專利名稱：人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種應(yīng)用單克隆抗體制備技術(shù)，以人工合成的多肽——人卵泡刺激素的一個(gè)組成單位，β亞基的氨基酸片段——為免疫原，制備得到靈敏性高、特異性強(qiáng)、實(shí)用性好的鼠源性抗人卵泡刺激素(FSH)β單克隆抗體。
背景技術(shù)：
目前國(guó)內(nèi)尚無商品化的FSHβ單抗，給科研及臨床應(yīng)用帶來了一些不便。
卵泡刺激素(FSH)是由腦垂體前葉分泌的一種糖蛋白激素，由α和β兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的多肽亞單位組成。FSH與人類的生殖生育功能密切相關(guān)，是雌性卵泡發(fā)生、雄性精子產(chǎn)生足夠活率和活力及支持細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。通過測(cè)定FSH的分泌水平可以對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的功能做出評(píng)價(jià)，因此FSH是重要的內(nèi)分泌及生殖生物標(biāo)記物之一。
FSHβ亞單位的氨基酸序列與其他糖蛋白激素不同，具有獨(dú)特的生物學(xué)和免疫學(xué)活性，其所呈現(xiàn)的活性形式是由β亞單位所決定的。
三、技術(shù)內(nèi)容1、技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是提供一種節(jié)省抗原用量、免疫效果好、針對(duì)已知表位特異性強(qiáng)的人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法。
2、技術(shù)方案 本發(fā)明的人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法為①制備免疫原以人工合成的FSHβ多肽片段為免疫原，其氨基酸序列51-60，將其滴在硝酸纖維素膜上；②免疫按常規(guī)外科操作將硝酸纖維膜埋入待免疫的小鼠脾內(nèi)，間隔兩周后加強(qiáng)免疫，腹腔注射抗原肽與福氏不完全佐劑混合液，第三次免疫起每次間隔3周至一個(gè)月；③篩選用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)篩選免疫鼠血清；④細(xì)胞融合、篩選及克隆化選抗血清效價(jià)最高的鼠取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞體外融合，經(jīng)三次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗FSHβ的單克隆抗體細(xì)胞株；⑤單克隆抗體的提取與純化將以上的細(xì)胞株體外擴(kuò)大培養(yǎng)后，定期收集上清液；⑥腹水制備將擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞株打入老齡鼠腹腔以生產(chǎn)大量腹水，經(jīng)提取、純化后即可得到FSHβ亞基單克隆抗體。在免疫原的制備中，在每一個(gè)2mm×2mm的硝酸纖維素膜上滴入10-20μg的免疫原，抗原肽與福氏不完全佐劑混合液的混合比例為1∶1，該混合液對(duì)鼠腹腔的注入量為0.5-1.5毫升，在單克隆抗體的提取與純化中，每3天收集1次上清液，以鹽析法純化，在腹水制備中，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞株打入鼠腔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)為105-107個(gè)左右，7-10天后收集腹水。
3、技術(shù)效果 本發(fā)明一改以往直接用FSHβ全長(zhǎng)做免疫原、直接對(duì)小鼠腹腔或脾臟進(jìn)行注射的免疫方式，以人工合成的FSHβ亞基(51-60)片段(簡(jiǎn)稱FSHβ)作免疫原，采用不與大分子載體蛋白偶聯(lián)、脾內(nèi)直接包埋小分子抗原的免疫方法，制備抗人FSHβ單克隆抗體，最大限度的節(jié)省了抗原用量，免疫效果好，針對(duì)已知表位特異性強(qiáng)。并通過對(duì)所得抗體特性的初步分析及鑒定，為特異、靈敏的尿液FSH酶免疫測(cè)定方法的進(jìn)一步建立與應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
四

圖1是免疫球蛋白類別及亞類測(cè)定結(jié)果。
其中“+”表示試條測(cè)定結(jié)果的有效性；“A”表示IgA型；“M”表示IgM型；“G1”表示IgG1型；“2a”表示Ig2a型；“2b”表示Ig2b型；“G3”表示IgG3型；“λ”表示輕鏈為λ型；“κ”表示輕鏈為κ型。
圖2是蛋白免疫印記(Western Blot)分析結(jié)果。
其中“KDr”表示分子量；“M”表示標(biāo)記過的已知分子量；“1”、“2”均表示人血清中IgG相關(guān)蛋白。
五具體實(shí)施例方式
1材料 BALB/C純系小鼠，雌性，8周齡。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株、RPMI1640培養(yǎng)基、新生小牛血清、次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)、次黃嘌呤-胸腺嘧啶(HT)、聚乙二醇(PEG4000)，(以上均由南京醫(yī)科大學(xué)分子生物研究所提供)。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物制品公司)。
氨基酸序列為“YTRDLVYKNP”的FSHβ合成肽(由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所合成)，經(jīng)毛細(xì)電泳純化，產(chǎn)品符合衛(wèi)生部生物制品標(biāo)準(zhǔn)。小鼠單抗亞型測(cè)定試劑盒(購(gòu)自美國(guó)羅氏公司)。預(yù)染的高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)(Marker)(購(gòu)自Biolab公司)。黃體生成素(LH)、促甲狀腺素(TSH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)放免檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自中國(guó)原子能科學(xué)研究院同位素研究所)。
2方法2.1免疫原制備 10μg(5μl，2μg/μl)抗原滴在2mm×2mm的硝酸纖維素膜(NC)上，晾干。
2.2免疫 脾內(nèi)植入免疫，小鼠氯胺酮麻醉，四肢固定后脾區(qū)拔毛，酒精消毒，左腋中線肋邊緣下作5mm切口，入腹?fàn)砍銎⑴K下緣，切開脾包膜，填入已吸附抗原之NC膜，壓迫止血，切口全層一針縫合。
免疫方案 首次免疫采用脾內(nèi)植入；間隔2周后加強(qiáng)免疫，腹腔注射抗原肽與福氏不完全佐劑混合液(1∶1)1ml；第3次免疫起每次間隔3周至一個(gè)月。
2.3ELISA篩選 用含0.2％戊二醛的磷酸緩沖液(PH5.8)處理酶標(biāo)板4h，加20μg/ml抗原溶液37℃包被3h，100mmol/L賴氨酸磷酸緩沖液(PH8.0)37℃封閉1h，PBST沖洗3遍，4℃保持。用時(shí)每包被孔加稀釋血清或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清100μl，37℃孵育30min，沖洗一遍，加1∶5000的酶標(biāo)二抗，37℃孵育15min，最后加底物-聯(lián)苯胺(TMB)、底物-雙氧水(H2O2)室溫顯色10-15min，以SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。
2.4細(xì)胞融合、篩選及克隆化融合前3天，對(duì)血清效價(jià)最高的小鼠眶下靜脈注射無佐劑抗原100μg，按常規(guī)方法，取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞(5∶1)融合，HAT選擇培養(yǎng)，用上述ELISA法篩選，陽性孔經(jīng)3次有限稀釋克隆化。
2.5單克隆抗體的提取與純化 經(jīng)過克隆的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，每隔3天收集1次上清液，1000r/min離心10min，上清液經(jīng)硫酸氨分級(jí)沉淀法純化后-20℃凍存。
2.6腹水制備 在每只BALB/C小鼠腹腔內(nèi)注入0.5ml液體石蠟，10天后同法每只注入已培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞106個(gè)，10天后小鼠腹部明顯隆起，手觸有波動(dòng)感，用16號(hào)針頭采集腹水。1500r/min離心30min，收集上清，-20℃凍存。
2.7McAb初步鑒定2.7.1效價(jià)測(cè)定 用間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清及誘生腹水抗體免疫學(xué)效價(jià)。包被抗原為合成的FSHβ短肽(51-60)，酶標(biāo)記物為羊抗鼠HRP酶標(biāo)二抗，酶底物為TMB-H2O2。
2.7.2McAb類型鑒定 按羅氏(Roche)公司小鼠免疫球蛋白亞類測(cè)定試劑盒說明操作。
2.7.3單克隆抗體特異性測(cè)定2.7.3.1蛋白免疫印記(Western Blot)分析首先進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，一、二抗結(jié)合后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。
2.7.3.2交叉反應(yīng)試驗(yàn) 選擇了3種可能與FSH有交叉反應(yīng)的抗原TSH、LH、hCG。將不同稀釋度的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗與人血清4℃孵育過夜，并用PBS與人血清孵育做對(duì)照，用放免方法測(cè)孵育后兩組樣品中以上3種抗原含量的差異。FSHβ(51-61)20μg/ml包板，作為陽性對(duì)照。無關(guān)抗原20μg/ml包板作為陰性對(duì)照。結(jié)果1雜交瘤細(xì)胞系的建立與克隆 免疫小鼠血清ELISA效價(jià)均達(dá)1∶104以上，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后HAT 培養(yǎng)基培養(yǎng)，一周左右部分孔見細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)，兩周后細(xì)胞生長(zhǎng)超過孔底面積1/3，融合成功率為72％，特異性抗體陽性率為27.6％，經(jīng)3次克隆化后保留一株最佳雜交瘤細(xì)胞株F1C。
2 FSHβ單抗的鑒定2.1效價(jià) 用間接ELISA法檢測(cè)F1C腹水型單抗及細(xì)胞培養(yǎng)上清中單抗效價(jià)分別為1∶1.6×104、1∶16。單克隆抗體F1C梯度稀釋后ELISA測(cè)定OD值如下F1C雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清1∶4 1∶8 1∶16 1∶32Control0.3890.3760.283 0.1290.088腹水 1∶400 1∶800 1∶16000 1∶320000.2800.2040.184 0.144注陽性標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)孔OD值/對(duì)照組OD值＞2.12.2免疫球蛋白(Ig)類別及亞型測(cè)定 經(jīng)鑒定，所得細(xì)胞株FIC分泌的免疫球蛋白為IgM，輕鏈類型為κ(見圖1)。
2.3特異性2.3.1 Western Blot鑒定 F1C可與人血清中的FSH在分子量30KD附近發(fā)生特異性結(jié)合(見圖2)。
2.3.2交叉反應(yīng)分析 人血清加入單抗組和加入PBS組相比，前述3種抗原不同濃度各組間含量差異見表2，F(xiàn)SH(51-61)20μg/ml包板ELISA實(shí)驗(yàn)陽性，無關(guān)抗原20μg/ml包板ELISA實(shí)驗(yàn)陰性。FSHβ亞基單抗F1C與3種激素的交叉反應(yīng)方差分析如下PBS孵育組激 不同稀釋度單抗孵育組激素含量(mIU/ml)激 素n F P素 含量1∶2 1∶51∶10(mIU/ml)HCG 6 (74.148-105 (105.821-10 (78.294-99 (60.746-10 0.03 0.997.559) 79.143) 2.873) 28.907) 5 19.340 8.492 9.231 8.519LH 8 (2.445-20.0 (1.992-16.6 (2.322-20. (2.282-18. 0.03 0.9908) 04) 068)127) 1 2TSH 5 2.351±0.3592.926±0.541 2.247±2.645± 1.33 0.290.442 0.8894 8注HCG、LH表示為幾何均數(shù)(最大值、最小值)，TSH表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差2.4穩(wěn)定性 F1C雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)月，其分泌抗體的能力沒有明顯的變化；經(jīng)凍存復(fù)蘇后，雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，并能穩(wěn)定地分泌單克隆抗體。
權(quán)利要求
1.一種人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法，其特征在于其方法為1.1制備免疫原以人工合成的FSHβ多肽片段為免疫原，其氨基酸序列51-60，將其滴在硝酸纖維素膜上；1.2免疫按常規(guī)外科操作將硝酸纖維膜埋入待免疫的小鼠脾內(nèi)，間隔兩周后加強(qiáng)免疫，腹腔注射抗原肽與福氏不完全佐劑混合液，第三次免疫起每次免疫間隔3周至1個(gè)月；1.3篩選用酶聯(lián)免疫吸附法篩選免疫鼠血清；1.4細(xì)胞融合、篩選及克隆化選抗血清效價(jià)最高的鼠取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞體外融合，經(jīng)三次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗FSHβ的單克隆抗體細(xì)胞株；1.5單克隆抗體的提取與純化將以上的細(xì)胞株體外擴(kuò)大培養(yǎng)后，定期收集上清液以鹽析法純化；1.6腹水制備將擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞株打入老齡鼠腹腔以生產(chǎn)大量腹水，經(jīng)提取、純化后即可得到FSHβ亞基單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法，其特征在于在免疫原的制備中，在每一個(gè)2mm×2mm的硝酸纖維素膜上滴入10-20μg的免疫原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法，其特征在于抗原肽與福氏不完全佐劑混合液的混合比例為1∶1，該混合液對(duì)鼠腹腔的注入量為0.5-1.5毫升。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法，其特征在于在單克隆抗體的提取與純化中，每3天收集1次上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法，其特征在于在腹水制備中，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞株打入鼠腔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)為105-107個(gè)左右。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法，其方法為①制備免疫原以人工合成的FSHβ多肽片段為免疫原，將其滴在硝酸纖維素膜上；②免疫將硝酸纖維膜埋入待免疫的小鼠脾內(nèi)，間隔兩周后加強(qiáng)免疫，第三次免疫起每次免疫間隔3周至1個(gè)月；③篩選用酶聯(lián)免疫吸附法篩選免疫鼠血清；④細(xì)胞融合、篩選及克隆化；⑤單克隆抗體的提取與純化；⑥腹水制備；人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備方法是一種應(yīng)用單克隆抗體制備技術(shù)，以人工合成的多肽——人卵泡刺激素的一個(gè)組成單位，β亞基的氨基酸片段——為免疫原制備得到靈敏性高、特異性強(qiáng)、實(shí)用性好的鼠源性抗人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1418965SQ0213867
公開日2003年5月21日 申請(qǐng)日期2002年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月28日
發(fā)明者卞倩, 管曉虹, 宋玲, 仇鎮(zhèn)寧, 王心如 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)