專利名稱：一種用酶水解法從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)和甲殼素及用甲殼素制備殼聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)和甲殼素的方法，特別是一種用酶水解法從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)和甲殼素及用甲殼素制備殼聚糖的方法，屬于生物技術(shù)酶解蠅蛆蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蠅蛆是一種繁殖速度快、營養(yǎng)價值高的昆蟲，含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和甲殼素資源。目前已能形成大規(guī)模養(yǎng)殖蠅蛆的水平。但目前蠅蛆主要作為替代型飼料，產(chǎn)品的技術(shù)含量低，經(jīng)濟效益差，嚴重阻礙了蠅蛆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來，隨著人們對蠅蛆營養(yǎng)價值和功能活性的深入認識，對蠅蛆的利用已由替代型飼料轉(zhuǎn)向食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品等高附加值用途的深層次開發(fā)。
目前蠅蛆蛋白粉的生產(chǎn)主要采用機械法或化學法，如將蠅蛆濕法粉碎，直接干燥；或?qū)⑾壡稍锖笤俜鬯椤＿@種蠅蛆蛋白粉產(chǎn)品的水溶性差、色澤差，還具有較重的腥味，僅用于動物飼料配方或作為動物飼料添加劑，應(yīng)用領(lǐng)域受到較大的限制。有關(guān)蠅蛆甲殼素的提取主要利用機械破碎，清洗，獲得蠅蛆皮后，再用稀酸稀堿處理，脫除蛋白、脫色、脫鈣等工藝流程。但由于機械法制得的蛆皮中蛋白質(zhì)含量較高，后續(xù)加工復(fù)雜，加工時間長，蛋白質(zhì)資源浪費較大，生產(chǎn)過程污染嚴重。更重要的是在加工過程中尚無有效地去除黑色口腔和黃色內(nèi)臟的方法，這些都影響了甲殼素和殼聚糖產(chǎn)品的聚合度、色澤和雜質(zhì)度，使產(chǎn)品質(zhì)量下降。
從相關(guān)文獻看出，雖已有將蠅蛆用于動物蛋白粉配方和作為動物蛋白飼料添加劑的公開文獻報道，并已有從蠅蛆中用化學法提取蠅蛆甲殼素的公開文獻報道，如中國專利971164908、981034462、991193911、001002651等，但國內(nèi)外未見用酶水解法從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)和回收甲殼素的報道。

發(fā)明內(nèi)容
(1)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用酶水解法從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)和回收甲殼素；將蠅蛆水解蛋白脫腥增香；利用酶法水解和結(jié)合物理法篩洗，將蠅蛆甲殼素中的黃色物和黑點(蠅蛆口腔)除去；從蠅蛆甲殼素制備殼聚糖，使殼聚糖脫乙酰度≥85％，達到食品衛(wèi)生標準。
(2)技術(shù)方案一種從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)的方法。它是應(yīng)用酶水解方法來提取蠅蛆蛋白質(zhì)，再利用美拉德(Maillard)反應(yīng)進行脫腥增香。其工藝流程框圖如附圖所示。本發(fā)明利用生物技術(shù)酶水解法從蠅蛆中提取水解蛋白，應(yīng)用酶水解將大分子蛋白質(zhì)變成水溶性多肽和氨基酸，同時通過選擇特定的酶種和條件優(yōu)化防止酶解產(chǎn)生的苦味。將經(jīng)酶解得到的蠅蛆蛋白質(zhì)利用美拉德反應(yīng)進行風味修飾，消除腥味，這樣可大大提高蛋白質(zhì)的溶解性和風味。以新鮮蠅蛆為原料，加水進行膠磨破碎，加熱保溫預(yù)處理，加酶進行酶水解反應(yīng)，滅酶，過濾，濾液進行美拉德反應(yīng)脫腥增香，濃縮或不濃縮，噴霧干燥，制得產(chǎn)品蠅蛆水解蛋白粉。
酶水解法工藝膠磨破碎用1份蠅蛆加1～3份水(w/w，重量比，下同)進行膠磨破碎，得2～4份蠅蛆漿料，根據(jù)加工要求可加水調(diào)配蠅蛆漿料濃度。
加熱保溫預(yù)處理將蠅蛆漿料于60～90℃加熱處理10～60分鐘，冷卻至60℃以下。
酶水解反應(yīng)以蛋白質(zhì)水解度的大小和苦味多少為指標，從多種蛋白酶中選擇比較合適蠅蛆蛋白水解的酶種。酶種采用堿性蛋白酶、AS.1398蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味酶、中性蛋白酶的單種酶或兩種酶的復(fù)合酶。工藝條件經(jīng)正交試驗分析，影響水解度的各因素主次關(guān)系為溫度＞時間＞酶底比＞pH。酶解條件為溫度30～55℃，時間1～4小時，酶底比(u/g)50～700，pH6.5～8.5。反應(yīng)結(jié)束滅酶。
過濾濾液為蠅蛆蛋白液，濾渣為蠅蛆皮。濾液進行美拉德反應(yīng)脫腥增香。
酶解蛋白液脫腥增香采用美拉德反應(yīng)進行后修飾，達到增香和除腥的目的。反應(yīng)利用酶水解產(chǎn)生的氨基酸和加入少量糖，根據(jù)下列配比進行。
原料及其配比

反應(yīng)條件溫度100～125℃，時間30～100分鐘。
制備蛋白粉反應(yīng)液濃縮，噴霧干燥，制得產(chǎn)品蠅蛆水解蛋白粉。產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量≥60％。
也可以酶解液滅酶后不經(jīng)過過濾，在相同工藝條件下直接將酶解液進行美拉德反應(yīng)脫腥增香，濃縮或不濃縮，噴霧干燥，制得蠅蛆水解蛋白粉，蛋白質(zhì)含量≥54％。
一種從蠅蛆中提取甲殼素(Chitin)的方法。它是如上所述，蠅蛆經(jīng)酶水解后，以過濾分離蠅蛆蛋白液后的濾渣經(jīng)酶水解的蠅蛆皮為原料，經(jīng)脫蛋白和脫鈣，制備蠅蛆甲殼素成品。其工藝流程框圖如附圖所示。通過酶水解提取蠅蛆蛋白質(zhì)后，蠅蛆皮中主要成分為甲殼素，還有少量蛋白質(zhì)、脂肪和灰分(碳酸鈣鹽)等，與蝦蟹殼相比，蠅蛆皮中甲殼素含量高，蛋白質(zhì)和鈣鹽的含量低，這就決定蠅蛆甲殼素提取工藝與蝦蟹殼甲殼素提取工藝有較大的不同。因此，采用合理的脫蛋白和脫鈣工藝條件對提高甲殼素的質(zhì)量是極其重要的。應(yīng)用生物技術(shù)酶水解法除水解去除蠅蛆皮中的蛋白質(zhì)外，還可同時水解蠅蛆皮中黑色的口器和黃色的內(nèi)臟，再經(jīng)過物理法可有效去除產(chǎn)品甲殼素中的雜質(zhì)。提取甲殼素的工藝為蠅蛆皮篩洗，堿煮脫蛋白，清洗至中性，酸浸脫鈣，清洗至中性，干燥，制得蠅蛆甲殼素成品。
脫蛋白用NaOH溶液進行脫蛋白，堿液濃度2～6％(w/w)，溫度60～100℃，液固比(ml/g)3～10，反應(yīng)時間1～5小時。
脫鈣蠅蛆皮經(jīng)脫蛋白，篩洗去雜質(zhì)后，留下的殘渣清洗至中性，離心去水后，用稀鹽酸溶液進行脫鈣，鹽酸濃度0.5～1.5mol/L，液固比2.0～9.0ml/g，反應(yīng)時間20～60分鐘，溫度為室溫，再用純水清洗至中性，在低溫下干燥得到蠅蛆甲殼素。
一種從蠅蛆甲殼素制備殼聚糖(Chitosan)的方法。它是以如上所述酶水解方法提取的蠅蛆甲殼素為原料，在濃堿液中進行脫乙酰反應(yīng)而制備的殼聚糖產(chǎn)品。
殼聚糖是一種陽離子型直鏈氨基多糖，是甲殼素脫去分子中的乙?；纬傻漠a(chǎn)物。殼聚糖的制備過程，實際也就是甲殼素這種酰胺類多糖的堿水解過程，即脫乙酰反應(yīng)。脫乙酰反應(yīng)的反應(yīng)式如下R代表2-脫氧-D-葡萄糖基。
目前殼聚糖的制備原料主要為蝦蟹甲殼素，通常是采用強堿在高溫下處理甲殼素使其脫除大部分乙?；频玫?。與蝦蟹甲殼素相比，蠅蛆甲殼素灰分少，重金屬含量低，品質(zhì)穩(wěn)定。脫乙酰度是殼聚糖的主要性能指標之一。食品級殼聚糖要求較高的脫乙酰度，即脫乙酰度≥85％。
本發(fā)明制備殼聚糖，是采用如上所述方法提取的蠅蛆甲殼素為原料，經(jīng)堿水解，即脫乙酰反應(yīng)而制備的殼聚糖產(chǎn)品。原料采用不粉碎的蠅蛆甲殼素，堿液采用NaOH溶液，堿濃度30～55％(w/w)，反應(yīng)溫度30～140℃，反應(yīng)時間2～30小時，液固比為5～20ml/g。在優(yōu)化工藝條件下，產(chǎn)品的脫乙酰度能達到88％以上。
(3)有益效果本發(fā)明通過詳細研究蠅蛆蛋白質(zhì)的酶水解工藝條件及甲殼素和殼聚糖的制備工藝條件，為蠅蛆資源的深度加工和綜合利用提供了一條新途徑。
通過蛋白質(zhì)的提取率和溶出率的比較發(fā)現(xiàn)，酶法處理后蛋白質(zhì)的提取率和溶出率達到92％和80％以上，而機械法分離僅為64％和24％。酶法顯著改善了蛋白質(zhì)的溶解性，提高了蛋白質(zhì)的溶出率，增加了蛋白質(zhì)的提取率。
采用美拉德反應(yīng)，蛋白液達到增香和去腥的目的，在優(yōu)化工藝條件下產(chǎn)品香味濃郁，腥味消失。
酶水解后的蠅蛆皮中蛋白質(zhì)的含量低于機械破碎得到的蠅蛆皮。大大節(jié)約了脫蛋白工序中堿的用量和反應(yīng)時間。酶水解后的蠅蛆皮中黑色口器和黃色內(nèi)臟也被酶解，再經(jīng)過篩洗，其中極大部分可容易被除去，少量殘留在蠅蛆皮中的雜質(zhì)經(jīng)堿處理后加以篩洗也被進一步除去，鏡檢黑點除去率達98％以上。
蠅蛆殼聚糖由蠅蛆甲殼素制備。在優(yōu)化工藝條件下，殼聚糖的脫乙酰度和得率均很高。經(jīng)紅外光譜和x-射線衍射分析，確證所得產(chǎn)品為殼聚糖。
蠅蛆蛋白質(zhì)具有很高的營養(yǎng)價值。據(jù)國內(nèi)外對蠅蛆營養(yǎng)成分的分析，蠅蛆(干基)含粗蛋白54～65％，脂肪10～14％，甲殼素8～10％和豐富的維生素、微量元素等，營養(yǎng)成分較全面。蠅蛆蛋白質(zhì)中氨基酸比較齊全，所提供的氨基酸均能滿足兒童和成人建議的氨基酸需要量。大量動物實驗表明由蠅蛆制得的蠅蛆蛋白粉具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用、抗疲勞作用、抗輻射作用、護肝作用及延緩衰老作用。應(yīng)用酶水解制得的蠅蛆水解蛋白粉將大分子蛋白質(zhì)變成水溶性多肽和氨基酸，食用后更易被人體所吸收。
酶水解法制備的蠅蛆蛋白質(zhì)除具有很高營養(yǎng)價值外，還由于具有良好的溶解性、保水性、乳化性及抗氧化性等，可被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。
在食品工業(yè)中，水解蛋白是一種能很好地增強食品自然風味的調(diào)味基料，它可應(yīng)用于各種風味型調(diào)味料和食品的營養(yǎng)強化劑，同時還可以提高食品的營養(yǎng)價值及貯藏安全性，作為一種天然的無限量食品添加劑可廣泛用于各種食品之中，如肉制品加工、蛋白飲料、焙烤制品等。在化妝品工業(yè)中，水解蛋白具有良好的乳化性、潤滑性和表面活性作用，是護膚品、護發(fā)品的優(yōu)質(zhì)基料之一。在醫(yī)藥工業(yè)中，口服水解蛋白可應(yīng)用于需食用高蛋白的特殊人群，而對于缺乏蛋白質(zhì)的病人，因腸胃功能衰退、嚴重燒傷、失血過多而不能口服者，注射水解蛋白是極為有效的方法。
殼聚糖是甲殼素最重要的衍生物之一，因其分子中含有游離的-NH2活性基團，當溶于酸性溶液時，可質(zhì)子化而帶上正電荷，是天然多糖中唯一堿性多糖，因而具有許多特殊的物理化學性質(zhì)和生理、藥理功能，已被許多學者譽為人體所必需的第六生命要素。
大量研究證實，甲殼素和殼聚糖具有多種功能，如降低膽固醇、保護肝臟、提高機體免疫力、降低體內(nèi)尿酸、抑制胃酸分泌、調(diào)節(jié)平衡人體微量元素水平、降低食物的熱量、抑菌防腐等。以甲殼素和殼聚糖為主要成分的保健食品正在被廣泛開發(fā)，其保健功能有調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血脂、降低血糖等。
綜上所述，本發(fā)明具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。


附圖酶法提取蠅蛆蛋白質(zhì)和甲殼素及用甲殼素制備殼聚糖的工藝流程示意圖。
具體實施例方式實施例1
酶水解法從蠅蛆中提取水解蛋白和甲殼素。新鮮蠅蛆經(jīng)膠磨破碎，漿料加熱處理后，采用AS.1398蛋白酶，在酶底比500u/g、45℃和pH7.0下，水解3小時。此時水解度為18％，蛋白質(zhì)溶出率為81％，水解液無苦味。
酶水解液滅酶，過濾，濾液經(jīng)美拉德反應(yīng)，120℃、反應(yīng)60分鐘時，產(chǎn)品的香味濃郁、腥味消失。噴霧干燥得到蠅蛆蛋白粉。
濾渣蠅蛆皮用于提取甲殼素，方法同下述實施例4。
實施例2酶水解法從蠅蛆中提取水解蛋白和甲殼素。采用AS.1398蛋白酶和風味酶，兩者以1∶1(w/w)組成的復(fù)合酶進行酶解，其余條件同實施例1。水解后的水解度和蛋白質(zhì)溶出率也能達到滿意的結(jié)果。
實施例3酶水解法從蠅蛆中提取水解蛋白。在蠅蛆經(jīng)過酶解后，酶解液直接經(jīng)美拉德反應(yīng)增香，噴霧干燥得到蠅蛆蛋白粉，蛋白質(zhì)含量≥60％。
實施例4酶水解法從蠅蛆中提取甲殼素。將酶水解后得到的蛆皮篩洗去雜后，脫蛋白用5％NaOH溶液，100℃煮沸3小時，液固比9ml/g，清洗至中性；脫鈣用1mol/L鹽酸溶液，液固比6ml/g，反應(yīng)50分鐘，清洗至中性。
脫蛋白后的甲殼素經(jīng)氨基酸分析證明，蛋白質(zhì)去除率為97％(以氨基酸總量計)。脫鈣后甲殼素的灰分含量為0.2％。
實施例5蠅蛆甲殼素脫乙?；苽錃ぞ厶?。將蠅蛆甲殼素在濃堿中進行脫乙?；磻?yīng)。采用溫度120℃，時間3小時，堿濃度45％，液固比10ml/g。此時產(chǎn)品的脫乙酰度為88％，得率為75％。
權(quán)利要求
1.一種從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是應(yīng)用酶水解方法來提取蠅蛆蛋白質(zhì)，再利用美拉德反應(yīng)進行脫腥增香，其工藝是以新鮮蠅蛆為原料，加水進行膠磨破碎，加熱保溫預(yù)處理，加酶進行酶水解反應(yīng)，滅酶，過濾，濾液進行美拉德反應(yīng)脫腥增香，噴霧干燥，制得產(chǎn)品蠅蛆水解蛋白粉；(1)酶水解法工藝膠磨破碎用1份蠅蛆加1～3份水(w/w，重量比，下同)進行膠磨破碎，得2～4份蠅蛆漿料，加水調(diào)配蠅蛆漿料濃度；加熱保溫預(yù)處理將蠅蛆漿料在60～90℃加熱處理10～60分鐘，冷卻至60℃以下；酶水解反應(yīng)酶種采用堿性蛋白酶、AS.1398蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味酶、中性蛋白酶的單種酶或兩種酶的復(fù)合酶，酶解條件為溫度30～55℃，時間1～4小時，酶底比50～700u/g，pH6.5～8.5，反應(yīng)結(jié)束滅酶；過濾，濾液為蠅蛆蛋白液，濾渣為蠅蛆皮；(2)酶解蛋白液脫腥增香濾液進行美拉德反應(yīng)脫腥增香，原料及其配比如下原料及其配比
反應(yīng)條件溫度100～125℃，時間30～100分鐘；(3)制備蛋白粉反應(yīng)液濃縮或不濃縮，噴霧干燥，制得產(chǎn)品蠅蛆水解蛋白粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)的方法，其特征是加酶進行酶水解反應(yīng)、滅酶后，將酶解液進行美拉德反應(yīng)脫腥增香、噴霧干燥，制得蠅蛆水解蛋白粉。
3.一種從蠅蛆中提取甲殼素的方法，其特征是蠅蛆經(jīng)酶水解后，以過濾分離蠅蛆蛋白液后的濾渣經(jīng)酶水解的蠅蛆皮為原料，其工藝為蠅蛆皮篩洗，堿煮脫蛋白，清洗至中性，酸浸脫鈣，清洗至中性，干燥，制得蠅蛆甲殼素成品；(1)脫蛋白用NaOH溶液進行脫蛋白，堿液濃度2～6％(w/w)，溫度60～100℃，液固比3～10ml/g，反應(yīng)時間1～5小時；(2)脫鈣蠅蛆皮經(jīng)脫蛋白，篩洗去雜質(zhì)后，留下的殘渣清洗至中性，離心去水后，用稀鹽酸溶液進行脫鈣，鹽酸濃度0.5～1.5mol/L，液固比2.0～9.0ml/g，反應(yīng)時間20～60分鐘，溫度為室溫，再用純水清洗至中性，干燥，得到蠅蛆甲殼素。
4.一種.從蠅蛆甲殼素制備殼聚糖的方法，其特征是以酶水解法提取的蠅蛆甲殼素為原料，在濃堿液中進行脫乙酰反應(yīng)制得殼聚糖產(chǎn)品，原料為蠅蛆甲殼素，堿液采用NaOH溶液，堿濃度30～55％(w/w)，反應(yīng)溫度30～140℃，反應(yīng)時間2～30小時，液固比為5～20ml/g。
全文摘要
一種用酶水解法從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)和甲殼素及用甲殼素制備殼聚糖的方法，屬于生物技術(shù)酶解蠅蛆蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。解決了用酶水解法從蠅蛆中提取蛋白質(zhì)和回收甲殼素，將蠅蛆水解蛋白脫腥增香，用甲殼素制備殼聚糖的工藝技術(shù)。主要技術(shù)特點是采用酶水解法來提取水解蛋白，用美拉德反應(yīng)來去除腥味和后修飾增香，經(jīng)酶解和篩選去除了蠅蛆皮中的黃色物和黑點，對酶解反應(yīng)、美拉德反應(yīng)、脫蛋白、脫鈣、脫乙?；o出了優(yōu)化的工藝條件。產(chǎn)品蛋白質(zhì)和殼聚糖質(zhì)量均達到食品級標準，可應(yīng)用于食品、保健品、藥品、化妝品等技術(shù)含量要求高的行業(yè)。
文檔編號C12P19/00GK1415757SQ0213864
公開日2003年5月7日 申請日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者夏文水, 陳潔, 項建琳, 賀繼東 申請人:江南大學