專利名稱：方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及處理單細(xì)胞物質(zhì)以生產(chǎn)具有改進(jìn)的功能特性的產(chǎn)物的方法。具體地，本發(fā)明涉及均化單細(xì)胞物質(zhì)，例如含水細(xì)菌漿的方法，其中使該物質(zhì)在控制溫度的條件下經(jīng)受壓降處理。
近來，更多關(guān)注已集中于開發(fā)可摻入人類和/或動(dòng)物消耗的食物中的新蛋白來源上。現(xiàn)在已經(jīng)提出了許多不同的含蛋白的物質(zhì)，作為人類食品和動(dòng)物飼料中更常規(guī)來源的蛋白如魚粉、豆制品和血漿的替代物。這些物質(zhì)包括單細(xì)胞微生物如包含高含量蛋白的真菌、酵母和細(xì)菌。這些可以通過單細(xì)胞繁殖并且已經(jīng)開發(fā)了幾種通過在烴或其它底物上培養(yǎng)單細(xì)胞微生物而制備蛋白的生物合成方法。目前應(yīng)用最廣的含蛋白的微生物(也稱為“單細(xì)胞蛋白”)是由真菌或酵母得到的那些。
單細(xì)胞蛋白物質(zhì)能夠直接用在食物中，例如作為噴霧干燥的產(chǎn)物使用。但是，它們?cè)谌祟惡蛣?dòng)物食品中的廣泛應(yīng)用性受到了它們的功能特性的限制。例如，這些具有很低的膠凝和乳化特性以及有限的油結(jié)合能力。
為了改進(jìn)單細(xì)胞蛋白物質(zhì)，特別是用于人類食品中的蛋白物質(zhì)的特性，已提出了幾種方法。例如，US-A-3843807(Standard Oil Company)描述了織構(gòu)處理(texturizing)包含蛋白的單細(xì)胞微生物的方法，其中包含完整細(xì)胞和破碎細(xì)胞的混合物的含水酵母糊被擠出。接下來的加熱和干燥步驟得到具有所需特性如咀嚼性、脆性和耐水中分散性的產(chǎn)物，從而使得這種產(chǎn)物特別適于用作人類食品添加劑，例如在香腸和漢堡包混合料中。具有改進(jìn)的功能特性的單細(xì)胞蛋白也可以通過熱處理含水酵母漿而得到(參見US-A-4192897，Standard Oil Company)。經(jīng)熱處理的產(chǎn)物在人類食物如色拉調(diào)料、墨西哥卷調(diào)味混合料、stroganoff調(diào)味汁(以酸奶油、肉湯、蘑菇等烹調(diào)的)和匹薩調(diào)味汁中增強(qiáng)了香味并且增加了光滑口感。
隨著越來越多地使用含蛋白的微生物作為傳統(tǒng)蛋白質(zhì)來源的替代物，因此持續(xù)需要可供選擇的改進(jìn)或改變這類物質(zhì)的功能特性以使得這些物質(zhì)更適于用在各種食物中的方法。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞蛋白的功能特性能夠通過使這些物質(zhì)經(jīng)受均化方法而改變和/或改進(jìn)，特別是經(jīng)受能夠使細(xì)胞破裂或破碎的機(jī)械方法，例如高壓均化法，其中含蛋白的單細(xì)胞物質(zhì)經(jīng)歷壓降。所得的均化后的產(chǎn)物具有改進(jìn)的功能特性，如在人類和動(dòng)物食物中用作營養(yǎng)蛋白時(shí)的凝膠形成、水結(jié)合、油結(jié)合和乳化特性。
因此，一方面，本發(fā)明提供了賦予單細(xì)胞蛋白物質(zhì)改進(jìn)的功能特性的方法，所述方法包括均化單細(xì)胞蛋白的水漿的步驟。由這種方法生產(chǎn)的均化的蛋白物質(zhì)形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面。
均化可以使用任何常規(guī)的方式進(jìn)行。優(yōu)選，均化使用高壓均化器，例如使單細(xì)胞物質(zhì)經(jīng)歷能夠?qū)嵤┘?xì)胞破裂的壓力改變，優(yōu)選壓降而進(jìn)行。通常，物質(zhì)可以經(jīng)過40MPa-120MPa(400-1200巴)的壓降，更優(yōu)選50MPa-110MPa(500-1100巴)，例如60MPa-100 MPa(600-1000巴)的壓降。通常，壓降是瞬時(shí)的。
更具體地，本發(fā)明提供了賦予單細(xì)胞蛋白物質(zhì)改進(jìn)的功能特性的方法，所述方法包括下列步驟(a)制備單細(xì)胞物質(zhì)的含水漿液；(b)將該漿液經(jīng)過能夠破碎細(xì)胞的壓降，例如40MPa-120MPa的壓降，更優(yōu)選50MPa-110MPa，例如60MPa-100MPa的壓降，由此產(chǎn)生均化的產(chǎn)品；(c)任選地干燥該均化的產(chǎn)物。
在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了已均化的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)或由單細(xì)胞物質(zhì)得到的含蛋白均化物(homogenate)，優(yōu)選均勻的細(xì)菌生物質(zhì)。
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“已均化的”或“均化物”等意指已經(jīng)使成為或變得均勻的任何產(chǎn)物，優(yōu)選經(jīng)歷過均化方法的產(chǎn)物。術(shù)語“均勻的”意指細(xì)胞組分的任何基本上均一的分散體、懸浮液或乳液。一般而言，同質(zhì)性程度至少60％或者更優(yōu)選至少70％或80％的任何產(chǎn)物可以被認(rèn)為是基本上均勻的?；旧暇鶆虻姆稚Ⅲw、懸浮液或乳液例如可以具有超過90％、優(yōu)選超過95％的同質(zhì)性程度。
典型地，本發(fā)明的均化法將涉及到呈可流動(dòng)的含水糊或漿形式的微生物單細(xì)胞物質(zhì)的處理。通常，所述形式基本上由完整細(xì)胞組成，但也可以存在一定比例的已破裂的細(xì)胞。
單細(xì)胞生物如細(xì)菌由大量的極小的細(xì)胞組成，每個(gè)細(xì)胞均包含蛋白，這些蛋白包封在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中。細(xì)胞壁相對(duì)較堅(jiān)硬，用來提供機(jī)械支持作用。在本發(fā)明的均化過程中，微生物細(xì)胞壁被破碎，從而由該細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)釋放出一部分蛋白。這例如可以通過一系列對(duì)單細(xì)胞物質(zhì)的加壓和去除壓力的操作而實(shí)現(xiàn)。均化可以通過對(duì)物質(zhì)加高達(dá)150MPa(1500巴)的壓力，優(yōu)選高達(dá)140MPa(1400巴)的壓力，例如高達(dá)120MPa(1200巴)的壓力。但是，相信確定該方法的有效性的實(shí)際壓降和典型的壓降在40MPa-120MPa，更優(yōu)選50MPa-110MPa，例如60MPa-100MPa的范圍內(nèi)。
典型地，該方法將在控制溫度的條件下在工業(yè)均化器，例如可由APVRannie，Denmark得到的勻化器中進(jìn)行，優(yōu)選溫度小于50℃，特別優(yōu)選為25-50℃，例如25-35℃。
其他本領(lǐng)域已知的方法可以用于進(jìn)行本發(fā)明的均化。例如，均化可以通過使單細(xì)胞物質(zhì)經(jīng)受能夠使細(xì)胞壁破裂的剪切力而進(jìn)行。這可以使用混合器而實(shí)現(xiàn)，在混合器中使物質(zhì)通過一個(gè)區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)由相對(duì)運(yùn)動(dòng)的表面產(chǎn)生剪切力作用于所述物質(zhì)。一般地，剪切力將在移動(dòng)的表面之間產(chǎn)生，例如旋轉(zhuǎn)的表面和靜止的表面，即如WO 99/08782中描述的轉(zhuǎn)子-定子。
其他已知的用在細(xì)胞機(jī)械式破碎法中的技術(shù)例如高速球研磨法可以用于進(jìn)行均化。也可以使用超聲法。
可以用本發(fā)明的方法處理任何單細(xì)胞蛋白物質(zhì)。但是，優(yōu)選的微生物包括細(xì)菌和酵母。任何允許用在食品中的細(xì)菌或酵母都可以使用并且合適的物種可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員選擇。特別優(yōu)選地，用在本發(fā)明中的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)將是微生物培養(yǎng)物，其組成為甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌，并任選混合有一種或多種異養(yǎng)細(xì)菌，尤其優(yōu)選甲烷營養(yǎng)型細(xì)菌和異養(yǎng)型細(xì)菌的混合。用于本發(fā)明中的術(shù)語“甲烷營養(yǎng)型”包含任何使用甲烷或甲醇進(jìn)行生長的細(xì)菌。術(shù)語“異養(yǎng)”用來指使用除甲烷或甲醇以外的有機(jī)底物進(jìn)行生長的細(xì)菌。
方便地說，單細(xì)胞物質(zhì)可以通過發(fā)酵法制得，所述方法包括將氧和合適的底物如液態(tài)或氣態(tài)烴、醇或碳水化合物，例如甲烷、甲醇或天然氣，以及營養(yǎng)礦物溶液加入包含微生物的管狀反應(yīng)器中。許多這類方法是本領(lǐng)域中已知并描述過的。
具體優(yōu)選用在本發(fā)明中的是由在烴部分或天然氣上發(fā)酵得到的單細(xì)胞物質(zhì)。特別優(yōu)選的是天然氣發(fā)酵得到的單細(xì)胞蛋白。隨著在發(fā)酵器中微生物濃度的增加，抽出一部分反應(yīng)物或肉湯，并通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)分離出微生物，所述技術(shù)例如離心和/或超濾。便利地，在這樣的發(fā)酵方法中，連續(xù)地從發(fā)酵器中抽取肉湯，并且肉湯中的細(xì)胞濃度為1％-5％重量，例如約3％重量。
由兩種或多種微生物得到的單細(xì)胞物質(zhì)可以用本發(fā)明的方法進(jìn)行處理。盡管這些可以在相同或不同的發(fā)酵器中生產(chǎn)，但是通常這些將在相同的發(fā)酵條件下在相同的發(fā)酵器中生產(chǎn)。由不同的發(fā)酵過程生產(chǎn)的物質(zhì)可以在按照本發(fā)明的方法均化前摻混在一起。
優(yōu)選的用在本發(fā)明中的細(xì)菌包括莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)(Bath)，這是一種嗜熱細(xì)菌，最初是由在Bath(England)的溫泉(hotsprings)中分離出來，在The National Collections of Industrial and MarineBacteria，Aberdeen，Scotland保藏為NCIMB 11132。莢膜甲基球菌(Bath)在約45℃時(shí)生長最佳，但也可以在37℃-52℃進(jìn)行生長。它是一種革蘭氏陰性、非運(yùn)動(dòng)型球型細(xì)胞，通常成對(duì)出現(xiàn)。細(xì)胞內(nèi)膜排列為I型甲烷營養(yǎng)菌特有的泡囊盤(vesicular discs)束。莢膜甲基球菌(Bath)從遺傳上講是沒有已知的質(zhì)粒的非常穩(wěn)定的生物。它能夠利用甲烷或甲醇進(jìn)行生長，并且利用氨、硝酸鹽或分子氮作為氮源進(jìn)行蛋白合成。
其它適用于本發(fā)明的細(xì)菌包括異養(yǎng)細(xì)菌Alcaligenes acidovorans DB3(菌株NCIMB 12387)、強(qiáng)固芽孢桿菌(Bacillus firmus)DB5(菌株NCIMB13280)和短芽孢桿菌(Bacillus brevis)DB4(菌株NCIMB 13288)，其中每種在約45℃的溫度時(shí)生長最佳。
A.acidovorans DB3是革蘭氏陰性需氧的運(yùn)動(dòng)型桿菌，屬于假單胞菌科，能夠利用乙醇、乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯進(jìn)行生長。短芽孢桿菌DB4是革蘭氏陰性的能形成芽孢的需氧桿菌，屬于芽孢桿菌屬，能夠利用乙酸酯、D-果糖、D-甘露糖、核糖和D-塔格糖。強(qiáng)固芽孢桿菌DB5是革蘭氏陰性的能形成芽孢的運(yùn)動(dòng)型需氧桿菌，屬于芽孢桿菌屬，能夠利用乙酸酯、N-乙酰基-葡糖胺、檸檬酸酯、葡糖酸鹽、D-葡萄糖、甘油和甘露醇。
合適的用在本發(fā)明方法中的酵母可以選自糖酵母屬(Saccharomyces)和假絲酵母屬(Candida)。
使用天然氣作為唯一碳源和能源的發(fā)酵方法的一個(gè)實(shí)例描述在EP-A-306466(Dansk Bioprotein)。這個(gè)方法是以在甲烷上生長的甲烷營養(yǎng)細(xì)菌莢膜甲基球菌的連續(xù)發(fā)酵為基礎(chǔ)進(jìn)行的?？諝饣蚣冄跤糜谘鹾希庇米鞯?。除了這些底物外，細(xì)菌培養(yǎng)物典型地還需要水、磷酸鹽(例如，磷酸)和幾種礦物質(zhì)，可以含有鎂、鈣、鉀、鐵、銅、鋅、錳、鎳、鈷和鉬，通常以硫酸鹽、氯化物或硝酸鹽的形式加以利用。所有用在生產(chǎn)單細(xì)胞物質(zhì)中的礦物質(zhì)都應(yīng)該是食品質(zhì)量級(jí)的。
盡管天然氣的組成會(huì)隨著不同的產(chǎn)氣區(qū)域而變化，但是天然氣的主要組成為甲烷。通常，可以期望天然氣包含約90％的甲烷、約5％的乙烷、約2％的丙烷和某些高級(jí)烴。在天然氣的發(fā)酵過程中，甲烷被甲烷營養(yǎng)細(xì)菌氧化產(chǎn)生生物質(zhì)和二氧化碳。甲醇、甲醛和甲酸是代謝中間產(chǎn)物。甲醛以及在某種程度上的二氧化碳被吸收至生物質(zhì)中。但是，甲烷營養(yǎng)細(xì)菌不能使用包含碳-碳鍵的底物進(jìn)行生長，并且天然氣中的剩余組分，即乙烷、丙烷和某些高級(jí)烴被甲烷營養(yǎng)細(xì)菌氧化以生產(chǎn)相應(yīng)的羧酸(例如，乙烷被氧化成乙酸)。這些產(chǎn)物能夠抑制甲烷營養(yǎng)細(xì)菌，因此重要的是它們的濃度在生產(chǎn)生物質(zhì)的過程中保持很低，優(yōu)選低于50mg/l。解決該問題的一個(gè)方案是聯(lián)合使用一種或多種能夠利用甲烷營養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物的異養(yǎng)細(xì)菌。這種細(xì)菌也能夠利用通過細(xì)胞溶胞釋放到發(fā)酵肉湯中的有機(jī)物質(zhì)。這一點(diǎn)對(duì)于避免形成泡沫很重要，而且還可以用來將培養(yǎng)物被不希望存在的細(xì)菌污染的危險(xiǎn)降至最小。甲烷營養(yǎng)細(xì)菌和異養(yǎng)細(xì)菌的混合得到穩(wěn)定的收率高的培養(yǎng)物。
在生產(chǎn)單細(xì)胞物質(zhì)的過程中，發(fā)酵混合物的pH通常被調(diào)節(jié)為約6-7，例如至6.5±0.3。用于進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的合適的酸/堿易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行選擇。特別適于用在這方面的是氫氧化鈉和硫酸。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵器中的溫度優(yōu)選應(yīng)保持在40-50℃范圍內(nèi)，最優(yōu)選為45℃±2℃。
特別優(yōu)選用在本發(fā)明中的是包含甲烷營養(yǎng)細(xì)菌莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，以及異養(yǎng)細(xì)菌Alcaligenes acidovorans DB3(菌株NCIMB12387)和強(qiáng)固芽孢桿菌DB5(菌株NCIMB 13280)的微生物培養(yǎng)物，任選還含有短芽孢桿菌DB4(菌株NCIMB 13288)。A.acidovorans DB3的作用是利用通過莢膜甲基球菌(Bath)由天然氣中的乙烷和丙烷產(chǎn)生的乙酸鹽和丙酸鹽。A.acidovorans DB3可占所得生物質(zhì)的總細(xì)胞量的高達(dá)10％，例如約6％-8％。短芽孢桿菌DB4和強(qiáng)固芽孢桿菌DB5的作用是利用培養(yǎng)基中的溶胞產(chǎn)物和代謝物。通常，短芽孢桿菌DB4和強(qiáng)固芽孢桿菌DB5在連續(xù)發(fā)酵過程中均占細(xì)胞計(jì)數(shù)的小于1％。
合適的用于制備單細(xì)胞物質(zhì)的發(fā)酵器是線圈型(loop)的那些，如描述在Dansk Bioprotein的EP-A-306466、EP-A-418187和DK 1404/92中的那些，或者空氣升液反應(yīng)器(air-lift reactors)。具有靜止攪拌器的線圈型發(fā)酵器的氣力利用率高(例如高達(dá)95％)，這是因?yàn)榘l(fā)酵器的活塞-流特征。氣體沿線圈在幾個(gè)位點(diǎn)引入，保持與液體接觸，直到它們分離進(jìn)入線圈端部的頂部空間。使用2-3％生物質(zhì)(基于干重)和稀釋率0.02-0.50h-1，例如0.05-0.25h-1可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵。
其它發(fā)酵器也可以用于制備單細(xì)胞物質(zhì)，這些包括管狀的和攪拌槽型發(fā)酵器。
理想地是，天然氣發(fā)酵制得的生物質(zhì)將包含60-80％重量的粗蛋白；5-20％重量的粗脂肪；3-10％重量的灰分；3-15％重量的核酸(RNA和DNA)；10-30g/kg磷；高達(dá)350mg/kg鐵；以及高達(dá)120mg/kg銅。特別優(yōu)選的是，生物質(zhì)將包含68-73％，例如約70％重量的粗蛋白；9-11％，例如約10％重量的粗脂肪；5-10％，例如約7％重量的灰分；8-12％，例如約10％重量的核酸(RNA和DNA)；10-25g/kg磷；高達(dá)310mg/kg鐵；以及高達(dá)110mg/kg銅。所含蛋白的氨基酸譜應(yīng)當(dāng)在營養(yǎng)上有利，且其中更重要的氨基酸半胱氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸、精氨酸含量高。通常，這些的存在量可以分別是約0.7％、3.1％、5.2％、7.2％、2.5％和6.9％(以基于氨基酸總量的百分率表示)。一般地，脂肪酸將主要包含飽和的棕櫚酸(約50％)和單不飽和的棕櫚油酸(約36％)。產(chǎn)物中的礦物質(zhì)通常包含高含量的磷(約1.5％重量)，鉀(約0.8％重量)和鎂(約0.2％重量)。
一般地，由連續(xù)發(fā)酵法得到的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)要經(jīng)過離心和過濾，例如超濾，過程以在均化前除去絕大部分所存在的水并形成含水糊或漿。在離心過程中，生物質(zhì)的干物料含量通常增加約2-15％重量，例如至約12％重量。超濾，可以在40-50℃，例如42-46℃實(shí)施，進(jìn)一步濃縮生物質(zhì)，使產(chǎn)物中包含10％-30％，優(yōu)選15％-25％，例如15％-22％重量的單細(xì)胞物質(zhì)。超濾中使用的排阻大小通常在約100000道爾頓范圍內(nèi)。
超濾后，通過例如將來自超濾單元的濃縮蛋白漿經(jīng)過熱交換器而冷卻生物質(zhì)，優(yōu)選至10-30℃，例如至15℃，然后將其以恒定溫度在緩沖槽中保留，例如1-24小時(shí)，優(yōu)選5-15小時(shí)，例如5-12小時(shí)，溫度為10-20℃，更優(yōu)選為5-15℃，pH為5.5-6.5。
均化可以在常規(guī)的高壓均化器中進(jìn)行，其中細(xì)胞可以首先通過加壓例如高達(dá)150MPa(150巴)的壓力而破碎，然后去除均化器內(nèi)部的壓力。優(yōu)選，應(yīng)用到生物質(zhì)上的總壓降將在40MPa-120MPa(400-1200巴)，例如約80MPa(800巴)。壓降可以是步降，即這可以包含一個(gè)或多個(gè)步驟，盡管通常將包含一個(gè)或兩個(gè)步驟，優(yōu)選一個(gè)步驟。當(dāng)均化是通過兩步進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選第二步中的壓降應(yīng)當(dāng)小于均化器中總壓降的1/5，優(yōu)選小于1/10，例如約1/20。均化中物質(zhì)的溫度應(yīng)優(yōu)選不超過50℃。
本發(fā)明所述的均化過程制造的產(chǎn)物包括，優(yōu)選基本上由破碎的細(xì)胞物質(zhì)組成。例如破碎的細(xì)胞物質(zhì)的存在量為至少80％，優(yōu)選至少90％重量。通常，該產(chǎn)物是相對(duì)粘稠的包含水溶性和顆粒狀細(xì)胞組分的蛋白漿。盡管這可以作為添加劑直接用在食品中，但是這通常進(jìn)行進(jìn)一步加工以從產(chǎn)物中除去過量的水。對(duì)任何附加的干燥步驟的選擇將取決于均化后產(chǎn)物中水的含量以及最終產(chǎn)物所需的濕度。
通常，將產(chǎn)物通過本領(lǐng)域已知的噴霧干燥技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步加工。可以使用任何常規(guī)的具有或不具有流化床單元的噴霧干燥器，例如可從APVAnhydro(Denmark)得到的3-SPD型噴霧干燥器。優(yōu)選，噴霧干燥器中空氣入口的溫度可以是約300℃，出口溫度可以是約90℃。優(yōu)選，所得產(chǎn)物的水含量為約2-10％重量，例如6-8％重量。所得產(chǎn)物的通常粒徑為0.1-0.5mm。
特別優(yōu)選地，均化步驟后立即進(jìn)行噴霧干燥。或者，可以是必須的或者也確實(shí)是需要的，在進(jìn)一步加工前，儲(chǔ)存或保持均化產(chǎn)物，例如儲(chǔ)存或保持在儲(chǔ)存或緩沖槽中。在這樣的情況下，已發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存產(chǎn)物的條件可以降低噴霧干燥后最終產(chǎn)物的膠凝特性。已均化物質(zhì)的膠凝特性可以通過將其儲(chǔ)存在低于20℃的溫度和小于7的pH值，優(yōu)選小于6.5的pH值，特別優(yōu)選是在5.5-6.5，例如5.8-6.5的pH值范圍內(nèi)而保持。在這些條件下，產(chǎn)物可以儲(chǔ)存高達(dá)24小時(shí)，而膠凝特性沒有實(shí)質(zhì)損失。
在又一個(gè)方面中，本發(fā)明因此提供了保持已均化的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)的功能特性的方法，所述方法包括在低于20℃的溫度和小于約6.5的pH值時(shí)儲(chǔ)存所述物質(zhì)的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物具有特別的所需特性，從而使得這些產(chǎn)物特別適于用在人類和動(dòng)物食品中，這些產(chǎn)物或者可以單獨(dú)使用，或者可以與其它蛋白來源結(jié)合使用。特別地，與最初的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)相比，均化產(chǎn)物具有改進(jìn)的功能特性，如凝膠形成、水結(jié)合、油結(jié)合和乳化特性。例如，本發(fā)明的產(chǎn)物當(dāng)與常規(guī)的食物級(jí)產(chǎn)物，特別是多糖如藻酸鹽和/或角叉菜聚糖(karragenates)混合時(shí)顯示具有改進(jìn)的凝膠形成作用。此外，改進(jìn)的油結(jié)合能力在將產(chǎn)物與油如豆油或魚油混合時(shí)觀察到。典型地，根據(jù)本發(fā)明制得的均化產(chǎn)物的15％(w/w)溶液可以顯示具有在1000-2000Pa范圍內(nèi)，例如約1500Pa的凝膠強(qiáng)度(彈性模數(shù))。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明因此提供了如本發(fā)明所描述的均化的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)作為膠凝劑、乳化劑或作為油或水的結(jié)合劑在制備食物或飼料產(chǎn)物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的產(chǎn)物特別適于用作食品中的功能蛋白，特別是在當(dāng)用作動(dòng)物飼料和寵物食物中的天然血漿的替代物時(shí)更是如此。當(dāng)用在寵物食物中時(shí)，可以在產(chǎn)物中加入附加的成分，如脂肪、糖、鹽、調(diào)味劑、礦物質(zhì)等。然后可以將該產(chǎn)物制成外觀和質(zhì)地上類似天然肉塊的大塊的形式。本發(fā)明的產(chǎn)物具有其它的優(yōu)點(diǎn)，即容易配制成包含所需的營養(yǎng)物質(zhì)，這是容易被動(dòng)物消化的，并且對(duì)動(dòng)物而言是美味的。
本發(fā)明的產(chǎn)物還可以具有其它用途，作為肉制品(例如肉丸子)中增稠劑(texturant)，作為替代物代替常規(guī)用作新鮮肉中的增量劑(extender)的血漿蛋白質(zhì)以增加重量和體積，作為乳化劑(例如在調(diào)味料中等)，以及在焙烤產(chǎn)物中以增強(qiáng)面團(tuán)性。
當(dāng)用在食品中時(shí)，均化物質(zhì)的通常用量為1-10％重量，優(yōu)選最高達(dá)5％重量。確切的比例將取決于物質(zhì)的所需功能，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易確定的。通常，當(dāng)用作膠凝劑時(shí)，它的存在量為高達(dá)20％重量，例如5-10％重量(基于產(chǎn)物的干物料含量)。
在其它的方面中，本發(fā)明因此提供了食物級(jí)產(chǎn)物或添加劑，例如動(dòng)物飼料或?qū)櫸锸澄?，包含本文所述的均化的單?xì)胞物質(zhì)。
在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了寵物食物，包括成塊的本文所述的均化的單細(xì)胞物質(zhì)。
現(xiàn)在將結(jié)合附

圖1描述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，其中圖1示意性地表示了用于制備本發(fā)明的均化的單細(xì)胞物質(zhì)中的設(shè)備。
參考圖1，莢膜甲基球菌(Bath)NCIMB 11132是在發(fā)酵器1中，在銨/無機(jī)鹽培養(yǎng)基(AMS)中、45℃、pH6.5和0.15h-1的稀釋率下，通過天然氣的連續(xù)發(fā)酵而制得的。每升AMS培養(yǎng)基中包含下列10mg NH3，75mgH3PO4·2H2O，380mg MgSO4·7H2O，100mg CaCl2·2H2O，200mg K2SO4，75mgFeSO4·7H2O，1.0mg CuSO4·5H2O，0.96mg ZnSO4·7H2O，120μg CoCl2·6H2O，48μg MnCl2·4H2O，36μg H3BO3，24μg NiCl2·6H2O和1.20μgNaMoO4·2H2O。氧是限制因子。
發(fā)酵器中填充有已在125℃熱滅菌10秒的水。根據(jù)消耗調(diào)節(jié)加入不同的營養(yǎng)物質(zhì)。在2-3％生物質(zhì)(基于干重)操作進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。
連續(xù)收集所得的單細(xì)胞物質(zhì)。然后，將其經(jīng)過離心機(jī)2進(jìn)行離心操作，在離心機(jī)中干物料含量增加2％-15％重量。所得的含水的生物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)存罐(未顯示)中進(jìn)行保存，例如在5-15℃的溫度下。
使用具有100000道爾頓排阻尺寸的超濾單元3將細(xì)菌生物質(zhì)繼續(xù)濃縮成包含15-22％重量生物質(zhì)的產(chǎn)物。超濾中的溫度通常保持在40-50℃。超濾后，通過將來自超濾單元的濃縮的蛋白漿通過熱交換器(未顯示)來冷卻生物質(zhì)，例如至10-30℃。此后，蛋白漿以恒定溫度保持在緩沖槽(未顯示)中。所得的產(chǎn)物是穩(wěn)定的沒有不希望存在的細(xì)菌污染物的培養(yǎng)物。
為了將水的使用降至最小并將廢水的量減至最小，在進(jìn)行短時(shí)間的熱處理后，將來自離心機(jī)2和/或超濾單元3的水返回發(fā)酵器中。
細(xì)菌生物質(zhì)的均化是在工業(yè)高壓均化器4中進(jìn)行的。來自緩沖槽的蛋白漿泵壓連續(xù)通過均化器，在均化器中細(xì)胞通過加壓和立即釋放壓力而破碎。均化器中的總壓降通常為60MPa-100MPa(600-1000巴)。均化過程中，溫度優(yōu)選保持在低于50℃。
均化后，相對(duì)粘稠的包含水溶性和顆粒狀細(xì)胞組分的蛋白漿在噴霧干燥器5中噴霧干燥。在入口空氣溫度為約300℃和出口溫度約90℃的噴霧干燥得到水含量為6-8％重量的最終產(chǎn)物。
所得的均化蛋白在加熱到高于60℃的溫度并接下來冷卻到環(huán)境溫度時(shí)形成蛋白濃度為7.5-15％重量的不同凝膠。凝膠形成的合適條件包括5.7-7.0的pH值，其中pH值是通過使用濃度為50-200mmol的緩沖液如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液控制的。
當(dāng)均化的產(chǎn)物與多糖如淀粉、藻酸鹽和ι-和κ-角叉菜聚糖混合時(shí)，觀察到改進(jìn)的凝膠形成作用。向產(chǎn)物(7.5-15％)的pH值為5-7.5的0.1-2.0％的氯化鉀水溶液中加入0.5-1.0％重量的角叉菜聚糖顯著地改變了凝膠強(qiáng)度，表明產(chǎn)物和多糖之間協(xié)同增效相互作用。類似的在流變學(xué)和凝膠形成之間的協(xié)同效果已在混合該產(chǎn)物和各種淀粉源(用量為最終淀粉濃度的3-10％)如包含各種量的直鏈淀粉和支鏈淀粉的化學(xué)改性淀粉和純化淀粉時(shí)觀測(cè)到。
均化產(chǎn)物的乳化特性通過將在pH值5-7的氯化鈉溶液中的蛋白(2-4％)和豆油(20-40％最終濃度)混合時(shí)得到驗(yàn)證。該溶液在thurrax摻混器中混合20秒，加入微流化器中在70MPa(700巴)壓力下制備乳液之前，通過微流化器回收四次乳液。由均化產(chǎn)物制得的乳液還可以通過在混合起始物質(zhì)之前加入黃原膠(例如用量為0.1-0.5％重量)而穩(wěn)定化。
均化物質(zhì)的油結(jié)合能力通過將該產(chǎn)物與漿中的油如豆油或魚油混合而驗(yàn)證，例如在3ml豆油中混合0.5g均化的產(chǎn)物，接下來在環(huán)境溫度下溫育30分鐘。因?yàn)槲沼停援a(chǎn)物的重量會(huì)增加50-80％。
下文的非限定性實(shí)施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1-制備均化的生物質(zhì)在線圈型發(fā)酵器中通過在銨/無機(jī)鹽培養(yǎng)基(AMS)中在45℃、pH6.5以及稀釋率0.15h-1時(shí)，連續(xù)需氧發(fā)酵天然氣而制得包含莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)、Alcaligenes acidovorans DB3(菌株NCIMB 12387)和強(qiáng)固芽孢桿菌DB5(菌株NCIMB 13280)的微生物培養(yǎng)物。每升AMS培養(yǎng)基中包含下列10mg NH3，75mg H3PO4·2H2O，380mg MgSO4·7H2O，100mgCaCl2·2H2O，200mg K2SO4，75mg FeSO4·7H2O，1.0mg CuSO4·5H2O，0.96mgZnSO4·7H2O，120μg CoCl2·6H2O，48μg MnCl2·4H2O，36μg H3BO3，24μgNiCl2·6H2O和1.20μg NaMoO4·2H2O。
發(fā)酵器中填充有已在125℃熱滅菌10秒的水。根據(jù)消耗調(diào)節(jié)加入不同的營養(yǎng)物質(zhì)。在2-3％生物質(zhì)(基于干重)操作進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。
連續(xù)收集具有下列特征的單細(xì)胞物質(zhì)組成(％產(chǎn)物中) 礦物質(zhì)粗蛋白*66 磷1.0％粗脂肪 9 氯0.7％灰分 7 硫0.5％水 6 鈣0.4％粗纖維 1 鉀0.4％鎂0.2％無N的提取物11 鈉0.1％合計(jì) 100 鐵200ppm
銅 90ppm鋅 15ppm氨基酸(％產(chǎn)物中) 砷 0.05ppm賴氨酸4.3 硒 0.02ppm蛋氨酸1.9 鉛 0.0002ppm胱氨酸0.4 鎘 0.00002ppm蘇氨酸3.1 汞 ＜0.02ppm色氨酸1.5亮氨酸5.2異亮氨酸 3.2 維生素 mg/kg纈氨酸4.2 煙酸 123酪氨酸2.8 核黃素B2 69苯丙氨酸 3.1 肌醇 28組氨酸1.7 維生素B1 11精氨酸4.1丙氨酸4.9天冬氨酸 6.2 能量 MJ/kg谷氨酸7.3 總能量 22.1甘氨酸3.4脯氨酸3.0絲氨酸2.5 其它數(shù)據(jù)合計(jì) 62.8 顏色 淺棕色味道 中性粒徑 100-300ppm*基于干重粗蛋白含量約是70％生物質(zhì)在工業(yè)連續(xù)離心機(jī)中以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心，接下來使用具有排阻大小為100000道爾頓的的膜進(jìn)行超濾。所得的產(chǎn)物然后在工業(yè)均化器中(壓降1000巴(100MPa)；入口溫度15℃)進(jìn)行均化，產(chǎn)生本發(fā)明的均化生物質(zhì)。
實(shí)施例2-均化后生物質(zhì)的特性2.1凝結(jié)/凝膠凝結(jié)測(cè)量為隨著蛋白變成熱變性的彈性模量(G’)的增加。這可以使用均化生物質(zhì)在0.2M Na-磷酸鹽(pH 7.2)中的15％(w/w)溶液而在Paar PhysicaUDS200流變儀上進(jìn)行。儀器在恒定的應(yīng)力(1×10-3Pa)和頻率(1Hz)下測(cè)定G’，而溫度的變化如下20至90℃ 10分鐘90℃ 5分鐘90至20℃ 5分鐘20℃ 2分鐘實(shí)施例1中所得產(chǎn)物的結(jié)果顯示在附圖2中。均化生物質(zhì)的凝結(jié)在60-70℃時(shí)開始。隨著溫度增加到90℃，觀察到彈性模量增加了10-20倍。而當(dāng)溫度保持在90℃時(shí)，彈性模量僅觀察到微小增加。冷卻到20℃，彈性模量再增加10倍。
2.2乳化2.2.1無穩(wěn)定作用實(shí)施例1制備的均化的生物質(zhì)懸浮在1.5％NaCl中，劇烈攪拌以破碎顆粒。根據(jù)需要調(diào)節(jié)pH(例如至pH 6.5)，攪拌溶液1小時(shí)。將溶液和豆油合并，使用Ytron-MS混合器MSU.G.C.AA型在全速混合3分鐘，制得乳液。將乳液轉(zhuǎn)移到試管中，記錄油或水的分離。對(duì)于已加熱的乳液，將試管浸在沸水浴中30分鐘。
實(shí)施例1的均化的生物質(zhì)得到穩(wěn)定的不分離出油相的乳液。但是，在低粘度體系中會(huì)分出乳油(creaming)。
2.2.2有穩(wěn)定作用使用黃原膠作為穩(wěn)定劑。通過在環(huán)境溫度下攪拌過夜而將黃原膠溶解在1.5％NaCl中。然后如2.2.1所述，使用0.5％和0.25％的黃原膠制備均化的生物質(zhì)乳液。
使用黃原膠增加粘度得到?jīng)]有分出乳油，保持穩(wěn)定長達(dá)幾個(gè)星期的乳液。加熱不會(huì)破壞乳液。但是，出現(xiàn)均化生物質(zhì)的凝結(jié)，可以觀察到凝結(jié)物之間出現(xiàn)水分離。對(duì)于大多數(shù)乳液而言，通過輕輕攪拌，能夠中斷凝結(jié)模式，由此保持穩(wěn)定的乳液。
穩(wěn)定的均化后的生物質(zhì)乳液能夠在不同的pH值時(shí)制得。酸性pH值與加熱聯(lián)合可產(chǎn)生一些乳油，最可能的原因是黃原膠的分解，并因此降低了粘度。
根據(jù)本發(fā)明的均化的生物質(zhì)可以產(chǎn)生包含多達(dá)80％油的水包油乳液。增加油的濃度至85％逆轉(zhuǎn)了該乳液，得到油包水乳液。
2.3脂肪/油吸收通過懸浮0.5g的實(shí)施例1的均化的生物質(zhì)在3ml豆油中，接下來在環(huán)境溫度下溫育超過30分鐘，而測(cè)定脂肪吸收(adsorption)。在小于10μm的過濾器上過濾上述懸浮液，測(cè)量吸收到油不溶性物質(zhì)上的油量(以克表示)。
測(cè)定實(shí)施例1的均化生物質(zhì)和幾種市售蛋白*的脂肪/油吸收，結(jié)果示于附圖3中?？梢钥吹奖景l(fā)明的產(chǎn)物比測(cè)試的其它市售蛋白更有效的結(jié)合脂肪。
(*“血漿”＝來自APC Europe的AP 820噴霧干燥的動(dòng)物血漿；“魚粉”＝來自Nordsildmel A/S的LT 3012魚粉(fish meal)；“Soya Kons Danpro A”和“Soya Kons Danpro A-02”＝來自Central SoyaAarhus A/S的豆?jié)饪s物)。
2.4水吸收制備實(shí)施例1的均化產(chǎn)物的2.5％懸浮液并劇烈混合以破碎顆粒。使用1M NaOH或1M HCl調(diào)節(jié)pH值至4、6和8，在環(huán)境溫度下，再攪拌懸浮液60分鐘。然后將所得的懸浮液在SS-34轉(zhuǎn)子上用10,000×g離心30分鐘。
倒掉上清液，通過將該管頭朝下倒置10分鐘而除去過量的水。測(cè)量沉淀物的濕重，然后在105℃干燥過夜。測(cè)量沉淀物的干重。
測(cè)定水吸收，或者為水不溶性沉淀物吸收的水量(以克表示)(水結(jié)合)或吸收到總蛋白上的水(以克表示)(水吸收)。結(jié)果顯示在下表1中表1-水吸收
從表1中可以看出本發(fā)明的均化生物質(zhì)的不溶部分吸收其重量約4-6倍的水，蛋白部分吸收其重量約2-2.5倍的水。
2.5溶解度蛋白溶解度(solubility)能夠以類似于水吸收性的實(shí)驗(yàn)確定，但是測(cè)定的是上清液中的可溶蛋白。測(cè)定的實(shí)施例1的均化生物質(zhì)和幾種市售蛋白*的結(jié)果示于附圖4中(*“血漿”＝來自APC Europe的AP 820噴霧干燥的動(dòng)物血漿；“魚粉”＝來自Nordsildmel A/S的LT 3012魚粉(fish meal))。
結(jié)果顯示本發(fā)明產(chǎn)物的溶解度取決于pH值酸性pH得到低溶解度；堿性pH得到高溶解度。在弱酸溶液中，本發(fā)明的產(chǎn)物的行為如同膠體顆粒并且就是這些膠體特性成為主流。
權(quán)利要求
1.賦予單細(xì)胞蛋白物質(zhì)改進(jìn)的功能特性的方法，所述方法包括均化單細(xì)胞蛋白的含水漿的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中均化是將單細(xì)胞物質(zhì)經(jīng)過40MPa-120MPa(400-1200巴)的總壓降而進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，還包括干燥所得的均化產(chǎn)物的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的賦予單細(xì)胞蛋白物質(zhì)改進(jìn)的功能特性的方法，所述方法包括下列步驟(a)制備單細(xì)胞物質(zhì)的含水漿液；(b)將該漿液經(jīng)過40MPa-120MPa(400-1200巴)的總壓降，由此產(chǎn)生均化的物質(zhì)；(c)任選地干燥該均化的產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中均化是在小于50℃的溫度，優(yōu)選25-50℃，例如25-35℃的溫度進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述壓降是步降的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述壓降是作為兩步法進(jìn)行的，包括其中第二步中壓降小于總壓降的1/5的第一步和第二步。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所得的均化產(chǎn)物是通過噴霧干燥而干燥的。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在噴霧干燥之前，均化的產(chǎn)物在小于20℃的溫度和低于約6.5的pH值下保持在儲(chǔ)存槽中。
10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述單細(xì)胞蛋白物質(zhì)包含細(xì)菌或酵母。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述單細(xì)胞蛋白物質(zhì)是微生物培養(yǎng)物，包含甲烷營養(yǎng)細(xì)菌，任選地結(jié)合有一種或多種異養(yǎng)細(xì)菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述微生物培養(yǎng)物包含甲烷營養(yǎng)細(xì)菌和異養(yǎng)細(xì)菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述微生物培養(yǎng)物包含甲烷營養(yǎng)細(xì)菌莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，以及異養(yǎng)細(xì)菌Alcaligenesacidovorans DB3(菌株NCIMB 12387)和強(qiáng)固芽孢桿菌DB5(菌株NCIMB13280)的混合物，任選還包含短芽孢桿菌DB4(菌株NCIMB 13288)。
14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述單細(xì)胞物質(zhì)是對(duì)烴部分或天然氣發(fā)酵得到的。
15.通過上述任一項(xiàng)權(quán)利要求得到的已均化的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)。
16.已均化的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)，例如均勻的細(xì)菌生物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的均化的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)，包含甲烷營養(yǎng)細(xì)菌莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，以及異養(yǎng)細(xì)菌Alcaligenesacidovorans DB3(菌株NCIMB 12387)和強(qiáng)固芽孢桿菌DB5(菌株NCIMB13280)的混合物，任選還含有短芽孢桿菌DB4(菌株NCIMB 13288)。
18.食物級(jí)產(chǎn)物或添加劑，例如動(dòng)物飼料或?qū)櫸锸澄?，包含根?jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的單細(xì)胞物質(zhì)。
19.寵物食物，包含成塊的如權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)要求保護(hù)的單細(xì)胞物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了賦予單細(xì)胞蛋白物質(zhì)改進(jìn)的功能特性的方法，所述方法包括下列步驟單細(xì)胞蛋白，例如在天然氣上發(fā)酵而得到的單細(xì)胞蛋白物質(zhì)的水漿進(jìn)行勻漿。所得已勻漿的蛋白物質(zhì)具有突出的功能特性并且發(fā)現(xiàn)在食品的制備中具有特別的用途，例如作為膠凝劑或乳化劑使用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1426460SQ0180514
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月16日
發(fā)明者阿里爾德·約翰尼森, 岡納·克萊普, 簡·拉森, 艾納·莫恩 申請(qǐng)人:諾弗姆公司