專利名稱：對腫瘤細(xì)胞有促凋亡功能的Survivin突變體重組腺病毒及獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到生物基因工程技術(shù)。
背景技術(shù)：
利用外源基因或核酸導(dǎo)入生物體內(nèi)達(dá)到防治疾病的基因治療是近幾十年發(fā)展起來的新技術(shù)。在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)的過程中，載體技術(shù)是關(guān)鍵，特別是其中的載體構(gòu)建。載體包括病毒載體和非病毒載體，病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等。其中，腺病毒載體(Ad)具有轉(zhuǎn)高染效率、能感染非增殖細(xì)胞、能產(chǎn)生更高病毒滴度(＞1011)等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，并具有攜帶大片段外源DNA的潛力及直接在體內(nèi)途徑(in vivo)基因轉(zhuǎn)移上有較大優(yōu)勢，因此被廣泛應(yīng)用于基因治療的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面。以腺病毒為載體構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的機(jī)理是先利用基因工程技術(shù)克隆目的基因，同源重組到腺病毒骨架質(zhì)粒以后，再包裝成復(fù)制缺陷型腺病毒，形成高轉(zhuǎn)染率、高表達(dá)的基因重組藥物。
現(xiàn)有的用腺病毒作為載體，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療效果的基因重組藥物，要么特異性不高，要么對腫瘤治療能力不強(qiáng)。例如中國專利申請02115228.4中公開的p53腺病毒載體引入外源野生型p53后，在一定程度上彌補(bǔ)了癌細(xì)胞中缺失或突變了的p53蛋白質(zhì)的作用，但因p53在細(xì)胞周期中主要在上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用，因此p53的過表達(dá)能引起細(xì)胞周期停滯，其誘導(dǎo)凋亡能力并不強(qiáng)。而且該項發(fā)明中腺病毒載體不包含綠色熒光蛋白，不方便檢測病毒滴度，操作不直觀。因此，構(gòu)建一種高轉(zhuǎn)染率，高表達(dá)，低風(fēng)險性，易生產(chǎn)，易檢測，強(qiáng)治療效果的基因重組藥物對腫瘤治療的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用極為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提出一種利用基因工程技術(shù)克隆并突變Survivin基因，再利用同源重組原理構(gòu)建到復(fù)制缺陷型的腺病毒載體上，形成對腫瘤細(xì)胞有促凋亡能力的Survivin突變體重組腺病毒。
本發(fā)明的目的通過以下方式來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的對腫瘤細(xì)胞有促凋亡功能的Survivin突變體重組腺病毒，包含突變的Survivin基因，其特征在于，所述的Survivin基因序列的第158位堿基a突變?yōu)閏，蛋白質(zhì)序列第53位氨基酸D相應(yīng)地突變?yōu)锳。
即所述的Survivin基因序列為atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagc158cttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgcgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgccatggattga蛋白質(zhì)序列表達(dá)式為MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPA53LAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD本發(fā)明的對腫瘤細(xì)胞有促凋亡功能的Survivin突變體重組腺病毒的獲得方法，包括引入突變、構(gòu)建質(zhì)粒和包裝病毒，其特征在于，引入突變的步驟為(1)首先根據(jù)已知野生型Survivin序列設(shè)計引物1和引物2，再根據(jù)突變原理設(shè)計含突變的引物3和引物4引物1 5’＞CGGAATTCCATGGGTGCCCCGACGTTGC ＜3’引物2 5’＞CGCTCGAGTCAATCCATGGCAGCCAGCTG ＜3’引物3 5’＞GAGAACGAGCCAGCCTTGGCCCAGTGTTTC ＜3’引物4 5’＞GGGCCAAGGCTGGCTCGTTCTCAGTG ＜3’或者設(shè)計引物1.1來代替引物15’＞ AGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTGC ＜3’，其中引物1和引物1.1是Survivin上游引物，分別含EcoR I和Kpn I內(nèi)切酶位點(diǎn)；引物2是Survivin下游引物，含Xho I內(nèi)切酶位點(diǎn)；引物3和引物4為引入突變點(diǎn)引物；
(2)首先用引物1和引物2從HeLa庫中釣出Survivin基因，再分別通過引物1和引物4、引物3和引物2兩對引物擴(kuò)增Survivin左右兩部分片段，回收后等量加入PCR擴(kuò)增體系，8-12個循環(huán)后，使具有重疊部分的左右兩段變性退火，形成全長雙鏈Survivin，再加入引物1和引物2進(jìn)行第三輪PCR循環(huán)擴(kuò)增出含突變的Survivin(Surv-D53A)，即第158位堿基a(腺嘌呤)突變?yōu)閏(胞嘧啶)，由此蛋白質(zhì)序列相應(yīng)發(fā)生了改變，即第53位氨基酸D(天冬氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)，如圖1；此后再通過生物基因工程中常用方法構(gòu)建質(zhì)粒和包裝病毒，其步驟為(3)通過EcoR I/Xho I雙酶切，把Surv-D53A構(gòu)建到pcDNA3-flag載體上；(4)將pcDNA3-flag-Surv-D53A經(jīng)Kpn I和Xho I內(nèi)切酶酶切，克隆到經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化過的pAd-Track-CMV載體上；或者以引物1.1替換引物1，經(jīng)過相應(yīng)的三輪PCR循環(huán)引入突變，擴(kuò)增出含突變的全長Survivin，經(jīng)Kpn I和Xho I酶切后連接到pAd-Track-CMV載體上；(5)經(jīng)內(nèi)切酶pme I單酶切線性化后與經(jīng)修飾改造過的腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-easyl共轉(zhuǎn)到大腸桿菌BJ5183中，在大腸桿菌中同源重組，經(jīng)篩選，得到重組質(zhì)粒pHomo-GFP-CMV-Surv-D53A；(6)該重組質(zhì)粒由內(nèi)切酶pac I線性化后轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞包裝得到復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-D53A。
本發(fā)明方法中所用試劑為EcoR I、Kpn I和Xho I內(nèi)切酶，CIAP堿性磷酸酶購自上海生工公司，細(xì)胞培養(yǎng)基來自O(shè)xid公司，脂質(zhì)體Liofectamine 2000購自clontech公司，etopside、TRAIL和doxorubicin等化療藥物購自R & D公司，Hoechst 33342及其它大部分試劑購自Sigma公司。
IAP家族在腫瘤細(xì)胞抗凋亡過程中起非常重要的作用，Survivin屬于IAP家族成員，這個家族的各個成員在BIR(baculovirus IAP repeat)結(jié)構(gòu)域中D最為保守，見圖2。Survivin第53位天冬氨酸D形成的酸性表面對于維持其三級結(jié)構(gòu)和生理功能極為重要，把它突變?yōu)楸彼岷螅琒urvivin的功能從抗凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲?，具體機(jī)制是由于它競爭性地抑制了野生型Survivin(WT)的功能，使Survivin(WT)不能結(jié)合到Smac(一種促凋亡蛋白)，從而解除了Survivin阻止凋亡的作用，突變體本身也不能結(jié)合到Smac；另一方面，Surv-D53A不能像野生型Survivin一樣與Aurora B(一種參與細(xì)胞分裂的激酶)結(jié)合，使處于強(qiáng)分裂的癌細(xì)胞分裂失敗，從而激發(fā)凋亡。同時，Survivin突變體重組腺病毒使腫瘤細(xì)胞對etopside、TRAIL和doxorubicin等化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡更加敏感。因此，用本發(fā)明方法獲得的Survivin突變體重組腺病毒對腫瘤細(xì)胞有較好的促凋亡治療效果。
為了設(shè)計對照，本發(fā)明同時還構(gòu)建了腺病毒載體Ad-GFP。將上述得到的復(fù)制缺陷型腺病毒載體進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證所述腺病毒Ad-D53A促凋亡性能。
(1)子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和肝癌細(xì)胞(QGY-7703)經(jīng)Ad-D53A感染24到48小時后，出現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象，而對照組Ad-GFP無變化，結(jié)果如附圖3(A、B、C、D)。
(2)MTT實(shí)驗(yàn)分析。Ad-D53A，Ad-GFP腺病毒按一定滴度感染QGY-7703細(xì)胞，在特定時間加入MTT，孵育3小時，接著溶解在DMSO中，最后通過570nm波長，在ELX800 UniversalMicroplate Reader(BIO-TEK Instrument Inc.USA)儀器上讀出讀數(shù)，計算細(xì)胞存活率。隨著時間的加長，被Ad-D53A感染的QGY-7703細(xì)胞凋亡百分比逐步上升，見圖4；同時Surv-D53A使QGY-7703對etoposide和doxorubicin的治療效果更加敏感，能明顯加強(qiáng)TRAIL對子宮頸癌HeLa細(xì)胞的治療作用，見圖5.
(3)瓊脂糖克隆數(shù)形成實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞板上先鋪一層0.7％的瓊脂糖膠，QGY-7703細(xì)胞包埋在0.3％的上層瓊脂糖培養(yǎng)基上，15天后，經(jīng)結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，拍照。，被Ad-D53A感染的肝癌細(xì)胞QGY-7703在瓊脂糖上極少存活，只有很少克隆數(shù)形成，絕大多數(shù)癌細(xì)胞已凋亡，而對照組PBS，Ad-GFP形成很多細(xì)胞克隆群。
(4)裸鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn)。經(jīng)皮下及腹腔注射肝癌細(xì)胞QGY-7703，建立腫瘤模型，再給予該基因藥物；或者皮下及腹腔注射經(jīng)重組基因藥物感染過的肝癌細(xì)胞。無論哪種處理方式，與對照組Ad-GFP比較起來，Ad-D53A都能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。
(5)免疫組化結(jié)果。腫瘤組織常規(guī)切片，脫蠟，復(fù)水后，用抗flag抗體，經(jīng)免疫組化試劑盒檢測表明，Ad-D53A處理過的腫瘤組織，有flag表達(dá)，呈陽性，Ad-D53A在腫瘤組織中高表達(dá)，細(xì)胞已發(fā)生凋亡；而對照組呈陰性。
(6)H & E染色結(jié)果。腫瘤組織常規(guī)切片，脫蠟，復(fù)水后，分別經(jīng)伊紅、蘇木素染色，脫水封片后，在顯微鏡下觀察到Ad-D53A處理過的腫瘤細(xì)胞大面積凋亡，而對照組未見損傷。
從多項實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明的重組腺病毒強(qiáng)烈誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(QGY-7703)，子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)及肺癌細(xì)胞(A549和H1299)等癌細(xì)胞凋亡。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步描述。
圖1是Survivin基因的結(jié)構(gòu)及突變點(diǎn)示意圖。
圖2是IAP家族中BIR結(jié)構(gòu)域中較為保守的序列示意圖。
圖3是Ad-D53A在子宮頸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡結(jié)果示意圖。
圖4是肝癌細(xì)胞(QGY-7703)感染后的MTT分析結(jié)果示意圖。
圖5是子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)被C1-GFP、C1-GFP-Survivin(野生型)、C1-GFP-Surv(D53A突變型)及化療藥物TRAIL處理后的MTT分析結(jié)果示意圖。
參見圖1，其中1、3為二聚體形成界面，2為BIR結(jié)構(gòu)域，4為與微管結(jié)合及核出位信號區(qū)，5為突變點(diǎn)(D突變?yōu)锳)參見圖2，本圖為IAP家族各成員BIR結(jié)構(gòu)域序列的比較，其中氨基酸D用星號標(biāo)出。該結(jié)果是用歐洲生物信息研究所ClustalW軟件和巴斯德研究所Boxshade軟件分析所得。
參見圖3，其中A、B圖中為HeLa細(xì)胞，A為Ad-GFP感染過，細(xì)胞未見凋亡，狀態(tài)良好，呈多角狀態(tài)，B圖中細(xì)胞為Ad-Surv(D53A)感染過，與A中比較，可見細(xì)胞變圓，有明顯的凋亡現(xiàn)象；C、D圖為肝癌細(xì)胞QGY-7703，C中細(xì)胞感染過Ad-GFP，細(xì)胞形態(tài)保持完好，未見損傷，而D圖中被Ad-Surv(D53A)感染后，部分細(xì)胞變圓，開始凋亡。
參見圖4肝癌細(xì)胞QGY-7703經(jīng)Ad-GFP或Ad-Surv(D53A)感染后，隨著時間的延長，細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增多。經(jīng)過MTT實(shí)驗(yàn)分析，Ad-Surv(D53A)組在24小時達(dá)到約28％的死亡率，在48小時約為45％。
參見圖5子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)先轉(zhuǎn)染C1-GFP，C1-GFP-Survivin(野生型)，C1-GFP-Surv(D53A突變型)，12小時后加入化療藥物TRAIL，其工作濃度為10納克每毫升，隨著與該藥孵育時間的加長，Surv(D53A)與TRAIL共同作用的細(xì)胞凋亡率，2小時已達(dá)到70％，而作為對照的野生型Survivin和C1-GFP細(xì)胞凋亡率不到50％。在4小時效果更加明顯，聯(lián)合用藥使癌細(xì)胞凋亡達(dá)100％。
具體實(shí)施例方式
1)引入突變所用PCR循環(huán)條件為94℃ 熱變性 8分鐘94℃ 熱變性 1分鐘56℃ 退火1分鐘72℃ 延伸1分鐘從第二步到第四步進(jìn)行30個循環(huán)72℃ 延伸10分鐘16℃ 保持首先，通過PCR循環(huán)用引物1和引物2從HeLa庫中釣出Survivin基因。
其次，分別以引物1和引物4，引物3和引物2擴(kuò)增Survivin左右兩段。以1％瓊脂糖膠回收后作為模板等量加入PCR擴(kuò)增體系，再次擴(kuò)增10個循環(huán)，使具有重疊部分的兩段變性后退火相連，形成全長含突變的Survivin。
最后，再加入引物1和引物2指數(shù)級擴(kuò)增突變Survivin。
如果在引入突變的三輪循環(huán)中用引物1.1替代引物1，則用Kpn I酶切位點(diǎn)替代EcoR I位點(diǎn)，以方便直接將突變Survivin基因連接到pAd-Track-CMV載體上，而不經(jīng)過pcDNA3-flag載體。
2)構(gòu)建質(zhì)粒和包裝病毒引物1和引物2分別含內(nèi)切酶EcoR I、Xho I酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切消化，連接到經(jīng)相應(yīng)酶切過的pcDNA3-flag真核表達(dá)載體上。
酶切體系(10μl)為BSA(小牛血清)1μlBuffer D(緩沖液) 1μlEcoR I(內(nèi)切酶) 0.2μlXho I(內(nèi)切酶)0.2μlSurv(D53A) 7.6μl37℃反應(yīng)4個小時，再跑膠回收。
連接體系(10μl)為
ligase Buffer(連接酶緩沖液)1μlligase(連接酶) 0.5μl載體pcDNA3-flag2μl片段Surv(D53A) 6.5μl16℃反應(yīng)過夜。再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α。挑取單克隆，搖菌，用試劑盒(kit)抽質(zhì)粒。再用內(nèi)切酶EcoR I、Xho I酶切鑒定，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確。免疫印記實(shí)驗(yàn)證實(shí)突變Survivin表達(dá)了。
把Survivin基因連接到pcDNA3-flag載體上，是為了使該基因與flag(一種只有十幾個氨基酸的抗原表位)融合，方便于用flag抗體檢測Survivin的表達(dá)。
用內(nèi)切酶Kpn I和Xho I把Survivin從pcDNA3-flag上切下(與EcoR I和Xho I具有相同的酶切體系和反應(yīng)條件)，連接到腺病毒體系中的轉(zhuǎn)移載體pAd-Track-CMV上。該載體含兩個CMV啟動子，一個調(diào)控目的基因，另一個調(diào)控GFP(綠色熒光蛋白)各自獨(dú)立調(diào)控表達(dá)。GFP的存在方便于病毒滴度的鑒定及感染效率的檢測，非常直觀。
pAd-Track-CMV-Surv(D53A)經(jīng)內(nèi)切酶pme I線性化后，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-easyl共同電轉(zhuǎn)到大腸桿菌菌株BJ5183，使Surv(D53A)重組到腺病毒中，經(jīng)卡那霉素篩選得到陽性重組克隆pHomo-Surv(D53A)，該質(zhì)粒經(jīng)pac I線性化后，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，13天后得到含Surv(D53A)的復(fù)制缺陷型重組病毒載體。
pmeI線性化條件(20μl體系)為H2O(水) 9μlBuffer4(緩沖液4) 1μlBSA(小牛血清) 1μlpme I(內(nèi)切酶) 2μlpAd-Track-CMV-Surv(D53A) 7μl37℃反應(yīng)過夜。
pac I線性化條件為H2O(水) 10μlBufferl(緩沖液1) 1μlBSA(小牛血清) 1μl
pac I(內(nèi)切酶)2μlpHomo-Surv(D53A) 6μl每管20μl，共4管，37℃反應(yīng)過夜。
質(zhì)粒pAd-Track-CMV-Surv(D53A)，pHomo-Surv(D53A)酶切后，再經(jīng)CIAP堿性磷酸酶處理，使其不能自連接，再跑膠回收。
CIAP(堿性磷酸酶)反應(yīng)體系分別為23/90μlCIAP Buffer(緩沖液)2.3μl/9μlCIAP堿性磷酸酶 0.7μl/1μl酶切后質(zhì)粒 20μl/80μl37℃反應(yīng)1小時。
電轉(zhuǎn)及篩選40μl感受態(tài)BJ5183菌株中加入4μl線性化pAd-Track-CMV-Surv(D53A)和2μl腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-easyl電壓2.5千伏特電阻200歐姆電容25微法拉電激4.94秒，快速加入LB培養(yǎng)基，37℃以50轉(zhuǎn)速度搖1個小時，涂在卡那抗性LB板上。48小時后，挑取小點(diǎn)培養(yǎng)，酚/氯仿法抽取質(zhì)粒，酶切，跑膠檢測，確定陽性克隆。
293A細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染步驟為在轉(zhuǎn)染前18-24小時傳293A細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時密度達(dá)60-80％。
取8μl脂質(zhì)體溶入200μl DMEM(不含血清和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基)，室溫放置2-5分鐘；取8μl線性化pHomo-Surv(D53A)溶入200μl DMEM中；輕輕打勻兩者，室溫放置15-20分鐘；給細(xì)胞換上新鮮培養(yǎng)基，加入質(zhì)粒脂質(zhì)體混合物，輕輕混勻。
3)大量包裝用原代病毒Ad-Surv(D53)感染293A細(xì)胞，大量包裝，3-4天后細(xì)胞懸浮，離心收集細(xì)胞(在4℃以1000轉(zhuǎn)離心5分鐘)，沉淀溶解在PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.2)中，放置在-80℃，20分鐘后取出，于37℃融化，用震蕩器破裂。重復(fù)凍融2次，離心(在4℃以9000轉(zhuǎn)離心10分鐘)，收集上清，分裝，-80℃保存.。
4)效果檢測感染細(xì)胞肝癌細(xì)胞(QGY-7703)，子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)，肺癌細(xì)胞(A549和H1299)等細(xì)胞長到密度約90％時，以MOI(滴度)50加入Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP，輕輕混勻，6小時后換培養(yǎng)基，24或48小時后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，與對照組Ad-GFP相比，能見到Ad-Surv(D53A)感染的癌細(xì)胞有明顯的凋亡現(xiàn)象。
MTT分析在96孔板中傳肝癌細(xì)胞，使其密度達(dá)到80％，24小時后，感染Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP，一定時間細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象后，1毫克每毫升的工作濃度加入MTT，37℃孵育3小時，加入100微升DMSO(二甲基亞砜)，半小時后，在ELX800讀數(shù)儀上讀數(shù)，取平均數(shù)后計算細(xì)胞存活率。
動物模型4周齡胸腺缺陷型裸鼠(Athymus BALB/c nude mice)皮下或腹腔種植肝癌細(xì)胞QGY-7703(每只約2×106個細(xì)胞)，一個星期后，腫瘤組織開始長成，再相應(yīng)地在皮下腫瘤或腹腔中注射復(fù)制缺陷型病毒Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP，10天后，經(jīng)皮下種植并被Ad-Surv(D53A)處理過的腫瘤基本消失，而對照組的腫瘤長的更大；腹腔種植腫瘤細(xì)胞并注射Ad-Surv(D53A)的裸鼠經(jīng)解剖開腔后發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)并無遷移和擴(kuò)散，只在原始部位有一很小的腫瘤組織，而對照組Ad-GFP處理過的裸鼠，腫瘤細(xì)胞侵潤到整個腹腔。
另一組實(shí)驗(yàn)是先培養(yǎng)肝癌細(xì)胞QGY-7703，使其密度達(dá)到90％，再用重組病毒Ad-Surv(D53A)或Ad-GFP以MOI為25的滴度感染細(xì)胞，6小時后換新鮮培養(yǎng)基，24小時后收細(xì)胞，皮下或腹腔注射裸鼠(每只約2×106個細(xì)胞)，14天后，與對照組Ad-GFP比較起來，Ad-Surv(D53A)能強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)展和遷移。
序列表<160>2<210>1<211>429<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag120gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagcct tggcccagtg tttcttctgc180ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat240tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa300tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag360aagaaagaat ttgaggaaac tgcgaagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc420atggattga429<210>2<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp1 5 10 15His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala20 25 30Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr35 40 45Glu Asn Glu Pro Ala Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu50 55 60Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu85 90 95Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys100 105 110Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala115 120 125Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp130 135 140
權(quán)利要求
1.一種對腫瘤細(xì)胞有促凋亡功能的Survivin突變體重組腺病毒，包括突變的Survivin基因，其特征在于，所述的Survivin基因序列的第158位堿基a突變?yōu)閏，其基因序列表達(dá)式為atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctctacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgaggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagc158cttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaaactgcgaagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgccatggattga蛋白質(zhì)序列第53位氨基酸D相應(yīng)地突變?yōu)锳，蛋白質(zhì)序列表達(dá)式為MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPA53LAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD
2.一種對腫瘤細(xì)胞有促凋亡功能的Survivin突變體重組腺病毒的獲得方法，包括引入突變、構(gòu)建質(zhì)粒和包裝病毒，其特征在于，引入突變的步驟為(1)根據(jù)已知野生型Survivin序列設(shè)計引物1和引物2，再根據(jù)突變原理設(shè)計含突變的引物3和引物4引物1 5’>CGGAATTCCATGGGTGCCCCGACGTTGC <3’引物2 5’>CGCTCGAGTCAATCCATGGCAGCCAGCTG <3’引物3 5’>GAGAACGAGCCAGCCTTGGCCCAGTGTTTC <3’引物4 5’>GGGCCAAGGCTGGCTCGTTCTCAGTG <3’其中引物1是Survivin上游引物，含EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn)；引物2是Survivin下游引物，含Xho I內(nèi)切酶位點(diǎn)；引物3和引物4為引入突變點(diǎn)引物；(2)用引物1和引物2從HeLa庫中釣出Survivin基因，再分別通過引物1和引物4、引物3和引物2兩對引物擴(kuò)增Survivin左右兩部分片段，回收后等量加入PCR擴(kuò)增體系，8-12個循環(huán)后，使具有重疊部分的左右兩段變性退火，形成全長雙鏈Survivin，再加入引物1和引物2進(jìn)行第三輪PCR循環(huán)擴(kuò)增出含突變的Survivin第158位堿基a突變?yōu)閏，此蛋白質(zhì)序列第53位氨基酸D相應(yīng)突變?yōu)锳；此后再通過生物基因工程中常用方法構(gòu)建質(zhì)粒和包裝病毒，其步驟為(3)通過EcoR I/Xho I雙酶切，把Surv-D53A構(gòu)建到pcDNA3-flag載體上；(4)將pcDNA3-flag-Surv-D53A經(jīng)Kpn I和Xho I內(nèi)切酶酶切，克隆到經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化過的pAd-Track-CMV載體上；(5)經(jīng)內(nèi)切酶pme I單酶切線性化后與經(jīng)修飾改造過的腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-easyl共轉(zhuǎn)到大腸桿菌BJ5183中，在大腸桿菌中同源重組，經(jīng)篩選，得到重組質(zhì)粒pHomo-GFP-CMV-Surv-D53A；(6)該重組質(zhì)粒由內(nèi)切酶pac I線性化后轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞包裝得到復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-D53A。
3.如權(quán)利要求2的對腫瘤細(xì)胞有促凋亡功能的Survivin突變體重組腺病毒的獲得方法，其特征在于，所述引入突變的步驟(1)中，根據(jù)已知野生型Survivin序列設(shè)計引物1.1來代替引物15’>AGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTGC <3’，它是Survivin上游引物，含Kpn I內(nèi)切酶位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求2或3的對腫瘤細(xì)胞有促凋亡功能的Survivin突變體重組腺病毒的獲得方法，其特征在于，所述引入突變的步驟(4)中，以引物1.1替換引物1，經(jīng)過相應(yīng)的三輪PCR循環(huán)引入突變，擴(kuò)增出含突變的全長Survivin，經(jīng)Kpn I和Xho I酶切后連接到pAd-Track-CMV載體上。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及生物基因工程技術(shù)。所述的Survivin突變體重組腺病毒，將Survivin基因序列的第158位堿基a突變?yōu)閏，蛋白質(zhì)序列第53位氨基酸D相應(yīng)地突變?yōu)锳。其獲得方法包括引入突變、構(gòu)建質(zhì)粒和包裝病毒。引入突變的步驟是首先根據(jù)已知野生型Survivin序列設(shè)計引物1和引物2，再根據(jù)突變原理設(shè)計含突變的引物3和引物4；用引物1和引物2從HeLa庫中釣出Survivin基因，再分別擴(kuò)增Survivin左右兩部分片段，回收后等量加入，變性退火再循環(huán)，形成全長雙鏈Survivin后進(jìn)行第三輪PCR循環(huán)，擴(kuò)增出含突變的Survivin(Surv－D53A)，此后再通過生物基因工程中常用方法構(gòu)建質(zhì)粒和包裝病毒。從多項實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，本發(fā)明的重組腺病毒強(qiáng)烈誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞、子宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等癌細(xì)胞凋亡。
文檔編號C12N15/861GK1710080SQ20041004104
公開日2005年12月21日 申請日期2004年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月17日
發(fā)明者吳緬, 那沙·阿丁·霍蒂, 朱的娥, 宋質(zhì)銀, 王宜 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)