bào)道小鼠LP到B6同種異體HCT。經(jīng)rIL_22治療的受體證明HCT三周后的沒有免疫抑制的活性GVHD期間Lgr5+I SC數(shù)目的增加(圖10，P〈0.05)。用Lgr5_GFP報(bào)道小鼠的初步證據(jù)表明ISC燈-67染色的增加，從而11^-22給藥后增加了15(:增殖。11^-22治療后小腸的qPCR證明Reg3 γ (Ρ〈0.001)和Reg3f3(P〈0.01)的表達(dá)增加，表明IL-22給藥潛在的抗菌益處。然而，在Wnt3和EGF的表達(dá)上不存在差異，認(rèn)為IL-22給藥后的干細(xì)胞益處不是由于ISC區(qū)位功能的改善。
[0239]實(shí)施例V
[0240]IL-22給藥到BALB/c中的B6腫瘤挑戰(zhàn)受體沒有限制GVL。
[0241]在造血細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的IL-22R表達(dá)。因此，監(jiān)測熒光素酶+A20腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光以跟蹤通過植入經(jīng)rIL-22治療的BALB/c腫瘤挑戰(zhàn)受體內(nèi)的B6T細(xì)胞介導(dǎo)的GVT效果。
[0242]實(shí)施例VI
[0243]IL-22給藥甚至在活性GVHD期間改善外周T細(xì)胞重建。
[0244]FVB MHC不匹配移植骨髓移植到具有Rag2-GFP骨髓和WT T細(xì)胞的BALB/c中。IL-22給藥如本文所述，提高HCT四個(gè)周后的供體骨髓衍生的CD4和CD8+胸腺移植(圖11，P〈0.01)。
[0245]實(shí)施例VII
[0246]本發(fā)明的IL-22+乳酸桿菌的使用和HCT后IL-22+乳酸桿菌對GVHD和GI組織損傷的效果。
[0247]該實(shí)施例示出GVHD中通過IL-22+乳酸桿菌給藥減少GVHD組織損傷的IL-22生產(chǎn)的內(nèi)源性損失的結(jié)果(A部分)。如下面B部分所示，乳酸桿菌給藥顯示能減少實(shí)驗(yàn)GVHD。
[0248]副干酪乳桿菌是人類胃腸道菌群的正常組成部分。因此本發(fā)明人設(shè)想的使用副干酪乳桿菌傳送治療劑量的外源性的IL-22，用于提供額外的治療益處。
[0249]A.內(nèi)源性的IL-22表達(dá)降低的小鼠HCT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0250]HCT的IL-22-/-K0受體證明下列輕微(圖1A)和較多(圖1B)的抗原不匹配HCT增加了死亡率，這與全身經(jīng)抗-1L-22中和抗體治療的野生型(WT)受體一樣(圖1C)。植入IL-22K0受體導(dǎo)致胃腸和肝GVHD組織病理學(xué)證據(jù)增加(圖2A)。因此，宿主衍生的IL-22影響死亡率和移植后的GVHD病理反應(yīng)。
[0251 ] IL-22的表達(dá)在allo-HCT后在胃腸道(圖2B)和血清(圖2E)中發(fā)現(xiàn)。然而，IL-22的水平在GVHD期間減少(圖2B，C)。腸的IL-23，IL-22表達(dá)的樹突細(xì)胞衍生調(diào)節(jié)因子，也在HCT后表達(dá)。產(chǎn)生CD45+CD3—ROR γ t+ILC的IL-22在T細(xì)胞耗盡(TCD)HCT之后在固有層被識別到(圖2G)。這些ILC是宿主衍生IL-7R+CCR6+NKp46—淋巴組織誘導(dǎo)物類細(xì)胞。盡管他們有抗輻射性，但產(chǎn)生ILC的IL-22在GVHD期間被迅速消除(圖2G)。因此，宿主衍生IL-22降低了 GVHD死亡率，但響應(yīng)損傷的IL-22在GVHD期間由于消除宿主ILC而鈍化。
[0252]雖然宿主IL-22的缺乏增加了GVHD(圖1和圖2A)，但在IL-22敲除受體中供體淋巴細(xì)胞腸浸潤或細(xì)胞因子的分泌中沒有可觀察的差異，表明GVHD中的減少不是由于同種異體反應(yīng)供體免疫的操縱。腸IL-22R表達(dá)通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)來測定，且在HCT后的GI上皮細(xì)胞可觀察到IL-22R的增加。
[0253]免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光(IF)表明ISC區(qū)位位于其中的腸隱窩中IL-22R的表達(dá)(圖3A-C) ο在Lgr5-LacZ報(bào)道小鼠中植入同種異體HCT，其在Lgr5的下游產(chǎn)生β-半乳糖苷酶來識別ISC。作為ISC功能的證據(jù)，單個(gè)Lgr5+隱窩基底柱狀細(xì)胞(CBC)能夠在體外和體內(nèi)產(chǎn)生整個(gè)隱窩結(jié)構(gòu)?？捎^察到GVHD期間ISC的急劇減少(圖3D)。此外，在非報(bào)道WT小鼠中通過IHC評估ISC區(qū)位確認(rèn)了GVHD期間CBC/ISC的損失(圖3E)。引人注目的是，IL-22K0受體證明在GVHD期間CBC/ISC的(圖3E)的巨大的損失和隱窩上皮細(xì)胞凋亡的增加(圖3F)，表明IL-22保護(hù)了 ISCs和祖細(xì)胞。最后，患有GVHD的IL-22K0小鼠證明IL-22調(diào)節(jié)的抗菌分子Reg3γ和Reg30的GI表達(dá)的降低和口服后不可吸收碳水化合物FITC-葡聚糖血清易位的增加(圖3G)，表明對上皮細(xì)胞屏障的損害增加。
[0254]因此，GI損傷導(dǎo)致IL-23的誘導(dǎo)。IL-23反過來又可以通過ILC刺激IL-22的生產(chǎn)。這種內(nèi)源性的IL-22保護(hù)來自炎性組織損傷的上皮細(xì)胞和干/祖細(xì)胞隔室。然而，必需的限制組織損傷的生產(chǎn)ILC的IL-22在GVHD期間丟失。如本文所示，HCT后rIL-22通過腹膜內(nèi)注射給藥(例如4ug/小鼠每日)在腸內(nèi)逆轉(zhuǎn)GVHD病理反應(yīng)中ILC枯竭和IL-22的損失，并在ISC/祖細(xì)胞隔室位于其中的腸隱窩中減少細(xì)胞凋亡(圖12A，B)。然而，對于臨床使用，全身細(xì)胞因子給藥是昂貴的，并且可能具有未預(yù)料到的全身效應(yīng)。因此，本發(fā)明人制備結(jié)構(gòu)性地生產(chǎn)IL-22的副干酪乳桿菌的兩種菌株(圖12C，D)。一種菌株產(chǎn)生分泌IL-22(乳酸-22s)，而另一種產(chǎn)生固定于細(xì)菌細(xì)胞表面的IL-22(乳酸-22a)。
[0255]B.1L22+乳酸桿菌治療GVHD的結(jié)果。
[0256]如本文所述，發(fā)現(xiàn)IL-22缺乏導(dǎo)致GVHD增加(圖1到3)，IL-22介導(dǎo)GVHD的減少(圖12)以及HCT后的抗菌分子的IL-22依賴性誘導(dǎo)后，用如本文所述的本發(fā)明的乳酸-22s和乳酸-22a菌在HCT后給藥IL-22。兩株乳酸桿菌的給藥與HCT相關(guān)(圖12E)。小鼠經(jīng)歷具有骨髓和T細(xì)胞的同種異體HCT以導(dǎo)致GVHD。從移植第一天開始，給小鼠灌胃18-1O9計(jì)量的再懸浮在I3BS中的野生型副干酪乳桿菌(乳酸-WT)、乳酸-22s或乳酸-22a和單獨(dú)灌胃PBS直到HCT后30天。GVHD導(dǎo)致在用PBS灌胃的小鼠中顯著的死亡率。雖然接受乳酸-WT的小鼠有提高存活率的趨勢，但由于GVHD這些小鼠的死亡率依然很高。
[0257]相反，接受乳酸-22s或乳酸-22a的小鼠和沒有T細(xì)胞的移植小鼠相比沒有明顯不同的死亡率。此外，從重量，毛皮質(zhì)量，皮膚完整性，姿勢和活動(dòng)的評估來看接受乳酸-22s的小鼠明顯降低了GVHD的臨床評分。而HCT后小鼠重量的改變可以作為GI GVHD的替代指標(biāo)，這些研究結(jié)果的系統(tǒng)性表明，GI保護(hù)可能是預(yù)防全身性疾病免受GVHD的關(guān)鍵。
[0258]如上所述完成了 T細(xì)胞耗盡的MHC匹配同種異體-HCT，而且每天給小鼠灌胃乳酸-WT、乳酸-22s和乳酸-22a。
[0259]實(shí)施例VIII
[0260]使用臨床模型LP—C57BL/6(B6)輕微抗原不匹配HSCT(H-2b—H-2b)，我們發(fā)現(xiàn)，從移植后第7天開始每日經(jīng)重組鼠(rm)的IL-22(4ug，腹膜內(nèi)注射)的治療導(dǎo)致GVHD減少腸病理反應(yīng)而不改變同種異體免疫。相對于PBS處理的對照組，BMT三周后在rmIL-22處理的患有GVHD的小鼠中整體GVHD病理反應(yīng)和上皮細(xì)胞凋亡評分顯著變低(P〈0.001)。我們觀察到，經(jīng)rmIL-22(且無藥理學(xué)免疫抑制)處理的小鼠具有數(shù)目增長的LGR5+ISC并顯著變大的ISC增殖(P〈0.01)。這不是由于在ISC區(qū)位中IL-22依賴性的變化，因?yàn)榕耸郊?xì)胞數(shù)、潘式細(xì)胞衍生生長因子(EGF、WNT3)和基質(zhì)衍生的生長因子(Rspo3)均在IL-22給藥后保持不變。然而，抗菌蛋白Reg30和Reg3 γ都是通過在rmIL-22處理小鼠的小腸(SI) (P〈0.01和p〈0.001分別地)的qPCR來上調(diào)，雖然這并沒有在內(nèi)臟微生物菌群中導(dǎo)致一致的變化。
[0261]為評價(jià)對上皮細(xì)胞再生的直接影響，我們在IL-22存在的情況下進(jìn)行腸類器官培養(yǎng)試驗(yàn)。從野生型B6小鼠SI和的大腸(LI)隱窩產(chǎn)生的類器官證明與IL-22培養(yǎng)7天后尺寸顯著增加(？〈0.001，51，圖^;?〈0.05丄1)。與先天淋巴樣細(xì)胞(11^0共培養(yǎng)隱窩，體內(nèi)11^-22有效生產(chǎn)者，也導(dǎo)致類器官尺寸的增加。此外，與IL-22培養(yǎng)顯著增加類器官的出芽(新隱窩形成)，隨著在IL_22(lng/ml)存在的情況下連續(xù)傳代導(dǎo)致增加的類器官膨脹，表明IL-22可以直接增加ISC膨脹。事實(shí)上，IL-22培養(yǎng)導(dǎo)致SI隱窩從Lgr5-GFP報(bào)道小鼠培養(yǎng)后類器官EDU摻入的增加和LGR5+ISC的膨脹(P〈0.001，圖1B)。證明對ISC的直接影響，IL-22導(dǎo)致在LGR5+細(xì)胞的STAT3磷酸化特異性和導(dǎo)致在培養(yǎng)僅四天的從分離的單個(gè)SI ISC培養(yǎng)的類器官芽的增加(Ρ〈0.01)。
[0262]為調(diào)查用于人類的平移潛力，我們在小鼠腸隱窩上測試了人源IL-22二聚體分子(F-652，Gener0n(上海)公司制造)，并發(fā)現(xiàn)F-652顯著增加SI和LI類器官的尺寸。使用上述LP—B6同種異體HSCT模型，我們發(fā)現(xiàn)用100ug/kg F-652從BMT后開始第7天隔日皮下(SQ)處理會(huì)導(dǎo)致臨床GVHD評分(P〈0.0001)和存活率(p〈0.05，圖1C)的顯著改善。
[0263]IL-22和先天淋巴樣細(xì)胞可以通過直接在上皮干細(xì)胞作用彌補(bǔ)免疫功能和組織再生。IL-22和F-652療法可能是一種新型的方法以促進(jìn)患有GVHD的患者的腸道恢復(fù)而不增加移植后免疫缺陷。
[0264]綜上所述，IL-22給藥被發(fā)現(xiàn)能夠在GVHD期間減少腸道病理反應(yīng)，提高ISC恢復(fù)，促進(jìn)供體骨髓衍生的T細(xì)胞發(fā)育。出人意料的是，IL-22的給藥不損害GVL。這些結(jié)果表明，移植后的IL-22的給藥代表一種新型方法以在同種異體HCT后保護(hù)腸上皮細(xì)胞并改善免疫功能重建。
[0265]在上述說明書中提及的所有出版物和專利在此通過引證的方式并入本文。所描述的組合物和本發(fā)明的方法的各種修改和變型對將本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，且不脫離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)不適當(dāng)?shù)叵抻谶@些具體實(shí)施方案。實(shí)際上，用于實(shí)施本發(fā)明的所描述的方式的各種修改對在藥品、診斷學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，且旨在在本發(fā)明的范圍和權(quán)利要求之內(nèi)。
[0266]以下參考文獻(xiàn)全文以引證的方式并入本文:
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【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種在胃腸道受傷或損傷后促進(jìn)受試者的胃腸上皮細(xì)胞恢復(fù)/再生的方法，所述方法包括用白介素-22(IL-22)接觸受試者的腸干細(xì)胞(ISC)。2.—種治療受試者的移植物抗宿主病(GVHD)而無免疫抑制的方法，所述方法包括對受試者給藥治療有效量的IL-22。3.—種增強(qiáng)腸干細(xì)胞(ISC)增殖的方法，所述方法包括在一定條件下用外源性IL-22接觸所述的ISC以促進(jìn)ISC的生長。4.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的方法，其中所述IL-22是重組IL-22。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述重組IL-22是人IL-22。6.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的方法，其中所述IL-22是以IL-22二聚體的形式。7.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的方法，其中所述IL-22是融合蛋白的形式。8.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其中所述ISC是Lgr5+。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受傷或損傷是由于炎癥性腸疾病，炎癥性直腸疾病，自身免疫性疾病，輻射或移植物抗宿主病(GVHD)。10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在移植前將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中一旦觀察到與對胃腸道傷害有關(guān)的癥狀，將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在移植后從一天到六個(gè)月將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在移植后從開始的一周到四個(gè)月開始將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中每天給藥所述IL-22。15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述接觸是在體內(nèi)或體外。16.—種IL-22或其二聚體，用于腸上皮細(xì)胞的再生。17.一種IL-22或其二聚體，用于治療炎癥性直腸疾病，自身免疫疾病，輻射誘發(fā)的腸損失或移植物抗宿主病(GVHD)。
【文檔編號】C07K14/00GK106029100SQ201480072525
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年11月7日
【發(fā)明人】馬塞爾·范登布林克, 艾倫·哈納斯, 卡洛琳·林德曼斯, 湯姆·唐
【申請人】紀(jì)念斯隆–凱特林癌病中心, 健能隆醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司