專利名稱：胰島素抗性細(xì)胞及其轉(zhuǎn)變方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰島素抗性細(xì)胞，特別是通過誘導(dǎo)將胰島素敏感性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素抗性的方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)變的細(xì)胞的鑒定方法及其在藥物篩選中的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病，影響糖類代謝和血糖水平，導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率，并導(dǎo)致病人個(gè)人和衛(wèi)生系統(tǒng)可觀的經(jīng)濟(jì)消耗。該疾病有幾種形式。I型糖尿病(胰島素依賴性糖尿病或IDDM)是一類自身免疫病，病人體內(nèi)出現(xiàn)針對(duì)胰島細(xì)胞的抗體，錯(cuò)誤的將胰臟β細(xì)胞當(dāng)成入侵者加以破壞和清除，從而阻止內(nèi)源性胰島素的產(chǎn)生，需要在病人余生中用外源性胰島素治療。通常發(fā)病于兒童期。用胰島素或飲食和降血糖藥物治療可使癥狀減輕，但常常不能防止該病的血管并發(fā)癥，如早熟性冠心病。
II型或成年發(fā)生的糖尿病可能是飲食引起的。II型糖尿病是隨著年齡增長越來越普遍的疾病。其最初特征是對(duì)胰島素敏感性的降低，和循環(huán)胰島素濃度的代償性上升，后者是維持正常血液糖原水平必需的。胰腺β細(xì)胞分泌的增加使胰島素水平提高，導(dǎo)致的高胰島素血癥是與糖尿病的心血管并發(fā)癥相關(guān)的。隨著胰島素抗性惡化，對(duì)胰腺β細(xì)胞的要求穩(wěn)定提高，直到胰腺再不能提供足夠水平的胰島素，導(dǎo)致血糖水平提高。最終，發(fā)生明顯的高血糖和高血脂，導(dǎo)致與糖尿病有關(guān)的破壞性的長期并發(fā)癥，包括心血管疾病、腎衰竭和失明。尚未了解導(dǎo)致II型糖尿病的確切機(jī)制，但該機(jī)制導(dǎo)致糖原運(yùn)輸、骨骼肌肉受到損害，肝糖原生產(chǎn)增加和胰島素應(yīng)答不充分。膳食改善通常是無效的，因此大多數(shù)病人最終需要藥物干涉，來有效防止和/或減緩疾病并發(fā)癥的發(fā)展?？捎靡环N或多種可行的口服抗-糖尿病藥劑治療病人，來提高胰島素分泌。但是目前所用的藥物可能有副作用。
目前研究和治療糖尿病的熱點(diǎn)主要有二一是各種低糖低脂的食物，但飲食不能根本改善或消除糖尿病的癥狀。另一種是各種能夠降糖的藥物和器具。而能夠真正闡述II型糖尿病病因以及可高效篩選抗II性糖尿病藥物的方法、材料和模型很少見。
II型糖尿病的治療目前主要著重于提高人體細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感，而這種提高是著重于胰島素反應(yīng)的信號(hào)途徑上，包括P13K和PKB。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)胰島素抗性細(xì)胞模型，以便進(jìn)行II型糖尿病的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種可用于II型糖尿病的研究的胰島素抗性細(xì)胞模型，及其在篩選藥物方面的應(yīng)用。
一方面，本發(fā)明提供了一種將胰島素敏感性的胰島素受體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胰島素抗性的方法，該方法包括步驟a)用糖濃度為0-0.1毫克/毫升的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)敏感性的胰島素受體細(xì)胞至穩(wěn)定；b)在培養(yǎng)液中加入胰島素和葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)；c)2-8日后，增加培養(yǎng)液中葡萄糖和胰島素的濃度，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞20-40天。
本發(fā)明還提供了用上述方法轉(zhuǎn)變的胰島素抗性的胰島素受體細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選例中，用上述方法轉(zhuǎn)變的胰島素受體細(xì)胞是人脂肪母細(xì)胞。
在另一個(gè)優(yōu)選例中，用上述方法轉(zhuǎn)變的細(xì)胞用于篩選II糖尿病藥物。
本發(fā)明還提供了一種篩選II型糖尿病藥物的方法，該方法包括在用上述方法轉(zhuǎn)變細(xì)胞的過程中，加入要檢測(cè)的藥物，觀察待轉(zhuǎn)變的細(xì)胞中糖原水平的變化；或在已轉(zhuǎn)變的上述細(xì)胞中加入要檢測(cè)的藥物，培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察細(xì)胞中糖原水平的變化。


圖1顯示了糖原染色免疫組織化學(xué)分析圖的標(biāo)準(zhǔn)。其中-，陰性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無紫紅色糖原顆粒；+，弱陽性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，紫紅色糖原顆粒約占細(xì)胞面積的1/3左右。
++，中陽性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可辨，紫紅色糖原顆粒約占細(xì)胞面積的1/2-2/3。
+++，強(qiáng)陽性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不可辨，紫紅色糖原顆粒約占細(xì)胞全面積。
圖2是對(duì)實(shí)施例2的細(xì)胞進(jìn)行PKS活性檢測(cè)的結(jié)果。
圖3是對(duì)實(shí)施例3的細(xì)胞進(jìn)行PKS活性檢測(cè)的結(jié)果。
圖4是未轉(zhuǎn)化的對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)施例2、實(shí)施例3的培養(yǎng)細(xì)胞糖原染色的免疫組織化學(xué)分析圖。
圖5是澤泄預(yù)防細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抗性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。
圖6是澤泄對(duì)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞胰島素抗性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。
具體實(shí)施例方式
胰島素敏感性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變方法一種將胰島素敏感性的胰島素受體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胰島素抗性的方法，其特征在于，該方法包括步驟a)用糖濃度為0-0.1毫克/毫升的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)敏感性的胰島素受體細(xì)胞至穩(wěn)定；b)在培養(yǎng)液中加入胰島素和葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)；c)2-8日后，增加培養(yǎng)液中葡萄糖和胰島素的濃度，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞20-40天。
本發(fā)明步驟b)所用的培養(yǎng)液中加入的起始胰島素濃度優(yōu)選為2-10國際單位/毫升，葡萄糖濃度為0.2-0.5毫克/毫升或以上，最優(yōu)選的本發(fā)明步驟b)中的起始胰島素濃度為4國際單位/毫升，葡萄糖濃度為0.25毫克/毫升。
在本發(fā)明方法中，通常通過從約第5日起每隔3-7天，較佳地每隔4-6日逐漸增加培養(yǎng)液中的葡萄糖和胰島素濃度，例如每隔5天增加濃度各1倍，以便胰島素受體細(xì)胞從敏感性轉(zhuǎn)變成抗性。通常，在培養(yǎng)20-40天，優(yōu)選25-35天后，胰島素受體細(xì)胞就會(huì)從敏感性轉(zhuǎn)變成抗性。
本發(fā)明還提供了用上述方法轉(zhuǎn)變的胰島素抗性細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選例中，用上述方法轉(zhuǎn)變的細(xì)胞是人脂肪母細(xì)胞。
本文所用的“胰島素敏感性細(xì)胞”是人類表達(dá)胰島素受體細(xì)胞，包括表達(dá)胰島素受體的脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。本發(fā)明用于轉(zhuǎn)變的優(yōu)選表達(dá)胰島素受體的細(xì)胞是胰島素敏感型的人脂肪母細(xì)胞。
在本文中，“胰島素抗性細(xì)胞”和“胰島素抗性受體細(xì)胞”可互換使用，都指表達(dá)人類表達(dá)胰島素受體，但對(duì)胰島素不敏感的細(xì)胞，例如當(dāng)胰島素敏感性細(xì)胞對(duì)胰島素的感受性從敏感性轉(zhuǎn)變?yōu)椴幻舾泻?，就成為胰島素抗性細(xì)胞。
胰島素敏感性細(xì)胞可以與胰島素結(jié)合，激活P13K(磷酸肌醇3-激酶)。P13K又通過復(fù)雜的機(jī)制激活PKB(蛋白質(zhì)激酶B，又稱為Aktβ)。PKB在糖代謝中起關(guān)鍵作用，一方面它能抑制細(xì)胞內(nèi)源肝糖合成，另一方面能激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體來促使血糖向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，使得血糖水平迅速下降。II型糖尿病病人本身能分泌胰島素，但是由于體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)胰島素的抗性，導(dǎo)致血中葡萄糖水平偏高，產(chǎn)生糖尿病癥狀。一般公認(rèn)這種現(xiàn)象與PKB功能損傷有關(guān)(Han Cho等，InsulinResistance and a Diabetes Mellitus-Like Syndrome in Mice Lacking the ProteinKinase Akt2(PKB)，Science，1999年1月)。研究人員發(fā)現(xiàn)，在小鼠中將PKB基因敲除，可使小鼠表現(xiàn)出胰島素抗性和不可抑制的產(chǎn)生肝糖，出現(xiàn)糖尿病癥狀。由此可見，胰島素抗性與PKB功能損傷有關(guān)。
胰島素抗性細(xì)胞的檢測(cè)方法在本發(fā)明中，可通過PKB活性檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)糖原含量的免疫組織化學(xué)來檢測(cè)細(xì)胞的誘變轉(zhuǎn)型。
1.PKB活性檢測(cè)如上所述，由于胰島素抗性與PKB功能損傷有關(guān)，因此對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行PKB活性檢測(cè)，可鑒定細(xì)胞是否發(fā)生了由胰島素敏感型向胰島素抵抗型的轉(zhuǎn)變。
用商品化的磷酸激酶測(cè)試試劑盒，使用常規(guī)方法，如酶的顯色反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行活性分析。
2.細(xì)胞內(nèi)糖原含量的測(cè)試方法細(xì)胞如在人為誘導(dǎo)下發(fā)生由胰島素敏感型轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素抵抗型，則細(xì)胞在胰島素存在下對(duì)外周糖的敏感、攝取和利用也會(huì)大大下降，直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)糖類和脂肪水平比未轉(zhuǎn)變前的細(xì)胞下降了4-5倍，是糖尿病的表征之一，該檢測(cè)方法具有直觀的優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明中，可用常規(guī)糖原染色的試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色(組織化學(xué)手冊(cè)，人民衛(wèi)生出版社，北京，1982，陳嘯梅等編)，或者用顯微分光光度儀對(duì)染色細(xì)胞的透光度進(jìn)行掃描，計(jì)算胞內(nèi)糖原的含量。
用轉(zhuǎn)變的細(xì)胞篩選治療II型糖尿病的候選藥物
在另一個(gè)優(yōu)選例中，用上述方法轉(zhuǎn)變的細(xì)胞篩選治療II糖尿病的候選藥物。
本發(fā)明還提供了一種篩選II型糖尿病藥物的方法，該方法包括a)在用上述方法轉(zhuǎn)變細(xì)胞的過程中，加入要檢測(cè)的藥物，觀察待轉(zhuǎn)變的細(xì)胞中糖原水平的變化；或者b)在已轉(zhuǎn)變的上述細(xì)胞中加入要檢測(cè)的藥物，培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察細(xì)胞中糖原水平的變化。
在a)中，轉(zhuǎn)變過程中如上文轉(zhuǎn)變方法中所述，是高糖高胰島素環(huán)境，而且培養(yǎng)液組分不變，除了加入候選的藥物。在培養(yǎng)過程中如上所述檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)糖原含量。加入含有有效成分的候選藥物的培養(yǎng)物中，細(xì)胞糖原含量未明顯下降，而未加藥物或加入的藥物對(duì)II型糖尿病沒有作用的培養(yǎng)物中，細(xì)胞中糖原含量下降很快，說明該候選藥物使細(xì)胞很難被高糖和高胰島素誘變成胰島素抵抗型。
在b)中，在加入或不加待檢測(cè)藥物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)已誘變成胰島素抗性的細(xì)胞一段時(shí)間，在藥物存在下，胰島素抗性細(xì)胞內(nèi)部糖原水平上升很快，逐漸恢復(fù)成胰島素敏感狀態(tài)，而未加藥物的細(xì)胞中胞內(nèi)糖原含量基本不變，保持低于正常細(xì)胞的水平。
發(fā)明效果使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)變方法，可方便的得到轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素抗性的細(xì)胞，并用其快速直觀的檢測(cè)出對(duì)II型糖尿病有療效的藥物。
實(shí)施例實(shí)施例1胰島素敏感性原代細(xì)胞的培養(yǎng)原代細(xì)胞的取材組織塊的處理a.取人的大網(wǎng)膜脂肪組織，切成小塊。
b.挑去明顯的脂肪，用Hanks培養(yǎng)液洗滌。
c.轉(zhuǎn)移入離心管中200轉(zhuǎn)至1000轉(zhuǎn)/分低速離心5到10分鐘，吸去上清液。重新加入培養(yǎng)液，并添加胰蛋白酶和膠原蛋白酶至終濃度0.2-0.5％左右，37℃保溫15分鐘到40分鐘，吸取上清液。連續(xù)重復(fù)三到五次，合并上清液。
用常規(guī)方法對(duì)上清液進(jìn)行混合計(jì)數(shù)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單集落培養(yǎng)。
依照細(xì)胞能否長期存活進(jìn)行分選，進(jìn)行細(xì)胞接種。
細(xì)胞的傳代原代細(xì)胞接種后，用加入10％BSA的無糖或低糖培養(yǎng)液連續(xù)傳代2到3代，以使細(xì)胞穩(wěn)定，減少出現(xiàn)死細(xì)胞的情況。
實(shí)施例2 胰島素敏感性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變用加入起始濃度為2國際單位/毫升的胰島素，起始濃度為0.20毫克/毫升的葡萄糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，每五天兩個(gè)濃度各增加一倍。15天后觀察細(xì)胞形態(tài)以及進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，每五天一次，34天后出現(xiàn)明顯特征。
實(shí)施例3 用高濃度的胰島素和葡萄糖濃度對(duì)胰島素敏感性細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)變用實(shí)施例2所述的相同方法轉(zhuǎn)變細(xì)胞，除了起始胰島素濃度4國際單位/ml，葡萄糖濃度0.25mg/ml，每五天兩個(gè)濃度各增加一倍。10天后觀察細(xì)胞形態(tài)以及進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，每五天一次，26天后出現(xiàn)明顯特征。
實(shí)施例4 轉(zhuǎn)變細(xì)胞的保存分別用液氮將未轉(zhuǎn)變與已轉(zhuǎn)變的細(xì)胞保存在-196℃下，遵循使用一管，保存一管的原則，以保證細(xì)胞的一慣性。
實(shí)施例5 轉(zhuǎn)變細(xì)胞的檢測(cè)在本實(shí)施例中，用PKB活性檢測(cè)和糖原和脂肪含量檢測(cè)鑒定細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
1.PKB活性的檢測(cè)使用CEll Signaling Tech.(Berverly，MA)的Akt Assay Kit試劑盒(商品目錄號(hào)9840)，在常規(guī)方法中(Livingstone，C.等(1995)EMBO J.14(8)，1785-1797)通過辣根過氧化物酶的顯色反應(yīng)，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)底物的磷酸化程度，測(cè)試PKB磷酸激酶的活性。用未轉(zhuǎn)變的細(xì)胞作為對(duì)照，培養(yǎng)的細(xì)胞重復(fù)兩次試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2顯示了用實(shí)施例2轉(zhuǎn)變的細(xì)胞PKB活性檢測(cè)的結(jié)果，可見Akt活性正常的細(xì)胞具有陰性條帶，樣品1和樣品2處條帶幾乎不可辨。說明其PKB活性大大下降，出現(xiàn)轉(zhuǎn)變特征。
圖3顯示了用實(shí)施例3轉(zhuǎn)變的細(xì)胞PKB活性檢測(cè)的結(jié)果，可見Akt活性正常的細(xì)胞具有陰性條帶，樣品1和樣品2處條帶幾乎不可辨。說明其PKB活性大大下降，出現(xiàn)轉(zhuǎn)變特征。
2.糖原免疫組織化學(xué)檢測(cè)的結(jié)果用發(fā)明描述中所述的方法，用Schiff試劑對(duì)實(shí)施例2和實(shí)施例3的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行糖原染色，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
未轉(zhuǎn)化的對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)施例2、實(shí)施例3的培養(yǎng)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果如圖4所示。
表1糖原染色陽性比例對(duì)照組范例一范例二+ 14％ 3％ 4％++18％ 12％ 13％+++ 52％ 2％ 2％總計(jì) 84％ 17％ 19％注+是指糖原染色的陽性程度。每組細(xì)胞隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野點(diǎn)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，每組共300個(gè)細(xì)胞。
從檢測(cè)結(jié)果也可看出對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)糖原陽性染色比實(shí)施例2和3的細(xì)胞組不但多，而且強(qiáng)陽性含量更高。這說明了實(shí)施例2和3的細(xì)胞內(nèi)糖原含量大大下降，發(fā)生了從胰島素敏感性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素抗性的轉(zhuǎn)變。
實(shí)施例6 用轉(zhuǎn)變成胰島素抗性的細(xì)胞篩選藥物在本實(shí)施例中，用實(shí)施例2中獲得的細(xì)胞模型篩選中藥澤泄和中藥茯苓，結(jié)果表明它們具有治療II型糖尿病的作用。
實(shí)驗(yàn)描述a)在細(xì)胞轉(zhuǎn)變培養(yǎng)過程中加入澤泄在如上文所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變的高糖高胰島素培養(yǎng)液中加入或不加入澤泄提取物，繼續(xù)培養(yǎng)，用實(shí)施例5中所述的相同方法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)糖原含量。用顯微分光光度儀測(cè)量細(xì)胞的透光度。用透光度表示細(xì)胞中糖原含量。正常細(xì)胞一般為0.3-0.4左右，而轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素抗性的細(xì)胞下降到0.02-0.03。根據(jù)下面的公式將其表示為相對(duì)糖原含量，對(duì)時(shí)間作圖糖原含量＝1/透光度相對(duì)糖原含量＝糖原含量培養(yǎng)的細(xì)胞/糖原含量正常細(xì)胞×100％
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，不加澤泄的對(duì)照組中相對(duì)糖原含量在第5天開始從約95％下降，在第30天時(shí)僅為正常細(xì)胞的30％左右，而加入澤泄的細(xì)胞內(nèi)糖原下降程度很小，在第30天仍保持在85％以上。說明澤泄能預(yù)防細(xì)胞胰島素抗性表型的出現(xiàn)。
b)澤泄對(duì)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞胰島素抗性的作用如發(fā)明描述中所述，在正常的培養(yǎng)液中加入或不加入澤泄，培養(yǎng)已轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素抗性的細(xì)胞一段時(shí)間，分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的糖原含量，用上式計(jì)算相對(duì)糖原含量，對(duì)時(shí)間作圖。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6是澤泄對(duì)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞胰島素抗性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖?？梢娂尤霛尚沟膶?shí)驗(yàn)組中相對(duì)糖原含量從第5日起開始上升，至第30日已恢復(fù)到正常含量的約90％左右，而未加澤泄的對(duì)照組相對(duì)糖原含量幾乎保持不變，維持在正常水平約20％的低水平，說明澤泄能逆轉(zhuǎn)胰島素抗性表型，將其轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)胰島素敏感的狀態(tài)，因此對(duì)II型糖尿病具有治療作用。
用本實(shí)施例的方法還篩選出茯苓，具有對(duì)II型糖尿病的預(yù)防和治療作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
所有在本文中引用的文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)和出版物，在此全文引入以供參考。雖然本發(fā)明已著重于優(yōu)選例進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然將明白，可在優(yōu)選例中制備和使用各種變化，而且除了本文中特別描述的以外，可用其它方式實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明將包括這些變化和其它實(shí)施方式。
權(quán)利要求
1.一種將胰島素敏感性的胰島素受體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胰島素抗性的方法，其特征在于，該方法包括步驟a)用糖濃度為0-0.1毫克/毫升的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)敏感性的胰島素受體細(xì)胞至穩(wěn)定；b)在培養(yǎng)液中加入胰島素和葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)；c)2-8日后，增加培養(yǎng)液中葡萄糖和胰島素的濃度，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞20-40天。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法中步驟b)中起始胰島素濃度為2-10國際單位/毫升，葡萄糖濃度為0.2-0.5毫克/毫升。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該方法中培養(yǎng)的起始胰島素濃度為4國際單位/毫升，葡萄糖濃度為0.25毫克/毫升。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法通過從第5日起每隔3-7日增加培養(yǎng)液中的葡萄糖和胰島素濃度各1倍。
5.用如權(quán)利要求1所述的方法轉(zhuǎn)變的胰島素抗性的胰島素受體細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是人脂肪母細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞的用途，其特征在于，該細(xì)胞用于篩選II型糖尿病藥物。
8.一種篩選II型糖尿病藥物的方法，其特征在于，該方法包括在如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)變方法中，在待轉(zhuǎn)變的細(xì)胞中加入要檢測(cè)的藥物，觀察細(xì)胞糖原水平的變化；或在已轉(zhuǎn)變的如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞中，加入要檢測(cè)的藥物，培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察細(xì)胞中糖原水平的變化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將胰島素敏感性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素抗性細(xì)胞的方法，包括步驟a)用糖濃度為0－0.1毫克/毫升的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)敏感性的胰島素受體細(xì)胞至穩(wěn)定；b)在培養(yǎng)液中加入胰島素和葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)；c)2－8日后，增加培養(yǎng)液中葡萄糖和胰島素的濃度，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞20－40天。本發(fā)明還提供了用這種方法轉(zhuǎn)變的細(xì)胞及其應(yīng)用。運(yùn)用本發(fā)明可以簡便迅速的篩選對(duì)II型糖尿病具有療效的藥物。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1436844SQ0211083
公開日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2002年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月9日
發(fā)明者吳超群, 高瑞蘭, 鐘翠平, 郭紅衛(wèi) 申請(qǐng)人:上海復(fù)旦金科生物技術(shù)有限公司