專利名稱：用新型基因標(biāo)記、與之相關(guān)的方法和組合物來評測皮膚的紫外輻射損傷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及人皮膚光損傷和光老化的治療和保護(hù)。更特別地，本發(fā)明涉及使用新型基因標(biāo)記來預(yù)防、治療、改善和修復(fù)由于受到紫外(UV)輻射而引起的皮膚損傷(光損傷)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過使用影響一組先前未鑒定的標(biāo)記基因的材料來預(yù)防、治療、改善和恢復(fù)光老化皮膚的方法，新近發(fā)現(xiàn)所述標(biāo)記基因的表達(dá)與皮膚受到UV輻射有關(guān)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過提供一組先前未鑒定的標(biāo)記基因來評測和評估皮膚的UV輻射損傷的方法，新近發(fā)現(xiàn)所述標(biāo)記基因的表達(dá)與皮膚受到UV輻射有關(guān)。另外，本發(fā)明涉及用于保護(hù)、改善、預(yù)防、抑制、阻滯、減少、治療或恢復(fù)皮膚光損傷和光老化的組合物(優(yōu)選地用于局部施用)，尤其是由急性和慢性地受到偶然和/或直接的UV輻射所引起的皮膚光損傷和光老化，例如日常和長時(shí)間發(fā)生的UV輻射。
背景技術(shù)：
日光(尤其是紫外線)損傷人的皮膚，除了帶來其他不希望的效應(yīng)外，還會引起光老化、免疫抑制和皮膚癌。
人的皮膚含有兩個(gè)部分淺層的外部部分(表皮)和深層的部分(真皮)。雖然最外部的表皮皮膚層一般提供了一定程度的對于身體的保護(hù)，但是表皮和真皮承受著上面所說的光損傷有害效應(yīng)的沖擊。天然的人的表皮主要由三種細(xì)胞類型組成，即角質(zhì)細(xì)胞(最多)、黑色素細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞。這些細(xì)胞類型的功能是提供人體中皮膚的基本保護(hù)作用。真皮對于表皮提供固體的和營養(yǎng)的支持，其主要含有成纖維細(xì)胞和主要由膠原蛋白、彈性蛋白和基質(zhì)所組成的細(xì)胞外基質(zhì)，這些組成細(xì)胞外基質(zhì)的物質(zhì)是由成纖維細(xì)胞合成的。另外，真皮含有白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、血管和神經(jīng)纖維。
已知太陽輻射包含紫外(UV)輻射(λ＜400nm)、可見輻射(400nm＜λ＜700nm)和紅外(IR)輻射(λ＞700nm)。UV輻射一般分為UVA(320-400nm)、UVB(290-320nm)和UVC(＜290nm)。UVC輻射一般被平流層的臭氧阻斷而不能到達(dá)地球表面。正是日光的紫外(UV)成分(特別是UVA和UVB)一般被認(rèn)為是光老化和光損傷的主要病因。對于人體來說，皮膚表皮是太陽輻射(尤其是UV輻射)到達(dá)的第一個(gè)目標(biāo)。
對于引起人皮膚光老化和/或光損傷所需的UV輻射輻照的程度目前還不是非常的明確，雖然對于在人皮膚中引起紅斑(變紅)(通常以曬斑來表示)所需的數(shù)量是已知的，并可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)從給出的UV源以“最小紅斑劑量”(“MED”)來定量。
皮膚受到太陽輻射(尤其是UV輻射)可能導(dǎo)致皮膚和皮膚內(nèi)某些化合物含量的變化，由此加速了天然的皮膚老化過程。由于UV輻射而引起的加速的或過早的皮膚老化過程一般稱為光老化(也稱為光化性老化或皮膚日射病(dermatoheliosis))。
光老化是由于外在因素對于皮膚的作用而產(chǎn)生的，包括太陽輻射，尤其是UV輻射。皮膚上光老化的表型效應(yīng)在臨床上一般表現(xiàn)為彈性喪失、粗糙、斑點(diǎn)狀色素沉著、蒼白、松弛、干燥、與彈性喪失相關(guān)的粗糙外觀、皮膚毛孔的變化和淺層與深層皺紋(特別是眼周圍)。前惡性和惡性腫瘤常常與反復(fù)的太陽輻照和光老化相關(guān)。光老化通常發(fā)生在平常暴露在日光下的皮膚中，如臉、耳、頭皮的光禿區(qū)域、頸、軀干、臂(例如前臂)、腿、足和手。
遮光劑一般用于預(yù)防暴露于日光下的皮膚區(qū)域的光損傷和光老化。遮光劑是含有吸收、反射和/或分散UV射線的成分的局部制劑。一些遮光劑基于不透明的顆粒材料，例如無機(jī)材料或者無機(jī)和有機(jī)材料的聯(lián)合物，包括氧化鋅、氧化鈦、粘土和氯化鐵，它們產(chǎn)生可見的保護(hù)層。其他遮光劑含有可在皮膚上產(chǎn)生透明的或半透明的產(chǎn)物的組分。含有遮光劑的化合物包括氧苯酮、磺異苯酮、二氧苯酮、鄰氨基苯甲酸薄荷酯、對氨基苯甲酸(PABA)、甲氧基肉桂酸辛酯、氰雙苯丙烯酸辛酯、drometrizole trisiloxane、水楊酸辛酯、水楊酸高薄荷酯、二甲基PABA辛酯、TEA水楊酸酯、二氧化鈦、氧化鋅、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、4-甲基亞芐基樟腦、辛基三嗪酮、terephthalydiene dicamphor sulfonic acid、PABA乙酯、羥基甲基苯基苯并三唑、亞甲基雙-苯并三嗪酮基四甲基丁基苯酚、雙-乙基己基氧基苯酚甲氧基苯酚三嗪和上述物質(zhì)的混和物，但是并不局限于此。其他合適的和有用的遮光劑活性物質(zhì)包括J.F.Grollier等人的U.S.專利5,000,937中所公開的那些。
UV輻射對于皮膚的外在影響的發(fā)展依賴于許多復(fù)雜的基因相互作用和反饋機(jī)制，這些通常會導(dǎo)致令人不愉快的或更嚴(yán)重的病理性表型變化，例如過早的皺紋形成和/或皮膚癌。由于技術(shù)的限制和現(xiàn)有方法的勞動密集性特性，先前難以確定和了解這種復(fù)雜的基因相互作用。
當(dāng)前的幾個(gè)用于評測UV引起的皮膚損傷的方法是依靠紅斑(即皮膚發(fā)紅)的產(chǎn)生和測量。從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體紅斑反應(yīng)具有相當(dāng)大的變化，因?yàn)槠湟蕾囉趥€(gè)體的基因組成，包括皮膚類型、人種背景等等。此外，終點(diǎn)是非常主觀的，并且重要的損傷如細(xì)胞損傷能夠在沒有可見紅斑的情況下發(fā)生。
其他用于測定UV引起的皮膚損傷或老化的方法沒有能夠如本發(fā)明這樣利用分子程序來鑒定和評估UV輻射引起的一組新近發(fā)現(xiàn)的基因的表達(dá)改變。另外，新近發(fā)現(xiàn)的基因在體內(nèi)的人皮膚中顯示出UV損傷效應(yīng)，這些基因先前沒有被其他方法如此進(jìn)行鑒定。例如，Bernstein等人的U.S.專利6,018,098公開了皮膚光老化的體內(nèi)和體外模型，在這些模型中使用彈性蛋白啟動子的報(bào)道基因來評估當(dāng)受到UV輻射時(shí)彈性蛋白啟動子報(bào)道基因的活化。Fisher等人的U.S.專利6,130,254公開了涉及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的酶活化方法，從而來評估受到UV輻射之后的損傷。Bernerd等人的U.S.專利6,079415公開了用于評測在受到A型紫外輻射之后的皮膚損傷的方法，其中在體外皮膚等效物中測量對于A型UV引起的皮膚損傷特異的標(biāo)記的變體。這種標(biāo)記變體包括I型(或間質(zhì))膠原酶、波形蛋白分析以及細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)、離子、細(xì)胞器、脂質(zhì)和多糖的非特異變體。Reece等人的U.S.專利5,691,158公開了一種組織模型即人工皮膚培養(yǎng)物，從而通過炎性介質(zhì)(例如白細(xì)胞介素-1-α)的誘導(dǎo)來測定遮光劑制劑的效能，或者通過細(xì)胞毒性檢驗(yàn)(例如MTT)來測定存活力。
隨著分子生物學(xué)工具(尤其是微陣列分析)的出現(xiàn)，已經(jīng)可以開始闡明復(fù)雜的基因變化和相互作用。本發(fā)明使用可以通過方便的分子工具和參數(shù)(優(yōu)選地通過核酸陣列技術(shù))來測量的新型基因標(biāo)記，從而來評測由于受到UV輻射而產(chǎn)生的皮膚光損傷和/或光老化。正如此處所描述的，本發(fā)明提供了新型和有利的方法和組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于評測由于太陽/UV輻射引起的皮膚損傷(即光損傷)的方法。當(dāng)在此處使用時(shí)，“UV輻射”包括“太陽輻射”。該方法包括在受到UV輻射之后評估一個(gè)或多個(gè)此處鑒定和描述的基因或者其組合的基因表達(dá)和/或活性的變化或改變。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)確定出一組獨(dú)特的和料想不到的基因以用于該方法之中，這是由于在皮膚受到UV輻射之后一個(gè)或多個(gè)這些基因的表達(dá)會發(fā)生改變。該方法的一個(gè)特殊的方面包括從受到UV輻射的皮膚源獲得核酸例如RNA，和分析檢驗(yàn)RNA以確定相對于未受到UV輻射的皮膚是否存在有UV輻射引起的一個(gè)基因標(biāo)記或者基因標(biāo)記組合的表達(dá)改變，其中所述基因標(biāo)記在受到UV輻射之后顯示出表達(dá)改變。在本發(fā)明的這一特殊方面，RNA的微陣列分析是優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了一種方法來評測能夠調(diào)節(jié)(例如減弱)或者修飾與皮膚受到UV輻射相關(guān)的基因表達(dá)的組合物。這種組合物包括局部施用的遮光劑、抗氧化劑、抗炎劑、美容劑(包括化妝品、營養(yǎng)補(bǔ)充物和其他內(nèi)吸收的口服試劑)、抗老化制劑(例如用于細(xì)紋和/或皺紋的霜劑)、局部用試劑、皮膚滲透劑等等，但不局限于此。同樣地根據(jù)本發(fā)明，對于以各種產(chǎn)品形式(例如經(jīng)皮膚的形式，如貼劑等等)配制在這種組合物中的成分、組分或化合物評測它們的光保護(hù)效用，這是通過評估它們調(diào)節(jié)或防止與皮膚受到UV輻射相關(guān)的基因表達(dá)的能力來進(jìn)行的。計(jì)劃將這種組合物、成分、組分、化合物和/或產(chǎn)品用于局部和口服施用。該評測方法使用一組新型基因標(biāo)記中的一個(gè)或多個(gè)基因，正如此處所描述的，發(fā)現(xiàn)這些基因標(biāo)記在皮膚受到UV輻射之后表達(dá)會改變。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了用于測試和評測物質(zhì)例如抗老化或抗光損傷制劑(如遮光劑制劑或產(chǎn)品，或者營養(yǎng)補(bǔ)充物)的組分或成分的新方法，從而鑒定那些具有下列性質(zhì)的物質(zhì)，即這些物質(zhì)能夠改善、治療、預(yù)防、抑制、阻滯、減少或修復(fù)UV輻射引起的皮膚損傷，和/或提供對于UV輻射損傷的光保護(hù)，和/或改善、治療和/或恢復(fù)光老化的皮膚。根據(jù)本發(fā)明，這種能夠改善、治療、預(yù)防、抑制、阻滯、減少、修復(fù)或恢復(fù)UV輻射引起的皮膚損傷的物質(zhì)適合于用作美容劑、遮光劑、抗老化產(chǎn)品或皮膚學(xué)營養(yǎng)補(bǔ)充物中的成分，從而例如對于使用者(優(yōu)選地對于使用者的皮膚)產(chǎn)生光保護(hù)和/或抗老化保護(hù)(即抗UV輻射引起的損傷的保護(hù))。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供了一種新方法來確定正在開發(fā)的產(chǎn)品例如遮光劑制劑或其試制型(prototype)是否具有對于UV輻射輻照的所希望的防護(hù)水平。因此，本發(fā)明提供了一種方法來篩選用于遮光劑或抗老化組合物的所希望的陽光保護(hù)因子或其水平，這是通過測定該因子或其水平相對于對照是否能夠調(diào)節(jié)包含新型標(biāo)記基因組的基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)來進(jìn)行的，其中新型標(biāo)記基因組的表達(dá)會由于受到UV輻射而改變。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了能夠在無保護(hù)的皮膚中調(diào)節(jié)基因表達(dá)和/或恢復(fù)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)水平的材料，其中該組標(biāo)記基因的表達(dá)在皮膚受到紫外輻射之后與對照(例如未受輻射的皮膚)相比較發(fā)生了改變。受到UV輻射會導(dǎo)致皮膚的光損傷和/或光老化。本發(fā)明涉及能夠改善、治療、預(yù)防、抑制、阻滯、減少、修復(fù)和/或恢復(fù)皮膚的光損傷，和/或能夠改善、治療、預(yù)防、抑制、阻滯、減少、修復(fù)或恢復(fù)皮膚的光老化的材料。在與之相關(guān)的方面，本發(fā)明也提供了含有一種或多種上面所描述的材料的組合物和制劑，特別是這些材料以能夠調(diào)節(jié)或恢復(fù)至少一個(gè)此處描述的標(biāo)記基因的表達(dá)的有效劑量存在。這種組合物和制劑以及其中的材料可用于針對皮膚的光損傷和光老化的治療劑或保護(hù)劑，此處的皮膚包括無保護(hù)的皮膚、皮膚組織、其他皮膚等效物或角蛋白形成細(xì)胞。
在其另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于評測化合物或組分對于皮膚的光損傷或光老化的紫外輻射保護(hù)、醫(yī)療和/或治療效用。該方法包括將正進(jìn)行評測的化合物或組分與選自皮膚或皮膚替代物(例如皮膚等效物、皮膚細(xì)胞或角蛋白形成細(xì)胞)的測試材料接觸，和將測試材料暴露于紫外輻射源。其后，用本領(lǐng)域常用的方法來評估與對照(例如未受到UV輻射的測試材料)相比較，在受到紫外輻射之后化合物或組分是否能夠調(diào)節(jié)測試材料的一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)水平。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了改善或治療光損傷或光老化皮膚的方法。特別地，本發(fā)明提供了修復(fù)光損傷皮膚或者恢復(fù)光老化皮膚的方法。該方法包括將含有調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因表達(dá)的材料的組合物施用于皮膚或其區(qū)域，其中這些標(biāo)記基因的表達(dá)在皮膚受到紫外輻射之后會發(fā)生改變。組合物優(yōu)選地以一定的數(shù)量和時(shí)間進(jìn)行局部施用，該數(shù)量和時(shí)間足以有效地在受到紫外輻射之后調(diào)節(jié)本發(fā)明的新型標(biāo)記基因組中至少一個(gè)基因的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，組合物和/或其中配制的活性材料當(dāng)施用于皮膚并在UV輻射之后調(diào)節(jié)至少一個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)水平的能力表明該組合物能夠改善、治療、修復(fù)或恢復(fù)受到UV輻射的光損傷或光老化皮膚。一般將組合物對于標(biāo)記基因組中至少一個(gè)基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)與至少一個(gè)對照進(jìn)行比較，例如未受到UV輻射的皮膚或皮膚替代物中基因的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了含有一種或多種光保護(hù)、光治療和/或抗光老化組分、材料或物質(zhì)的組合物(優(yōu)選的為美容組合物)，其中一種或多種組分、材料或物質(zhì)已被證明提供了光保護(hù)、光治療或抗光老化效用，這是通過改善、抑制、阻滯、減少、預(yù)防、修復(fù)、治療或恢復(fù)UV輻射引起的皮膚損傷或老化來達(dá)到的，這些用這種組分、材料或物質(zhì)調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)新近發(fā)現(xiàn)與受到UV輻射相關(guān)的標(biāo)記基因的表達(dá)改變的能力進(jìn)行了評估。優(yōu)選地，組分、材料或物質(zhì)進(jìn)行的調(diào)節(jié)導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)反映出或類似于未受到UV輻射的對照中的基因表達(dá)水平。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面提供了包含支持物或支持材料(例如膜，更特別的為硝酸纖維素或尼龍膜)的試劑盒，這些支持物或支持材料含有一組以一定形式存在的新型基因，其中這些基因的表達(dá)在皮膚受到UV輻射時(shí)發(fā)生改變，并且所述一定形式對于專業(yè)人員來說適合用于鑒定具有光保護(hù)效用和/或能夠改善、修復(fù)、預(yù)防、抑制、阻滯、減少、治療或恢復(fù)由于皮膚、皮膚替代物、皮膚細(xì)胞或角蛋白形成細(xì)胞受到UV輻射而引起的光損傷和/或光老化的化合物、材料、試劑、成分、藥劑等等。除了可以提供經(jīng)鑒定的目標(biāo)基因標(biāo)記組來確定那些能夠克服或影響UV輻射引起的損傷和/或老化的試劑之外，該試劑盒可包含其他對于進(jìn)行該檢驗(yàn)方法所必需的材料，包括標(biāo)記探針、緩沖液、對照和使用說明，但是并不局限于此。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對于UV引起的基因表達(dá)作出響應(yīng)的個(gè)體即個(gè)體亞群的鑒定，這是通過具有此處新近描述的UV輻射誘導(dǎo)的標(biāo)記基因組中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)改變來進(jìn)行鑒定的。這樣的個(gè)體更容易在受到UV輻射后造成光損傷和光老化。這些個(gè)體可以通過用本發(fā)明的方法進(jìn)行篩選而進(jìn)行鑒定，它們尤其易接受包括能夠調(diào)節(jié)此處描述的標(biāo)記基因組中一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)改變的材料、成分、化合物、制劑和組合物的治療或醫(yī)療。鑒定出的個(gè)體特別適合于UV輻射引起的光損傷和光老化的改善、還原、治療、預(yù)防、修復(fù)、減少和/或恢復(fù)。
根據(jù)每一個(gè)上述的本發(fā)明的方面，標(biāo)記基因組包含至少一個(gè)其表達(dá)在受到UV輻射之后會發(fā)生改變的基因，該標(biāo)記基因組包括Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；標(biāo)記基因的獨(dú)特亞片段；和其組合。
材料、化合物、組分、成分、物質(zhì)或組合物相對于對照(例如未受到UV輻射的皮膚或者所受到的UV輻射已被阻斷或減弱的皮膚)調(diào)節(jié)上面列出的標(biāo)記基因組中至少一個(gè)基因表達(dá)水平的能力與該材料改善、治療、預(yù)防、抑制、阻滯、減少和/或修復(fù)皮膚的光損傷，和/或改善、治療、預(yù)防、抑制、阻滯、減少和/或恢復(fù)皮膚的光老化的光保護(hù)和醫(yī)療能力有關(guān)。
當(dāng)連同附隨的附圖一起考慮時(shí)，在閱讀本發(fā)明的詳述之后將會更好地意識到本發(fā)明進(jìn)一步的方面、特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡述

圖1A和1B分別表示在正常對照皮膚(圖1A)和受到4個(gè)最小紅斑劑量單位(4MED)的UV輻射之后32小時(shí)的受到太陽刺激性輻射(SSR)的皮膚(圖1B)中的基因表達(dá)模式的cDNA陣列圖譜。
圖2A和2B顯示了log-轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的散布圖分析，這些數(shù)據(jù)是來自同樣皮膚樣品的兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。每個(gè)點(diǎn)代表單個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平。直線表明最佳擬合回歸。
圖3表示long-轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的散布圖分析，這些數(shù)據(jù)是受輻射的皮膚對正常(未受輻射的)對照的數(shù)據(jù)。每個(gè)點(diǎn)代表來自四個(gè)實(shí)驗(yàn)的單個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平的平均值。直線表明等于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(±0.35)的置信區(qū)間。
圖4A和4B顯示了逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的結(jié)果，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR是為了確認(rèn)本發(fā)明所描述的基因標(biāo)記人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3)中的一個(gè)的正調(diào)節(jié)。圖4A人皮膚受到SSR之后的HBD2基因表達(dá)(RNA的RT-PCR)。圖4B人皮膚受到SSR之后的HBD3基因表達(dá)(RNA的RT-PCR)。
圖5A和5B顯示了在人皮膚受到SSR之后HBD2和HBD3的RT-PCR時(shí)間過程分析。在這些分析中，從未受照射的皮膚和受到4MED SSR之后8、24、32或48小時(shí)的皮膚中取出角膜刀。從角膜刀樣品中提取RNA；對于HBD2和HBD3進(jìn)行RT-PCR。(圖5A)，(也可見實(shí)施例1)。圖5B中顯示了標(biāo)準(zhǔn)化相對倍數(shù)增加。
發(fā)明詳述因?yàn)閁V輻射引起的皮膚損傷的有害結(jié)果，例如免疫抑制、光致癌作用(例如黑素瘤)和由于光老化造成的皺紋與彈性喪失，所以需要在受到UV輻射之前以及之后預(yù)防、抑制、阻滯、減少、治療、改善、修復(fù)和/或恢復(fù)這些結(jié)果。
本發(fā)明總體上提供了在體內(nèi)太陽刺激性輻射(SSR)(即UV輻射)激發(fā)下人皮膚或皮膚細(xì)胞的獨(dú)特的基因表達(dá)/調(diào)節(jié)特性。本發(fā)明已經(jīng)鑒定了一組新的和料想不到的基因，即標(biāo)記基因系列，其表達(dá)會在受到UV輻射之后發(fā)生改變。新近發(fā)現(xiàn)的基因標(biāo)記組包括含有幾個(gè)不同類別蛋白質(zhì)分子的基因，即細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞外通信蛋白；細(xì)胞表面抗原和粘著受體蛋白；生長因子，細(xì)胞因子，趨化因子和受體；細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)物，效應(yīng)物和調(diào)節(jié)劑；癌基因和腫瘤抑制因子；蛋白質(zhì)抑制劑和蛋白質(zhì)修飾分子；異生素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；轉(zhuǎn)錄激活蛋白和阻抑蛋白；基本轉(zhuǎn)錄因子；細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑；細(xì)胞外通信蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和激酶激活劑和抑制劑。相對于至少一個(gè)未受到UV輻射的對照(如皮膚、皮膚替代物或皮膚等效物)中的基因表達(dá)，測定該組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)改變。
特別地，基因標(biāo)記組包含上述類型基因中的35個(gè)基因(和Clontech Laboratories，Palo Alto，CA提供的用于商購可得的Clontech微陣列的GenBank編號)，它們的表達(dá)受到UV輻射輻照的影響。這35個(gè)基因包括下列的基因Ras相關(guān)蛋白RAB-7(GenBank編號X93499)；Corneodesmosin(GenBank編號L20814)；雙調(diào)蛋白(GenBank編號M30704)；粒細(xì)胞趨化蛋白(GenBank編號X78686)；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)(GenBank編號X06233)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)(GenBank編號X06234)；Ephrin受體(GenBank編號M59371)；上皮細(xì)胞激酶(ECK)(GenBank編號X74979)；shb原癌基因(GenBank編號X75342)；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白(GenBank編號L06895)；鈣蛋白酶(GenBank編號M23254)；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)(GenBank編號M93056)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)(GenBank編號M18082；.J02685)；β防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))(GenBank編號Z71389)(HBD3編號M18661)；α1抗胰蛋白酶前體(GenBank編號X02920)；Tristetraproline(生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475)(GenBank編號M92843)；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)(GenBank編號U73036)；核因子1(GenBank編號L31881)；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑(GenBank編號D26155)；胸腺素原(GenBank編號M26708)；GATA3轉(zhuǎn)錄因子(GenBank編號X55122)；組氨酸脫羧酶(GenBank編號X54297)；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白(GenBank編號M14200)；核心蛋白聚糖(GenBank編號M14219)；CD44抗原(GenBank編號M59040)；B94蛋白(GenBank編號M92357)；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)(GenBank編號K02091)；載脂蛋白E(GenBank編號M12529)；上皮網(wǎng)柄菌素受體(GenBank編號X74979)；凝血酶受體(GenBank編號M62424)；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶(GenBank編號X12646)；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)(GenBank編號Y00815)；細(xì)胞色素p450 IVB1(GenBank編號J02871)；硫氧還蛋白過氧化物酶(GenBank編號U25182)；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)(GenBank編號X70326)；和EB1微管伴隨蛋白(GenBank編號U24166)。
包含基因標(biāo)記組的基因呈現(xiàn)在表1中，并以其中的一般類別進(jìn)行了鑒定。根據(jù)本發(fā)明，可以使用這些基因中的一個(gè)、全部或者組合作為用于UV輻射引起的皮膚損傷或光老化的獨(dú)特的標(biāo)記或基因標(biāo)記組，這是由于在受到UV輻射之后它們的基因表達(dá)發(fā)生改變或變化?！案淖儭北硎鞠鄬τ谖词艿経V輻射的對照或者所受到的UV輻射已被阻斷或減弱的對照的基因表達(dá)變化，該變化可包括例如在受到UV輻射之后基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)。如果相對于對照此處給出的基因中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)改變?yōu)橹辽俅蠹s1.5倍，優(yōu)選地為大約2倍，更優(yōu)選地為大約2倍或更大，或者離平均值大約2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)或更大，那么認(rèn)為這種改變相對于對照是顯著的。
表1
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包含評測皮膚所受UV輻射的損傷的方法。該方法包括用紫外線照射皮膚、器官型皮膚模型(包括人和非人的動物皮膚)、皮膚等效物、人或非人的培育細(xì)胞或者角蛋白形成細(xì)胞(例如來自皮膚、頭發(fā)和甲的細(xì)胞)；用本領(lǐng)域已知和常用的方法分離核酸(優(yōu)選的為RNA)；和評測分離出的核酸(優(yōu)選的為RNA)以確定一個(gè)或多個(gè)表1中給出的基因的表達(dá)水平是否發(fā)生了變化或改變(見實(shí)施例1)。
根據(jù)本發(fā)明方法，將皮膚(例如皮膚活檢組織或皮膚角膜刀)、器官型皮膚模型或培養(yǎng)細(xì)胞暴露于UV輻射或UV輻射源并保持給定的時(shí)間。受到UV輻射的時(shí)間由專業(yè)人員根據(jù)正經(jīng)受輻照的個(gè)體的MED值來確定。一般而言，對于細(xì)胞和組織等效物的UV輻照小于或大約為6J/cm2。在其中的一個(gè)方面，體內(nèi)皮膚源的使用有利地提供了一種樣品，該樣品含有有助于皮膚中UV引起的基因表達(dá)的那些皮膚組分，如脈管系統(tǒng)和在體內(nèi)遷移入皮膚中的全套真皮細(xì)胞與炎性細(xì)胞。
適合于在該方法中使用的培養(yǎng)皮膚細(xì)胞的非限制性例子包括初級分離細(xì)胞和所建立的表皮和真皮類型細(xì)胞系，如角質(zhì)細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、sebocyte、毛乳頭與基質(zhì)細(xì)胞以及甲基質(zhì)細(xì)胞，但是并不局限于此。這樣的細(xì)胞的來源包括美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)；和細(xì)胞/組織庫，如Clonetics/BioWhittaker(San Diego，CA)或CascadeBiologics公司(Portland，OR)，但是并不局限于此。組織等效物可從組織工程公司獲得，如Organogenesis公司(Canton，MA)、MatTek公司(Ashland，MA)和Skinethic公司(Nice，法國)。新鮮的細(xì)胞可從人皮膚或者其他哺乳動物的活檢組織獲得。其他的皮膚細(xì)胞系也可從上述來源的其他哺乳動物獲得。
在受到UV輻射之后，基因表達(dá)可以用多種分子程序評測一次或多次，這些分子程序用于分析從皮膚、皮膚替代物、皮膚等效物、角蛋白形成細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞分離出的核酸或多核苷酸，例如DNA、RNA、cDNA。作為指導(dǎo)，UV輻射對于一個(gè)或多個(gè)基因標(biāo)記的影響的評測可以在受到UV輻射之后幾分鐘至幾小時(shí)至幾天進(jìn)行，其包括大約5分鐘至大約96小時(shí)，優(yōu)選地為大約1小時(shí)至大約72小時(shí)，更優(yōu)選地為大約4小時(shí)至大約32小時(shí)，但是并不局限于此。
在皮膚、皮膚替代物或培養(yǎng)細(xì)胞受到UV輻射之后，相對于此處所描述的一個(gè)或多個(gè)對照(未受到UV輻射)，UV輻射引起的新近提供的基因標(biāo)記中一個(gè)或多于一個(gè)基因(即組合)的表達(dá)改變可以用許多本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的合適的分子技術(shù)和程序來測量。例如，基因表達(dá)可以通過測定受到UV照射的皮膚、皮膚替代物或培養(yǎng)細(xì)胞的RNA水平來測量，RNA水平的測定可用本領(lǐng)域常用的技術(shù)來進(jìn)行，例如Northern印跡技術(shù)和PCR，如“實(shí)時(shí)”PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT PCR)。(見例如J.Sambrook等人，1989，Molecular CloningALaboratoryManual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；R.Higuchi等人，1992，Biotechnology，10413-417；R.Higuchi等人，1993，Biotechnology，111026-1030；E.S.Kawasaki，1990，“RNA的擴(kuò)增”(Amplificationof RNA)，RNA ProtocolsAGuide to Methods & Applications，M.A.Innis等人，Academic出版社，San Diego，CA，pp.21-27)。另外，皮膚、皮膚替代物或培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)可以用下列方法進(jìn)行評測，即基因(cDNA)陣列(含有膜、玻璃或塑料支持材料的微陣列或核酸基因芯片測試陣列)、基因表達(dá)系列分析(SAGE)(例如由V.E.Velculescu等人，1995，Science，270(5235)484-487；A.Lal等人，1999，Cancer Res.59(21)5403-5407所描述的)或者差異展示技術(shù)。
優(yōu)選的是基因陣列方法學(xué)，其可以容易地和可靠地用于根據(jù)本發(fā)明的篩選和評測方法中。許多基因陣列(微陣列或基因芯片陣列)是商購可得的以便專業(yè)人員使用，例如Clontech Laboratories(PaloAlto，CA)；Affymetrix(Santa Clara，CA)；Operon Technologies(Alameda，CA)；Perkin-Elmer/NEN(Boston，MA)；和Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)，但是并不局限于此。更特別地，核酸微陣列分析使得能夠從多種基因中建立基因表達(dá)模式，和有助于了解在受試者或樣品中由選擇性干涉(如根據(jù)本發(fā)明受到UV輻射)引起的復(fù)雜的相互作用。微陣列程序使得能夠在體內(nèi)干涉(如受到 UV輻射)之后測定一組基因中的選擇性特性修飾以及基因表達(dá)或活性的新的和特異的變化。作為進(jìn)一步的指導(dǎo)并且無任何限制的，微陣列可以根據(jù)下列文獻(xiàn)中描述的方法來制備和使用WO 95/11995(Chee等人)；D.J.Lockhart等人，1996，Nature Biotechnology，141675-1680；和M.Schena等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310614-10619。微陣列在P.Lal等人的U.S.專利6,015,702的公開內(nèi)容中作了進(jìn)一步的描述。另外，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到的，包括了高通量分析作為分析微陣列和/或基因芯片技術(shù)的結(jié)果的手段。
在本發(fā)明之前，本領(lǐng)域中還未認(rèn)識到使用基因陣列技術(shù)來評測和評估UV輻射輻照或鑒定能夠調(diào)節(jié)由于受到UV輻射而產(chǎn)生的基因表達(dá)的材料，這些材料可用于治療、改善、預(yù)防、減少、修復(fù)或恢復(fù)皮膚的光損傷或光老化。此外，根據(jù)本發(fā)明鑒定出了在UV輻照之后其表達(dá)發(fā)生改變的新基因(見表1)，以前并不知道這些基因與皮膚受到UV輻射之后的光損傷和光老化有關(guān)。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法評測基因表達(dá)的改變時(shí)，測定對照(例如無UV輻射輻照或阻斷了UV輻射輻照)和測試樣品(例如受到UV輻射之后)之間的基因表達(dá)水平的差異。如上文中所提到的，根據(jù)本發(fā)明的方法，基因表達(dá)的顯著差異(即與對照相比構(gòu)成顯著的改變或變化)為至少大約1.5倍的差異，優(yōu)選地為大約2倍，更優(yōu)選地為大約2倍或更大。作為另一種選擇，在該方法中當(dāng)比較對照和測試樣品時(shí)認(rèn)為離平均值大約2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差或更大的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異是顯著的。
在本發(fā)明所包括的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用評測一個(gè)或多個(gè)此處提供的基因標(biāo)記的基因表達(dá)改變的方法來鑒定和/或評估能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選地減弱)UV輻射引起的皮膚光損傷或光老化的成分、組分、試劑、材料等等。在這一方面，可以評估皮膚護(hù)理和/或美容產(chǎn)品的特殊成分，從而確定它們在受到UV輻射的皮膚、皮膚替代物、皮膚細(xì)胞或角蛋白形成細(xì)胞中調(diào)節(jié)此處描述的一個(gè)或多個(gè)基因標(biāo)記的表達(dá)改變的能力。這種由所述成分或產(chǎn)品進(jìn)行的調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致預(yù)防、抑制、阻滯、還原、治療、改善和/或恢復(fù)光損傷和光老化的皮膚。
更特別地，將待測試的成分、組分、材料或物質(zhì)或者產(chǎn)品(如遮光劑制劑，或者抗老化制劑或組合物)以有效濃度和有效時(shí)段(例如每天、每星期或者每2至4星期)與皮膚或皮膚替代物或其區(qū)域進(jìn)行接觸，或者施用于皮膚或皮膚替代物或其區(qū)域。另外，如果需要或期望，在這些時(shí)段內(nèi)可以進(jìn)行多次施用。作為非限制性指導(dǎo)，施用于測試皮膚上的位點(diǎn)的測試材料的濃度為(優(yōu)選的)每天大約0.5-5mg/cm2，優(yōu)選地為大約1-2mg/cm2，并持續(xù)大約1、2或4星期。
在本發(fā)明的評測方法中，將測試皮膚暴露于UV輻射源，例如最小紅斑劑量(MED)，從大約0.5MED至大約5MED，優(yōu)選地大約1MED至大約4MED，并持續(xù)大約5分鐘至大約48小時(shí)，優(yōu)選地大約5分鐘至大約1小時(shí)。作為對照，從另一個(gè)未受到UV輻射的皮膚樣品中檢查新型基因標(biāo)記組中一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)水平。沒有施用測試材料的皮膚或皮膚替代物可以暴露于UV輻射并且也可作為對照來進(jìn)行評估，即皮膚或皮膚替代物在缺乏測試材料的情況下也暴露于UV輻射而作為對照。
在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的微陣列系統(tǒng)中，從有和沒有施用測試材料并受到UV輻射的皮膚以及未經(jīng)歷UV輻射輻照的皮膚樣品中制備和分離RNA。用特異的基因陣列引物將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄從而形成互補(bǔ)核苷酸序列(cDNA)，同時(shí)例如摻入放射性32P標(biāo)記以用作陣列的探針。然后將標(biāo)記的cDNA與含有成百或成千基因(包括此處描述的35個(gè)基因)的人基因陣列(例如膜基質(zhì))進(jìn)行雜交(例如實(shí)施例1)。
作為另一種選擇，標(biāo)記的cDNA優(yōu)選地與一個(gè)陣列(例如尼龍或硝酸纖維素膜，或塑料薄膜，或基因芯片)雜交，該陣列含有35個(gè)基因中的至少一個(gè)、組合或全部或者其核酸部分(例如寡聚體)，該核酸部分可特異地或獨(dú)特地鑒定本發(fā)明所新近描述的標(biāo)記基因，以便進(jìn)行該獨(dú)特性標(biāo)記基因組的更特異的表達(dá)分析。因此，可以使用此處描述的基因標(biāo)記組中的至少一個(gè)、或全部、或組合來制備專用的微陣列。優(yōu)選地，將包含一組大約35個(gè)基因中的一個(gè)或多個(gè)或全部基因或者其特異性序列的標(biāo)記基因組用于陣列中，如用于例如同位素印跡雜交的基因(核酸)芯片或微陣列。用于陣列的支持物的非限制性例子包括基于尼龍或硝酸纖維素膜、玻璃(例如用于熒光檢測的載玻片)或塑料薄膜支持物的微陣列，該微陣列用于確定產(chǎn)品、成分或材料是否具有光保護(hù)性或者是否能夠改善、預(yù)防、減少、修復(fù)、抑制、阻滯、減弱、壓制、治療或恢復(fù)與(優(yōu)選地為皮膚的)UV輻射輻照相關(guān)的光損傷和/或光老化的方法之中。這就是說，該方法使得能夠確定，相對于對照，產(chǎn)品、成分或材料是否能夠在受到UV輻射之后調(diào)節(jié)標(biāo)記基因組中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)或表達(dá)改變。熟練的專業(yè)人員將會意識到，在微陣列程序中可以使用放射性(例如32P)或非放射性材料如熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶標(biāo)記、生物素-抗生物素蛋白標(biāo)記等等來標(biāo)記核酸(例如從皮膚或皮膚替代物中分離和制備得到的cDNA)，或者可以適當(dāng)?shù)厥褂脴?biāo)記探針。將各種標(biāo)記探針與基因微陣列接觸。通過從微陣列上特異基因位置的標(biāo)記探針獲得的信號(例如放射性、熒光、化學(xué)發(fā)光等等信號)數(shù)量來證實(shí)表達(dá)數(shù)量。探針與微陣列上特異基因位置的結(jié)合的數(shù)量越大，該基因的表達(dá)就越多。
在適當(dāng)?shù)碾s交間隔(例如從幾個(gè)小時(shí)至過夜或稍微更長)之后，洗滌陣列(例如膜)以除去未結(jié)合的材料(例如根據(jù)膜供應(yīng)廠商的說明)，和將其置于磷成像屏上以便能夠進(jìn)行基因表達(dá)水平的顯影?；蛘T導(dǎo)用強(qiáng)度值表示，并用本領(lǐng)域中常用的合適的軟件(例如實(shí)施例1中所描述的)進(jìn)行分析。用此處描述的標(biāo)記探針和微陣列分析的檢測程序來評估標(biāo)記基因中一個(gè)或多于一個(gè)(例如2個(gè)或更多，3個(gè)或更多，4個(gè)或更多)基因、全部基因或者其組合的基因表達(dá)水平的改變，其中這些標(biāo)記基因的表達(dá)可由UV輻射誘導(dǎo)并與對照基因表達(dá)水平相比較發(fā)生了改變(見例如實(shí)施例1)。
如果發(fā)現(xiàn)測試材料能夠相對于未受到UV輻射的對照在皮膚受到UV輻射之后調(diào)節(jié)本發(fā)明的標(biāo)記基因組中一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)改變或變化，那么可以確定該材料為改善、預(yù)防、減少、抑制、阻滯、壓制、修復(fù)、恢復(fù)或治療光損傷和/或光老化皮膚的候選物。也可以進(jìn)行時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)來確定，在暴露于UV射線的延長或不同時(shí)間內(nèi)，測試物質(zhì)作為光損傷和/或光老化保護(hù)劑或者作為光損傷和/或光老化修復(fù)或治療試劑的效用。本發(fā)明也設(shè)想了用于評估物質(zhì)是否能夠恢復(fù)由于受到UV輻射而引起的皮膚光損傷和/或光老化的方法，這是通過在發(fā)生光損傷或光老化之后施用所描述的方法來實(shí)現(xiàn)的。
如果發(fā)現(xiàn)待測試的成分、物質(zhì)、材料或產(chǎn)品在受到UV輻射的皮膚或測試材料中可以影響或調(diào)節(jié)此處描述的一組標(biāo)記基因中一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)，那么可以認(rèn)為該成分為用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品或美容制劑之中的候選物，所述產(chǎn)品或制劑可用于局部和/或口服使用以預(yù)防、抑制、阻滯、減少、治療、改善、修復(fù)或恢復(fù)由于受到UV輻射而造成的光損傷和/或光老化。使皮膚護(hù)理產(chǎn)品和制劑包含上面所鑒定的成分。這樣的皮膚護(hù)理產(chǎn)品和制劑包括遮光劑、抗氧化劑制劑、經(jīng)皮膚的裝置(如貼劑等等)、頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品、化妝品和美容產(chǎn)品(例如口紅、面霜和手霜、粉底、體霜、洗液、保溫劑、抗皺紋制劑等等)，但是并不局限于此。正如熟練的專業(yè)人員將會意識到的，這樣的材料和成分優(yōu)選地以對于調(diào)節(jié)標(biāo)記基因組中至少一個(gè)基因的表達(dá)有效(更優(yōu)選地相對于至少一個(gè)未受到UV輻射的對照的基因表達(dá))的數(shù)量用于組合物和制劑之中。
本發(fā)明提供了有利和有用的方法來篩選和評測皮膚護(hù)理、顏料、個(gè)人護(hù)理和頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品的潛在益處。由于上面的描述，將可以了解到本發(fā)明進(jìn)一步包括一種方法或檢測系統(tǒng)來鑒定提供光保護(hù)(例如用于預(yù)防用途)的新材料，這些材料可修復(fù)、改善、減少或治療光損傷或光老化的皮膚或者可恢復(fù)先前的受到UV輻射的皮膚光損傷(例如，為了治療目的)。
本發(fā)明所包括的組合物可以任何適合于美容的形式提供，優(yōu)選地作為洗液或霜劑，也可在軟膏或油基底中，以及可噴霧的液體形式(例如可保護(hù)頭發(fā)和頭皮抗UV輻射引起的損傷的“頭發(fā)”噴霧劑，該噴霧劑可存在于以美容上可接受的方式進(jìn)行干燥的基底之中，而不會有將洗液或軟膏施用于頭發(fā)而通常具有的油膩的外觀)。另外，本發(fā)明所設(shè)想的組合物可以包括一種或多種熟練的專業(yè)人員通常使用和已知的并且美容上可接受的輔劑，例如著色劑、芳香劑、潤滑劑、濕潤劑、防腐劑、維生素、螯合劑、增稠劑等等，以及植物制劑如蘆薈、春黃菊等等。如果應(yīng)當(dāng)包括類視黃醇，它們優(yōu)選地進(jìn)行局部使用，其濃度為大約0.001％至大約5％，更優(yōu)選地為大約0.1％至大約1％。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，其設(shè)想了一種方法來鑒定和評測能夠最終作為經(jīng)口服攝取的光保護(hù)、光治療和光修復(fù)試劑的營養(yǎng)補(bǔ)充物。在這一方面，采用本發(fā)明的方法來鑒定和評測營養(yǎng)補(bǔ)充物，在該方法中對于補(bǔ)充物或潛在補(bǔ)充物進(jìn)行評估以確定在受到UV輻射之后其調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā)明的至少一個(gè)基因標(biāo)記的基因表達(dá)改變的能力。這樣的調(diào)節(jié)可以是例如減弱、預(yù)防、抑制、阻滯、減少、改善、修復(fù)和/或恢復(fù)UV引起的光損傷或光老化。因此，本發(fā)明提供了一種新型和有利的程序來評測營養(yǎng)補(bǔ)充物的光保護(hù)和/或醫(yī)療效用，這些營養(yǎng)補(bǔ)充物例如能夠提供抗UV引起的細(xì)胞和組織損傷的內(nèi)在保護(hù)和醫(yī)療，或者內(nèi)在地改善、修復(fù)、抑制、減少或治療UV引起的細(xì)胞和組織損傷。(例如Chakrabaty等人，1994，F(xiàn)ree Radical Biol.Med，16417)。
僅僅作為一個(gè)例子，類視黃醇如視黃酸、視黃醇相關(guān)物質(zhì)、抗氧化劑以及本發(fā)明所包括和鑒定的光保護(hù)和/或醫(yī)療組分也可以系統(tǒng)吸收的方式進(jìn)行攝取，優(yōu)選地通過口服施用。當(dāng)口服給藥時(shí)，類視黃醇和其他被攝取的光保護(hù)劑組分優(yōu)選地以大約0.1mg/kg(體重)至大約1mg/kg乃至更高的數(shù)量進(jìn)行施用，所有的劑量均低于可能出現(xiàn)毒性的數(shù)量。作為另一個(gè)例子，抗氧化劑常常以“大劑量”進(jìn)行攝取(例如至少1g/d的維生素C，至少1000 I.U.的一種或多種生育酚)。
對于非局部的施用如系統(tǒng)吸收或口服施用，本發(fā)明所鑒定和包括的組分或材料一般配制在生理上可接受的組合物中，優(yōu)選的為藥物上可接受的組合物，包括生理上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。該組合物可以單獨(dú)施用或者與至少一種其他試劑(如穩(wěn)定化化合物)一起施用，其可以任何無菌的、生物適合的藥物載體進(jìn)行施用，包括鹽水、緩沖鹽水、葡聚糖和水，但是并不局限于此。該組合物可以單獨(dú)施用于患者，或者與其他試劑、藥物、激素或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物一起施用于患者。該組合物可以下列形式(只是舉例而非限制)進(jìn)行攝取、施用、應(yīng)用或引入，即凝膠膠囊、片劑、粉劑、懸浮液、液體、膠囊形片劑、桿狀物、搖動劑(shakes)、飲料等等，如下面將作進(jìn)一步的描述。
在本發(fā)明中使用的藥物組合物可以通過許多途徑進(jìn)行施用，包括口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸、局部、舌下、陰道或直腸的方式，但是并不局限于此。
本發(fā)明包括經(jīng)皮膚的遞送方式如貼劑等等，其含有或沒有合適的滲透增強(qiáng)劑。本發(fā)明所包括的方法和組合物提供了一種方式，通過這種方式一種或多種光保護(hù)、光治療或光修復(fù)藥物或者藥劑可以在經(jīng)皮膚的系統(tǒng)中有效地進(jìn)行施用。具有弱的局部吸收或者需要高劑量水平的化合物常常經(jīng)皮膚進(jìn)行遞送。因此，向皮膚遞送藥物組合物(通常與滲透增強(qiáng)組合物一起)的經(jīng)皮膚的方式為經(jīng)皮膚的貼劑或者本領(lǐng)域中已知和已描述的類似裝置。在U.S.專利5,146,846、5,223,262、4,820,724、4,379,454和4,956,171中公開了這種裝置的例子；但并不限于這些。向皮膚貯存與遞送組合物并形成活性組合物的經(jīng)皮膚的方式是方便的，并且非常適合于本發(fā)明實(shí)施方案的目的。
除了活性成分(包括如此處鑒定出的光保護(hù)、光修復(fù)和/或光治療化合物或成分)之外，生理上可接受的和藥用的組合物可以包含合適的、藥物上可接受的和含有輔助劑的載體、稀釋劑或賦形劑，所述輔助劑有助于將活性化合物加工成藥學(xué)上可用的制劑。在最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack出版公司；Easton，PA)中提供了關(guān)于配制和施用技術(shù)的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。
用于口服施用的藥物組合物可用本領(lǐng)域中熟知的藥物上可接受的載體以對于口服施用合適的劑量來進(jìn)行配制。這樣的載體使得能夠?qū)⑺幬锝M合物配制成用于患者攝取的片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、結(jié)晶漿液、懸浮液等等。
用于口服使用的藥物組合物可以通過下列步驟來獲得，即將活性化合物和固體賦形劑組合，可選擇地磨碎結(jié)果所得的混和物，和(如果需要)在加入合適的輔助劑之后加工顆粒的混和物，從而獲得藥片或糖衣丸核心。合適的賦形劑為碳水化合物或蛋白質(zhì)填充物，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；來自玉米、小麥、稻米、馬鈴薯或其他植物的淀粉；纖維素，如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；樹膠，包括阿拉伯膠和西黃蓍膠；和蛋白質(zhì)，如明膠和膠原蛋白。如果需要，可以加入分解劑或穩(wěn)定劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、褐藻酸或其生理上可接受的鹽如褐藻酸鈉。
糖衣丸核心可與生理上合適的包衣材料結(jié)合使用，如濃縮的糖溶液，其也可以含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯(carbopol)凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦；漆溶液(lacquersolutions)；和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混和物。染料或色素可以加入到藥片或糖衣丸包衣之中以易于識別或者表征活性化合物的數(shù)量即劑量。
可口服使用的藥物制劑包括明膠制成的推入配合式(push-fit)膠囊以及明膠和包衣(如甘油或山梨糖醇)制成的軟性有刻度的膠囊。推入配合式膠囊可以含有與填充物或粘合物如乳糖或淀粉、潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂和(可選擇的)穩(wěn)定劑混和的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸浮在合適的液體中，例如有或沒有穩(wěn)定劑的脂肪油、液體或者液體聚乙二醇。
適合于腸胃外施用的藥物制劑可以在水溶液中進(jìn)行配制，優(yōu)選地在生理相容的緩沖液中進(jìn)行配制，例如Hanks’溶液、Ringer’s溶液或生理緩沖溶液。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。另外，活性化合物的懸浮液可以制備成適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋∫?。合適的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂質(zhì)體?？蛇x擇地，懸浮液也可以含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的試劑從而使得能夠制備高濃縮的溶液。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到的，將藥物制劑制備成各種形式不會不利地影響制劑中活性材料的功能或活性。
對于局部或鼻部施用，在制劑中使用適合于特殊滲透障礙的滲透劑或滲透試劑或增強(qiáng)劑。這樣的滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的。
本發(fā)明的藥物組合物可以本領(lǐng)域中已知的方式進(jìn)行制造，例如通過傳統(tǒng)的混和、溶解、顆?；?、制成糖衣丸、磨碎、乳化、裝入膠囊、截留或凍干程序。
如果適用，藥物組合物可以鹽的形式來提供，并可用許多酸來形成，這些酸包括鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等等，但是并不局限于此。鹽傾向于比相應(yīng)的游離堿形式在水性溶劑或其他質(zhì)子性溶劑中更加可溶。在其他情況下，制劑可以為可包含下列任一或全部物質(zhì)的凍干粉1-50mM組氨酸，0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，其pH為4.5-5.5，使用前與緩沖液結(jié)合。
在制備了光保護(hù)、光修復(fù)和/或光治療的藥物組合物之后，可將它們置于合適的容器中，并標(biāo)注用于指定條件的治療。對于光保護(hù)、光修復(fù)和/或光治療產(chǎn)品的施用，這種標(biāo)注包括施用的數(shù)量、頻率和施用方法。
適合于在本發(fā)明中使用的藥物組合物包括這樣的組合物，即在該組合物中以對于獲得預(yù)期目的有效的劑量含有活性成分或材料。有效劑量或數(shù)量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。對于任何化合物，治療有效劑量或濃度范圍最初可在細(xì)胞培養(yǎng)檢驗(yàn)中進(jìn)行估計(jì)，例如使用贅生性細(xì)胞。治療有效劑量是指活性成分(例如根據(jù)本發(fā)明所鑒定的光保護(hù)、光修復(fù)和/或光治療化合物或組分)的數(shù)量，這些數(shù)量例如可預(yù)防、改善、減少、治療、恢復(fù)、壓制、修復(fù)或消除癥狀或病癥。劑量一般在上述的范圍內(nèi)變化，其依賴于所使用的劑型、患者的敏感性和施用途徑。專業(yè)人員將會考慮與需要治療的個(gè)體相關(guān)的因素并確定正確的劑量。
調(diào)整劑量和施用以提供活性部分的足夠水平或保持所希望的效果。一般要考慮的因素包括個(gè)體特殊需要的嚴(yán)重性，患者的總體健康狀況，患者的年齡、體重和性別，飲食，施用的時(shí)間和頻率，藥物組合，反應(yīng)敏感性，和對于治療的耐受/響應(yīng)。作為一般性的指導(dǎo)，長期作用的藥物組合物可以每3-4天、每星期或每2個(gè)星期一次進(jìn)行施用，這依賴于特定制劑的半壽期和清除率。這些劑量水平的變化可使用用于優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序來調(diào)整，這在本領(lǐng)域中是非常熟悉的。
作為非限制性指導(dǎo)，正常的劑量可于0.1-100,000微克(μg)變化，直至大約1克(g)的總劑量，這依賴于施用的途徑。文獻(xiàn)中提供了對于特殊的遞送劑量和方法的指導(dǎo)，這對于本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是可用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會根據(jù)光保護(hù)和/或光治療化合物的性質(zhì)如結(jié)構(gòu)、組成來使用不同的制劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種篩選方法從而使得能夠鑒定對于UV引起的基因表達(dá)作出響應(yīng)的個(gè)體或個(gè)體亞群，這是通過具有此處新近描述的UV輻射誘導(dǎo)的標(biāo)記基因組中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)改變來進(jìn)行鑒定的。這樣的個(gè)體由于具有UV輻射誘導(dǎo)的標(biāo)記基因中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)改變，因而它們可能會在受到UV輻射之后比正常個(gè)體更容易造成光損傷和光老化或者對于光損傷和光老化具有更高的敏感性，它們能夠通過使用本發(fā)明的方法來篩選鑒定。例如，該實(shí)施方案的篩選方法包括例如按實(shí)施例1中的描述從正進(jìn)行測試的個(gè)體中獲得皮膚樣品如皮膚活檢組織或皮膚角膜刀樣品；將樣品暴露于UV輻射；從受到UV輻射的樣品中分離核酸；和使用檢驗(yàn)方法(例如此處描述的微陣列系統(tǒng)和新近鑒定的標(biāo)記基因)來評測相對于對照個(gè)體內(nèi)UV輻射誘導(dǎo)的基因中至少一個(gè)基因的基因表達(dá)是否發(fā)生了改變。篩選方法進(jìn)一步使得能夠確定那些特別易受治療或醫(yī)療影響的個(gè)體，所述治療或醫(yī)療包括能夠調(diào)節(jié)此處描述的UV輻射誘導(dǎo)的標(biāo)記基因組中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)改變或者修飾基因表達(dá)的材料、成分、化合物、制劑和組合物。鑒定或篩選出的個(gè)體會特別適合于根據(jù)本發(fā)明來改善、還原、治療、預(yù)防、修復(fù)、減少和/或恢復(fù)UV輻射引起的光損傷和光老化。
本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案涉及含有支持物或支持材料(例如尼龍或硝酸纖維素膜，或塑料薄膜，或玻璃，或微陣列，但不局限于此)的試劑盒，這些支持物或支持材料以一定的形式含有此處描述的一組新型基因，該形式對于專業(yè)人員來說適合用于鑒定能夠改善、預(yù)防、抑制、阻滯、壓制、減少、修復(fù)、治療或恢復(fù)由于皮膚受到UV輻射而引起的光損傷和/或光老化的化合物、試劑、成分、物質(zhì)、藥劑等等。該試劑盒可以在合適的基質(zhì)或微陣列上含有新型基因標(biāo)記組或者這些基因的亞群或者這些基因的獨(dú)特的核酸部分，其提供了經(jīng)鑒定的目標(biāo)基因標(biāo)記組來鑒定能夠調(diào)節(jié)(即減弱、修飾或克服)UV輻射引起的皮膚光損傷和/或光老化的試劑。另外，該試劑盒可包含其他對于進(jìn)行該檢驗(yàn)方法所必需的材料，包括標(biāo)記的或未標(biāo)記的核酸探針、檢測標(biāo)記、緩沖液、對照和使用說明，但是并不局限于此。
實(shí)施例下面的實(shí)施例描述了本發(fā)明的特殊方面從而來舉例說明本發(fā)明，并對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供了本方法的描述。這些實(shí)施例不應(yīng)構(gòu)成本發(fā)明的限制，它們僅僅提供了用于理解和實(shí)施本發(fā)明和其各種方面的特殊方法學(xué)。
實(shí)施例1細(xì)胞通過細(xì)胞功能中基因組和非基因組的變化來對刺激作出響應(yīng)。按傳統(tǒng)在個(gè)別(單個(gè))基因基礎(chǔ)上進(jìn)行了解細(xì)胞和組織如何在基因組(RNA)水平上作出響應(yīng)。隨著基因陣列技術(shù)的使用，可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中研究成百的甚至成千的基因。
該實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)的目的是使用基因陣列技術(shù)和人皮膚來鑒定導(dǎo)致對于紫外輻射(UVR)引起的光損傷作出響應(yīng)的變化。因?yàn)閁VR是造成皮膚光損傷和光老化的病原物質(zhì)，所以使用受到UV照射的皮膚作為用于檢查與光損傷相關(guān)的急性和慢性變化的模型系統(tǒng)。使用該基于人皮膚樣品的模型系統(tǒng)作為一種方法來篩選能夠改善以及減少、治療、修復(fù)、恢復(fù)或預(yù)防急性和慢性UVR輻照造成的光損傷效應(yīng)的材料。
為了進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，從5名正常志愿者的臀部區(qū)域收集大約2cm×5cm大小并含有表皮和真皮細(xì)胞的皮膚角膜刀。在受到4MED的UVR輻照(太陽刺激性輻射，SSR)之后32小時(shí)收集角膜刀。對照角膜刀沒有受到UVR輻照?？焖倮鋬鼋M織以便進(jìn)行隨后的總RNA分離。
為了RNA的分離，在Trizol試劑(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中用polytron將組織勻漿，匯集，并按照Trizol試劑的說明分離出總RNA。一旦分離，將總RNA用特異基因陣列引物組(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)反轉(zhuǎn)錄從而形成互補(bǔ)的核苷酸序列，同時(shí)摻入放射性32P標(biāo)記。將標(biāo)記的cDNA與含有1176個(gè)人類基因的人Atlas 1.2I Array(Clontech Laboratories，PaloAlto，CA)雜交。雜交過夜之后，將膜根據(jù)膜供應(yīng)廠商的說明進(jìn)行洗滌，并將其置于磷成像屏上大約10天以便能夠進(jìn)行基因表達(dá)水平的顯影。通過磷成像分析儀用AtlasImage軟件(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)獲得用強(qiáng)度值表示的基因誘導(dǎo)并進(jìn)行分析。在用磷成像分析定量基因表達(dá)之后，用ImageQuaNTM軟件將基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化至膜上所有基因的平均強(qiáng)度并對背景雜交進(jìn)行校正。
全部的RNA提取、標(biāo)記、雜交和基因變化的計(jì)算重復(fù)4次并進(jìn)行平均。在該實(shí)施例中，相對于對照大約2-2.5倍的基因表達(dá)變化，或者在基線(對照)之上或之下2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)可認(rèn)為是顯著的。那些在皮膚受到UV輻射之后顯示出顯著的表達(dá)變化(正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié))的基因于此處進(jìn)行了描述并呈現(xiàn)在表1中。
實(shí)施例2微陣列為了產(chǎn)生對于微陣列中的基因特異的寡核苷酸，使用開始于核苷酸序列3’末端的計(jì)算機(jī)算法來檢查特異的基因序列。該算法可鑒定出指定長度的寡聚體，這些寡聚體對于基因是獨(dú)特的，并具有在適合于雜交的范圍內(nèi)的GC含量，和沒有預(yù)測的將會干擾雜交的二級結(jié)構(gòu)。該算法可鑒定出特殊長度的特異性寡核苷酸，例如20-100個(gè)核苷酸，如20聚體、30聚體、50聚體、80聚體、100聚體。形成一組匹配的寡核苷酸，其中在每個(gè)序列中心的一個(gè)核苷酸發(fā)生了改變。對于微陣列中的每個(gè)基因重復(fù)這一程序，并在熒光或放射性核苷酸存在下合成雙組寡核苷酸并將其排列在基質(zhì)表面。當(dāng)基質(zhì)是硅芯片時(shí)，使用光指導(dǎo)的化學(xué)處理以進(jìn)行沉積(見例如WO 95/11995，M.Chee等人)。
可選擇地，使用化學(xué)偶聯(lián)程序和墨水噴射裝置來在基質(zhì)的表面合成寡聚體。(見例如WO 95/25116，J.D.Baldeschweiler等人)。作為另一個(gè)選擇，可使用與點(diǎn)(或縫)印跡類似的“柵格化”的陣列來將cDNA片段或寡核苷酸排列在基質(zhì)表面上和將其與基質(zhì)表面連接，這是通過例如真空系統(tǒng)或者熱、UV、機(jī)械或化學(xué)結(jié)合技術(shù)來進(jìn)行的。
一般的陣列可以通過手工或通過使用可用的材料和裝置來生產(chǎn)，其可以含有多個(gè)點(diǎn)的柵格。在雜交之后，洗滌微陣列以除去未雜交的探針，并使用檢測裝置來確定放射性或熒光的水平和模式。檢測裝置可與X-射線膠片一樣簡單，或者與光掃描儀一樣復(fù)雜。檢查掃描出的熒光圖像來確定微陣列中每個(gè)寡核苷酸序列的互補(bǔ)性程度和相對豐度/表達(dá)水平或者表達(dá)水平變化，這優(yōu)選地通過比較對照和測試樣品或材料來進(jìn)行。
實(shí)施例3對于體外組織模型或單層培養(yǎng)物的兩種類型基因陣列方法學(xué)的使用在測試輻照之前24小時(shí)用新鮮的培養(yǎng)基飼喂置于100mm組織培養(yǎng)皿(70-80％匯合)中的體外人表皮組織(0.63cm2大小)或單層培養(yǎng)物。將測試成分樣品在UV輻照之前1小時(shí)在培養(yǎng)基中稀釋，或者對于組織局部施用于模型。
對于單層培養(yǎng)物的輻照，在即將進(jìn)行UV輻照之前(例如大約5分鐘)從培養(yǎng)皿中傾出可用的細(xì)胞培養(yǎng)基。在組織中，通過鹽水(生理的)洗滌從局部施用部分中去除任何過量的材料以避免與UV射線的直接相互作用。在受到UV輻射之后，對于每一次處理使用三個(gè)組織/單層培養(yǎng)物，包括未處理的對照(只含有培養(yǎng)基)、經(jīng)UV處理的(UV對照)和未處理的/非UV對照(基線)。將組織于-80℃冷凍貯存直至RNA的分離。
使用Clontech Nucleospin RNA II純化試劑盒(ClontechLaboratories公司，Palo Alto，CA)從細(xì)胞培養(yǎng)物或組織(組織模型)中分離總RNA。將組織模型用商業(yè)勻漿器進(jìn)行勻漿或者在液氮存在的情況下用研缽和研杵進(jìn)行研磨。經(jīng)勻漿的組織模型或單層細(xì)胞培養(yǎng)物用試劑盒的供應(yīng)廠商所提供的裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解，然后將結(jié)果所得的經(jīng)裂解的材料移液至均質(zhì)的懸浮液中。(如果細(xì)胞懸浮液由于存在一些剩余的完整細(xì)胞或顆粒而混濁，或者由于基因組DNA而非常粘稠，可用Nucleospin過濾單元(Clontech Laboratories公司，Palo Alto，CA)過濾該樣品)。將制備好的DNA酶I反應(yīng)混和物加入到Nucleospin柱上，并于室溫溫育15分鐘。在用所提供的緩沖液進(jìn)行幾次洗滌之后，將Nucleospin過濾管置于1.5-ml管中，并同時(shí)用不含核酸酶的水洗脫RNA。使用UV光譜法測量RNA的純度和收率，并測定260nm/280nm的吸光度比率。也要用本領(lǐng)域中通常已知的變性瓊脂糖凝膠電泳來檢查RNA的純度和完整性。
對于每一個(gè)測量的終點(diǎn)，使用10-20μg的總RNA用于雜交?？俁NA可用Clontech Atlas熒光標(biāo)記試劑盒(Clontech Laboratories)和Cy3與Cy5標(biāo)記(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)進(jìn)行標(biāo)記，或者使用Atlas cDNA表達(dá)陣列試劑盒(Clontech Laboratories)并根據(jù)廠商提供的試劑盒說明書用33P或32P dATP(AmershamPharmacia)進(jìn)行放射性標(biāo)記。
將標(biāo)記的RNA涂布在用于雜交的載玻片(熒光標(biāo)記的RNA)或尼龍膜(放射性標(biāo)記的RNA)上，這是通過用試劑盒中所提供的相應(yīng)數(shù)量的雜交溶液稀釋RNA從而覆蓋載玻片或尼龍膜來進(jìn)行的。在溫育(大約16小時(shí))之后，根據(jù)廠商的說明用多種濃度的SSC緩沖液洗滌載玻片或膜。對于CY3/CY5標(biāo)記的載玻片，用干燥的氮?dú)飧稍镙d玻片并將其置于熒光基因陣列閱讀儀(Axon Instruments，F(xiàn)oster CA.，Genepix 4000B)中，該閱讀儀含有用于激發(fā)/發(fā)射Cy3和Cy5熒光標(biāo)記的激光。
對于放射性標(biāo)記的尼龍膜，在用磷成像儀(Molecular Dynamics公司，Sunnyvale，CA，STORM 840)進(jìn)行顯影之前將膜暴露于磷成像屏大約6-14天。使用Genepix 4000B掃描儀(Axon Instruments)提供的Genepix Pro 3.0軟件在熒光標(biāo)記的載玻片上進(jìn)行陣列分析，或者對于放射性標(biāo)記的尼龍膜使用AtlasImage 1.5(ClontechLaboratories)來進(jìn)行分析，并隨后用AtlasNavigator 1.0軟件(Clontech Laboratories)進(jìn)行附加的分析。例如，Genepix Pro 3.0使得能夠定量分析和比較來自載玻片微陣列的信號強(qiáng)度；AtlasImage1.5使得能夠定量分析和比較來自Atlas尼龍陣列的信號強(qiáng)度；使用Atlas Navigator用于基因簇分析，陣列數(shù)據(jù)的全面標(biāo)準(zhǔn)化，在線基因注釋，通過線形圖、條形圖、散布圖和規(guī)則的列表來呈現(xiàn)基因。
此處引用的所有專利、專利申請、發(fā)表的文章、摘要、書、參考手冊和摘要、GenBank序列編號被整體引用作為參考，從而更充分地描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的狀況。
由于在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下可以在上述主題中作出多種變化，因此意圖將上面的描述中包含的或者附加的權(quán)利要求中定義的所有主題解釋為本發(fā)明的描述性和說明性部分。根據(jù)上面的教導(dǎo)，對本發(fā)明的許多修飾和變化是可能的。
權(quán)利要求
1.包含至少一個(gè)基因的標(biāo)記基因組，所述基因是通過受到紫外輻射之后其表達(dá)水平相對于未受到紫外輻射的表達(dá)水平發(fā)生改變而鑒定的，該標(biāo)記基因組選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；其獨(dú)特的片段；和其組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記基因組，其中在受到紫外輻射之后至少一個(gè)基因表達(dá)發(fā)生的改變包括(i)與對照表達(dá)水平相比較至少大約1.5倍的表達(dá)水平，(ii)與對照相比較離平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差或更多標(biāo)準(zhǔn)偏差。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的標(biāo)記基因組，其中對照包括下列中的一種或多種(i)在未受到紫外輻射的情況下所述至少一個(gè)標(biāo)記基因的基因表達(dá)水平；或(ii)在紫外輻射被阻斷或減弱的情況下所述至少一個(gè)標(biāo)記基因的基因表達(dá)水平。
4.評測化合物或材料的紫外輻射保護(hù)、修復(fù)和/或醫(yī)療效用的方法，其包括(a)將皮膚或皮膚替代物與待評測的測試化合物或材料接觸；(b)將經(jīng)接觸的皮膚或皮膚替代物暴露于紫外輻射源；和(c)與對照的基因表達(dá)水平相比較來評估在經(jīng)接觸的皮膚或皮膚替代物受到紫外輻射之后測試化合物或材料是否能夠調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的基因表達(dá)；其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；和其組合；其中測試化合物或材料相對于對照調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的基因表達(dá)的能力表明該化合物或材料具有紫外輻射保護(hù)、修復(fù)和/或醫(yī)療效用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中皮膚替代物選自人和非人器官型皮膚模型或者人和非人培養(yǎng)細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中對照包括下列中的一種或多種(i)未受到紫外輻射的相同或不同的皮膚或皮膚替代物；(ii)相同或不同的皮膚或皮膚替代物，其中紫外輻射被阻斷或減弱；或(iii)在無該化合物或材料的情況下受到紫外輻射的相同或不同的皮膚或皮膚替代物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中(a)的接觸步驟包括將測試化合物或材料局部施用到皮膚或皮膚替代物或者其區(qū)域上。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在受到紫外輻射之后皮膚或皮膚替代物的一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)水平選自(i)與對照表達(dá)水平相比較至少大約1.5倍，或(ii)與對照表達(dá)水平相比較離平均值大約2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差或更多標(biāo)準(zhǔn)偏差。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物受到紫外輻射的時(shí)間選自大約5分鐘至大約96小時(shí)；大約1小時(shí)至大約72小時(shí)；大約4小時(shí)至大約32小時(shí)，大約5分鐘至大約48小時(shí)，或大約5分鐘至大約1小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于大約1MED至大約4MED的最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中評估通過選自下列的檢驗(yàn)方法來進(jìn)行微陣列、Northern印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)、反向聚合酶鏈反應(yīng)、基因表達(dá)的系列分析和差異展示。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中按照以下條件重復(fù)這些步驟(i)延長暴露于紫外輻射源的時(shí)間，或(ii)以不同時(shí)間暴露于紫外輻射源。
14.通過根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法確定的具有紫外輻射保護(hù)、修復(fù)或醫(yī)療效用的化合物或材料。
15.具有紫外輻射保護(hù)、修復(fù)或醫(yī)療效用的化合物或材料，其中與對照的基因表達(dá)相比較該化合物或材料可在皮膚或皮膚替代物受到紫外輻射之后調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的基因表達(dá)的改變；其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；和其組合；并且，其中測試化合物或材料相對于對照調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中所述至少一個(gè)基因的基因表達(dá)改變的能力表明該化合物或材料具有紫外輻射保護(hù)、修復(fù)和/或醫(yī)療效用。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的化合物或材料，其為營養(yǎng)補(bǔ)充物。
17.改善和/或治療光損傷或光老化的皮膚的方法，其包括將含有有效劑量的可調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因表達(dá)的材料的組合物施用于皮膚或其區(qū)域并保持一段有效的時(shí)間，其中所述標(biāo)記基因的表達(dá)在皮膚受到紫外輻射之后發(fā)生改變；以可調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因表達(dá)的有效劑量施用該組合物，其中所述標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；和其組合。
18.恢復(fù)和/或修復(fù)光損傷或光老化的皮膚的方法，其包括將含有有效劑量的可調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因表達(dá)的材料的組合物施用于皮膚或其區(qū)域并保持一段有效的時(shí)間，其中所述標(biāo)記基因的表達(dá)在皮膚受到紫外輻射之后會發(fā)生改變；在受到紫外輻射之后以可調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中所述至少一個(gè)基因表達(dá)的有效劑量施用該組合物，所述標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；和其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的方法，其中每天施用該組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的方法，其中施用該組合物2-4個(gè)星期。
21.評測一種物質(zhì)是否能夠修復(fù)或恢復(fù)與受到紫外輻射有關(guān)的光損傷或光老化效應(yīng)的方法，其包括(a)將選自皮膚或皮膚替代物的測試材料暴露于紫外輻射源，其中暴露于紫外輻射源會導(dǎo)致與對照相比較在受到紫外輻射之后測試材料的一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生改變；該標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；所述標(biāo)記基因的獨(dú)特亞片段；和其組合；(b)將待測的物質(zhì)與已經(jīng)暴露于紫外輻射源的測試材料接觸；和(c)評估待測的物質(zhì)是否能夠調(diào)節(jié)受到紫外輻射的測試材料的一組標(biāo)記基因中所述至少一個(gè)基因的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致受到紫外輻射的測試材料的基因表達(dá)水平能夠反映或達(dá)到對照的基因表達(dá)水平；其中該物質(zhì)調(diào)節(jié)受到紫外輻射的測試材料的一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)水平的能力表明該物質(zhì)能夠在測試材料上修復(fù)或恢復(fù)紫外輻射的影響，因此可修復(fù)或恢復(fù)與受到紫外輻射相關(guān)的皮膚光損傷或光老化效應(yīng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中皮膚替代物選自人和非人器官型皮膚模型或者人和非人培養(yǎng)細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中對照包括下列中的一種或多種(i)未受到紫外輻射的相同或不同的皮膚或皮膚替代物；(ii)相同或不同的皮膚或皮膚替代物，其中紫外輻射被阻斷或減弱；或(iii)在無所述物質(zhì)的情況下受到紫外輻射的相同或不同的皮膚或皮膚替代物。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物受到紫外輻射的時(shí)間選自大約5分鐘至大約96小時(shí)；大約1小時(shí)至大約72小時(shí)；大約4小時(shí)至大約32小時(shí)，大約5分鐘至大約48小時(shí)，或大約5分鐘至大約1小時(shí)。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于大約1MED至大約4MED的最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于大約1MED至大約4MED的最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源，并持續(xù)大約5分鐘至大約48小時(shí)。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中評估通過選自下列的檢驗(yàn)方法來進(jìn)行微陣列、Northern印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)、反向聚合酶鏈反應(yīng)、基因表達(dá)的系列分析和差異展示。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中按照以下條件重復(fù)所述步驟(i)延長暴露于紫外輻射源的時(shí)間，或(ii)以不同時(shí)間暴露于紫外輻射源。
30.通過根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法確定的具有皮膚光損傷或光老化修復(fù)或恢復(fù)效用的物質(zhì)或材料。
31.具有皮膚光損傷或光老化修復(fù)或恢復(fù)效用的物質(zhì)或材料，其中該物質(zhì)或材料可調(diào)節(jié)受到紫外輻射的皮膚的一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的基因表達(dá)水平改變，從而導(dǎo)致受到紫外輻射的皮膚的基因表達(dá)水平能夠反映或達(dá)到未受到紫外輻射或者阻斷或減弱了所受紫外輻射的對照的基因表達(dá)水平，因此可修復(fù)或恢復(fù)與受到紫外輻射相關(guān)的皮膚光損傷或光老化效應(yīng)，該組標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；和其組合。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31所述的物質(zhì)或材料，其為營養(yǎng)補(bǔ)充物。
33.含有根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31所述的物質(zhì)或材料的組合物或制劑。
34.光保護(hù)性或治療性抗光損傷或抗光老化制劑，其含有通過根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法確定的化合物或材料。
35.評測在受到紫外輻射之后紫外輻射引起的皮膚或皮膚替代物損傷的方法，其包括(a)評估在皮膚或皮膚替代物受到紫外輻射之后一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的基因表達(dá)水平，其中該標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；這些標(biāo)記基因的獨(dú)特亞片段；和其組合；和(b)比較來自(a)的至少一個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)水平和對照的表達(dá)水平，該對照是(i)未受到紫外輻射，或(ii)其中對照所受的紫外輻射被阻斷或減弱，從而確定與對照的基因表達(dá)水平相比較至少一個(gè)標(biāo)記基因的基因表達(dá)水平是否發(fā)生了改變；其中標(biāo)記基因組中所述至少一個(gè)標(biāo)記基因相對于對照的表達(dá)水平改變選自(i)與對照表達(dá)水平相比較至少大約1.5倍，或(ii)與對照表達(dá)水平相比較偏離平均值大約2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差或更多標(biāo)準(zhǔn)偏差，接著使其與紫外輻射引起的皮膚或皮膚替代物的損傷相關(guān)聯(lián)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中皮膚替代物選自人和非人器官型皮膚模型或者人和非人培養(yǎng)細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物受到紫外輻射的時(shí)間選自大約5分鐘至大約96小時(shí)；大約1小時(shí)至大約72小時(shí)；大約4小時(shí)至大約32小時(shí)，大約5分鐘至大約48小時(shí)，或大約5分鐘至大約1小時(shí)。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于大約1MED至大約4MED的最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中皮膚或皮膚替代物暴露于大約1MED至大約4MED的最小紅斑劑量(MED)的紫外輻射源，并持續(xù)大約5分鐘至大約48小時(shí)。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中該方法通過選自下列的檢驗(yàn)方法來進(jìn)行微陣列、Northern印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)、反向聚合酶鏈反應(yīng)、基因表達(dá)的系列分析和差異展示。
42.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中按照以下條件重復(fù)所述步驟(i)延長暴露于紫外輻射源的時(shí)間，或(ii)以不同時(shí)間暴露于紫外輻射源。
43.預(yù)防光老化和/或光損傷的皮膚的方法，其包括將一種或多種成分以對于調(diào)節(jié)一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)水平改變有效的濃度施用于皮膚，所述標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；和EB1微管伴隨蛋白，其中將所述一種或多種成分以有效的一段時(shí)間施用于皮膚。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述一段時(shí)間選自每天或者大約1-4個(gè)星期。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中治療、預(yù)防或改善皮膚的光老化。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中治療、預(yù)防或改善皮膚的光損傷。
47.鑒定或篩選那些在受到紫外輻射之后容易造成皮膚光損傷或光老化或者對于皮膚光損傷或光老化高度敏感的個(gè)體的方法，其包括(a)將來自待測試或待篩選的個(gè)體的皮膚樣品暴露于UV輻射；和(b)確定與對照相比較受到UV輻射的皮膚內(nèi)的一組標(biāo)記基因中至少一個(gè)基因的表達(dá)是否發(fā)生了改變，該對照是(i)未受到紫外輻射，或(ii)其所受的紫外輻射被阻斷或減弱；該標(biāo)記基因選自Ras相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；所述至少一個(gè)標(biāo)記基因的獨(dú)特序列；和其組合；其中至少一個(gè)標(biāo)記基因的基因表達(dá)改變的確定可將個(gè)體鑒定為容易形成皮膚的光損傷或光老化或者對于皮膚的光損傷或光老化高度敏感。
48.用于評估物質(zhì)的抗光損傷或抗光老化特性的試劑盒，其包括含有選自下列至少一個(gè)的標(biāo)記基因組的支持材料，所述標(biāo)記基因?yàn)镽as相關(guān)蛋白RAB-7；Corneodesmosin；雙調(diào)蛋白；粒細(xì)胞趨化蛋白；移動抑制因子MRP8(鈣粒蛋白A)；移動抑制因子MRP14(鈣粒蛋白B)；Ephrin受體；上皮細(xì)胞激酶(ECK)；shb原癌基因；MAD轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白；鈣蛋白酶；白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)；胎盤纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-2)；β-防衛(wèi)素(人β-防衛(wèi)素2(HBD2)和人β-防衛(wèi)素3(HBD3))；α1抗胰蛋白酶前體；Tristetraproline；生長因子誘導(dǎo)型核蛋白475；干擾素調(diào)節(jié)因子(IFR家族)；核因子1；hSNF2轉(zhuǎn)錄激活劑；胸腺素原；GATA3轉(zhuǎn)錄因子；組氨酸脫羧酶；乙酰輔酶A結(jié)合蛋白；核心蛋白聚糖；CD44抗原；B94蛋白；運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)(前白蛋白)；載脂蛋白E；上皮網(wǎng)柄菌素受體；凝血酶受體；絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶；白細(xì)胞抗原相關(guān)蛋白(LAR)；細(xì)胞色素p450 IVB1；硫氧還蛋白過氧化物酶；豆蔻基化的富含丙氨酸的C激酶底物，MacMARCKS(MRP)；EB1微管伴隨蛋白；所述至少一個(gè)標(biāo)記基因的獨(dú)特序列；和其組合；其中所述至少一個(gè)標(biāo)記基因固定在支持材料上；并且所述試劑盒可選地含有核酸探針、檢測標(biāo)記、緩沖液、對照和使用說明。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中支持材料選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、塑料薄膜或載玻片。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的試劑盒，其中用該試劑盒進(jìn)行的檢驗(yàn)為微陣列。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于治療和/或評測由于受到太陽紫外(UV)輻射所造成的皮膚的光損傷和/或光老化。該方法使用一組獨(dú)特的標(biāo)記基因，新近發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)會在皮膚受到UV輻射之后而改變。本發(fā)明提供了一種有利的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于鑒定和評估能夠調(diào)節(jié)(例如減弱)UV輻射引起的至少一個(gè)新近提供的皮膚中標(biāo)記基因表達(dá)的改變或變化的物質(zhì)，這種表達(dá)的改變或變化是相對于沒有受到UV輻射的皮膚中的基因表達(dá)水平來說的。本發(fā)明還提供了含有當(dāng)施用于皮膚時(shí)能夠在皮膚受到UV輻射之后調(diào)節(jié)標(biāo)記基因組中至少一個(gè)基因的基因表達(dá)的材料的組合物，因此提供了對于光損傷和光老化的保護(hù)和醫(yī)療效用以及治療?？梢杂帽痉椒▉碓u估例如皮膚護(hù)理、頭發(fā)護(hù)理、美容和個(gè)人護(hù)理試劑以及營養(yǎng)補(bǔ)充物作為具有抗光損傷和/或抗光老化特性的材料的潛在益處。
文檔編號C12Q1/68GK1518604SQ02810842
公開日2004年8月4日 申請日期2002年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月9日
發(fā)明者B·C·瓊斯, B C 瓊斯, C·伯斯克, 箍, K·庫奧伯, 虜, T·麥科考米克, 瓶濟(jì)卓 申請人:克利夫蘭大學(xué)醫(yī)院