專利名稱：寡核苷酸芯片及其在乙型肝炎病毒突變位點檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體地是涉及乙肝病毒突變位點的寡核苷酸檢測芯片，利用寡核苷酸芯片的固相PCR來檢測乙肝病毒突變位點。
根據(jù)功能分類，基因芯片可分為分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片，前者可用于基因功能的分析。寡核苷酸芯片除了可繪制表達譜外，在高通量測序、臨床診斷、疾病耐藥性檢測、單核苷酸多態(tài)性、基因分型等方面具有潛在的優(yōu)勢。例如人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究、BRCA I外顯子11、CFTR基因、ATM基因、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因的突變檢測、分枝桿屬內(nèi)不同種的識別及利福酶素抗性檢測等。
寡核苷酸芯片識別單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或單堿基突變可以通過PCR擴增得到的片段與等位特異性的寡核苷酸探針雜交，根據(jù)信號的強弱來分析結(jié)果。但由于核酸的雜交效率和形成雜合體的熱穩(wěn)定性與核酸的序列、結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，改變反應(yīng)條件如溫度、雜交嚴謹度等只能部分改善雜交效率和雜合體的熱穩(wěn)定性。由于該限制性，衍生出許多新方法和新思路。寡核苷酸芯片由最初的固相合成到合成后點樣，高密度芯片與低密度芯片同時并存?；诠押塑账彡嚵械奈y序、單堿基延伸、固相PCR等也應(yīng)運而生。
肝炎是世界性傳染疾病，我國是公認的肝炎大國，肝炎的患病率和發(fā)病率都居世界前列，尤其是乙型肝炎在全國范圍內(nèi)分布最廣。肝炎病毒的感染，不僅與急慢、性肝炎，還與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。乙肝病毒基因不同位點的突變可引起免疫逃避、抗病毒治療逃避，使得臨床檢測出現(xiàn)漏檢、用藥不當，以至延誤治療。傳統(tǒng)的乙肝突變檢測，通常是通過限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)等各種分子標記、PCR擴增而實現(xiàn)的。它們難以做到對大量樣品的同時、平行分析，而且所需樣品量大，檢測靈敏度低，操作時間長。
本發(fā)明總的構(gòu)思是集寡核苷酸芯片和固相PCR反應(yīng)于一體。在PCR反應(yīng)中，鑒于TaqDNA聚合酶在引物的3′末端存在錯配時不能正確延伸的特點，將突變位點設(shè)計在檢測探針的3′末端，然后將其5′末端固定在經(jīng)過化學(xué)修飾的玻璃基片上作為寡核苷酸芯片的探針、固相PCR反應(yīng)的固相引物，其3′末端游離。設(shè)計不同的液相引物，使其與固相引物配對。為確保擴增的效率和準確性，所擴增的PCR區(qū)域不超過150bp，熒光標記采用Cy3-dCTP。固相PCR擴增結(jié)果的檢測采用熒光掃描或是熒光顯微鏡觀察(見附

圖1)。
在本發(fā)明中，采用了三對液相引物。上游引物3與下游引物3用于擴增包括S區(qū)已知突變位點在內(nèi)的區(qū)域。上游引物1與下游引物1用于擴增前C區(qū)1762、1764位點聯(lián)合突變，上游引物2與下游引物2來擴增前C區(qū)其它突變位點。液相混合物中的上游引物分別和其相應(yīng)的反義鏈上的寡核苷酸檢測探針，即固相下游引物配對。液相混合物中的下游引物分別和其相應(yīng)的正義鏈上的寡核苷酸探針，即固相上游引物配對。從而擴增出不同長短、包含突變位點信息的帶有熒光標記的片段。
本發(fā)明中，乙肝每一個突變位點在DNA的正、反義鏈上分別設(shè)計有相應(yīng)的檢測探針，同時還有與檢測探針相對應(yīng)，僅缺少3′末端待檢測堿基在內(nèi)的陽性對照探針。所以，每一突變位點設(shè)計有6條寡核苷酸探針，陽性對照探針2條、突變檢測探針2條、野生檢測探針2條，均分別設(shè)計在DNA的正、反義鏈上。根據(jù)陽性對照，如果某一位點的在正、反義鏈上的突變探針的陽性信號強度遠高于野生探針，證明該位點為純合突變位點M/M；反之為純合野生位點W/W。如果同一位點在正、反義鏈上的探針信號強度相近，證明該位點為雜合位點M/W。
本發(fā)明的寡核苷酸檢測芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對照的點涂層，所述點涂層是在玻璃基片上陣列式均勻分布的，含有包括乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個突變位點和其相對應(yīng)的野生位點的72條寡核苷酸探針。
上述玻璃基片為硅烷化玻璃載片，或是經(jīng)過三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾、丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片。
上述寡核苷酸芯片上的所有探針通過5′末端氨基己烷連接在修飾后的玻片上。
上述寡核苷酸探針所在陣列與對照的點涂層的大小可以根據(jù)點的大小，點間距的變化而變化；陣列的排列和分布數(shù)量可以根據(jù)待分析樣品的數(shù)目而變化。
上述寡核苷酸探針排列如附圖3所示，探針點直徑為100μm，點間距為300μm時，肽核酸探針所在陣列與相應(yīng)的點涂層大小為2.2mm×2.5mm。
上述的72條寡核苷酸探針包含的12個突變位點是，乙肝表面抗原區(qū)已知的5個突變位點546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原區(qū)7個已知的突變位點1896G-A、1762A-T與1764G-A聯(lián)合突變、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
上述的72條寡核苷酸探針，每一個待檢測位點包括6條探針，突變位點和野生位點的正、反義鏈探針共計4條。陽性對照探針2條，分別位于正、反義鏈，它缺少3′末端的待檢測堿基。
上述的寡核苷酸探針的長度為14-19mer，Tm值相差不超過10℃，GC堿基百分含量為50％-70％。
本發(fā)明寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點檢測中的應(yīng)用，方法包括(1)乙肝突變位點檢測寡核苷酸探針的設(shè)計及合成；(2)玻璃基片的修飾和寡核苷酸探針的固定；(3)乙肝樣品DNA的提取；(4)固相PCR擴增；(5)寡核苷酸芯片的洗滌和信號檢測分析。
上述的固相PCR是在寡核苷酸芯片上進行的；固相引物為寡核苷酸芯片上的探針，液相引物為上游引物1、2、3與下游引物1、2、3的混合物；PCR擴增之中采用Cy3-dCTP熒光摻入標記。
上述的固相PCR擴增中的3對液相引物，分別是用于擴增包括S區(qū)已知突變位點在內(nèi)的區(qū)域的上游引物3與下游引物3，用于擴增前C區(qū)1762、1764位點聯(lián)合突變的上游引物1與下游引物1，用于擴增前C區(qū)其它突變位點的上游引物2與下游引物2；3對液相引物具體如下
Tm值為解鏈溫度，GC％為鳥嘌呤與胞嘧啶百分含量。
本發(fā)明所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點檢測中的應(yīng)用，具體包括以下步驟1、乙肝突變位點檢測寡核苷酸探針的設(shè)計及合成采用奧理勾5.0(Oligo5.0)軟件來設(shè)計探針。檢測探針采用寡脫氧核苷酸，長度為14-19mer，每一突變位點的探針包括2條突變檢測探針、2條野生檢測探針、2條陽性對照探針，分別設(shè)計在乙肝DNA的正、反義鏈。4條檢測探針的3′末端最后一個堿基分別為正、反義鏈上待檢測突變位點，2條陽性對照探針缺少3′末端待檢測堿基。(附圖2為S區(qū)546位點探針設(shè)計示意圖)，所有探針的Tm值按GC百分比計算，在65℃-75℃間。寡核苷酸芯片中所用探針(由上海生工生物工程公司合成)信息見表1。探針的5′端連接有氨基己烷NH2-(CH2)6以與活化的玻璃基片結(jié)合。氨基己烷通過polyT15與寡核苷酸探針相連，多聚胸腺嘧啶的加入，可以減少寡核苷酸探針與玻璃基片之間的空間阻遏，利于PCR的進行。2、玻璃基片的修飾和寡核苷酸探針的固定用硅烷化試劑處理干凈的空白玻片，得到的硅烷化玻片可以直接用于點樣?；蚴菍⒉Ｆ?％-3％三甲氧基丙基-乙烯亞胺(95％的乙醇配制)溶液處理玻片1小時，然后用丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯溶液(用9∶1V/V的DMSODMF配置)處理5個小時。
寡核苷酸探針采用pH9.0的碳酸鈉鹽緩沖液溶液作為點樣液，寡核苷酸探針在基片上的分布原則是每一位點的六條探針為一組，陣列面積可以根據(jù)探針的排列以及點、點間距的變化而變化。附圖3中，圓圈內(nèi)的數(shù)字與表1中的探針編號一致，該陣列共計8行9列，探針點直徑為100μm，點間距為300μm，總面積為2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分別代表乙肝S區(qū)待檢測位點546、551、552、585、587；前C區(qū)待檢測位點1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12組72條寡核苷酸檢測探針。每一組的6條探針分左右兩排排列，左邊的一排從上到下分別是該位點正義鏈上的陽性對照、野生探針和突變探針；右邊的一排從上到下分別是該位點反義鏈上的陽性對照、野生探針和突變探針。點樣后的陣列經(jīng)水合后直接用于固相PCR擴增。3、乙肝樣品DNA的提取取乙肝病人血清20-100μl，加入3倍體積的裂解液劇烈振蕩混勻。然后加入等體積的氯仿、異戊醇溶液(24∶1)，混勻后離心。收集上清液，加入2倍體積的無水乙醇于-20℃放置2個小時，離心后所得沉淀用70％的乙醇清洗沉淀2次，自然干燥。4、固相PCR擴增固相PCR擴增中所用的固相引物為固定在陣列上的寡核苷酸探針，相引物為三對上、下游引物的混合物。擴增采用MJ Research PTC-200固相PCR擴增儀，應(yīng)體系為10μl。
PCR擴增采程序為94℃ 6分鐘 1個循環(huán)94℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒，50個循環(huán)5、寡核苷酸芯片的洗滌和信號檢測分析固相PCR擴增后的寡核苷酸陣列用1×SSC(0.15M NaCI、17mM檸檬酸鈉，pH7.0)，內(nèi)含0.1％的SDS溶液清洗兩次。清洗后的寡核苷酸陣列經(jīng)激光掃描儀掃描或熒光顯微鏡觀察并收集信號，分析檢測結(jié)果。掃描結(jié)果顯示如果某一位點的陽性對照有熒光信號，正、反義鏈的野生探針陽性信號遠高于突變探針的信號強度，證明該位點為純合野生位點W/W。反之為純合突變位點M/M。如果同一位點在正、反義鏈的探針信號強度相近，證明該位點為雜合位點M/W。
表1 乙肝前S區(qū)與C區(qū)突變位點檢測探針
其中，每一位點所標出的6條探針的排列次序按序號從低到高分別是正義鏈的陽性對照探針、野生檢測探針和突變檢測探針，反義鏈的陽性對照探針、野生檢測探針和突變檢測探針。同時，該表中還包含了探針的序列、長度、Tm值和GC百分比等內(nèi)容。
本發(fā)明的優(yōu)良效果如下1)本發(fā)明集固相PCR與寡核苷酸芯片于一體。與傳統(tǒng)的突變檢測技術(shù)，如PCR和RFLP等分子標記技術(shù)相比，它可以同時高通量地檢測很多突變位點，平行分析多個樣品。與常規(guī)的基因芯片相比，它直接在芯片上進行PCR擴增，PCR擴增結(jié)束后即可直接通過掃描檢測結(jié)果而不必要經(jīng)過雜交，從而縮短了檢測時間。
2)本發(fā)明經(jīng)多輪PCR擴增后，摻入標記的熒光信號的強度大大增加，使得該檢測方法的靈敏度大大提高。
3)對于寡核苷酸芯片檢測突變來說，待檢測序列自身結(jié)構(gòu)對雜交效率和雜交穩(wěn)定性都有影響，因而難以實現(xiàn)對大量突變位點的同時檢測。本發(fā)明利用TaqDNA聚合酶在3′末端存在錯配時不能正確延伸的特點來檢測突變，而不經(jīng)過雜交。從而使之適用于高通量突變檢測和單核苷酸多態(tài)性分析。
4)本發(fā)明利用寡核苷酸芯片的固相PCR反應(yīng)來檢測乙型肝炎病毒突變位點，可獲得與突變位點相關(guān)的臨床信息，指導(dǎo)臨床用藥。
圖2是以S區(qū)546位點為例的正、反義探針設(shè)計示意圖。其中，探針1、2、3為正義鏈上的三條探針，4、5、6為反義鏈上的三條探針。探針1、4分別為正、反義鏈上該位點的陽性對照。2、5分別為該位點在正、反義鏈上的野生型探針，3、6為該位點在正、反義鏈上的突變型探針。
圖3為寡核苷酸探針在玻璃基片上的分布示意圖。
其中，1為玻璃基片，2為寡核苷酸探針與對照的點涂層。圓圈內(nèi)的數(shù)字與表1所列出的寡核苷酸探針序號相對應(yīng)。
圖4為利用激光共聚焦掃描儀ScanArray4000掃描(激光強度為80，PMT增益為80)經(jīng)固相PCR擴增和清洗后的寡核苷酸芯片的結(jié)果圖。寡核苷酸芯片上分布有乙肝1896和1901位點的12條探針。其中，1和2列是1896位點的6條探針，3和4列是1901位點的6條探針。A1、B1、C1分別是1896位點正義鏈上的陽性對照，野生位點檢測探針和突變位點檢測探針；A2、B2、C2分別是1896位點反義鏈上的陽性對照，野生位點檢測探針和突變位點檢測探針。1901位點的探針排列如1896位點，3、4列分別為正義鏈和反義鏈上的三條探針。
寡核苷酸探針與對照的點涂層2陣列共計8行9列，針點直徑為100μm，間距為300μm，總面積為2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分別代表乙肝S區(qū)待檢測位點516、551、552、585、587；前C區(qū)待檢測位點1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12組72條寡核苷酸檢測探針。每一組的6條探針分左右兩排排列，左邊的一排從上到下分別是該位點正義鏈上的陽性對照、野生探針和突變探針；右邊的一排從上到下分別是該位點反義鏈上的陽性對照、野生探針和突變探針。點樣后的陣列經(jīng)水合后直接用于固相PCR擴增。
固相PCR在寡核苷酸芯片上進行，寡核苷酸探針同時是固相PCR擴增的固相引物，三對液相引物包括了所有待檢測突變位點在內(nèi)的區(qū)域，且保證最長的擴增片段不超過150bp。在固相PCR擴增過程中采用Cy-3-dCTP熒光摻入標記。寡核苷酸芯片的固相PCR產(chǎn)物經(jīng)激光共聚焦掃描儀掃描后分析各突變位點。
實施例2.如實施例1所述的寡核苷酸芯片，所不同的是在玻璃基片1是經(jīng)過三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾、丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片。
實施例3.寡核苷酸檢測芯片用于乙型肝炎病毒突變位點的檢測1.乙肝突變位點檢測寡核苷酸探針的設(shè)計及合成采用Oligo5.0軟件來設(shè)計探針。檢測探針采用寡脫氧核苷酸，長度為14-19mer，每一突變位點的探針包括2條突變檢測探針、2條野生檢測探針、2條陽性對照探針，分別設(shè)計在乙肝DNA的正、反義鏈。4條檢測探針的3′末端最后一個堿基分別為正、反義鏈上待檢測突變位點，2條陽性對照探針缺少3′末端待檢測堿基。(附圖2為S區(qū)546位點探針設(shè)計示意圖)所有探針的Tm值按GC百分比計算，在65℃-75℃間。寡核苷酸芯片中所用探針(由上海生工生物工程公司合成)信息見表1。探針的5′端連有氨基己烷NH2-(CH2)6以與活化的玻璃基片結(jié)合。氨基己烷通過polyT15與寡核苷酸探針相連，加入多聚胸腺嘧啶，以減少寡核苷酸探針與玻璃基片之間的空間阻遏，利于PCR的進行。2.玻璃基片的表面化學(xué)修飾和寡核苷酸探針的固定(1)玻璃基片的表面化學(xué)修飾1)將載玻片用1MNaOH浸泡1小時，水洗后再用1MHCI浸泡1小時。純水充分清洗后用乙醇清洗1次，甩干。
2)室溫下將上述玻片用3％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(95％的乙醇溶液配制)、或是3％的三甲氧基丙基-乙烯亞胺(95％的乙醇配制)處理1小時，劇烈振蕩。
3)室溫下將玻片用95％的乙醇溶液清洗3次，每次5分鐘。
4)使用平板離心機，800rpm離心8分鐘，甩干玻片。
5)將玻片置于80℃，烘烤1小時。至此得到的3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化的玻璃基片可以直接用于結(jié)合寡核苷酸探針，3％的三甲氧基丙基-乙烯亞胺處理的基片繼續(xù)進行以下處理6)室溫下用20mM的丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯溶液(9∶1V/V的DMSODMF配制)處理5個小時。
7)用乙醇清洗玻片兩次，每次5分鐘。
8)使用平板離心機，800rpm離心8分鐘，甩干玻片。
(2)寡核苷酸探針的固定寡核苷酸探針采用pH9.0的碳酸鹽緩沖液作為點樣液，探針濃度為50μM。利用卡塔森5500(Cartesian Pixsys5500)點樣儀把寡核苷酸探針點到活化的玻璃基片上，陣列的排列如附圖3所示，點直徑為100μm，點間距為300μm，陣列大小為2.2mm×2.5mm。點樣后而得到的寡核苷酸芯片置于含飽和NaCI溶液的濕盒中，室溫過夜。然后將玻片浸于150mM的乙醇胺(用100mM的Tris-CI配置，pH值為9.0)溶液，55℃反應(yīng)20分鐘以封閉未反應(yīng)的丁二酸-N-丁二酰亞胺酯。3.寡核苷酸芯片上的固相PCR(1)乙肝病毒DNA的提取1)取100μl乙肝病人血清，加入3倍體積的裂解液(4M硫氰酸胍、巰基乙醇、0.1MTris-CI，pH7.5)混勻。2)加入等體積的仿、異戊醇溶液(24∶1)，充分混勻。室溫下12000rpm離心15分鐘。3)小心將上清液移入另一1.5ml離心管中，加入2倍體積的無水乙醇。-20℃放置2個小時。4)4℃，12000rpm離心15分鐘。5)離心后所得沉淀用70％的乙醇清洗2次，每次在4℃，12000rpm離心10分鐘。6)沉淀自然干燥后溶于5.55μl純水中。(2)固相PCR擴增采用MJ Research PTC-200固相PCR擴增儀。1)PCR反應(yīng)體系為10μl，其中包括10×PCR緩沖液1.0μl2mM dATP dGTP dTTP 混合物1.0μl2mM dCTP 0.65μl1mM dCTP 0.7μl3對液相液相引物混合物(5μM) 1.0μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.1μl乙肝DNA 5.55μl10μl其中10×PCR緩沖液的成分為500mM Tris-CI(pH8.3)、20mM MgCI2、0.75％牛血清蛋白。2)PCR擴增采程序為94℃ 6分鐘 1個循環(huán)94℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒， 50個循環(huán)4.寡核苷酸芯片的清洗、掃描和結(jié)果分析固相PCR擴增后的寡核苷酸陣列用1×SSC，內(nèi)含0.1％的SDS溶液清洗兩次，每次5分鐘。清洗后的寡核苷酸陣列經(jīng)激光共聚焦掃描儀ScanArray4000掃描并收集信號，分析檢測結(jié)果。圖4為根據(jù)本發(fā)明所提供的具體方法，使用經(jīng)3-氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的玻片固定探針，檢測一未知的乙肝病毒DNA1896和1901位點突變的結(jié)果圖。該寡核苷酸芯片包含了乙肝病毒1896和1901兩個位點的12條探針，所用的液相引物為上游引物2和下游引物2。圖中的1和2列是1896位點的6條探針，3和4列是1901位點的6條探針。A1、B1、C1分別是1896位點正義鏈上的陽性對照，野生位點檢測探針和突變位點檢測探針；A2、B2、C2分別是1896位點反義鏈上的陽性對照，野生位點檢測探針和突變位點檢測探針。1901位點的探針排列如1896位點，3、4列分別為正義鏈和反義鏈上的三條探針。根據(jù)掃描結(jié)果和陽性對照探針的熒光強度，1896位點的B1和B2的熒光信號強度均遠高于C1和C2，因此該位點為野生純合。1901位點中C3的熒光強度高于C2，證明1901位點在正義鏈上存在突變1901G-A。B4的熒光強度要強于C4，1901位點在反義鏈上不存在突變，所以該位點為野生雜合。
權(quán)利要求
1.一種寡核苷酸芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對照的點涂層，其特征在于所述的點涂層是在玻璃基片上均勻分布的、含有包括乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個突變位點和其相對應(yīng)的野生位點的72條寡核苷酸探針。
2.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的玻璃基片為硅烷化玻璃載片，或者是經(jīng)過三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾和丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片。
3.如權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針通過5′末端的氨基己烷連接在修飾后的玻片上。
4.如權(quán)利要求1所述的的寡核苷酸檢測芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針所在陣列與對照的點涂層的大小，可以根據(jù)點的大小，點間距的變化而變化；陣列的排列和分布數(shù)量可以根據(jù)待分析樣品的數(shù)目而變化。
5.如權(quán)利要求4所述的寡核苷酸檢測芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針點直徑為100μm，點間距為300μm時，寡核苷酸探針所在陣列與對照點涂層大小為2.2mm×2.5mm。
6.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸檢片，其特征在于，所述的72條寡核苷酸探針包含的12個突變位點是，乙肝表面抗原區(qū)已知的5個突變位點546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原區(qū)7個已知的突變位點18966-A、1762A-T與1764G-A聯(lián)合突變、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
7.如權(quán)利要求1或6所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針，每一個待檢測位點包括6條探針，突變位點和野生位點的正、反義鏈探針共計4條，陽性對照探針2條，分別位于正、反義鏈，它缺少3′末端的待檢測堿基。
8.如權(quán)利要求1或6所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針的長度為14-19mer，Tm值相差不超過10℃，GC百分含量為50％-70％。
9.一種權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點檢測中的應(yīng)用，包括(1)乙肝突變位點檢測寡核苷酸探針的設(shè)計及合成；(2)玻璃基片的修飾和寡核苷酸探針的固定；(3)乙肝樣品DNA的提??；(4)固相PCR擴增；(5)寡核苷酸芯片的洗滌和信號檢測分析。
10.如權(quán)利要求9所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點檢測中的應(yīng)用，其特征在于，所述的固相PCR是在寡核苷酸芯片上進行的；固相引物同時為寡核苷酸芯片上的探針，液相引物為上游引物1、2、3與下游引物1、2、3的混合物；PCR擴增之中采用Cy3-dCTP熒光摻入標記。
11.如權(quán)利要求10所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點檢測中的應(yīng)用，其特征在于，所述的固相PCR擴增中的3對液相引物，分別是用于擴增包括S區(qū)已知突變位點在內(nèi)的區(qū)域的上游引物3與下游引物3，用于擴增前C區(qū)1762、1764位點聯(lián)合突變的上游引物1與下游引物1，用于擴增前C區(qū)其它突變位點的上游引物2與下游引物2，3對液相引物具體如下
全文摘要
寡核苷酸芯片及其在乙型肝炎病毒突變位點檢測中的應(yīng)用，屬于基因芯片技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的寡核苷酸檢測芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對照的點涂層，所述的寡核苷酸探針共72條，包含有乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個突變位點和其相對應(yīng)的野生位點。以玻璃基片上的寡核苷酸探針作為固相引物，乙肝病毒DNA作為模板，三對液相引物混合后，通過熒光標記的Cy3－dCTP進行固相PCR擴增。根據(jù)寡核苷酸芯片上不同位點熒光信號的強弱來分析突變位點。本發(fā)明集寡核苷酸芯片和固相PCR于一體，具有快速、高效、準確、平行診斷的特點。
文檔編號C12Q1/68GK1431317SQ0213562
公開日2003年7月23日 申請日期2002年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者魯艷芹, 韓金祥 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心