專利名稱：預(yù)防病原性細(xì)菌引起的腹瀉的新雙歧桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙歧桿菌屬的新的微生物，它能夠預(yù)防病原性細(xì)菌引起的腹瀉。特別是，本發(fā)明涉及所說的微生物在可吸收的載體的制備方面的使用和含有這種微生物的組合物。
很久以來，產(chǎn)生乳酸作為主要代謝組合物的微生物就為人們所知。在牛奶或牛奶處理工廠中，活著或腐爛的植物中也可在人和動(dòng)物的腸子中發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌。這些微生物概述為“乳酸細(xì)菌”，其代表了一組相當(dāng)不同類的細(xì)菌包括乳球菌(Lactococcus)、乳菌(Lactobacillus)，鏈球菌(Streptococcus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、片球菌(Pediococcus)等。
乳酸細(xì)菌作為低pH值條件下保存食物的發(fā)酵劑使用，發(fā)酵產(chǎn)物的作用抑制有害細(xì)菌的生長。另外，乳酸細(xì)菌也用于制備不同的乳制品例如奶酪、酸奶酪和其他發(fā)酵的乳制品。
近期，乳酸細(xì)菌的一些菌株顯示出對人和動(dòng)物的吸收頗有價(jià)值的性質(zhì)，引起了人們的密切關(guān)注。特別是，特殊的乳酸菌或雙歧桿菌的菌株被發(fā)現(xiàn)能夠在腸內(nèi)膜繁殖。它們暫時(shí)性或長期的保持在腸胃中被認(rèn)為對于人類的健康具有巨大的正面的作用。
在這方面，EP0768375公開了雙歧桿菌的特異性菌株，這種菌株能夠灌輸進(jìn)入腸內(nèi)并且粘附在腸細(xì)胞上。報(bào)道說這些雙歧桿細(xì)菌有助于免疫功能，能夠競爭性排除病原性細(xì)菌對腸內(nèi)細(xì)胞的粘附，有助于維持生物個(gè)體的健康。
在最近幾年科研集中在乳酸細(xì)菌作為益生菌試劑的潛在應(yīng)用。益生菌被認(rèn)為是能通過保持腸內(nèi)自然微生物區(qū)系促進(jìn)生物個(gè)體健康的可生長的微生物制品。微生物制品通常被認(rèn)為是益生菌也就是這種有效的微生物并且人們已經(jīng)知道了它們作用的模式。益生菌貼附在腸粘膜上，在腸道內(nèi)生長并且防止有害微生物在其上粘附。對于它們在腸內(nèi)發(fā)揮作用的至關(guān)重要的先決條件是它們必須以一種適當(dāng)?shù)哪艽婊畹姆绞秸掣降絻?nèi)臟的粘膜上而且在胃腸上部不被消滅，特別是不受胃內(nèi)低pH區(qū)域的影響。
在這方面，作為這樣的一種益生菌，WO97/00078公開了一種特異性菌株，稱為乳酸菌GG(ATCC53103)。在防止或治療食物誘發(fā)的過敏反應(yīng)的方法中特定使用這種微生物，也就是將其和已經(jīng)經(jīng)過用胃蛋白酶和/或胰酶一起進(jìn)行水解處理的食品材料一起給藥于受體。所選擇的乳酸菌菌株顯示了粘附和建群性能及蛋白酶體系，以至于含在將被給藥的食物中的蛋白質(zhì)通過被這種特殊的乳酸菌分泌的蛋白酶進(jìn)一步水解。這份文件所討論的方法最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)被內(nèi)臟消化，沒有顯示出存在任何引起過敏的物質(zhì)。
更進(jìn)一步，在EP 0 577 903參考資料中采用了這種乳酸菌，它具有取代幽門螺桿菌的能力，幽門螺桿菌公認(rèn)是引起潰瘍的原因，上述制備可以治療和預(yù)防幽門螺桿菌引起的潰瘍。
乳酸菌特定的菌株可以提供有價(jià)值的特性，技術(shù)人員期望發(fā)現(xiàn)另外的細(xì)菌菌株能夠有益于人類和/或動(dòng)物的健康。
因此，本發(fā)明的問題是提供另外的乳酸菌菌株，它能表現(xiàn)出對人和/或動(dòng)物例如寵物有益的新性質(zhì)。
通過提供新的屬于雙歧桿菌屬的新的微生物得到了解決，這些新的微生物具有防止病原性細(xì)菌移植腸胃引起腹瀉的能力且用它們制備可吸收的載體物質(zhì)。
這種雙歧桿菌是從由長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)CNCMI-2169和CNCMI-2170組成的組中選擇。
本發(fā)明的微生物顯示有如下特性它們是革蘭氏陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性和CO2生產(chǎn)陰性，它們生產(chǎn)L(+)乳酸和可以基本上防止引起腹瀉的細(xì)菌諸如致病的大腸桿菌、例如致腸病的E大腸桿菌(EPEC)、或沙門氏例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)在腸胃細(xì)胞上建群。
新的微生物可以用于制備一種可吸收的載體物質(zhì)，例如奶、酸奶酪、凝乳、奶基發(fā)酵產(chǎn)品、發(fā)酵谷類產(chǎn)品、奶粉(milk based powders)、嬰兒食品或?qū)櫸锸称?，也可以大約105cfu/g到1011cfu/g的量包含在載體中。本發(fā)明采用的縮寫cfu的意思是“菌落形成單位”，定義為瓊脂板上的微生物計(jì)數(shù)器所表示的細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)目。
本發(fā)明也提供一種食品或藥物組合物，含有至少一種雙歧桿菌菌株，和/或含有一種其中生長有微生物的上清液，或其活性部分。在此方面，細(xì)菌上清液也顯示具有抗病的活性。
為了制備本發(fā)明的食物組合物，至少一種雙裂菌菌株被加到在合適的載體中，其含量為大約105cfu/g到1012cfu/g，優(yōu)選含量為大約106cfu/g到1010cfu/g，更優(yōu)選含量為大約107cfu/g到109cfu/g。
藥品可以以片劑、液體細(xì)菌懸浮液、干的口服補(bǔ)充劑、濕的口服補(bǔ)充劑(oralsupplements)、干的管飼或濕的管飼等等的形式制備，所用的雙歧桿菌的含量高達(dá)1012cfu/g，優(yōu)選大約107cfu/g到1011cfu/g，更優(yōu)選107cfu/g到1010cfu/g。
微生物在生物體腸內(nèi)的活性當(dāng)然取決于劑量。也就是分別通過上述食品或藥物組合物攝入的微生物越多，保護(hù)和/或治療的作用越高。由于所用的微生物對于人類或動(dòng)物無害，實(shí)際上是從自然環(huán)境中分離出來的，也就是從嬰兒的糞中分離出來的，加入的量高，生物體腸內(nèi)新微生物建群的比例也就高。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的雙歧桿菌培養(yǎng)基的上清液或活性部分，可以用于制備可吸收的載體。這些上清液可以這樣使用或在不毀滅被這些微生物分泌的代謝化合物的條件下干燥例如冷凍干燥加入液體介質(zhì)，也可以包容在載體中。為了最大程度的減少上清液中未知化合物的數(shù)量，雙歧桿菌優(yōu)選在指定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基的組合物是已知的并且對于宿主沒有負(fù)的影響。而且熟練的操作人員根據(jù)一般的常識將從上清液分離未知的產(chǎn)物，例如采用色譜方法。
在這些圖中


圖1表示細(xì)胞系CNCMI-2169(稱為B128/Cal)和長雙歧桿菌CNCMI-2170(稱為BL29/F9)粘附在培養(yǎng)基中人類腸細(xì)胞的能力。
圖2表示病原細(xì)菌對于長雙歧桿菌CNCMI-2170(稱為BL29/F9)的病原敏感性。
圖3表示病原細(xì)菌對于長雙歧桿菌CNCMI-2169(稱為B128/Cal)的病原敏感性。
圖4表示細(xì)胞系B128/cAL和BL29/F9對于鼠沙門氏菌SL1344感染Caco-2細(xì)胞的活性。
圖5表示鼠沙門氏菌SL1344感染的小鼠和用雙歧桿菌BL29/F9處理的小鼠的存活率。
在進(jìn)行本發(fā)明的廣泛研究中，發(fā)明人調(diào)查了嬰兒糞便并分離了不同的細(xì)菌菌株。隨后檢驗(yàn)了這些菌株防止引起腹瀉的細(xì)菌在上皮細(xì)胞的建群和/或侵入，引起腹瀉的細(xì)菌諸如大腸桿菌(E.coli)、志賀氏菌(Sigella)，克雷伯氏桿菌(Klebsiella)，耶爾森氏菌(Yersinia)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、賴文氏菌(Listeria)、鏈球菌(Streptococcus)，Staphilococcus，難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)，幽門螺桿菌(H.pyori)以及白色假絲酵母(Candidaalbicans)。
依據(jù)對腹瀉的抑制性，包含雙歧桿菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬在內(nèi)的幾種細(xì)菌被篩選。采用病原微生物例如大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、耶爾森氏桿菌、銅綠假單胞菌、幽門螺桿菌和鼠沙門氏菌作為感染生物個(gè)體引起腹瀉的病原微生物進(jìn)行抑制性能試驗(yàn)。
各種細(xì)菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，例如在它們適宜的MRS、Hugo-Jago或M17培養(yǎng)基中，最佳的生長溫度30到40℃生長。在這些細(xì)菌穩(wěn)定生長后采用離心分離和在生理鹽水溶液中重新懸浮收集這些細(xì)菌。在這些不同試驗(yàn)之間這些細(xì)菌細(xì)胞被冷凍儲存(-20C)。
選擇下列方法評估抗菌的性能。
按照一個(gè)方案檢驗(yàn)了本發(fā)明培養(yǎng)的雙歧桿菌減少不同病原性微生物存活能力的性能。為此，病原細(xì)菌培養(yǎng)物和濃縮雙歧桿菌培養(yǎng)物的上清液相接觸并檢驗(yàn)病原細(xì)菌的生長勢。
按照第二個(gè)方案檢驗(yàn)了本發(fā)明雙歧桿菌在腸的細(xì)胞模型培養(yǎng)物T84細(xì)胞上的粘附能力。為此，雙歧桿菌和T84細(xì)胞一起培養(yǎng)并檢驗(yàn)粘附率。
按照另一個(gè)方案檢測了本發(fā)明的雙歧桿菌防止腸細(xì)胞沙門氏菌感染的能力，采用了細(xì)胞系Caco-2作為腸的模型。在這方面，本發(fā)明的雙歧桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和病原微生物一起加入腸細(xì)胞并分別檢驗(yàn)粘附或侵入率。
培養(yǎng)的雙歧桿菌和上清液證明具有極大的防止粘附和侵入腸細(xì)胞的作用，表明新微生物分泌的代謝化合物具有抗腹瀉能力。
本發(fā)明將舉例說明。并不局限于這些例子。
培養(yǎng)基和溶液MRS(Difco)Hugo-Jago(胰蛋白胨30g/l(Difco)，酵母提取物10g/l(Difco)，乳糖5g/l(Difco)，KH2PO46g/l，牛肉汁2g/l(Difco)，瓊脂2g/l(Difco)
M17(Difco)密集的西紅柿瓊脂(罐裝西紅柿汁400ml，密集的瓊脂(Eugon agar)BBL45.5g，麥芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，瓊脂(Difco)5g，蒸餾水600ml)DMEM(Dulbecco`s modified eagle medium)CFA(根據(jù)Ghosh等等，Journal of Clinical Microbiology，1993 31 2163-6)Muller Hinton瓊脂(Oxoid)LB(Luria Bertami，Maniatis，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港，1992)C14-醋酸鹽(53，4Ci/mMol，Amersham International PLC)PBS(NaCl8/l，KCl0.2g/l，nAhpo4 1.15g/l，kh2po4 0.2g/l)胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)FCS胎牛血清(Gibco)從西雅圖華盛頓大學(xué)獲得大腸桿菌DAEC C 1845，從美國馬里蘭大學(xué)疫苗發(fā)展中心獲得E大腸桿菌JPN15。
從美國加利福尼亞斯坦福大學(xué)微生物系獲得鼠沙門氏菌株SL1344。這種菌株作為病員細(xì)菌作用在小鼠上，這種細(xì)菌抗鏈球菌。它粘附在Cac)-2結(jié)腸細(xì)胞(Finlay和Falkow，1990)。
從法國Faculte de Pharmacie Paris XI Chatenay-Malabry，微生物實(shí)驗(yàn)室獲得的庫存臨床分離物獲得克雷伯氏桿菌.
從INSERM Unit411，Hpital Necker，Paris，F(xiàn)rance，獲得耶爾森氏桿菌。
從Faculte de Pharmacie Paris XI，Chatenay-Malabry，F(xiàn)rance的微生物實(shí)驗(yàn)室的庫存臨床分離物獲得銅綠假單胞菌。
從Institute of Microbiology，Lausanne University，Lausanne Switzerland獲得幽門螺桿菌。
實(shí)施例1雙歧桿菌的分離從15到27天大的健康嬰兒的尿布收集新鮮的糞便。1克新鮮糞便在無氧的條件下送到實(shí)驗(yàn)室，并且在從取樣開始的兩小時(shí)內(nèi)用Ringer溶液系列稀釋，并涂在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行微生物分析。密集的西紅柿瓊脂(罐裝西紅柿汁400ml，密集的瓊脂BBL45.5g，麥芽糖(Difco)10g，血晶素sigma 5mg，瓊脂(Difco)5g，蒸餾水600ml)37℃下培養(yǎng)48小時(shí)用于分離雙歧桿菌。隨機(jī)采集菌落并提純。對于分離株進(jìn)行生理學(xué)和遺傳學(xué)表征。
實(shí)施例2培養(yǎng)細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞細(xì)胞系Caco-2作為小腸的成熟的腸細(xì)胞模型，用于抑制作用的檢驗(yàn)。這種細(xì)胞具有腸細(xì)胞特征例如極化、腸酶表達(dá)、特定結(jié)構(gòu)多肽的制備等等。這些細(xì)胞在不同的載體上生長，也就是在塑料盤(25cm2Corning)用于生長和繁殖，在脫脂和滅菌6well玻璃皿(22×22mm，cornning)用于粘附和抑制試驗(yàn)。在培養(yǎng)第二天后按照日常規(guī)則改變培養(yǎng)基(DMEM)。在使用之前，用100U/ml的青霉素/鏈霉素，1μm氨芐青霉素，56℃30分鐘滅活的20％FC和含有非必需氨基酸溶液1％(10Mm)(Eurobio，Paris，F(xiàn)rance)補(bǔ)充培養(yǎng)基。在90％的空氣和10％的CO2組成的大氣中37℃下培養(yǎng)。這些細(xì)胞每六天分離一次。這些細(xì)胞在PBS中pH7.2條件下用0.015％胰酶和3mM EDTA進(jìn)行處理。為了中和胰酶的作用，等體積的含有FCS的培養(yǎng)基加入獲得的細(xì)胞懸浮液，將這些混合物離心分離(1000轉(zhuǎn)10分鐘)然后在培養(yǎng)基介質(zhì)中溶解分離產(chǎn)物。計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量(不用苔盼藍(lán)染色)。大約3.5×105活細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶，每個(gè)孔大約1.4×105細(xì)胞并培養(yǎng)直到獲得細(xì)胞融合單層。
T84細(xì)胞為了分析粘附性，細(xì)胞系T84作為腸的結(jié)腸細(xì)胞樣品。這些細(xì)胞系具有腸細(xì)胞的特征例如極性、腸酶表達(dá)、特別結(jié)構(gòu)多肽的生產(chǎn)等等。從University ofCalifornia，San Diego，CA.獲得T84細(xì)胞。在90％的空氣和10％的CO2組成的大氣中37℃條件下細(xì)胞在DMEM(50％)和Ham`s F12(50％)中生長，用2mM谷氨酸鹽，50mM HEPES，1％非必需氨基酸和10％的滅活(30分鐘，56℃)胎牛血清(Boehringer，Mannheim，Germany)補(bǔ)充。細(xì)胞以106/cm2的濃度接種。細(xì)胞最遲在匯合后也就是在10天以后進(jìn)行粘附性能檢驗(yàn)。
除了雙歧桿菌外所有的菌株-80℃維持在含有15％甘油的培養(yǎng)基中。因?yàn)檗D(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基的數(shù)目對于粘附因子有影響，在24小時(shí)內(nèi)只轉(zhuǎn)移2次沙門氏菌株，第一次在菌株處于冰凍狀態(tài)時(shí)轉(zhuǎn)移。所有培養(yǎng)物進(jìn)行有氧的培養(yǎng)。
雙歧桿菌
雙歧桿菌菌株(長雙歧桿菌CNCM I-2169(B128/Cal)和長雙歧桿菌CNCMI-2170(BL29/F9)在-20℃貯存在含有15％甘油的MRS培養(yǎng)基中。在抑制性能檢測之前這些菌株在無氧條件下在MRS中生長并以24小時(shí)的間隔轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中兩次。用于檢測的濃度是2×109cfu/ml。通過以20,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離1小時(shí)獲得上清液，然后檢測存在的細(xì)菌。雙裂菌菌株在MRS37℃無氧培養(yǎng)18小時(shí)。然后離心分離(4℃，20分鐘)這些培養(yǎng)基，收集上清液，凍干，轉(zhuǎn)變成溶液然后離心分離10次(10×)。上清液的pH值最后調(diào)節(jié)到4.5。
E大腸桿菌C1845在解凍后第一次傳代在CFA-Muller Hinton瓊脂上進(jìn)行，這種瓊脂適合于完成細(xì)菌粘附因子表達(dá)。在每一次試驗(yàn)前，在每24個(gè)小時(shí)轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基細(xì)菌細(xì)胞在37℃培養(yǎng)。
克雷伯氏桿菌在37℃條件下細(xì)菌在Luria肉湯中過夜培養(yǎng)18小時(shí)。
耶爾森氏桿菌在37℃條件下細(xì)菌在Luria肉湯中過夜培養(yǎng)18小時(shí)。
銅綠假單胞菌在37℃條件下細(xì)菌在Luria肉湯中過夜培養(yǎng)18小時(shí)。
幽門螺桿菌細(xì)菌在含有0.25％的酵母提取物(Difco Laboratories，Detroit，MI)，10％的馬血清和0.4％的Campylobacter選擇性補(bǔ)充劑(Skirrow supplement，SR69；Oxoid Ltd，Basingstoke，England).的腦-心-浸液(BHI)-瓊脂板中培養(yǎng).
實(shí)施例4B1288Cal和BL29/F9對T84和Caco-2細(xì)胞的粘附在玻璃蓋玻片上制備的Cac)-2和T84單層用磷酸鹽緩沖劑(PBS)洗滌兩次，所說的玻璃蓋玻片放在6孔Corning組織培養(yǎng)皿中(Corning Glass Works，Corning，NY)。將雙歧桿菌1ml，4×108細(xì)菌/ml spent培養(yǎng)基上清液，處理上清液或新鮮的MRS肉湯)加入1ml的這種細(xì)胞培養(yǎng)基中。這種上清液(2ml)加入每個(gè)組織培養(yǎng)基皿的孔中并將其在37℃ 10％CO2/90％的空氣中培養(yǎng)。在培養(yǎng)1小時(shí)后，這種單層用滅菌PBS洗滌5次，用甲醇固化，用革蘭氏染色劑染色，用顯微鏡進(jìn)行檢測。每一次粘附檢測連續(xù)進(jìn)行三次腸細(xì)胞的重復(fù)試驗(yàn)。對于每一個(gè)玻璃蓋上的單層在20個(gè)任意的顯微區(qū)域評估粘附細(xì)菌的數(shù)目。為了排除人為因素，由兩個(gè)不同的技術(shù)人員評估粘附。
試驗(yàn)結(jié)果如
圖1所示，很明顯B128/Cal和BL29/F9都有粘附在腸細(xì)胞的能力并可以和已知的細(xì)胞系GG(WO97/00078)或Lal(EP0577903)相比。
實(shí)施例5雙歧桿菌的抗病活性選用了病原性細(xì)菌大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、耶爾森氏桿菌、銅綠假單胞菌和幽門螺桿菌。
細(xì)菌(B128/Cal或BL29/F9)的培養(yǎng)基在MRS培養(yǎng)基總保持18小時(shí)，產(chǎn)生指數(shù)增長的培養(yǎng)物(37℃3小時(shí))。取出2ml溶液在4℃5500g離心分離5分鐘。在收集上清液后，沉淀用滅菌PBS洗滌。在離心分離后，收集沉淀加入2ml無菌PBS。計(jì)數(shù)細(xì)菌并按照濃度在1到5×106之間細(xì)菌/ml制成懸浮液。
按照Lehrer等J.Imunol.Methods 137(1991)，167-173描述的Lehrer法對本發(fā)明的雙歧桿菌的抗菌的作用進(jìn)行了檢驗(yàn)，這項(xiàng)方法的文件請見參考文獻(xiàn)。檢驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示。
從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出本發(fā)明的雙歧桿菌可以有效的抑制各種病原細(xì)菌的生長。
實(shí)施例6抑制沙門氏菌的檢驗(yàn)沙門氏菌是一種侵入表皮細(xì)胞并在那里大量繁殖的細(xì)菌。為了測定本發(fā)明雙歧桿菌的抑制鼠沙門氏菌的能力，采用了菌株SL1344和如下的方法。
在LB-培養(yǎng)基中培養(yǎng)病原細(xì)胞。在第二次傳代到新的培養(yǎng)基之后，采用10μCi/ml放射性同位素C14-醋酸鹽在LB-培養(yǎng)基中標(biāo)記細(xì)菌菌株。在該培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)18小時(shí)。
隨后離心分離(1041rpm，15分鐘)細(xì)菌懸浮液，從上清液中去除殘余的C14-醋酸鹽。將沉淀在PBS中懸浮并洗滌，這些細(xì)胞以大約108細(xì)胞/ml的濃度在1％的滅菌甘露糖溶液中懸浮。甘露糖抑制非特異性粘附。然后將細(xì)菌溶液調(diào)整到2×108細(xì)胞/毫升。
在37℃將病原菌(1ml；2×108細(xì)胞)和一部分(1ml)雙歧桿菌培養(yǎng)基的上清液預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)。然后離心分離懸浮液，去除得到的上清液，將沉淀在0.5ml的PBS中再一次懸浮。隨后將病原菌溶液(0.5ml)和人類腸細(xì)胞在培養(yǎng)物中接觸。培養(yǎng)物用滅菌PBS洗滌兩次并加入0.5ml粘附培養(yǎng)基(DMEM)。然后在37℃在10％CO2條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞1小時(shí)。
在培養(yǎng)后，計(jì)算培養(yǎng)基中和在腸細(xì)胞上/內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目。為了測定粘附在細(xì)胞上的量或侵入腸細(xì)胞的量，采用了如下方法。
為了測量粘附細(xì)菌的數(shù)目，輕輕倒出培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基介質(zhì)洗滌一次，用滅菌PBS洗滌一次。隨后，每個(gè)間隔加入1ml滅菌水，溶胞細(xì)胞并形成細(xì)胞溶液，在37℃培養(yǎng)1-2小時(shí)，然后連續(xù)稀釋。為了計(jì)數(shù)粘附和侵入的細(xì)菌數(shù)目，離心分離細(xì)胞溶液去除細(xì)胞碎片然后測量放射性。
按照另一個(gè)方案，將10等分試樣加在TSA培養(yǎng)基上。然后在37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。
為了測量侵入細(xì)菌的量，Caco-2細(xì)胞用PBS洗滌以去除所有的沒有粘附的細(xì)胞。隨后，加入含有慶大霉素(20μg/ml)的培養(yǎng)基并在37℃連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。慶大霉素是一種抗生素但不進(jìn)入腸細(xì)胞，于是所有的細(xì)胞外的微生物都被殺死，而已經(jīng)侵入腸細(xì)胞的細(xì)菌將存活。這些細(xì)胞然后在37℃再培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)并用PBS洗滌兩次。在37℃通過加入滅菌蒸餾水和培養(yǎng)，來溶胞這些細(xì)胞。在去除了細(xì)胞碎片后，測量放射性。按照另一個(gè)方案采用TSA培養(yǎng)基連續(xù)稀釋。在37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。
可以看出培養(yǎng)的細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液對于防止沙門氏菌的粘附和侵入腸細(xì)胞具有極其有效的作用。
實(shí)施例7鼠沙門氏菌C5菌株感染小鼠成年、7-8周大的無菌雌性小鼠(C3H/He/oujco conventional，Iffa Credo，F(xiàn)rance)，在無菌條件下飼養(yǎng)，用固定濃度的鼠沙門氏菌(0.2ml，108cfu/每只小鼠)通過口服感染。一些小鼠植入雙歧桿菌從而成為單主寄生物。將這些小鼠的腸子片段用PBS洗滌并切碎，計(jì)算雙歧桿菌的數(shù)目。另一些小鼠保持在無菌環(huán)境中，和對照組的小鼠的存活天數(shù)進(jìn)行比較。
結(jié)果如圖5所示，正如所推測的，對照組幾乎所有的小鼠在大約10天左右死掉。與此對比，用BL29/F9處理的所有的小鼠都活過10天，只有20％的小鼠在30天以后被沙門氏菌致死。這些試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的雙歧桿菌有極其有效的上述性能。
關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
權(quán)利要求
1.能夠預(yù)防引起腹瀉的細(xì)菌在腸內(nèi)建群的雙歧桿菌的培養(yǎng)物上清液在可吸收的載體物質(zhì)中的應(yīng)用。
2.雙歧桿菌的應(yīng)用，其中用于制備可吸收的載體物質(zhì)的雙歧桿菌是長雙歧桿菌CNCM1-2169(B128/Cal)或長雙歧桿菌CNCM1-2170(BL29/F9)。
3.權(quán)利要求2中的應(yīng)用，其中的雙歧桿菌在載體物質(zhì)中的含量為大約105cfu/g到大約1012fu/g載體物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1到3中的應(yīng)用，其中所使用的載體物質(zhì)是一種食物組合物選自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、發(fā)酵奶、奶基發(fā)酵產(chǎn)品、冰激凌、谷類發(fā)酵產(chǎn)品、奶粉、嬰兒食品、寵物食品或片劑、液體細(xì)菌懸浮液、干口服補(bǔ)充劑、濕口服補(bǔ)充劑、干的管飼、濕的管飼或?qū)櫸锸称贰?br> 5.權(quán)利要求1到4任一權(quán)利要求的應(yīng)用，其中的載體物質(zhì)用于治療和/或預(yù)防腹瀉相關(guān)的失調(diào)。
6.能夠防止引起腹瀉的細(xì)菌建群的雙歧桿菌，它是長雙歧桿菌CNCM1-2169(B128/Cal)或長雙歧桿菌CNCM1-2170(BL29/F9)。
7.含有至少一種權(quán)利要求6雙歧桿菌或能夠防止腹瀉的雙歧桿菌培養(yǎng)物上清液的食物或藥物組合物。
8.權(quán)利要求7的組合物，選自奶、酸奶酪、凝乳、干酪、發(fā)酵奶、奶基發(fā)酵產(chǎn)品、冰激凌、谷類發(fā)酵產(chǎn)品、奶粉、嬰兒食品、寵物食品，片劑、液體細(xì)菌懸浮液、干口服補(bǔ)充劑、濕口服補(bǔ)充劑、干的管飼、濕的管飼或?qū)櫸锸称贰?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及雙歧桿菌屬的新的微生物,它能夠防止病原性細(xì)菌引起的腹瀉。特別是,本發(fā)明涉及所說的微生物在可吸收的載體的制備方面的應(yīng)用以及含有這種微生物的組合物。
文檔編號A23L1/03GK1369005SQ00811245
公開日2002年9月11日 申請日期2000年7月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月5日
發(fā)明者J·－R·尼澤爾, R·雷尼羅, F·羅查特, A·賽文 申請人:雀巢制品公司