專利名稱：慢病毒載體系統(tǒng)，產(chǎn)生載體的方法及其應(yīng)用的制作方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種慢病毒載體系統(tǒng)，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及能感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂或不分裂哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的慢病毒載體系統(tǒng)，載體不含有或少含有輔助基因和重疊基因，以及利用痘病毒產(chǎn)生慢病毒載體的方法以及獲得的慢病毒載體在制備藥品或治療疾病中的應(yīng)用。
現(xiàn)在基因傳遞系統(tǒng)分為兩類病毒型和非病毒型。從各種病毒衍生出的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、picarnovirus、假病毒屬等。慢病毒載體被認(rèn)為是目前最有潛力的用于基因治療的載體，慢病毒載體通過(guò)慢病毒衍生而來(lái)。HIV、SIV和FIV等都屬于這個(gè)家族的。
基于HIV的載體是目前研究得最多的一種。它們被證明能在體內(nèi)高效的轉(zhuǎn)移基因，并能完成傳遞基因在各種器官中長(zhǎng)期表達(dá)，像在腦中，視網(wǎng)膜中，肝中和肌肉中。再有它能把基因轉(zhuǎn)移到分化的細(xì)胞和未分化的細(xì)胞。而且，用這個(gè)帶有基因地載體可以被簡(jiǎn)單的注射液傳輸。最后，這個(gè)載體為了達(dá)到不同的靶細(xì)胞和組織可用各種各樣不同類型的包膜蛋白包裝成病毒粒子。通過(guò)改變胞膜，載體粒子還可以避開先前形成的抗特殊胞膜的抗體。
Iwakuma.T.等建立一個(gè)HIV-1衍生載體生產(chǎn)系統(tǒng)，包括三個(gè)質(zhì)粒一個(gè)包裝載體pHP2，一個(gè)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTV，和一個(gè)可編碼質(zhì)粒pHEF-VSV-G。把這三個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)TE671人類橫紋肌肉瘤細(xì)胞一天能產(chǎn)生出105-106感染濃度/每毫升病毒載體。它們修飾了PTV的長(zhǎng)重復(fù)末端，構(gòu)建了一個(gè)安全的慢病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，用切除末端的巨細(xì)胞病毒的早期直接增強(qiáng)啟動(dòng)子替代5’端U3，并刪除了3’端U3，即使這種優(yōu)勢(shì)修飾也有產(chǎn)生衍生病毒的可能。再刪除3’端U5則會(huì)削弱載體的功能，導(dǎo)致這個(gè)系統(tǒng)的安全性都比較低。
由Naldini等創(chuàng)立的，并由Dull等發(fā)展完善的慢病毒載體系統(tǒng)里，單獨(dú)編碼HIV gag/pol，Rev，VSV-G胞膜蛋白和RNA載體的4個(gè)質(zhì)粒要用于轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。當(dāng)HIV-1前體多聚蛋白gag/pol和Gag在生產(chǎn)載體粒子的細(xì)胞表達(dá)后，它們接著包裝載體RNA并從細(xì)胞膜芽裂形成病毒粒子，當(dāng)VSV-G蛋白與Gag/Pol共表達(dá)，得到的質(zhì)粒將會(huì)在其表面存在VSV-G蛋白，這就可以使粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞更容易。盡管這個(gè)包裝系統(tǒng)限制了很多HIV附屬蛋白的表達(dá)，但由于有幾個(gè)重疊區(qū)，所以有可能引起重組產(chǎn)生復(fù)制的活病毒，一個(gè)是RRE編碼序列，有234bp長(zhǎng)，而且存在于載體RNA編碼質(zhì)粒和編碼gag/pol的質(zhì)粒中。第二個(gè)是在5’末端編碼區(qū)域長(zhǎng)350bp得到一個(gè)含有5’LTR的DNA片斷，剪接供體和受體，gag/pol，RRE，和3’段LTR的重組型，可以增加活病毒的復(fù)制。再有這個(gè)系統(tǒng)需要用4個(gè)不同質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)入一個(gè)核的可能性比一個(gè)或兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)入核的可能性低得多，這肯定會(huì)減低生產(chǎn)效率。慢病毒載體的報(bào)道序列通常只有105的轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)用于小規(guī)模的生產(chǎn)。最后，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，一些質(zhì)粒會(huì)整合到宿主細(xì)胞的染色體上，這個(gè)系統(tǒng)用修飾了的細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)載體粒子，它有從載體生產(chǎn)細(xì)胞里得到致癌基因地潛在危險(xiǎn)性，并把基因整合到受體細(xì)胞的染色體上。
中國(guó)專利9719888.3采用在啟動(dòng)子位于5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的非慢病毒表達(dá)調(diào)控元件，且定位于LTR的中間，中國(guó)專利97198767.X提出了一種不含有或少含有慢病毒輔助基因的慢病毒載體，既是這樣，由于基因間存在著重疊區(qū)，存在著回復(fù)突變的危險(xiǎn)性，另外，各基因間的啟動(dòng)子處于雜亂無(wú)章中，影響相互之間的協(xié)調(diào)，導(dǎo)致產(chǎn)量不高。
盡管目前研究的眾多慢病毒載體有許多優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是在制備載體的過(guò)程中有形成的復(fù)制型病毒存在的潛在危險(xiǎn)性。這個(gè)安全性問(wèn)題阻礙了慢病毒載體用于人類的基因治療。另一個(gè)問(wèn)題是很難達(dá)到生產(chǎn)載體病毒的高滴度，這樣使這個(gè)載體系統(tǒng)很難用于治療。
發(fā)明技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新型的高安全性的慢病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)不含有輔助基因或重疊基因，安全性高。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)高滴度且安全性好的慢病毒載體的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是慢病毒載體在制備藥品和治療疾病中的應(yīng)用。
一種能感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂或不分裂哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的慢病毒載體系統(tǒng)，不含有或少含有輔助基因，其特征是慢病毒載體基因不含有或少含有重疊基因組，且所含基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間或痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間。
HIV-1病毒的輔助基因包括Vpr，Vif，Tat，Nef，以及其它慢病毒的類似輔助基因，不重疊基因指基因編碼序列不重疊，主要是指其結(jié)構(gòu)基因，蛋白基因和調(diào)控基因，特別是Rev及U3啟動(dòng)子一種優(yōu)化的慢病毒載體系統(tǒng)，其慢病毒載體基因包括
(1)GAG-POL基因處于痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間；(2)VSV-G基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間；(3)載體RNA編碼序列處于T7啟動(dòng)子和終止子之間。一種更優(yōu)化的慢病毒載體系統(tǒng)，其慢病毒載體基因包括(1)來(lái)源于HIV-1的GAG-POL基因處于痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間；(2)來(lái)源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間；(3)載體RNA編碼序列處于T7啟動(dòng)子和終止子之間，且T7啟動(dòng)子之后連著3個(gè)G核甘酸序列，再于R和U5相連。
來(lái)源于HIV-1的GAG-POL基因最好處于痘病毒PvacE/L啟動(dòng)子和Tvac終止子之間；載體RNA編碼序列從5’端到3’端的最佳順序?yàn)門7啟動(dòng)子，3G序列，R，U5，起始子結(jié)合位點(diǎn)，包裝信號(hào)，CMV啟動(dòng)子，增強(qiáng)性綠色熒光蛋白編碼區(qū)，多聚嘌呤序列(PPT)，U3，3G序列，R，和T7終止子。
由于包膜上含有VSV-G蛋白容易引起細(xì)胞融合，而且VSV-G蛋白在載體的生產(chǎn)細(xì)胞里過(guò)量表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致大量的細(xì)胞融合，因此采用傳統(tǒng)的系統(tǒng)生產(chǎn)載體粒子會(huì)降低載體粒子的產(chǎn)量。本發(fā)明為了抑制VSV-G蛋白在包裝細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)，用T7啟動(dòng)子調(diào)控VSV-G蛋白表達(dá)。在用再用含T7噬菌體RNA聚合酶的痘病毒感染細(xì)胞，只有10％T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄物加了帽，能被宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)表達(dá)。用T7RNA聚合酶能抑制有功能的mRNA及其蛋白的合成。再者，在載體RNA編碼序列里，直接在T7啟動(dòng)子后設(shè)置了三個(gè)G，以提高T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效率，得到的載體RNA轉(zhuǎn)錄物在5’端有三各G，在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，有載體5’端復(fù)制的強(qiáng)終止子DNA與載體RNA3’端通過(guò)3’R的堿基互補(bǔ)配對(duì)退火。為了使逆轉(zhuǎn)錄不斷進(jìn)行，在3’U3和R之間需有三個(gè)G才能同強(qiáng)終止子DNA 3’末端的3個(gè)G互補(bǔ)配對(duì)，HIV-1HB株的基因組RNA在3’U3和R中間有3個(gè)G。這樣的基因結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的質(zhì)粒，保證了構(gòu)建載體系統(tǒng)的安全性和載體的高滴度在這個(gè)載體系統(tǒng)里依賴含T7RNA聚合酶的痘病毒的轉(zhuǎn)錄安全在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，不需要HIV、Tat和Rev那種中間型的反勢(shì)激活；再有，在包裝系統(tǒng)中進(jìn)行，也不需要U3啟動(dòng)子的功能；這個(gè)載體整合到宿主染色體后不會(huì)機(jī)會(huì)宿主細(xì)胞的癌基因，減少致病可能。為了克服在用痘病毒復(fù)制機(jī)制產(chǎn)生病毒載體中的污染感染性的痘病毒的重要問(wèn)題，最佳方法是采用一個(gè)缺少必須基因D13L的缺陷型痘病毒。
一種生產(chǎn)慢病毒載體系統(tǒng)的方法，其特征是制備不含有或少含有重疊基因組，且基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間或痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間的質(zhì)粒組，將質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，再用含T7噬菌體RNA聚合酶的痘病毒感染已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的宿主細(xì)胞而獲得慢病毒載體。
一種優(yōu)化的生產(chǎn)慢病毒載體系統(tǒng)的方法，其特征是制備下列質(zhì)粒組(1)在痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間的，來(lái)源于HIV-1的GAG-POL質(zhì)粒；(2)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的，來(lái)源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G質(zhì)粒；(3)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的載體RNA編碼序列質(zhì)粒，且在T7啟動(dòng)子之后連著3個(gè)G核甘酸序列，再與R和U5相連；將上述三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再用含T7噬菌體RNA聚合酶的痘病毒感染已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的宿主細(xì)胞而獲得慢病毒載體。
一種更優(yōu)化的生產(chǎn)慢病毒載體系統(tǒng)的方法是先制備下列質(zhì)粒組(1)痘病毒PvacE/L啟動(dòng)子和Tvac終止子之間的，來(lái)源于HIV-1的GAG-POL質(zhì)粒；(2)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的，來(lái)源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G質(zhì)粒；(3)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的載體RNA編碼序列質(zhì)粒，且從5’端到3’端的順序?yàn)門7啟動(dòng)子，3G序列，R，U5，起始子結(jié)合位點(diǎn)，包裝信號(hào)，CMV啟動(dòng)子，增強(qiáng)性綠色熒光蛋白編碼區(qū)，多聚嘌呤序列，U3，3G序列，R，和T7終止子；將上述三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再用含T7噬菌體RNA聚合酶的痘病毒或者用含T7噬菌體RNA聚合酶的D13L缺陷型痘病毒感染已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的宿主細(xì)胞而獲得慢病毒載體。
D13L是編碼一個(gè)病毒粒子組裝所需的65kDa結(jié)構(gòu)蛋白的。抑制它的表達(dá)不會(huì)影響病毒DNA的復(fù)制和病毒蛋白的合成，但會(huì)阻截病毒的形成，從而生產(chǎn)的載體中不含有痘病毒。
將在痘病毒啟動(dòng)子(PvacE/L)和終止子(Tvac)之間的HIV-1HXB2gag/pol多聚蛋白的開放閱讀框克隆到質(zhì)粒pUCl9的多克隆位點(diǎn)，從而得到pGAG-POL-Vpr，屬于PNL4/3基因型。含有HIV-1HXB2gag/pol多聚蛋白的開放閱讀框的pGAG-POL-Vpr質(zhì)粒于2001年4月19日保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC M201014。
將在噬菌體T7啟動(dòng)子和終子之間的皰疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白開放閱讀框克隆到質(zhì)粒pT7的多克隆位點(diǎn)，從而得到質(zhì)粒pVSV-G。在噬菌體T7啟動(dòng)予和終止子之間的疤疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白開放閱讀框的pVSV-G質(zhì)粒于2001年4月19日保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCCM201015。
在T7啟動(dòng)子和終止子之間的RNA編碼序列，該序列的編碼區(qū)排列順序?yàn)閺?’端到3’端順序是R，UR，起始子結(jié)合位點(diǎn)，包裝信號(hào)，CMV啟動(dòng)子，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼區(qū)，多聚嘌吟序列，U3利R的質(zhì)粒，克隆到質(zhì)粒pBR322的多克隆位點(diǎn)，從而得到質(zhì)粒pHIV，屬于PNL4/3基因型。在T7啟動(dòng)子和終止子之間的RNA編碼序列的pHIV質(zhì)粒于2001年4月19門保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC M201017。
采用Lipofect Amine轉(zhuǎn)染法，用等量的pGAG-POL-Vpr、pVSV-G和pHIV共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系，培養(yǎng)液是含2.5％胎牛血清的DMEM。經(jīng)過(guò)4個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有107pfuvTF7.3或vT7D13L重組痘病毒。經(jīng)2小時(shí)的接種后，除去接種物，細(xì)胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)48小時(shí)的溫育后，收集含HIV-1型慢病毒裁體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
與先前的載體系統(tǒng)及生產(chǎn)載體的系統(tǒng)比較，本發(fā)明的慢病毒載體系統(tǒng)和生產(chǎn)方法的優(yōu)點(diǎn)是1.由這個(gè)系統(tǒng)生產(chǎn)出來(lái)的載體其生物安全性比現(xiàn)在所說(shuō)的各種慢病毒載體都好。首先，我們從基因中除掉慢病毒的輔助蛋白基因和相應(yīng)序列，以及重疊基因，包括Vpr，Vif，Tat，Nef，TAR，RRE，Rev及U3啟動(dòng)子，這樣將會(huì)完全阻止活的慢病毒的復(fù)制。其次，因?yàn)檩d體的生產(chǎn)是完全在細(xì)胞質(zhì)里進(jìn)行的，大大減少了從生產(chǎn)載體粒子的細(xì)胞里攜帶基因到受體細(xì)胞的危險(xiǎn)性。
2.本發(fā)明的載體系統(tǒng)里質(zhì)粒只需要轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞里，因此轉(zhuǎn)運(yùn)效率要比轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中高很多；另外細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒DNA將被痘病毒DNA聚合酶復(fù)制，導(dǎo)致載體RNA的復(fù)制數(shù)和包裝蛋白的合成將會(huì)增加，而且其自身蛋白質(zhì)的合成依賴痘病毒的感染，宿主的蛋白合成機(jī)制將被動(dòng)痘病毒同化，這將增加包裝組分的合成。
本發(fā)明的慢病毒載體或本發(fā)明制備的載體在制備藥品或治療疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明的慢病毒載體可以被簡(jiǎn)單的注射液傳輸。
術(shù)語(yǔ)“載體RNA”是指含有一個(gè)外源基因表達(dá)框并能被包裝成病毒粒子的RNA。
術(shù)語(yǔ)“病毒粒子”是指一個(gè)病毒基因組核苷酸被包裝好的病毒。
術(shù)語(yǔ)“載體粒子”是指編碼一個(gè)表達(dá)框的核苷酸被包裝好的修飾過(guò)的病毒粒子。
術(shù)語(yǔ)“缺陷型痘病毒”是指缺少一個(gè)親本痘病毒必須基因的痘病毒。
圖4顯示了制備缺陷型痘病毒vTF7-3D13L的示意圖實(shí)施例2外膜蛋白質(zhì)粒的構(gòu)造將在噬菌體T7啟動(dòng)子和終子之間的皰疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白開放閱讀框克隆到質(zhì)粒pT7的多克隆位點(diǎn)，從而得到質(zhì)粒pVSV-G。在噬菌體T7啟動(dòng)予和終止子之間的疤疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白開放閱讀框的pVSV-G質(zhì)粒于2001年4月19日保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCCM201015。
實(shí)施例3，載體RNA編碼序列質(zhì)粒的構(gòu)造在T7啟動(dòng)子和終止子之間的RNA編碼序列，該序列的編碼區(qū)排列順序?yàn)閺?’端到3’端順序是R，UR，起始子結(jié)合位點(diǎn)，包裝信號(hào)，CMV啟動(dòng)子，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼區(qū)，多聚嘌吟序列，U3利R的質(zhì)粒，克隆到質(zhì)粒pBR322的多克隆位點(diǎn)，從而得到質(zhì)粒pHIV，屬于PNL4/3基因型。在T7啟動(dòng)子和終止子之間的RNA編碼序列的pHIV質(zhì)粒于2001年4月19門保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCCM201017。
實(shí)施例4檢測(cè)載體生產(chǎn)細(xì)胞里的載體RNA、VSV-G蛋白、Gag和Gag-Pol的表達(dá)。
為了確定在用了質(zhì)粒pVEC RNA、pGAG/POL和pVSV-G轉(zhuǎn)染再用重組痘病毒VTG7-3感染的HeLa細(xì)胞的載體RNA、VSV-G蛋白和包裝蛋白的表達(dá)。我們用Westem印跡除去Gag(55kDa)、Gag-pol(160kDa)，用Northen印跡除去全長(zhǎng)載體RNA。用DNA酶處理從生產(chǎn)細(xì)胞里抽提的RNA，防止由遺留質(zhì)粒DNA引起的假陽(yáng)性。
實(shí)施例5檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液里的載體粒子為了檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液里的載體粒子，我們檢測(cè)HIV-1殼蛋白P24，逆轉(zhuǎn)錄酶活性和載體RNA。用0.2μm的濾膜過(guò)濾上清，除去細(xì)胞和殘?jiān)苊釮IV殼蛋白殘留，和細(xì)胞里的載體RNA的殘留。
檢測(cè)P24。P24是HIV-1的殼蛋白。它經(jīng)常作為病毒粒子數(shù)量的指示劑?？捎肊LISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清里含有的P24。
檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶存在于HIV病毒體里。它是在病毒體組裝時(shí)病毒的蛋白水解酶剪切了前體Gag/Pol多聚蛋白形成的P51和P66的二聚體。這個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶的活性通常也作為載體粒子的指示劑。通常用于檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性的方法是，檢測(cè)抗原接觸過(guò)酌dT，這個(gè)dT以在有polyA為模板時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)記上[a-32pIdTTPl。
檢測(cè)載體RNA，這個(gè)載體RNA能用RTPCR來(lái)檢測(cè)。只有用RTPCR去肯定只有RNA被包裝到載體粒子里，去除從破裂細(xì)胞里釋放到培養(yǎng)基的RNA和編碼載體RNA的質(zhì)粒DNA這很重要。為了這個(gè)目的，要用RNA酶去處理載體生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的上清液。被包膜保護(hù)的載體RNA要用硫氰酸胍再用苯酚氯仿抽提。用乙酸沉淀后，用水溶解RNA沉淀，再用DNA酶處理除去DNA。滅活DNA酶后，就可以用RTPCR法來(lái)去除RNA里的載體RNA了。可用400-500bp片段的報(bào)導(dǎo)基因作為起始子(引物)。如果載體RNA存在，DNA鏈的合成時(shí)必需用RTPCR而不是PCR。再有，全長(zhǎng)載體RNA能用Northern印跡去除。為了達(dá)到用Northern印跡分析載體RNA的納克水平，載體粒子需在抽提RNA前用超速離心法濃縮。
實(shí)施例6檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率制備的載體粒子的轉(zhuǎn)化效率由兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)判斷轉(zhuǎn)化滴度和原始細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力。轉(zhuǎn)化的測(cè)量包括報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)和受體細(xì)胞的藥物抗性基因。
靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)化載體粒子被VSV-G蛋白包裹，因此在將載體粒子與靶細(xì)胞共同孵育時(shí)載體應(yīng)可進(jìn)入廣譜的宿主細(xì)胞里。先進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，可用人類細(xì)胞如hela細(xì)胞檢測(cè)載體粒子。如果成功，可用原始分化細(xì)胞和未分化細(xì)胞作為受體細(xì)胞。在初始研究中，應(yīng)用復(fù)制型痘病毒重組體轉(zhuǎn)錄載體粒子。在載體粒子的制備物中殘余的痘病毒會(huì)在幾天內(nèi)在細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)散。為了避免痘病毒的感染，可以把EGFP的增加作為一個(gè)指示，在24小時(shí)宿主轉(zhuǎn)化中EGFP的表達(dá)將被清除。當(dāng)用缺陷型重組痘病毒作載體粒子的轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，藥物抗性標(biāo)記(如，磷酸轉(zhuǎn)移新霉素)可被用于篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
載體粒子的滴度測(cè)定測(cè)定載體粒子的滴度，要把靶細(xì)胞和經(jīng)過(guò)一系列稀釋的載體粒子生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液起接種。然后計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。利用載體所帶的報(bào)導(dǎo)基因或藥物抗性基因來(lái)觀察或篩選細(xì)胞。
實(shí)施例7檢測(cè)清除載體制備物中的活的復(fù)制型HIV-1理論上，我們的包裝系統(tǒng)不會(huì)在載體粒子產(chǎn)物中出現(xiàn)活的復(fù)制型HIV-1。但因?yàn)檫@個(gè)HI-1衍生載體將用于人類的基因治療，我們必須肯定復(fù)制型活的HIV-1病毒不存在于載體粒子制備物中。我們用于指示復(fù)制型活HIV-1病毒存在的指示劑是重組產(chǎn)物5’LTR-gag/pol-3’LTR的存在。盡管5’LTRgag/pol-3，LTR本身不會(huì)導(dǎo)致復(fù)制型活HIV-1的出現(xiàn)，但這樣的序列出現(xiàn)標(biāo)志著通過(guò)復(fù)制型活病毒的重組也許出現(xiàn)。
為了檢測(cè)5’LTR-gag/pol-3’LTR序列，HeLa細(xì)胞要和制備好的載體粒子一起接種，比例是每十個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)一個(gè)載體，這樣確保有足夠的載體粒子的受體細(xì)胞。把細(xì)胞進(jìn)行無(wú)選擇培養(yǎng)。定期從細(xì)胞里抽提DNA，除去5’LTR-gag/pol-3’LTR，再用PCR法插入。
實(shí)施例8構(gòu)建D13L一缺陷型痘病毒為了用痘病毒作為輔助去生產(chǎn)慢病毒載體，需構(gòu)建一個(gè)D131基因缺陷的能自由復(fù)制的活病毒。ZhangY和B.Moss已報(bào)導(dǎo)構(gòu)建出一個(gè)重組痘病毒，他用Escherichia.coli(大腸桿菌)乳糖操縱子調(diào)控D13L基因表達(dá)。但在抑制劑IPTG存在時(shí)得到重組痘病毒的復(fù)制不能被完全抑制，這是由于有D13L基因殘余轉(zhuǎn)錄物存在。為了完全去除D13L基因的表達(dá)，我們計(jì)劃用細(xì)菌的gpt基因替代在vTF7-3里的D13L基因，從而除去痘病毒基因組中的D13L基團(tuán)。生產(chǎn)和選擇D13L缺陷型vTF7-3(vTF7-3ΔDl3L)的方法已在圖4中列出。
制備D13L缺陷型重組子的第一步是①構(gòu)建一個(gè)目標(biāo)質(zhì)粒。它包含一個(gè)在痘病毒前后啟動(dòng)子和終止子之間的gpt編碼組。gpt轉(zhuǎn)錄單元有兩個(gè)側(cè)翼500bp片段，且與D13L基因編碼區(qū)上下游的側(cè)翼序列同源。②用得到的質(zhì)粒pGPT轉(zhuǎn)染CV-I細(xì)胞(Arcc#ccL70)，再用vTF7-3重組痘病毒感染細(xì)胞。48小時(shí)后，收集細(xì)胞并裂解釋放出痘病毒粒。③篩選出D13L基因缺陷型重組體vTF7-3Δ13L。用含有在痘病毒前后啟動(dòng)子控制下的D13L基因的質(zhì)粒pDl31瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BS-C-11細(xì)胞(ATCC#CCL26)，然后用含有D13L缺陷型重組子的稀釋細(xì)胞裂解液。在存在MPA(mycophenolic acid)，黃嘌吟和次黃嘌吟時(shí)，由于pDl3L提供D13L基因gpt陽(yáng)性重組子將復(fù)制形成噬斑。收集噬斑，用32P-標(biāo)記的gptcDNA作為探針以Dotblootting法確定gpt基因的存在。Gpt陽(yáng)性病毒經(jīng)幾次BS-C-1細(xì)胞的MPA篩選進(jìn)一步純化。為了確定gpt陽(yáng)性病毒是D13L缺陷型，將進(jìn)行不提供D13L基因時(shí)BS-C-1細(xì)胞培養(yǎng)中病毒無(wú)能力形成噬斑的試驗(yàn)。
復(fù)制型牛痘菌病毒的檢測(cè)。為了增強(qiáng)檢測(cè)的敏感性，我們用B一半乳糖苷酶作為復(fù)制型痘苗病毒的指示劑。Hela以在痘苗啟動(dòng)子控制下含LacZ基因的質(zhì)粒瞬間感染，以使細(xì)胞被痘苗病毒感染后可表達(dá)β一半乳糖苷酶。對(duì)12孔板中轉(zhuǎn)染的Hela用產(chǎn)載體顆粒細(xì)胞的上清濾液(0.45μm)接種。分時(shí)固定并取樣觀察表達(dá)β酶的細(xì)胞。表達(dá)酶的細(xì)胞數(shù)增加就說(shuō)明制備物中存在復(fù)制型痘病毒。同時(shí)還應(yīng)做Hela培養(yǎng)的痘病毒噬斑形成。
實(shí)施例9檢測(cè)vTF7-3ΔDl3L生產(chǎn)能自由復(fù)制的活病毒的慢病毒載體粒子的能力。
用vTF7-3ΔDl3L生產(chǎn)慢病毒載體象“載體粒子牛產(chǎn)方法”里說(shuō)的去做。檢測(cè)包裝蛋白，VSV-G蛋白和載體RNA的表達(dá)，殼按“檢測(cè)載體RNA，VSV-G蛋白，6ag和Gag/pol在裁體生產(chǎn)細(xì)胞里表達(dá)”里的方法去做。檢測(cè)載體粒子則按“檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的載體粒子”里的方法去做。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率和活HIV的復(fù)制機(jī)制來(lái)檢測(cè)載體粒子制備物可按“檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率”和“清除在載體粒子里復(fù)制型活的HIV-1”里說(shuō)的方法去做。另外，復(fù)制型活的HIV-1將用以下方法檢測(cè)，保證載體制備物能自由復(fù)制活的痘病毒。
清除復(fù)制型活的痘病毒。為了增強(qiáng)檢測(cè)的敏感性，我們用β一半乳糖苷酶作為復(fù)制型痘苗病毒的指示劑。對(duì)Hela細(xì)胞用在痘病毒啟動(dòng)子控制下含lacZ基因的質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)感染，以便細(xì)胞被痘病毒感染后可表達(dá)β一半乳糖苷酶。對(duì)12孔板中轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞用產(chǎn)載體顆粒細(xì)胞的的上清濾液(0.45um)接種。分時(shí)固定并取樣觀察表達(dá)β一半乳糖苷酶的細(xì)胞。表達(dá)β一半乳糖苷酶的細(xì)胞數(shù)量增加就說(shuō)明制備物中存在復(fù)制型痘病毒。
同時(shí)噬菌斑的形成將檢測(cè)Hela細(xì)跑的培養(yǎng)。
實(shí)施例10測(cè)定HIV-1型基因轉(zhuǎn)移載體的滴度在24孔板中加入HeLa細(xì)胞，每孔105個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后，用含1％胎牛血清的Opti-DMEM(GIBCO-BRL)將收集的實(shí)施例⑤細(xì)胞培養(yǎng)物上清夜10倍稀釋，每孔加入1M1的稀釋后的上清液。24小時(shí)后，綠色熒光細(xì)胞就可以用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種能感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂或不分裂哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的慢病毒載體系統(tǒng)，不含有或少含有輔助基因，其特征是慢病毒載體基因不含有或少含有重疊基因組，且所含基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間或痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征是慢病毒載體基因不含有或少含有HIV-1輔助基因或重疊基因，Vpr，Vif，Tat，Nef，Rev及U3啟動(dòng)子
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征是慢病毒載體基因(1)GAG-POL基因處于痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間；(2)VSV-G基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間；(3)載體RNA編碼序列處于T7啟動(dòng)子和終止子之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征是慢病毒載體基因(1)來(lái)源于HIV-1的GAG-POL基因處于痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間；(2)來(lái)源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間；(3)載體RNA編碼序列處于T7啟動(dòng)子和終止子之間，且T7啟動(dòng)子之后連著3個(gè)G核甘酸序列，再于R和U5相連。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征是載體RNA編碼序列從5’端到3’端的順序?yàn)門7啟動(dòng)子，3G序列，R，U5，起始子結(jié)合位點(diǎn)，包裝信號(hào)，CMV啟動(dòng)子，增強(qiáng)性綠色熒光蛋白編碼區(qū)，多聚嘌呤序列(PPT)，U3，3G序列，R，和T7終止子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征是來(lái)源于HIV-1的GAG-POL基因處于痘病毒PvacE/L啟動(dòng)子和Tvac終止子之間；
7.生產(chǎn)權(quán)利要求1-6所述的慢病毒載體系統(tǒng)的方法，其特征是制備不含有或少含有重疊基因組，且基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間或痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間的質(zhì)粒組，將質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，再用含T7噬菌體RNA聚合酶的痘病毒感染已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的宿主細(xì)胞而獲得慢病毒載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的慢病毒載體生產(chǎn)方法，其特征是制備下列質(zhì)粒組(1)在痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間的，來(lái)源于HIV-1的GAG-POL質(zhì)粒；(2)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的，來(lái)源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G質(zhì)粒；(3)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的載體RNA編碼序列質(zhì)粒，且在T7啟動(dòng)子之后連著3個(gè)G核甘酸序列，再與R和U5相連；將上述三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再用含T7噬菌體RNA聚合酶的痘病毒感染已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的宿主細(xì)胞而獲得慢病毒載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的慢病毒載體生產(chǎn)方法，其特征是制備下列質(zhì)粒組(1)痘病毒PvacE/L啟動(dòng)子和Tvac終止子之間的，來(lái)源于HIV-1的GAG-POL質(zhì)粒；(2)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的，來(lái)源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G質(zhì)粒；(3)在T7啟動(dòng)子和終止子之間的載體RNA編碼序列質(zhì)粒，且從5’端到3’端的順序?yàn)門7啟動(dòng)子，3G序列，R，U5，起始子結(jié)合位點(diǎn)，包裝信號(hào)，CMV啟動(dòng)子，增強(qiáng)性綠色熒光蛋白編碼區(qū)，多聚嘌呤序列，U3，3G序列，R，和T7終止子；將上述三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再用含T7噬菌體RNA聚合酶的痘病毒感染已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的宿主細(xì)胞而獲得慢病毒載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的慢病毒載體生產(chǎn)方法，其特征是制備下列質(zhì)粒組(1)CCTCC-M201014(2)CCTCC-M201015(3)CCTCC-M201017將上述三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，再用含T7噬菌體RNA聚合酶的D13L缺陷型痘病毒感染已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的宿主細(xì)胞而獲得慢病毒載體。
11.慢病毒載體在制備藥品或治療疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂或不分裂哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的高安全性的慢病毒載體系統(tǒng)，載體不含有或少含有輔助基因，也不含有或少含有重疊基因組，且所含基因處于T7啟動(dòng)子和終止子之間或痘病毒啟動(dòng)子和終止子之間本發(fā)明還公開了一種生產(chǎn)高滴度且安全性好的慢病毒載體的方法，包括構(gòu)建質(zhì)粒組，質(zhì)粒組轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并用痘病毒感染而獲得載體；還公開了慢病毒載體在制備藥品或治療疾病中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1429911SQ01130159
公開日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2001年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月30日
發(fā)明者李信墻 申請(qǐng)人:李衛(wèi)云, 于紅潮, 李一君