芳族甲基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用的制作方法

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專利名稱：：芳族甲基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物遺傳學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及與生育酚生物合成通路相關(guān)的基因，即編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的基因，及其這些基因的用途。生育酚是哺乳動(dòng)物飲食中的一種重要組分。流行病學(xué)調(diào)查表明添加生育酚可以使罹患心血管疾病和癌癥的機(jī)率降低，可以增強(qiáng)免疫功能，還可以預(yù)防或延緩大量人體退行性疾病進(jìn)程(Traber和Sies，Annu.Rev.Nutr.16321-347(1996))。生育酚部分地通過穩(wěn)定生物膜的脂雙層(Skrypin和Kagan，Biochim.Biophys.Acta815209(1995)；Kagan，N.Y.Acad.Sci.p121，(1989)；Gomez-Fernandez等，Ann.N.Y.Acad.Sci.p109(1989))、還原脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸(PUFA)自由基(Fukuzawa等，Lipids17511-513(1982))，清除氧自由基、脂質(zhì)過氧基以及單線態(tài)氧類(Diplock等，Ann.NYAcad.Sci.57072(1989)；Fryer，PlantCellEnviron.15(4)381-392(1992))起作用。α-生育酚通常又被稱作維生素E，屬于一類脂溶性抗氧化劑，后者包括α，β，γ和δ-生育酚以及α，β，γ和δ-生育三烯酚。盡管α，β，γ和δ-生育酚以及α，β，γ和δ-生育三烯酚有時(shí)合稱作“維生素E”，但維生素E在化學(xué)上更恰當(dāng)?shù)亩x是指α-生育酚。維生素E或α-生育酚對(duì)人體健康很重要，部分是因?yàn)樗谌梭w內(nèi)容易吸收和保留，因而比其他生育酚類具有更高的生物活性(Traber和Sies，Annu.Rev.Nutr.16321-347(1996))。然而，其他的生育酚如β，γ和δ-生育酚也有重要的健康和營養(yǎng)價(jià)值。生育酚主要由植物及有光合作用的其他生物(包括藍(lán)細(xì)菌)合成。因此，哺乳動(dòng)物飲食中的生育酚幾乎都是從這些來源獲得的。植物組織在總的生育酚含量及生育酚的組成上有很大的不同。在綠色、光合植物組織中主要是α-生育酚。每克新鮮的葉組織可含有10-50μg的總生育酚，但世界主要農(nóng)作物(如稻、玉米、小麥、土豆)中的多數(shù)僅產(chǎn)生少量或極少量的總生育酚，其中又僅有一小部分為α-生育酚(Hess，高等植物中的維生素E、α-生育酚及抗氧化劑，R.Alscher和J.Hess，Eds.，CRCPress，BocaRaton.pp.111-134(1993))。油籽作物通常含有較多的總生育酚，但在多數(shù)油籽中僅有一小部分為α-生育酚(Taylor和Barnes，ChemyInd.，Oct722-726(1981))。從普通的美國飲食中，要達(dá)到每天攝取15-30mg維生素E的建議量是很困難的。例如，要達(dá)到建議的每天維生素E的攝取量，需要消耗超過750克的菠菜葉，其中α-生育酚占總生育酚的60％，或者200-400克的大豆油。盡管可以在飲食中加入添加劑，但多數(shù)添加劑含有的主要是合成的維生素E，其中含有8個(gè)立體異構(gòu)體，而天然維生素E主要由單一異構(gòu)體組成。而且，添加劑相對(duì)來說比較昂貴，普通人群不會(huì)進(jìn)行常規(guī)使用。因此，需要尋找組合物和方法，來提高植物來源的生育酚的總量或提高其中α-生育酚所占的相對(duì)百分比。生育酚除對(duì)健康有利外，農(nóng)作物生育酚水平的提高還可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)植物產(chǎn)品的貨架期(Peterson，Cereal-Chem.72(1)21-24(1995)；Ball，食品分析中的脂溶性維生素分析，綜述，London，ElsevierSciencePublishersLtd.(1988))。而且，已證明豬、牛及家禽飼料中生育酚的添加可以大大提高肉的質(zhì)量，并通過延緩加工后脂質(zhì)的氧化來延長(zhǎng)加工后肉制品的貨架期。加工后脂質(zhì)氧化會(huì)產(chǎn)生具有不良?xì)馕兜慕M分(Sante和Lacourt，J.Sci.FoodAgric.65(4)503-507(1994)；Buckley等，J.ofAnimalScience733122-3130(1995))。生育酚的生物合成高等植物的質(zhì)體通過相互關(guān)聯(lián)的生化通路，產(chǎn)生包括生育酚在內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物。高等植物生育酚的生物合成通路涉及尿黑酸及葉綠基焦磷酸的縮合，以形成2-甲基葉綠基質(zhì)體醌(methylphytylplastoquinol)(Fiedler等，Planta155511-515(1982)；Soll等，Arch.Biochem.Biophys.204544-550(1980)；Marshall等，Phytochem.241705-1711(1985))。這種植物生育酚通路可分為四部分1)尿黑酸(HGA)的合成，為生育酚提供芳香環(huán)；2)葉綠基焦磷酸的合成，為生育酚提供側(cè)鏈；3)HGA和葉綠基焦磷酸經(jīng)由異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，隨后環(huán)化；4)芳香環(huán)的S-腺苷蛋氨酸依賴性的甲基化，這一步影響每類生育酚的相對(duì)豐度。參見圖1。下表列出了生育酚生物合成中涉及的各種基因及其編碼蛋白。如本文所用，尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(HPT)，葉綠基異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(PPT)，slr1736以及ATPT2指的是具有相同酶活性的蛋白或編碼蛋白的基因。尿黑酸的合成尿黑酸是生育酚和質(zhì)體醌共有的前體。在至少一些細(xì)菌，尿黑酸的生物合成要經(jīng)過如下步驟分支酸轉(zhuǎn)換成代丙酮酸，再經(jīng)由雙功能代丙酮酸脫氫酶作用生成對(duì)羥苯基丙酮酸。雙功能細(xì)菌代丙酮酸脫氫酶的例子包括由草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)和大腸桿菌的tyrA基因編碼的蛋白。TyrA基因產(chǎn)物催化從分支酸到代丙酮酸的產(chǎn)生以及隨后的代丙酮酸脫氫生成對(duì)羥苯基丙酮酸(p-HPP)，p-HPP是尿黑酸的直接前體。然后，p-HPP在羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)作用下轉(zhuǎn)換成尿黑酸。與此相反，植物缺乏代丙酮酸脫氫酶活性，因此，通常認(rèn)為，從分支酸到尿黑酸的合成要經(jīng)過中間體arogenate(酪氨酸前體)的合成和轉(zhuǎn)換。由于尿黑酸合成涉及的通路也參予酪氨酸的形成，所以這些通路的任何改變也會(huì)引起酪氨酸及其他芳香族氨基酸合成的改變。葉綠基焦磷酸的合成生育酚是異戊二烯類化合物家族的一個(gè)成員。其他異戊二烯類包括類胡蘿卜素、赤霉素、萜烯、葉綠素和脫落酸。異戊二烯類生成的一個(gè)中間中間體是異戊烯基雙磷酸(IPP)。關(guān)于胞漿和質(zhì)體產(chǎn)生IPP的通路已有報(bào)道。胞漿通路涉及乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMG輔酶A合成酶、HMG輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。最近，Rohmer和Arigoni研究小組的研究證據(jù)表明，存在另外一種質(zhì)體的異戊二烯類生物合成通路(Eisenreich等，Chem.Bio.，5R221-R233(1998)；Rohmer，Prog.Drug.Res.，50135-154(1998)；Rohmer，ComprehensiveNaturalProductsChemistry，Vol.2，pp.45-68，Barton和Nakanishi(eds.)，PergamonPress，Oxford，England(1999))。他們?cè)趯?duì)某些真細(xì)菌和植物的萜類化合物的研究中發(fā)現(xiàn)，同位素標(biāo)記的結(jié)果按照甲羥戊酸通路無法解釋。Arigoni及其同事隨后發(fā)現(xiàn)1-脫氧木酮糖或其衍生物是新通路的中間體，新通路現(xiàn)在被稱為MEP通路(Rohmer等，Biochem.J.，295517-524(1993)；Schwarz，Ph.D.thesis，Eidgen_ssicheTechnischeHochschule，Zurich，Switzerland(1994))。最近的研究表明，通過一種dxs基因編碼的酶(Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，952105-2110(1997)；和Lange等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，952100-2104(1998))可以從各一分子的甘油醛3-磷酸(Rohmer，ComprehensiveNaturalProductsChemistry，Vol.2，pp.45-68，Barton和Nakanishi，eds.，PergamonPress，Oxford，England(1999))和丙酮酸(Eisenreich等，Chem.Biol.，5R223-233(1998)；Schwarzsupra；Robmer等，J.Am.Chem.Soc.，1182564-2566(1996)；和Sprenger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412857-12862(1997))形成1-脫氧木酮糖5-磷酸(Broers，Ph.D.thesis(Eidgen_ssicheTechnischeHochschule，Zurich，Switzerland)(1994))。1-脫氧木酮糖5-磷酸可進(jìn)一步被dxr基因編碼的還原異構(gòu)酶(Bouvierelal.，PlantPhysiol，1171421-1431(1998)；和Rohdich等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611758-11763(1999))轉(zhuǎn)換成2-C-甲基赤蘚醇4-磷酸(Arigoni等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9410600-10605(1997))。已報(bào)道的MEP通路涉及的基因還包括ygbP和ygbB。其中，ygbP催化2-C-甲基赤蘚醇4-磷酸轉(zhuǎn)換成各自的胞苷焦磷酸衍生物，ygbB催化4-磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇轉(zhuǎn)換成2C-甲基-D-赤蘚醇，3，4-環(huán)磷酸鹽。這些基因在大腸桿菌基因組上緊密連接(Herz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97(6)2485-2490(2000))。一旦IPP通過MEP通路形成，就在GGDP合成酶的作用下，轉(zhuǎn)換成GGDP，進(jìn)一步變成葉綠基焦磷酸，后者是生育酚側(cè)鏈的核心組分。結(jié)合和環(huán)化尿黑酸通過葉綠基/異戊烯基轉(zhuǎn)移酶與葉綠基-焦磷酸或solanyl焦磷酸結(jié)合，分別形成2-甲基葉綠基質(zhì)體醌或2-甲基solanyl質(zhì)體醌。2-甲基solanyl質(zhì)體醌是質(zhì)體醌生物合成的前體，而2-甲基葉綠基質(zhì)體醌最終轉(zhuǎn)換成生育酚。芳香環(huán)的甲基化各種生育酚亞型主要結(jié)構(gòu)的區(qū)別在于苯環(huán)周圍甲基的位點(diǎn)。2-甲基葉綠基質(zhì)體醌和2-甲基solanyl質(zhì)體醌都是植物2-甲基葉綠基質(zhì)體醌和2-甲基solanyl質(zhì)體醌轉(zhuǎn)移酶(生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶2；甲基轉(zhuǎn)移酶2；MT2；tMT2)的底物，后者可以使生育酚前體甲基化。在γ生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(GMT)作用下，γ-生育酚5位點(diǎn)甲基化產(chǎn)生α-生育酚。生成α-生育酚的另一可能通路涉及在生育酚環(huán)化酶作用下，2-甲基葉綠基質(zhì)體醌環(huán)化而產(chǎn)生δ-生育酚。δ-生育酚在GMT作用下，5位點(diǎn)甲基化轉(zhuǎn)換成β-生育酚。δ-生育酚在tMT2作用下，3位點(diǎn)甲基化，然后在GMT作用下，5位點(diǎn)甲基化轉(zhuǎn)換成α-生育酚。還有一種可能是β-生育酚在tMT2作用下，3位點(diǎn)甲基化直接轉(zhuǎn)換成α-生育酚(參見，例如BiochemicalSocietyTransactions，11504-510(1983)；植物生化入門，第二版，11章(1983)；維生素激素，29153-200(1971)；BiochemicalJournal，109577(1968)；和BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication，28(3)295(1967))。由于產(chǎn)生α-生育酚的所有主要機(jī)制都涉及tMT2的催化，所以這一活性缺陷的植物體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)β和δ-生育酚的堆積，而這一活性增強(qiáng)的植物體內(nèi)則會(huì)出現(xiàn)α和γ-生育酚的堆積。由于許多植物的的種子沒有GMT活性，所以這些植物會(huì)積累γ-生育酚。因此有必要尋找編碼與生育酚生物合成相關(guān)的酶的核酸分子，以及增強(qiáng)或改變植物生育酚產(chǎn)生的相關(guān)的酶和抗體，并進(jìn)一步發(fā)展表達(dá)生育酚生物合成相關(guān)核酸分子的轉(zhuǎn)基因生物，后者可以加強(qiáng)食品和飼料的營養(yǎng)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明包括并提供編碼tMT2酶的基本純化的核酸分子。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的核酸分子，其中包含選自SEQIDNOs1和2的核苷酸序列。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的核酸分子，其中包含選自SEQIDNOs3-7的核苷酸序列。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的核酸分子，其中包含選自SEQIDNOs8-14的核苷酸序列。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的核酸分子，其編碼一種具有2-甲基葉綠基質(zhì)體醌(Methylphytylplastoquinol)甲基轉(zhuǎn)移酶活性的植物多肽分子。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的具有2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶活性的植物多肽分子。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的突變多肽分子，其相對(duì)于非突變多肽來講，具有改變的2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的多肽分子，其中包含選自SEQIDNOs16和28的氨基酸序列。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的多肽分子，其中包含選自SEQIDNOs17-21以及29-32的氨基酸序列。本發(fā)明包括并提供一種基本純化的多肽分子，其中包含選自SEQIDNOs22-27和33-38的氨基酸序列。本發(fā)明包括并提供一種能與一種多肽特異結(jié)合的抗體，該多肽包含選自SEQIDNOs16-38的氨基酸序列。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，該導(dǎo)入的核酸分子包含一種選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，該導(dǎo)入的核酸分子編碼一種多肽分子，所述多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28和33-38的氨基酸序列。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，該導(dǎo)入的核酸分子編碼一種多肽分子，其中多肽分子包含選自SEQIDNOs17-21和29-32的氨基酸序列。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含一種選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736，HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH等，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物(ortholog)和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子編碼一種多肽分子，該多肽分子包含一種選自SEQIDNOs16，22-28，33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736，HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH等，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含一種選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子編碼一種多肽分子，該多肽分子包含一種選自SEQIDNOs16，22-28，33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列。本發(fā)明包括并提供一種降低植物tMT2基因表達(dá)的方法，其包括A)用一種核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中的核酸分子具有導(dǎo)入的啟動(dòng)子區(qū)域，能在植物細(xì)胞引起mRNA分子的產(chǎn)生，其中的啟動(dòng)子區(qū)域與具有轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈的轉(zhuǎn)錄的核酸分子相連接，其中的轉(zhuǎn)錄鏈與包含選自SEQIDNOs1-15的核酸序列的核酸分子互補(bǔ)，其中轉(zhuǎn)錄的核酸分子與3’非翻譯序列相連，后者在植物細(xì)胞會(huì)引起轉(zhuǎn)錄的終止以及在mRNA序列3’端添加聚腺苷酸化核糖核苷酸；B)培育轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括并提供包含核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，所述核酸分子包含導(dǎo)入的啟動(dòng)子區(qū)域，所述啟動(dòng)子在植物中引起mRNA分子產(chǎn)生，它與具有轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈的轉(zhuǎn)錄的核酸分子相連接，其中的轉(zhuǎn)錄鏈與包含選自SEQIDNOs1-15的核酸序列的核酸分子互補(bǔ)，其中所述轉(zhuǎn)錄的核酸分子與3’非翻譯序列相連，后者在植物細(xì)胞會(huì)引起轉(zhuǎn)錄的終止以及在mRNA序列3’端添加聚腺苷酸化核糖核苷酸。本發(fā)明包括并提供一種產(chǎn)生植物的方法，該植物的種子中γ-生育酚的含量較高，所述方法包括A)用一種導(dǎo)入的核酸分子轉(zhuǎn)化上述植物，其中的核酸分子包含編碼一種多肽分子的序列，其中的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28，33-38的氨基酸序列；B)培育轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括并提供一種產(chǎn)生一種植物的方法，該植物的種子中γ-生育酚的含量較高，具體包括A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物，其中所述第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736，HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體；B)培育轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括并提供一種產(chǎn)生一種植物的方法，該植物的種子中γ-生育酚的含量較高，具體包括A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化上述植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含一段序列，該序列編碼一種多肽分子，該多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28，33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736，HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體；B)培育轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括并提供一種產(chǎn)生一種植物的方法，該植物的種子中α-生育酚的含量較高，具體包括A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化上述植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含一種選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列；B)培育轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括并提供一種產(chǎn)生一種植物的方法，該植物的種子中α-生育酚的含量較高，具體包括A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化上述植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含一段序列，該序列編碼一種多肽分子，該多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28，33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列；B)培育轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括并提供一種種子，其來源于一種包含導(dǎo)入核酸分子的植物，其中的核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列。本發(fā)明包括并提供一種種子，其來源于一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736，HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH等，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。本發(fā)明包括并提供一種種子，其來源于一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入第一核酸分子、第二核酸及第三核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列，導(dǎo)入的第三核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736，HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH等，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入第一核酸分子、第二核酸及第三核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子編碼一種多肽分子，該多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28，33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列，導(dǎo)入的第三核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1、HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH等及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。本發(fā)明包括并提供一種包含導(dǎo)入第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中的第一核酸分子編碼tMT2酶，第二核酸分子編碼GMT酶。本發(fā)明包括并提供一種產(chǎn)生一種植物的方法，該植物的種子中α-生育酚的含量較高，所述方法包括A)用編碼tMT2酶的核酸分子和編碼GMT酶的核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物；B)培育所述植物。核酸和氨基酸序列簡(jiǎn)述SEQIDNO1提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼一種野生型擬南芥Columbia生態(tài)型的tMT2酶。SEQIDNO2提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼一種野生型擬南芥Landsberg生態(tài)型的tMT2酶。SEQIDNO3提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼擬南芥Landsberg生態(tài)型的tMT2酶的hdt2突變。SEQIDNO4提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼擬南芥Columbia生態(tài)型的tMT2酶的hdt6突變。SEQIDNO5提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼擬南芥Columbia生態(tài)型的tMT2酶的hdt9突變。SEQIDNO6提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼擬南芥Landsberg生態(tài)型的tMT2酶的hdt10突變。SEQIDNO7提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼擬南芥Columbia生態(tài)型的tMT2酶的hdt16突變SEQIDNO8提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼玉米的tMT2酶。SEQIDNO9提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼陸地棉(Gossypiumhirsutum)的tMT2酶。SEQIDNO10提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼韭蔥(Alliumporrum)的tMT2酶。SEQIDNO11提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼大豆的tMT2酶。SEQIDNO12提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼稻的tMT2酶。SEQIDNO13提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼歐洲油菜(Brassicanapus)的tMT2酶。SEQIDNO14提供了一種DNA分子的核酸序列，該DNA分子編碼一種與SEQIDNO13序列不同的歐洲油菜的tMT2酶。SEQIDNO15提供一種野生型擬南芥tMT2酶的核酸編碼序列。SEQIDNO16提供野生型擬南芥Columbia和Landsberg生態(tài)型的tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO17提供野生型擬南芥Landsberg生態(tài)型hdt2突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO18提供野生型擬南芥Columbia生態(tài)型hdt6突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO19提供野生型擬南芥Columbia生態(tài)型hdt9突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO20提供野生型擬南芥Landsberg生態(tài)型hdt10突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO21提供野生型擬南芥Columbia生態(tài)型hdt16突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO22提供玉米tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO23提供陸地棉tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO24提供韭蔥tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO25提供大豆tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO26提供稻tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO27提供歐洲油菜tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO28提供一種成熟的野生型擬南芥Columbia生態(tài)型tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO29提供一種成熟的野生型擬南芥Landsberg生態(tài)型hdt2突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO30提供一種成熟的野生型擬南芥Columbia生態(tài)型hdt6突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO31提供一種成熟的野生型擬南芥Landsberg生態(tài)型hdt10突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO32提供一種成熟的野生型擬南芥Columbia生態(tài)型hdt16突變株tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO33提供一種成熟的歐洲油菜tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO34提供一種成熟的稻tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO35提供一種成熟的玉米tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO36提供一種成熟的大豆tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO37提供一種成熟的韭蔥tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO38提供一種成熟的陸地棉tMT2酶的氨基酸序列。SEQIDNO39提供一種編碼擬南芥γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO40提供一種編碼擬南芥Columbia生態(tài)型γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO41提供一種編碼稻γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO42提供一種編碼玉米γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO43提供一種編碼陸地棉γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO44提供一種編碼pulcherrium萼距花γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO45提供一種編碼歐洲油菜S8γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO46提供一種編碼歐洲油菜P4γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO47提供一種編碼番茄γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO48提供一種編碼大豆γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶1的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO49提供一種編碼大豆γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶2的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO50提供一種編碼大豆γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶3的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO51提供一種編碼萬壽菊γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶1的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO52提供一種編碼兩色蜀黍γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO53提供一種編碼點(diǎn)形念珠藻γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO54提供一種編碼魚腥藻γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的核酸序列。SEQIDNO55和56提供MAA21_40_1引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO57和58提供MAA21_40_2引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO59和60提供MAA21_40_3引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO61和62提供MAA21_40_4引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO63和64提供MAA21_40_5引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO65和66提供MAA21_40_6引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO67和68提供MAA21_40_7引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO69和70提供MAA21_40_8引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO71和72提供MAA21_40_9引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO73和74提供MAA21_40_10引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO75和76提供MAA21_40_11引物對(duì)的核酸序列。SEQIDNO77和78提供用于擴(kuò)增編碼一種成熟歐洲油菜tMT2酶的基因的引物的核酸序列。SEQIDNO79和80提供用于擴(kuò)增編碼一種成熟稻tMT2酶的基因的引物的核酸序列。SEQIDNO81和82提供用于擴(kuò)增編碼一種成熟玉米tMT2酶的基因的引物的核酸序列。SEQIDNO83和84提供用于擴(kuò)增編碼一種成熟大豆tMT2酶的基因的引物的核酸序列。SEQIDNO85和86提供用于擴(kuò)增編碼一種成熟韭蔥tMT2酶的基因的引物的核酸序列。SEQIDNO87和88提供用于擴(kuò)增編碼一種成熟陸地棉tMT2酶的基因的引物的核酸序列。SEQIDNO89和90提供用于擴(kuò)增編碼全長(zhǎng)擬南芥tMT2酶的基因的引物#17286和#17181的核酸序列。SEQIDNO91提供擬南芥γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO92提供擬南芥Columbia生態(tài)型γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO93提供稻γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO94提供玉米γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO95提供陸地棉γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO96提供pulcherrima萼距花γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO97提供歐洲油菜S8γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO98提供歐洲油菜P4γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO99提供番茄γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO100提供大豆γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶1的氨基酸序列。SEQIDNO101提供大豆γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶2的氨基酸序列。SEQIDNO102提供大豆γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶3的氨基酸序列。SEQIDNO103提供萬壽菊γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO104提供兩色蜀黍γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO105提供asiaticum百合γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO106提供點(diǎn)形念珠藻γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。SEQIDNO107提供魚腥藻γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶。SEQIDNO108提供圖3a和圖3b所示多肽對(duì)比中的氨基酸一致序列。附圖簡(jiǎn)述圖1是生育酚生物合成通路的圖解。圖2表示一些農(nóng)作物tMT2基因的核苷酸序列與擬南芥tMT2基因(NCBIGeneralIdentifierNumbergi7573324)的TBLASTN同源對(duì)比結(jié)果。圖3a和3b表示不同植物種類tMT2蛋白序列的PrettyAlignment結(jié)果。圖4描述重組表達(dá)的魚腥藻MT1甲基轉(zhuǎn)移酶活性(陽性對(duì)照)。酶活性通過攜帶pMON67174的大腸桿菌粗細(xì)胞提取物進(jìn)行檢測(cè)。圖5描述重組表達(dá)的成熟擬南芥tMT2甲基轉(zhuǎn)移酶活性。酶活性通過攜帶pMON67191的大腸桿菌粗細(xì)胞提取物進(jìn)行檢測(cè)。圖6描述重組表達(dá)的成熟擬南芥tMT2hdt2突變甲基轉(zhuǎn)移酶活性。酶活性通過攜帶pMON67207的大腸桿菌粗細(xì)胞提取物進(jìn)行檢測(cè)。圖7描述重組表達(dá)的魚腥藻MT1無2-甲基葉綠基質(zhì)體醌底物的甲基轉(zhuǎn)移酶活性(陰性對(duì)照)。酶活性通過攜帶pMON67174的大腸桿菌粗細(xì)胞提取物進(jìn)行檢測(cè)。圖8描述分離的豌豆葉綠體中甲基轉(zhuǎn)移酶I活性(陽性對(duì)照)。圖9為pMON67205的質(zhì)粒圖。圖10為pMON67220的質(zhì)粒圖。圖11為pMON67226的質(zhì)粒圖。圖12為pMON67225的質(zhì)粒圖。圖13為pMON67227的質(zhì)粒圖。圖14為pMON67224的質(zhì)粒圖。圖15為pMON67223的質(zhì)粒圖。圖16a和16b描述δ-生育酚在各種類型擬南芥中的表達(dá)水平。圖17描述hdt2突變品系中，napin啟動(dòng)子(pMON67205)控制下，來自兩個(gè)表達(dá)tMT2品系的T3種子中的δ-生育酚(％)。圖18a-d描述10個(gè)種子的tMT2庫中α，β，γ和δ-生育酚的含量。圖19a-d描述10個(gè)種子的tMT2/GMT庫中α，β，γ和δ-生育酚的含量。圖20描述一個(gè)來自pMON67226轉(zhuǎn)化大豆品系(28072)的單種子中的生育酚組成。圖21a-d描述來自pMON67226R1大豆單種子中的α，β，γ和δ-生育酚含量。圖22描述一個(gè)來自pMON67227轉(zhuǎn)化大豆品系(28906)的單種子中的生育酚組成。圖23a-d描述來自pMON67227R1大豆單種子中的α，β，γ和δ-生育酚含量。圖24描述各種2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶的分析結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一些的因子(agent)，如與生育酚合成相關(guān)的核酸分子和多肽等，而且還提供了這些因子的用途。因子本發(fā)明的因子優(yōu)選具有一定的“生物學(xué)活性”，該活性既可以是結(jié)構(gòu)特征方面的，如一種核酸分子與另一種核酸分子雜交的能力；也可以是一種蛋白被一種抗體結(jié)合的特性(或與另一種分子競(jìng)爭(zhēng)這樣的結(jié)合)。這種活性也可以是催化作用，因而涉及因子介導(dǎo)一種化學(xué)反應(yīng)的性能。本發(fā)明的因子優(yōu)選“基本純化的”。這里提到的“基本純化的”這一術(shù)語是指一種分子基本從所有其他在自然狀況下與其相關(guān)的分子中分離出來。更優(yōu)選，一種基本純化的分子在制備物占大多數(shù)。其在自然混合物(除溶劑外)中的純度可以超過60％，優(yōu)選75％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％?！盎炯兓摹边@一術(shù)語的目的就是排除自然狀況下與其混在一起的其他分子。本發(fā)明的因子也可以是重組的。這里的“重組的”是指因子(如DNA、肽等)來源于人對(duì)核酸分子的操作，或是人對(duì)核酸分子操作的間接結(jié)果?？梢岳斫猓景l(fā)明的因子也可以被一些試劑標(biāo)記，以方便檢測(cè)(如熒光標(biāo)記，Prober等，Science238336-340(1987)；Albarella等，EP144914；化學(xué)標(biāo)記，Sheldon等，U.S.Patent4,582,789；Albarella等，U.S.Patent4,563,417；修飾堿基，Miyoshi等，EP119448).核酸分子本發(fā)明的因子包含核酸分子。本發(fā)明優(yōu)選其中的核酸分子包含編碼生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。其中的甲基轉(zhuǎn)移酶是指能特異催化2-甲基葉綠基質(zhì)體醌、2-甲基-5-葉綠基質(zhì)體醌、2-甲基-3-葉綠基質(zhì)體醌、δ-生育酚或β-生育酚苯環(huán)的3位點(diǎn)甲基化的任何一種植物蛋白(參見，Photosyn.Research，3199-111(1992)和Phytochemistry19215-218(1980))。tMT2優(yōu)選來自以下生物擬南芥、玉米、棉花、韭蔥、大豆、稻及油籽油菜。tMT2的一個(gè)更優(yōu)選的例子是一種多肽，該多肽含有選自SEQIDNOs16-38的氨基酸序列。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，tMT2由SEQIDNOs1-15中任何一項(xiàng)的序列所編碼。本發(fā)明還優(yōu)選其中的核酸分子包含一種選自SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列或兩者的片段的核酸序列。本發(fā)明還優(yōu)選其中的核酸分子包含一種選自SEQIDNOs1和2及其互補(bǔ)序列的核酸序列。本發(fā)明還優(yōu)選其中的核酸分子包含一種選自SEQIDNOs3-7及其互補(bǔ)序列的核酸序列。本發(fā)明還優(yōu)選其中的核酸分子包含一種選自SEQIDNOs8-14及其互補(bǔ)序列的核酸序列。本發(fā)明還優(yōu)選其中的核酸分子包含一種選自SEQIDNO15及其互補(bǔ)序列的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選其中的核酸分子包含編碼一種氨基酸分子的核酸序列，其中的氨基酸序列選自SEQIDNOs16-38和其片段。本發(fā)明還進(jìn)一步優(yōu)選其中的核酸分子包含編碼一種氨基酸分子的核酸序列，其中的氨基酸序列選自SEQIDNO16和其片段。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含一種序列的核酸分子，所述序列編碼SEQIDNO108，及其互補(bǔ)序列。另一方面，本發(fā)明提供包含一種序列的核酸分子，該序列編碼SEQIDNO108的殘基83-356，及其互補(bǔ)序列。另一方面，本發(fā)明提供包含一種序列的核酸分子，該序列編碼SEQIDNO108的殘基83-356的一個(gè)片段，其中的片段的長(zhǎng)度至少為25、50、75、100、150、200或250殘基，及其互補(bǔ)序列。另一方面，本發(fā)明提供核酸分子，該核酸分子編碼一或多種SEQIDNO108的下述片段82-123，132-146及269-295，及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明包含上述序列及其片段在轉(zhuǎn)基因植物和其他生物中的用途以及下述的其他用途。本發(fā)明的核酸分子進(jìn)一步包含編碼一種氨基酸序列的核酸序列，其中的氨基酸序列選自SEQIDNOs17-21及其片段。本發(fā)明的核酸分子進(jìn)一步包含編碼一種氨基酸序列的核酸序列，其中的氨基酸序列選自SEQIDNOs22-27及其片段。本發(fā)明的核酸分子進(jìn)一步包含編碼一種氨基酸序列的核酸序列，其中的氨基酸序列選自SEQIDNOs28-38及其片段。本發(fā)明的核酸分子進(jìn)一步包含編碼SEQIDNOs28及其片段的氨基酸序列的核酸序列。本發(fā)明的核酸分子進(jìn)一步包含編碼一種氨基酸序列的核酸序列，其中的氨基酸序列選自SEQIDNOs29-32及其片段。本發(fā)明的核酸分子進(jìn)一步包含編碼一種氨基酸序列的核酸序列，其中的氨基酸序列選自SEQIDNOs33-38及其片段。本發(fā)明還優(yōu)選其中的核酸分子包含編碼一種質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列，其中的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可操作地與編碼本發(fā)明的一種蛋白或其片段的核酸分子相融合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼突變的tMT2酶。其中的“突變”的酶或多肽是指含有一個(gè)與其同類的野生型的同一位點(diǎn)的氨基酸不同的氨基酸的酶或多肽。本發(fā)明的合適的突變的例子包括但不局限于本申請(qǐng)中的實(shí)施例1中給出的。可以這樣理解，本發(fā)明的核酸序列進(jìn)一步能編碼一種蛋白，該蛋白不同于任何已提到的蛋白之處在于，其一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了缺失、替換或添加，但并不改變其功能。例如，現(xiàn)有技術(shù)已知某些密碼子可以編碼這樣的保守的氨基酸替換。另一方面，本發(fā)明的核酸是導(dǎo)入的核酸分子。如果一種核酸分子被人為地插入一種細(xì)胞或生物體，那么無論如何間接，都可以稱作“導(dǎo)入”。導(dǎo)入的核酸分子的例子包括任何經(jīng)由轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、注射和發(fā)射等的方式進(jìn)入細(xì)胞的核酸分子，以及經(jīng)由接合、內(nèi)吞和吞噬等方式導(dǎo)入生物體的核酸分子。本發(fā)明核酸分子的一個(gè)子集(subset)是片段核酸分子。片段核酸分子可以由本發(fā)明核酸分子的重要部分，或?qū)嶋H上大部分組成，如特別公開所示的那些。片段也可以包含更小的寡核苷酸(具有大約15-400個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選具有大約15-30，或大約50-100，或大約100-200，或大約200-400，或大約275-350個(gè)核苷酸殘基)。本發(fā)明的一或多種核酸分子的片段可以作為探針，尤其是PCR探針。PCR探針是一種核酸分子，它在與另一核酸分子形成雙鏈時(shí)起始多聚酶活性。現(xiàn)有技術(shù)中有各種決定PCR探針結(jié)構(gòu)和PCR技巧的方法。例如，可以使用Primer3(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)、STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，BioTechniques25112-123(1998))等計(jì)算機(jī)搜索程序?qū)ふ矣行У囊?。本發(fā)明的核酸分子及其片段在一定條件下能與其他核酸分子特異地雜交。本發(fā)明的核酸分子包括能特異地與下述核酸分子雜交的核酸分子，其中的下述核酸分子具有選自SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列。本發(fā)明的核酸分子還包括能特異地與下述核酸分子雜交的核酸分子，其中的下述核酸分子編碼選自SEQIDNOs16-38及其片段的氨基酸序列。其中，如果兩個(gè)核酸分子能形成反向平行的雙鏈結(jié)構(gòu)，就稱之為兩種核酸分子能特異雜交。如果它們完全互補(bǔ)的話，那么一種核酸分子就可以稱為另一種核酸分子的“互補(bǔ)序列”。其中，完全互補(bǔ)是指一種分子的每一個(gè)核苷都與另一分子的核苷互補(bǔ)。如果兩種分子在至少常規(guī)的“低嚴(yán)謹(jǐn)”條件下，能雜交且具有足夠的穩(wěn)定性保持退火狀態(tài)，那么將其稱為“最小互補(bǔ)”。同樣的，如果兩種分子在常規(guī)的“高嚴(yán)謹(jǐn)”條件下，能雜交且具有足夠的穩(wěn)定性保持退火狀態(tài)，那么將其稱為“互補(bǔ)”。常規(guī)的嚴(yán)謹(jǐn)條件見Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)，以及Haymes等，NucleicAcidHybridization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，DC(1985)所述。因而，與完全互補(bǔ)有偏差是允許的，只要這種偏差不完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。因此，核酸分子要作為引物或探針，只需在序列上足夠互補(bǔ)，從而可以在特定的溶劑和鹽濃度條件下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。促進(jìn)DNA雜交的合適的嚴(yán)謹(jǐn)條件為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉或者可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1981)，6.3.1-6.3.6中找到，例如，約45℃條件下6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后用2.0×SSC在20-25℃條件下洗滌。再例如，洗脫步驟的鹽濃度可以從低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募s2.0×SSC在50℃到高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募s0.2×SSC在65℃。再者，洗脫步驟的溫度可以從低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)氖覝兀s22℃，到高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募s65℃。溫度和鹽濃度均可以不同，或者將溫度或鹽濃度保持恒定而改變其他變量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸將在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，如在約2×SSC及約65℃條件下，特異地與一個(gè)或多個(gè)SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列所示的核酸分子雜交。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸將包括能在高嚴(yán)謹(jǐn)條件如0.2×SSC及約65℃下，與一個(gè)或多個(gè)SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列所示的核酸分子特異雜交的核酸分子。一方面，本發(fā)明的核酸具有一個(gè)或多個(gè)SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列所示的核酸序列。另一方面，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)核酸分子與SEQIDNOs1-15所示的核酸序列及其互補(bǔ)序列和兩者的片段中的一個(gè)或多個(gè)有90％-100％的序列一致性。另一方面，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)核酸分子與SEQIDNOs1-15所示的核酸序列及其互補(bǔ)序列和兩者的片段中的一個(gè)或多個(gè)有95％-100％的序列一致性。更為優(yōu)選，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)核酸分子與SEQIDNOs1-15所示的核酸序列及其互補(bǔ)序列和兩者的片段中的一個(gè)或多個(gè)有98％-100％的序列一致性。更為優(yōu)選，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)核酸分子與SEQIDNOs1-15所示的核酸序列及其互補(bǔ)序列和兩者的片段中的一個(gè)或多個(gè)有99％-100％的序列一致性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，相似性百分比的計(jì)算使用BLASTN或BLASTP((default，parameters，version2.0.8，Altschul等，NucleicAcidsRes.253389-3402(1997))。本發(fā)明的核酸也可以編碼一種直向同源物多肽。其中的直向同源物多肽分子或其片段指的是另一種類中相應(yīng)的多肽分子或其片段(如玉米的核酮糖-1，5-二磷酸羥化/加氧酶小亞基是擬南芥核酮糖-1，5-二磷酸羥化/加氧酶的一種直向同源物)。直向同源物也可以通過分子進(jìn)化或DNA改組技術(shù)得到，以便該分子保留原多肽的至少一種功能或結(jié)構(gòu)特征(參見，例如，U.S.Patent5,811,238).在另一實(shí)施方案中，直向同源物選自以下種類紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉(canola)、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、一種觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。優(yōu)選直向同源物選自卡諾拉、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉花子、亞麻子、油菜子、紅花、油棕、亞麻和向日葵。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物選自卡諾拉、油菜子、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、大豆、向日葵、紅花、油棕和花生。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物是大豆。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物是卡諾拉。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物是油籽油菜。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子具有SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列或兩者的片段；更為優(yōu)選，SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列能用來獲得這樣的直向同源物。更進(jìn)一步，本發(fā)明的核酸分子還包括與SEQIDNOs1-15所示的編碼多肽或其片段的序列所不同的序列。因?yàn)槎嚯目梢杂幸换蚨鄠€(gè)保守性氨基酸改變，因此編碼多肽的核酸序列也可以不同?？梢岳斫猓幋a這樣的保守性氨基酸替換的密碼子為本領(lǐng)域人員所知曉。本領(lǐng)域眾所周知，原序列中的一或多個(gè)氨基酸可以用其他與其電荷和極性相似的氨基酸替換，即保守性替換。原多肽序列中氨基酸的保守性替換可以從原氨基酸所屬類別的其他氨基酸中選擇。氨基酸可以分為以下四類(1)酸性氨基酸，(2)堿性氨基酸，(3)中性極性氨基酸，(4)中性非極性氨基酸。這些種類中代表性的氨基酸包括但不局限于(1)酸性(負(fù)電)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(正電)氨基酸，如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；及(4)中性非極性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。原多肽序列中保守性氨基酸替換可以通過將一個(gè)氨基酸用與其同屬一類的其他氨基酸替換來實(shí)施。優(yōu)選本發(fā)明的蛋白及其片段的生物功能類似物有10或更少的保守性氨基酸改變，更優(yōu)選7或更少的保守性氨基酸改變，最優(yōu)選5或更少的保守性氨基酸改變。編碼核苷酸序列也會(huì)有相應(yīng)的堿基替換，以編碼本發(fā)明多肽的生物功能類似物形式。可以理解，一個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)中某些氨基酸可以替換成其他氨基酸而并不影響其與其他結(jié)構(gòu)(如抗體的抗原結(jié)合區(qū)域或底物分子的結(jié)合位點(diǎn))相互作用的結(jié)合特性。蛋白的生物功能活性是通過相互作用特性和蛋白的本質(zhì)來定義的，所以可以通過蛋白序列中某些氨基酸的改變(基于DNA編碼序列改變)來得到具有相似特性的蛋白。因此，發(fā)明者考慮可以對(duì)本發(fā)明的蛋白或片段的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列做各種改變，而并不影響其生物應(yīng)用或活性。可以理解，能編碼這樣的氨基酸改變的密碼子為本領(lǐng)域人員所知曉。在進(jìn)行替換時(shí)，可能要考慮氨基酸的親水性指數(shù)(hydropathicindex)。本領(lǐng)域人員通常都知道親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157，105-132(1982))。通常認(rèn)為，氨基酸的相對(duì)親水性指數(shù)促進(jìn)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，后者又反過來定義蛋白與其他分子如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。每種氨基酸以其疏水性及荷電性為基礎(chǔ)，都有親水性指數(shù)(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157105-132(1982))，具體如下異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、胱/半胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在進(jìn)行替換時(shí)，優(yōu)選替換氨基酸親水性指數(shù)在±2范圍內(nèi)，更優(yōu)選±1范圍內(nèi)，更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)。相似氨基酸的替換也可以在親水性基礎(chǔ)上有效進(jìn)行。U.S.Patent4,554,101表明一個(gè)蛋白的最大局部平均親水性由其鄰近氨基酸的親水性決定，與蛋白的生物學(xué)特性相關(guān)。如U.S.Patent4,554,101所詳述，以下列舉了各氨基酸殘基的親水性值精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在進(jìn)行替換時(shí)，優(yōu)選替換氨基酸親水性值在±2范圍內(nèi)，更優(yōu)選±1范圍內(nèi)，更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明還包括與發(fā)明中描述的特異序列不同的一或多個(gè)核酸分子，因?yàn)樵幋a的氨基酸發(fā)生了保守性替換，所以編碼密碼子也要進(jìn)行相應(yīng)的改變。本發(fā)明的因子包含核酸分子，其編碼本發(fā)明的多肽的相鄰接的至少約10個(gè)氨基酸區(qū)域，更優(yōu)選至少約25，40，50，100或125個(gè)氨基酸區(qū)域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的任何核酸分子都能可操作性連接于啟動(dòng)子區(qū)域，后者在植物細(xì)胞引起mRNA分子的產(chǎn)生。其中與啟動(dòng)子相連接的核酸分子相對(duì)該啟動(dòng)子來講是異源性的。其中，“異源性的”指非自然在一起。蛋白和肽分子還有一類因子包括本發(fā)明的核酸因子所編碼的一或多個(gè)多肽分子。特別優(yōu)選一類蛋白具有選自SEQIDNOs16-38及其片段的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明的多肽分子包含選自SEQIDNOs17-21及其片段的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明的多肽分子包含選自SEQIDNOs22-27及其片段的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明的多肽分子包含選自SEQIDNOs28-38及其片段的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明的多肽分子包含一個(gè)編碼SEQIDNO28及其片段中的一個(gè)氨基酸的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明的多肽分子包含選自SEQIDNOs29-32及其片段的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明的多肽分子包含選自SEQIDNOs33-38及其片段的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)含有SEQIDNO108的氨基酸序列的多肽。另一方面，本發(fā)明提供含有SEQIDNO108的殘基83-356氨基酸序列的多肽。另一方面，本發(fā)明提供含有SEQIDNO108中的殘基83-356氨基酸序列的多肽，其中的多肽長(zhǎng)度至少為約25，50，75，100，150，200或250個(gè)殘基。另一方面，本發(fā)明提供含有一或多個(gè)下述片段氨基酸序列的多肽，其中下述片段指SEQIDNO108中的殘基82-123，132-146和269-295。多肽因子可含有C或N末端氨基酸序列延伸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中用到的一類N末端延伸是質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。操作時(shí)將肢體轉(zhuǎn)運(yùn)肽連接于N末端序列，從而可以使多肽因子定位于質(zhì)體。本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以使用任何合適的質(zhì)體靶向序列。如果合適的話，質(zhì)體靶向序列可替換為原質(zhì)體靶向序列，例如，tMT2蛋白原來的CTP。另一實(shí)施方案中，與任何tMT2蛋白或此處所述片段異源性的質(zhì)體靶向序列均可使用。另一實(shí)施方案中，任何合適的、修飾的質(zhì)體靶向序列均可使用。另一實(shí)施方案中，質(zhì)體靶向序列是CTP1序列(參見WO00/61771)。本發(fā)明的蛋白優(yōu)選使用原轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列或異源性轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列定位于質(zhì)體。就相應(yīng)于非高等植物如藍(lán)細(xì)菌的核酸序列的核酸序列來講，核酸序列可以進(jìn)行修飾，將蛋白的編碼序列與質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列相連。此處所用的術(shù)語“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括任何含有5個(gè)或5個(gè)以上氨基酸的分子。本領(lǐng)域眾所周知，蛋白、肽或多肽可以進(jìn)行修飾，包括翻譯后修飾，如二硫鍵形成，糖基化、磷酸化或寡聚化，但不限于此。因而，此處術(shù)語“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括任何經(jīng)過生物或非生物途徑修飾的蛋白。術(shù)語“氨基酸”指任何自然存在的L-氨基酸。這樣定義的目的是為了包含正亮氨酸、正纈氨酸、鳥氨酸、同型半胱氨酸和同型絲氨酸。一或多個(gè)蛋白或其片段、肽分子或多肽可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生，或優(yōu)選通過細(xì)菌或真核宿主表達(dá)。合適的方法在Sambrook等編寫的MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEdition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)及類似書中均有描述?！暗鞍灼巍敝鸽幕蚨嚯姆肿?，其氨基酸序列包含該蛋白的氨基酸序列的亞群。如果一個(gè)蛋白或其片段中包含一或多個(gè)非該蛋白來源的額外肽區(qū)域，則稱之為“融合”蛋白。這樣的分子可進(jìn)一步延伸為包括碳水化合物或其他部分(如鑰孔_血藍(lán)蛋白)。本發(fā)明的融合蛋白或肽分子優(yōu)選通過重組方式產(chǎn)生。另一類因子包括蛋白、肽分子或多肽或其片段或其融合，其中包含SEQIDNOs16-38及其片段，且其中保守性的、非關(guān)鍵的或非相關(guān)的氨基酸殘基發(fā)生了添加、置換或缺失。用計(jì)算機(jī)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)修飾為本領(lǐng)域人員所知曉(Dahiyat和Mayo，Science27882-87(1997))。本發(fā)明的蛋白、肽或多肽也可以是直向同源物蛋白、肽或多肽。所謂直向同源物蛋白、肽、多肽或其片段是其在另一種類中的相應(yīng)的蛋白、肽、多肽或其片段。直向同源物也可以通過分子進(jìn)化或DNA改組技術(shù)得到，以便該分子保留原分子的至少一種功能或結(jié)構(gòu)特征(參見，如U.S.Patent5,811,238)。在另一實(shí)施方案中，直向同源物選自以下種類紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。優(yōu)選直向同源物選自卡諾拉、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉花子、亞麻子、油菜子、紅花、油棕、亞麻和向日葵。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物選自卡諾拉、油菜子、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、大豆、向日葵、紅花、油棕和花生。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物是大豆。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物是卡諾拉。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，直向同源物是油籽油菜。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子或其互補(bǔ)序列及兩者的片段可以用來獲得這些直向同源物。本發(fā)明的因子包括蛋白和其片段，其中的蛋白和其片段至少包含本發(fā)明的蛋白鄰近的約10個(gè)氨基酸區(qū)域，優(yōu)選約20個(gè)氨基酸區(qū)域，更優(yōu)選25、35、50、75或100個(gè)氨基酸區(qū)域。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包括約10-25個(gè)氨基酸區(qū)域，更優(yōu)選約20-50個(gè)鄰近的氨基酸區(qū)域，更優(yōu)選約40-80個(gè)鄰近的氨基酸區(qū)域。植物構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化本發(fā)明的一或多個(gè)核酸分子可以用于植物的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。外源基因物質(zhì)轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，植物細(xì)胞再發(fā)育為完整的、有或無生育能力的植物。外源基因物質(zhì)指任何基因物質(zhì)，天然或非天然，來源于能被插入任何生物體的物質(zhì)。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)優(yōu)選包含編碼生育酚轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)還優(yōu)選包含選自SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列和兩者的片段。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼選自SEQIDNOs16-38及其片段的核酸序列。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼選自SEQIDNOs17-21及其片段的核酸序列。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼選自SEQIDNOs22-27及其片段的核酸序列。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼選自SEQIDNOs28-38及其片段的核酸序列。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼SEQIDNO28及其片段的核酸序列。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼選自SEQIDNOs29-32及其片段的核酸序列。本發(fā)明的外源基因物質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選包含編碼選自SEQIDNOs33-38及其片段的核酸序列。本發(fā)明的核酸序列進(jìn)一步還編碼細(xì)胞內(nèi)定位、輸出或翻譯后修飾所涉及的肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含tMT2酶或其片段的外源基因物質(zhì)與一或多個(gè)額外基因被導(dǎo)入植物細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，優(yōu)選基因連接包括一或多個(gè)下述基因tyrA、slr1736、HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、GMT、tMT2、AANT1、slr1737、IDI、GGH或其植物直向同源物及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體(Kridl等，SeedSci.Res.1209219(1991)；Keegstra，Cell56(2)247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9112760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.1381309-1316(1992)；Cyanobase，www.kazusa.orjp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)2105-2110(1998)；Takahashi等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norris等，PlantPhysiol.1171317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，PlantPhysiol.1041469-1470(1994)，Smith等，PlantJ.1183-92(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily，等，PlantPhysiol.，100(2)1069-1071(1992)；Sato等，J.DNARes.7(1)31-63(2000))。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，tMT2與GMT相結(jié)合。此處公開的任何使用編碼GMT的核酸分子的實(shí)施方案中，核酸分子優(yōu)選地選自包含選自SEQIDNOs39-54的核酸序列的核酸分子，和編碼具有選自SEQIDNOs39-54的氨基酸序列的GMT的核酸分子。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，tMT2與GMT及上述的一或多個(gè)基因相連接。在這樣的連接中，通過使用質(zhì)體靶向序列，一或多個(gè)基因產(chǎn)物可以被定位于質(zhì)體。或者，一或多個(gè)基因產(chǎn)物被定位于胞漿。這些基因可以如下導(dǎo)入植物細(xì)胞與tMT2或GMT或兩者在同一構(gòu)建體中，與tMT2的片段或GMT的片段或兩者在同一構(gòu)建體中，或者在不同的構(gòu)建體但同批轉(zhuǎn)化，或轉(zhuǎn)入不同的植物但隨后進(jìn)行一或多次雜交以產(chǎn)生理想的基因連接。在上述連接中，優(yōu)選啟動(dòng)子是napin啟動(dòng)子，優(yōu)選質(zhì)體靶向序列是CTP1序列。優(yōu)選基因產(chǎn)物定位于質(zhì)體。優(yōu)選將編碼tMT2多肽的核酸分子與編碼下述任何一種酶tyrA、slr1736、HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、tMT2、AANT1、slr1737、IDI、GGH或其植物直向同源物及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體的核酸分子的連接導(dǎo)入植物。更優(yōu)選導(dǎo)入植物細(xì)胞的連接是編碼tMT2多肽的核酸分子和編碼GMT多肽的核酸分子，其中兩種多肽都定位于質(zhì)體，其中兩種多肽之一為原有，另一種為導(dǎo)入的。編碼這兩種多肽的核酸序列可以通過同一基因構(gòu)建體導(dǎo)入，也可以通過分別構(gòu)建體導(dǎo)入。在另一實(shí)施方案中，tMT2與GMT及tyrA、slr1736、HPT生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI和GGH中的一或多種相連接。另一優(yōu)選的組合(不是連接)是，將編碼tMT2蛋白的核酸分子與編碼一種GMT酶的核苷酸分子與tyrA、slr1736、HPT生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI和GGH中的一或多種一起導(dǎo)入植物。另一優(yōu)選的可以導(dǎo)入的連接是，編碼tMT2蛋白的核酸分子與導(dǎo)致GMT蛋白下調(diào)的核酸分子的組合。在此方面，優(yōu)選植物堆積г-生育酚或г-生育三烯酚或兩者。這些基因物質(zhì)可以轉(zhuǎn)移入單子葉植物或雙子葉植物，其中包括但不局限于卡諾拉、玉米、大豆、擬南芥、菜豆、花生、紫苜蓿、小麥、稻、燕麥、油菜子、裸麥、tritordeum、小米、牛毛草、常年生黑麥草、甘蔗、酸果蔓果實(shí)、木瓜、香蕉、紅花、油棕、亞麻、香瓜、蘋果、黃瓜、石槲蘭、劍蘭、菊花、百合花、棉花、桉樹、向日葵、蕓苔、油籽油菜、草坪草、甜菜、咖啡和薯蕷(Christou，InParticleBombardmentforGeneticEngineeringofPlants，BiotechnologyIntelligenceUnit.AcademicPress，SanDiego，California(1996))，優(yōu)選卡諾拉、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、油菜子、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花、油棕、亞麻和向日葵。優(yōu)選卡諾拉、油菜子、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、大豆、向日葵、紅花、油棕和花生。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因物質(zhì)轉(zhuǎn)入卡諾拉。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因物質(zhì)轉(zhuǎn)入油籽油菜。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因物質(zhì)轉(zhuǎn)入大豆。編碼蛋白的核酸的導(dǎo)入可以導(dǎo)致該多肽在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)或過表達(dá)。本發(fā)明的核酸編碼的一或多種蛋白或其片段可以在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)或過表達(dá)。這種表達(dá)或過表達(dá)是外源基因物質(zhì)的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)移所致。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，α-生育酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，γ-生育酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)的降低、表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，δ-生育酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)的降低、表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，β-生育酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，生育三烯酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，α-生育三烯酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，γ-生育三烯酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)的降低、表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，δ-生育三烯酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)的降低、表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，β-生育三烯酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽與編碼下述任何一種酶tyrA、slr1736、HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、tMT2、AANT1、slr1737、IDI、GGH或其植物直向同源物及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體的核酸分子的連接在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，總生育酚的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，質(zhì)體醌的水平提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物來說，總生育酚的水平提高。本文所述任何實(shí)施方案中，γ-生育酚、α-生育酚或兩者水平的提高會(huì)導(dǎo)致β-生育酚、δ-生育酚或兩者的相對(duì)比例降低。同樣地，γ-生育三烯酚、α-生育三烯酚或兩者水平的提高會(huì)導(dǎo)致β-生育三烯酚、δ-生育三烯酚或兩者的相對(duì)比例降低。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在植物中的表達(dá)或過表達(dá)，可以使該植物或植物的一種組織相對(duì)于與其具有相似基因背景但未轉(zhuǎn)化的植物或植物組織來說，tMT2蛋白或其片段的水平提高。在一些實(shí)施方案中，生育酚生物合成通路的一或多種產(chǎn)物(包括生育酚、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、β-生育酚、生育三烯酚、α-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚和β-生育三烯酚)的水平升高超過約10％。更優(yōu)選超過25％、35％、50％、75％、80％、90％、100％、150％、200％、1,000％、2,000％或2,500％。產(chǎn)物水平的提高可以是在整個(gè)生物體如植物或局限于該生物體的一或多個(gè)特異的器官或組織。例如，產(chǎn)物水平的提高可以是在植物的一或多個(gè)組織和器官，包括但不局限于根、塊莖、莖、葉、柄、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、莖皮、莢、種子或花。優(yōu)選器官是種子。在一些實(shí)施方案中，生育酚生物合成通路的一或多種產(chǎn)物(包括生育酚、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、β-生育酚、生育三烯酚、α-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚和β-生育三烯酚)的水平升高，以至于其在器官或組織的總生育酚中的含量超過約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。產(chǎn)物水平的提高可以是在整個(gè)生物體如植物或局限于該生物體的一或多個(gè)特異的器官或組織。例如，產(chǎn)物水平的提高可以是在植物的一或多個(gè)組織和器官，包括但不局限于根、塊莖、莖、葉、柄、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、莖皮、莢、種子或花。優(yōu)選器官是種子。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子中涉及生育酚、生育三烯酚或質(zhì)體醌合成的酶的表達(dá)會(huì)由于那些組織中重要的GMT活性的缺乏而導(dǎo)致γ-生育酚水平的提高。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，光合組織中涉及生育酚、生育三烯酚或質(zhì)體醌合成的酶的表達(dá)，會(huì)由于那些組織相對(duì)于種子組織來說GMT活性水平較高而導(dǎo)致α-生育酚水平的提高。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，種子中涉及生育酚、生育三烯酚或質(zhì)體醌合成的酶的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致總生育酚、生育三烯酚或質(zhì)體醌水平的提高。在一些實(shí)施方案中，生育酚或其中一類如α-生育酚的水平可以改變。在一些實(shí)施方案中，生育三烯酚的水平可以改變。這些改變是相對(duì)于具有相同背景的植物而言。在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生高水平的α-生育酚或α-生育三烯酚或兩者的植物(如紅花)中的α-生育酚或α-生育三烯酚或兩者的水平可以通過導(dǎo)入編碼tMT2酶的基因而提高。在一個(gè)優(yōu)選的方面，相似的基因背景指互相對(duì)比的生物體核內(nèi)的基因物質(zhì)有50％或更高相同。更優(yōu)選，相似的基因背景指互相對(duì)比的生物體核內(nèi)的基因物質(zhì)有75％或更高相同，更優(yōu)選90％或更高相同。在另一更優(yōu)選的方面，相似的基因背景所對(duì)比的生物體是植物，這些植物除原先用植物轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入的基因物質(zhì)外，是等基因(isogenic)的。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種多肽在一種轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)的降低、表達(dá)或過表達(dá)，可以提供對(duì)各種應(yīng)激的耐受，如氧化應(yīng)激耐受如對(duì)氧或臭氧、UV耐受、冷耐受或真菌/微生物病原耐受。如此處所述，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)應(yīng)激的抵抗或耐受是由植物在受到應(yīng)激如寒冷刺激時(shí)的能力決定的，耐受的植物比不耐受的產(chǎn)量要高。更優(yōu)選，對(duì)應(yīng)激的耐受或抵抗是相對(duì)于與耐受或抵抗植物具有相似基因背景的植物而言，只是耐受植物降低表達(dá)、表達(dá)或過表達(dá)本發(fā)明的蛋白或其片段。外源基因物質(zhì)可以通過為此目的而設(shè)計(jì)的DNA載體或構(gòu)建體而轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。載體的設(shè)計(jì)基本都在現(xiàn)有技術(shù)范圍內(nèi)(參見PlantMolecularBiologyALaboratoryManual，Clark(ed.)，Springer，NewYork(1997))。構(gòu)建體或載體包括一種植物啟動(dòng)子，以表達(dá)所選多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述任何核酸分子可操作的連接于啟動(dòng)子，后者在植物細(xì)胞中引起mRNA分子的產(chǎn)生。例如，可以在植物細(xì)胞中引起mRNA分子產(chǎn)生的任何啟動(dòng)子如本發(fā)明所述啟動(dòng)子，無任何限制，均可使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是植物啟動(dòng)子。文獻(xiàn)中描述了大量在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。包括胭脂堿合成酶(NOS)啟動(dòng)子(Ebert等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)845745-5749(1987))、章魚堿合成酶(OCS)啟動(dòng)子(在根瘤農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒中發(fā)揮作用)、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動(dòng)子(Lawton等，PlantMol.Biol.9315-324(1987))及CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等，Nature313810-812(1985))、玄參花葉病毒35S-啟動(dòng)子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子、Adh啟動(dòng)子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)846624-6628(1987))、蔗糖合成酶啟動(dòng)子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(US.A.)874144-4148(1990))、R基因復(fù)合物啟動(dòng)子(Chandler等，ThePlantCell11175-1183(1989))和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子等。這些啟動(dòng)子已被用于在植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中；參見，如PCT出版WO84/02913。在植物中優(yōu)選使用CaMV35S啟動(dòng)子。其他已知或發(fā)現(xiàn)能在植物細(xì)胞引起DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明。為了在植物的源組織如葉、種子、根或莖中表達(dá)，優(yōu)選使用在特異組織中相對(duì)高表達(dá)的啟動(dòng)子。本發(fā)明的蛋白的組織特異表達(dá)是一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案。為達(dá)此目的，可以從大量的啟動(dòng)子中選擇適于基因進(jìn)行組織或細(xì)胞特異或增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子。文獻(xiàn)中報(bào)道的這樣的啟動(dòng)子的例子包括豌豆的葉綠體谷氨酰胺合成酶GS2(Edwards等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)873459-3463(1990))、小麥的葉綠體果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)啟動(dòng)子(Lloyd等，Mol.Gen.Genet.225209-216(1991))、土豆的核光合ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等，EMBOJ.82445-2451(1989))、擬南芥的絲氨酸/蘇氨酸激酶(PAL)啟動(dòng)子和葡糖淀粉酶(CHS)啟動(dòng)子。報(bào)道的在光合活性組織有活性的啟動(dòng)子有美洲落葉松(larixlaricina)來源的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)啟動(dòng)子、松樹來源的cab基因，cab6啟動(dòng)子(Yamamoto等，PlantCellPhysio35773-778(1994))、小麥來源的Cab-1基因啟動(dòng)子(Fejes等，PlantMol.Biol.15921-932(1990))、菠菜來源的CAB-1基因啟動(dòng)子(Lubberstedt等，PlantPhysiol.104997-1006(1994))、稻來源的cab1R基因啟動(dòng)子(Luan等，Plantcell.4971-981(1992))、玉米來源的丙酮酸、正磷酸雙激酶(PPDK)啟動(dòng)子(Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA.)909586-9590(1993))、煙草Lhcb1*2基因啟動(dòng)子(Cerden等，PlantMol.Biol.33245-255(1997))、擬南芥SUC2蔗糖-H+共運(yùn)輸啟動(dòng)子(Truernit等.Planta.196564-570(1995))及菠菜來源的類囊體膜蛋白啟動(dòng)子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。其他葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動(dòng)子如白芥菜來源的LhcB和PsbP基因啟動(dòng)子也可以在本發(fā)明中使用(Sinapisalba；Kretsch等，PlantMol.Biol.28219-229(1995))。為了在植物的庫組織如土豆的塊莖、西紅柿的果實(shí)、玉米、小麥、稻和大麥的種子中表達(dá)，優(yōu)選本發(fā)明所用的啟動(dòng)子在這些特異組織中有相對(duì)的高表達(dá)。有大量啟動(dòng)子可以用于基因塊莖特異或塊莖增強(qiáng)表達(dá)，包括I類patatin啟動(dòng)子(Bevan等，EMBOJ81899-1906(1986)；Jeffersonelal.，PlantMol.Biol.14995-1006(1990))、土豆塊莖ADPGPP基因(包括大亞基和小亞基)啟動(dòng)子、蔗糖合成酶啟動(dòng)子(Salanoubat和Belliard，Gene6047-56(1987)，Salanoubat和Belliard，Gene84181-185(1989))、包括22kd蛋白復(fù)合物和蛋白酶抑制劑的主要塊莖蛋白啟動(dòng)子(Hannapel，PlantPhysiol.101703-704(1993))、顆粒束縛淀粉合成酶(GBSS)基因(Visser等，PlantMol.Biol.17691-699(1991))和其他I和II類patatin啟動(dòng)子(Koster-Topfer等，Mol.Gen.Genet.219390-396(1989)；Mignery等，Gene.6227-44(1988))。其他啟動(dòng)子也可以用來在特異組織如種子或果實(shí)中表達(dá)多肽。事實(shí)上，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的啟動(dòng)子是種子特異的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子包括來自基因如napin(Kridl等，SeedSci.Res.1209219(1991))、菜豆蛋白(Bustos，等，PlantCell，1(9)839-853(1989))、大豆胰蛋白酶抑制劑(Riggs，等，PlantCell1(6)609-621(1989))、ACP(Baerson，等，PlantMol.Biol.，22(2)255-267(1993))、硬脂酰-ACP脫氫酶(Slocombe，等，PlantPhysiol.104(4)167-176(1994)))、大豆b-conglycinin的a’亞基(Chenelal.，Proc.NatLAcad.Sci.，838560-8564(1986))和油質(zhì)蛋白等的5’調(diào)節(jié)區(qū)域。進(jìn)一步的例子包括β-conglycinin啟動(dòng)子。也包括玉米醇溶蛋白，后者是在玉米胚乳發(fā)現(xiàn)的一組儲(chǔ)藏蛋白。玉米醇溶蛋白基因的基因組的克隆已分離出(Pedersen等，Cell291015-1026(1982)，和Russell等，TransgenicRes.6(2)157-168))，這些克隆的啟動(dòng)子包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和基因也可以使用。其他已知在玉米發(fā)揮作用的示例啟動(dòng)子包括如下基因的啟動(dòng)子waxy、Brittle、Shrunken2、分支酶I和II、淀粉合成酶、去分支酶、油質(zhì)蛋白、谷蛋白和蔗糖合成酶。玉米胚乳表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是來自稻的谷蛋白基因啟動(dòng)子，更優(yōu)選Osgt-1啟動(dòng)子(Zheng等，Mol.CellBiol.135829-5842(1993))。適于小麥表達(dá)的示例啟動(dòng)子包括ADP蔗糖焦合酶(ADPGPP)亞基、顆粒束縛和其他淀粉合成酶、分支和去分支酶、胚胎發(fā)生高豐度蛋白、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白等基因的啟動(dòng)子。稻的示例啟動(dòng)子包括ADPGPP亞基、顆粒束縛和其他淀粉合成酶、分支和去分支酶、蔗糖合成酶和谷蛋白基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選啟動(dòng)子是稻谷蛋白和Osgt-1啟動(dòng)子。大麥的示例啟動(dòng)子包括ADPGPP亞基、顆粒束縛和其他淀粉合成酶、分支和去分支酶、蔗糖合成酶、大麥醇溶蛋白、胚球蛋白和糊粉特異蛋白的啟動(dòng)子。優(yōu)選在種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子是napin啟動(dòng)子。另一優(yōu)選啟動(dòng)子是Arcelin5啟動(dòng)子。也可以用根特異的啟動(dòng)子。其中一個(gè)例子是酸性幾丁質(zhì)酶基因的啟動(dòng)子(Samac等，PlantMol.Biol.25587-596(1994)))。在根組織的表達(dá)也可以通過利用已識(shí)別的根特異的CaMV35S啟動(dòng)子的亞域(Lam等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)867890-7894(1989))。其他根細(xì)胞特異啟動(dòng)子包括Conkling等所報(bào)道的(Conkling等，PlantPhysiol.931203-1211(1990))。其他可以使用的啟動(dòng)子在U.S.Patents5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435和4,633,436中有記載。另外，組織特異的增強(qiáng)子也可以使用(Fromm等，ThePlantCell1977-984(1989))中所述。載體或構(gòu)建體中除目的基因編碼區(qū)外，還應(yīng)該包括終止該區(qū)域轉(zhuǎn)錄的核酸序列，后者的全部或部分發(fā)揮終止作用。已分離出大量這樣的序列，包括Tr73’序列和NOS3’序列(Ingelbrecht等，ThePlantCell1671-680(1989)；Bevan等，NucleicAcidsRes.11369-385(1983))。本發(fā)明的植物表達(dá)構(gòu)建體中也提供了調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可以通過編碼目的基因的DNA序列提供或是從不同基因來源的方便的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，例如，與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)自然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。技術(shù)人員應(yīng)該能意識(shí)到任何能在植物細(xì)胞終止轉(zhuǎn)錄的方便的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)均可用于本發(fā)明的構(gòu)建體。載體或構(gòu)建體還可以包括調(diào)節(jié)元件。這種例子包括Adh內(nèi)含子1(Callis等，Genes和Develop.11183-1200(1987))、蔗糖合成酶內(nèi)含子(Vasil等，PlantPhysio.911575-1579(1989))及TMVω元件(Gallie等，ThePlantCell1301-311(1989))。適當(dāng)時(shí)可以包括這些及其他一些調(diào)節(jié)元件。載體或構(gòu)建體還可以包括可選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記也可以用來選擇含有外源基因物質(zhì)的植物或植物細(xì)胞。示例性選擇標(biāo)記包括但不局限于neo基因(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199183-188(1985))，其編碼卡那霉素抗性，可以用卡那霉素、RptII、G418、hpt等來篩選；編碼雙丙氨膦抗性的bar基因；編碼草甘膦抗性的突變的EPSP合成酶基因(Hinchee等，BiolTechnology6915-922(1988)；Reynaerts等，SelectableandScreenableMarkers.InGelvinandSchilperoort，PlantMolecularBiologyManual，Kluwer，Dordrecht(1988)；Reynaerts等，Selectableandscreenablemarkers.InGelvinandSchilperoort.PlantMolecularBiologyManual，Kluwer，Dordrecht(1988))，aadA(Jones等，Mol.Gen.Genet.(1987))，)；編碼溴苯腈抗性的腈水解酶基因(Stalker等，J.Biol.Chem.2636310-6314(1988))；編碼咪唑啉酮或磺脲抗性的突變乙酰乳酸合成酶(EuropeanPatentApplication154,204(Sept.11，1985))，ALS(D′Halluin等，Bio/Technology10309-314(1992))，以及氨甲蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，J.Biol.Chem.26312500-12508(1988))。載體或構(gòu)建體還可以包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽?？梢允褂煤线m的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(EuropeanPatentApplicationPublicationNumber0218571)。也可以整合入翻譯增強(qiáng)子作為載體DNA的一部分。DNA構(gòu)建體還可以包括5’非翻譯前導(dǎo)序列，后者可能增強(qiáng)mRNA轉(zhuǎn)錄子的基因產(chǎn)物的表達(dá)。這樣的序列可以來源于表達(dá)基因的啟動(dòng)子，或者經(jīng)過特異修飾來提高mRNA的翻譯。這樣的區(qū)域也可以來自病毒RNAs、合適的真核基因或合成的基因序列。優(yōu)化轉(zhuǎn)基因表達(dá)的綜述參見Koziel等，PlantMol.Biol.32393-405(1996)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)運(yùn)肽是CTP1。載體或構(gòu)建體還可以包括一個(gè)篩選標(biāo)記。可以用篩選標(biāo)記來監(jiān)測(cè)表達(dá)。示例性的篩選標(biāo)記包括β-葡糖醛縮酶或uidA基因(GUS)，其編碼的酶可以作用于多種已知的顯色底物(Jefferson，PlantMol.Biol.，Rep.5387-405(1987)；Jefferson等，EMBOJ.63901-3907(1987))；R-基因座基因，其編碼產(chǎn)物調(diào)節(jié)植物組織花青素色素(紅色)的產(chǎn)生(Dellaporta等，StadlerSymposium11263-282(1988))；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.53737-3741(1978)，其編碼的酶可以作用于多種已知的顯色底物(如PADAC，一種顯色頭孢菌素)；一種熒光酶基因(Ow等，Science234856-859(1986)))；xylE基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)801101-1105(1983))，其編碼兒茶酚雙加氧酶，可以轉(zhuǎn)換顯色兒茶酚；一種α-淀粉酶基因(Ikatu等，BiolTechnol.8241-242(1990)；一種酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.1292703-2714(1983))，其編碼的酶能氧化酪氨酸生成DOPA和多巴醌，后兩者又縮合成黑色素；α-半乳糖苷酶，作用于顯色的α-半乳糖底物?！斑x擇或篩選標(biāo)記基因”這一術(shù)語還包括編碼分泌標(biāo)記的基因，對(duì)分泌物的檢測(cè)可以作為鑒別或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一種方式。示例標(biāo)記包括編碼可分泌抗原的標(biāo)記(通過與抗體的相互作用來識(shí)別)，甚至還包括可分泌的酶標(biāo)記(通過催化作用來識(shí)別)。分泌蛋白包括很多類，如小的，可擴(kuò)散的蛋白，可通過如ELISA等來檢測(cè)；小的活性酶，在胞外溶液中可以檢測(cè)(如α-淀粉酶、β-內(nèi)酰胺酶、膦絲菌素轉(zhuǎn)移酶)或插入或嵌入細(xì)胞壁的蛋白(如包括前導(dǎo)序列的蛋白如表達(dá)單元所見或煙草PR-S)。現(xiàn)有技術(shù)中還有其他可能的選擇和/或篩選標(biāo)記基因。有許多方法可以將轉(zhuǎn)化核酸分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。合適的方法實(shí)際上包括任何可以將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的方法，如通過農(nóng)桿菌感染或直接轉(zhuǎn)移的方法如PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔或通過DNA包被顆粒的加速作用等(Potrykus，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.42205-225(1991)；Vasil，PlantMol.Biol.25925-937(1994))。例如，電穿孔已被用于轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體(Fromm等，Nature312791-793(1986))。其他適于將轉(zhuǎn)化DNA導(dǎo)入宿主植物細(xì)胞的載體系統(tǒng)包括但不局限于二等分人工染色體(BIBAC)載體(Hamilton等，Gene200107-116(1997))；以及用RNA病毒載體轉(zhuǎn)染(Della-Cioppa等，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1996)，792(EngineeringPlantsforCommercialProductsandApplications)，57-61))。其他的載體系統(tǒng)還包括植物選擇性YAC載體，如Mullen等，MolecularBreeding4449-457(1988)所述。DNA導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，主要有如下四種(1)化學(xué)方法(Graham和vanderEb，Virology54536-539(1973))；(2)物理方法，如微注射(Capecchi，Cell22479-488(1980))、電穿孔(Wong和Neumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.107584-587(1982)；Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)825824-5828(1985)；U.S.Patent5,384,253)、基因槍(Johnston和Tang，MethodsCellBiol.43353-365(1994))和真空滲入(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，LifeSci.3161194-1199.(1993))；(3)病毒載體(Clapp，Clin.Perinatol.20155-168(1993)；Lu等，JExp.Med.1782089-2096(1993)；Eglitis和Anderson，Biotechniques6608-614(1988))和(4)受體介導(dǎo)機(jī)制((Curiel等，Hum.Gen.Ther.3147-154(1992)，Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)896099-6103(1992))?？梢允褂玫募铀俜椒òㄎ⒘＾Z擊等。將轉(zhuǎn)化核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法的例子是微粒轟擊。Yang和Christou(eds.)在ParticleBombardmentTechnologyforGeneTransfer，OxfordPress，Oxford，England(1994)中對(duì)該方法進(jìn)行了綜述。非生物顆粒(微粒)可以用來包被核酸，然后通過推進(jìn)力轉(zhuǎn)移入細(xì)胞。示例微粒包括鎢、黃金、白金等。微粒轟擊除可以作為一種有效的可重復(fù)的轉(zhuǎn)化單子葉的方式外，還有一個(gè)特別的優(yōu)勢(shì)在于不需要分離原生質(zhì)體(Cristou等，PlantPhysiol.87671-674(1988))也不需要對(duì)農(nóng)桿菌易感。一種通過加速作用將DNA轉(zhuǎn)移入玉米細(xì)胞的方法的說明性實(shí)施方案是生物彈α-微粒轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，用此系統(tǒng)將附著DNA的微粒推進(jìn)，穿過阻擋網(wǎng)如不銹鋼的或Nytex阻擋網(wǎng)，到達(dá)覆蓋有在懸液中培養(yǎng)的玉米細(xì)胞的濾器表面。Gordon-Kamm等，描述了用DNA包被鎢微粒的基本程序(Gordon-Kamm等，PlantCell2603-618(1990))。阻擋網(wǎng)分散了鎢核酸微粒以便其不會(huì)以大量聚集物的形式轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞。適于本發(fā)明使用的一種微粒轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是氦加速PDS-1000/He槍，可從Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室購得(Bio-Rad，Hercules，California)(Sanford等，Technique33-16(1991))。為了進(jìn)行轟擊，將懸液中的細(xì)胞濃集于濾器。含待轟擊細(xì)胞的濾器置于微粒阻擋板下適當(dāng)?shù)木嚯x處。如果需要的話，可以在槍和待轟擊細(xì)胞之間放置一或多個(gè)阻擋網(wǎng)。另外，未成熟的胚胎或其他靶細(xì)胞也可以培養(yǎng)在固態(tài)培養(yǎng)基上。待轟擊細(xì)胞置于微粒阻擋板下適當(dāng)?shù)木嚯x處。如果需要的話，可以在加速裝置和待轟擊細(xì)胞之間放置一或多個(gè)阻擋網(wǎng)。通過這里提出的方法，可以得到1000或以上細(xì)胞的基因座瞬時(shí)表達(dá)標(biāo)記基因。轟擊后48小時(shí)，一個(gè)轉(zhuǎn)化灶中表達(dá)外源基因的細(xì)胞數(shù)通常有1-10個(gè)，平均1-3個(gè)。在轟擊轉(zhuǎn)化中，可以優(yōu)化轟擊前的培養(yǎng)條件以及轟擊參數(shù)來獲得最大量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。該技術(shù)中，物理的和生物的參數(shù)都很重要。物理的參數(shù)包括控制DNA/微粒沉淀的參數(shù)、影響大或微粒飛行和速率的參數(shù)等。生物參數(shù)包括轟擊前或轟擊后即刻對(duì)細(xì)胞的所有處理步驟、靶細(xì)胞的滲透性調(diào)節(jié)來緩解轟擊所帶來的損傷以及轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)如線形DNA或完整的超螺旋DNA。通常認(rèn)為，轟擊前的處理對(duì)未成熟胚胎的成功轉(zhuǎn)化非常重要。在另一實(shí)施方案中，質(zhì)體可以被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。高等植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法包括含選擇性標(biāo)記DNA的離子槍轉(zhuǎn)移以及通過同源重組將DNA定位于染色體(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)878526-8530(1990)；Svab和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90913-917(1993)；Staub和Maliga，EMBOJ.12601-606(1993)；U.S.Patents5,451,513和5,545,818))。因而，可以考慮在小批量的研究中，調(diào)整各種轟擊參數(shù)，充分優(yōu)化條件。尤其可以考慮調(diào)整物理參數(shù)如間距、飛行距離、組織距離和氦的壓力。還可以調(diào)整影響受體細(xì)胞生理狀態(tài)，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化和整合效率的的參數(shù)，最小化創(chuàng)傷還原因子。例如，受體細(xì)胞的滲透壓、組織水化狀態(tài)和亞培養(yǎng)階段或細(xì)胞循環(huán)均可以進(jìn)行調(diào)整，以優(yōu)化轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移在將基因?qū)胫参锛?xì)胞方面廣為應(yīng)用，因?yàn)橛么朔椒―NA可以被導(dǎo)入完整的植物組織，不需要再從原生質(zhì)體產(chǎn)生完整的植物。將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞所用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物整合載體在本領(lǐng)域眾所周知。參見Fraley等，Bio/Technology3629-635(1985)和Rogers等，MethodsEnzymol.153253-277(1987)所述方法。而且，Ti-DNA的整合是一個(gè)相對(duì)精確的過程，很少導(dǎo)致重排。DNA的被轉(zhuǎn)移的區(qū)域由邊界序列所限定，轉(zhuǎn)入DNA通常如所述(Spielmann等，Mol.Gen.Genet.20534(1986)))插入植物基因組。較新的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體既能在農(nóng)桿菌復(fù)制也能在大腸桿菌復(fù)制，如所述(Klee等，InPlantDNAInfectiousAgents，Hohn和Schell(eds.)，Springer-Verlag，NewYork，pp.179-203(1985))，便于操作。而且，農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的載體已有很大改進(jìn)，改進(jìn)了基因和限制位點(diǎn)的排列，便于能表達(dá)各種多肽編碼基因的載體的構(gòu)建體。所提及的載體提供了非常方便的多接頭區(qū)，其兩側(cè)是啟動(dòng)子和聚腺苷酸化酸位點(diǎn)，可以直接表達(dá)插入的多肽編碼基因，適合需要(Rogers等，MethodsEnzymol.153253-277(1987))。另外，包含裝甲和卸甲Ti基因的農(nóng)桿菌均可用于轉(zhuǎn)化。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化有效的植物株，首選農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，因?yàn)槠浜?jiǎn)便且符合基因轉(zhuǎn)移的特性。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物通常在一個(gè)染色體上含有單基因。對(duì)轉(zhuǎn)入的基因來說，這樣的轉(zhuǎn)基因植物可以被稱為雜合的。優(yōu)選對(duì)轉(zhuǎn)入的結(jié)構(gòu)基因來說，轉(zhuǎn)基因植物是純合的，即轉(zhuǎn)基因植物含有兩個(gè)轉(zhuǎn)入的基因，分別位于一個(gè)染色體對(duì)的兩條染色體的相同位點(diǎn)。純合基因植物可以通過下述方式得到性交配(自交)一種獨(dú)立的分離子，即含有單個(gè)轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因植物，然后培育產(chǎn)生的種子，分析所得的含有目的基因的植物。很容易理解，兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以交配，產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立的分離的外源基因的子代。合適的子代自交能產(chǎn)生對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)入的編碼目的多肽的外源基因來講都是純合子的植物。還可以考慮，象植物繁殖那樣，與親本回交以及與非轉(zhuǎn)基因植物異型雜交。植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化還可以通過使用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔以及這些方法的結(jié)合來完成(參見，例如，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.205193-200(1986)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.199178(1985)；Fromm等，Nature319791(1986)；Uchimiya等，Mol.Gen.Genet.204204(1986)；Marcotte等，Nature335454-457(1988)))。這些系統(tǒng)在不同植株的應(yīng)用取決于從原生質(zhì)體產(chǎn)生該植株的能力。從原生質(zhì)體生成谷物的例證方法已有描述(Fujimura等，PlantTissueCultureLetters274(1985)；Toriyama等，Theor.Appl.Genet.20534(1986)；Yamada等，PlantCellRep.485(1986)；Abdullah等，Biotechnology41087(1986))。要轉(zhuǎn)化不能從原生質(zhì)體成功再生的植株，可以使用其他將DNA導(dǎo)入完整細(xì)胞或組織的方法。例如，谷物從不成熟的胚胎或外植體的再生可以如所述受到影響(Vasil，Biotechnology6397(1988))。另外，可以使用“微粒槍”或高速微粒技術(shù)(Vasil等，BiolTechnology10667(1992))。使用微粒槍技術(shù)，DNA附著于小的金屬顆粒表面，穿過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞漿(Klein等，Nature32870(1987)；Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)858502-8505(1988)；McCabe等，Bio/technology6923(1988))。金屬微粒穿過細(xì)胞的一些層，使組織外植體中的細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。還可以使用其他細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，包括但不局限于直接將DNA轉(zhuǎn)入花粉(Hess等，InternRev.Cytol.107367(1987)；Luo等，PlantMolBiol.Reporter6165(1988))、直接將DNA注射于植物的繁殖器官(Pena等，Nature325274(1987))或直接將DNA注射入不成熟的胚胎細(xì)胞，然后使干燥的胚胎再水化(Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.7530(1987))。植物從單個(gè)植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化子或各種轉(zhuǎn)化的外植體的再生、發(fā)育和培育在現(xiàn)有技術(shù)中已有(Weissbach和Weissbach，InMethodsforPlantMolecularBiology，AcademicPress，SanDiego，CA，(1988)))。這種再生和生長(zhǎng)過程通常包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇、個(gè)體細(xì)胞從通常的胚胎階段到根胚階段的培育。轉(zhuǎn)基因胚胎和種子也用同樣方法再生。接著將轉(zhuǎn)基因苗種植于土壤等合適的植物培養(yǎng)基上。含有編碼目的蛋白的外源基因的植物的發(fā)育或再生在現(xiàn)有技術(shù)中已有。優(yōu)選再生植物為自身授粉，以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物。否則，將從再生植物得到的花粉與農(nóng)學(xué)上重要種系的種子發(fā)育的植物雜交。反過來，用這些重要種系植物的花粉給再生植物授粉。本發(fā)明的含有目的多肽的轉(zhuǎn)基因植物用眾所周知的現(xiàn)有技術(shù)培育。有各種各樣的方法可以從植物組織再生植物。再生的方法的選用取決于起始的植物組織和再生的植物種類。轉(zhuǎn)化雙子葉植物獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，主要是通過根瘤農(nóng)桿菌，在棉花(U.S.Patent5,004,863；U.S.Patent5,159,135；U.S.Patent5,518,908)、大豆((U.S.Patent5,569,834；U.S.Patent5,416,011；McCabe等，Biotechnology6923(1988)；Christou等，PlantPhysio.87671-674(1988))、蕓苔(U.S.Patent5,463,174)、花生(Cheng等，PlantCellRep.15653-657(1996)，McKently等，PlantCellRep.14699-703(1995))、木瓜、豌豆(Grant等，PlantCellRep.15254-258(1995))、和擬南芥(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，LifeSci.3161194-1199(1993))等中的應(yīng)用已出版。轉(zhuǎn)化擬南芥的方法通常稱作“浸涂”或真空滲入或胚質(zhì)轉(zhuǎn)化。用電穿孔、微粒轟擊和農(nóng)桿菌方法轉(zhuǎn)化單子葉植物也已有報(bào)道。轉(zhuǎn)化和植物再生已在蘆筍(Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)845354(1987)))、大麥((Wan和Lemaux，PlantPhysiol10437(1994))、玉米(Rhodes等，Science240204(1988)；Gordon-Kamm等，PlantCell2603-618(1990)；Fromm等，Bio/Technology8833(1990)；Koziel等，Bio/Technology11194(1993)；Armstrong等，CropScience35550-557(1995))、燕麥(Somers等，Bio/Technology101589(1992))、鴨茅(Horn等，PlantCellRep.7469(1988))、稻(Toriyama等，TheorAppl.Genet.20534(1986)；Part等，PlantMol.Biol.321135-1148(1996)；Abedinia等，Aust.J.PlantPhysiol.24133-141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76835(1988)；Zhang等，PlantCellRep.7379(1988)；Battraw和Hall，PlantSci.86191-202(1992)；Christou等，Bio/Technology9957(1991))、裸麥(DelaPena等，Nature325274(1987)、甘蔗(Bower和Birch，PlantJ.2409(1992))、高牛毛草(Wang等，Bio/Technology10691(1992))以及小麥((Vasil等，Bio/Technology10667(1992)；U.S.Patent5,631,152)中完成。已發(fā)展出一些基于克隆核酸構(gòu)建體的瞬時(shí)表達(dá)的基因表達(dá)分析方法，其中核酸分子通過聚乙二醇處理、電穿孔或微粒轟擊(Marcotte等，Nature335454-457(1988)；Marcotte等，PlantCell1523-532(1989)；McCarty等，Cell66895-905(1991)；Hattori等，GenesDev.6609-618(1992)；Goff等，EMBOJ.92517-2522(1990))導(dǎo)入植物細(xì)胞。瞬時(shí)表達(dá)也可以用于功能性分離基因構(gòu)建體(參見Mailga等，MethodsinPlantMolecularBiology，ColdSpringHarborPress(1995))。本發(fā)明的任何核酸均可以與其他基因元件如載體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等組合，以永久或瞬時(shí)的方式導(dǎo)入植物細(xì)胞。另外，本發(fā)明的任何核酸分子均可以導(dǎo)入植物細(xì)胞，以允許其所編碼的蛋白或其片段表達(dá)或過表達(dá)。共抑制指的是某一內(nèi)源基因或基因家族表達(dá)水平(通常是在RNA水平)的降低，其原因是所轉(zhuǎn)錄mRNA鏈與內(nèi)源基因相同的同源正義構(gòu)建體的表達(dá)(Napoli等，PlantCell2279-289(1990)；vanderKrol等，PlantCell2291-299(1990))。共抑制可以是由與細(xì)胞某一核酸序列同源的核酸分子的單拷貝穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所引起(Prolls和Meyer，PlantJ.2465-475(1992))，也可以是由多拷貝轉(zhuǎn)化引起(Mittlesten等，Mol.Gen.Genet.244325-330(1994))。與同源啟動(dòng)子連接的基因，即使不同，也會(huì)引起鄰接基因的共抑制(Vaucheret，C.R.Acad.Sci.III3161471-1483(1993)；Flavell，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)913490-3496(1994))；vanBlokland等，PlantJ.6861-877(1994)；Jorgensen，TrendsBiotechnol.8340-344(1990)；Meins和Kunz，InGeneInactivationandHomologousRecombinationinPlants，Paszkowski(ed.)，pp.335-348，KluwerAcademic，Netherlands(1994))?？梢岳斫?，本發(fā)明的一或多個(gè)核酸可以導(dǎo)入植物細(xì)胞，并用合適的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致內(nèi)源蛋白的共抑制。反義途經(jīng)是通過靶向于基因物質(zhì)而防止或降低基因功能的一種方法(Mol等，F(xiàn)EBSLett.268427-430(1990))。反義途經(jīng)的目的是通過使用與靶基因互補(bǔ)的序列，來阻斷靶基因表達(dá)，導(dǎo)致靶蛋白水平選擇性降低或完全缺失的突變細(xì)胞系或生物體。反義技術(shù)相對(duì)于其他的“反基因”方法有一些優(yōu)點(diǎn)。失活位點(diǎn)及其對(duì)發(fā)育的影響可以通過反義基因啟動(dòng)子的選擇或外部應(yīng)用的時(shí)間選擇或顯微注射來操縱。反義可以通過選擇靶基因特有的區(qū)域或與其他相關(guān)基因同源的區(qū)域來控制其特異性(Hiatt等，InGeneticEngineering，Setlow(ed.)，Vol.11，NewYorkPlenum49-63(1989))。反義RNA技術(shù)涉及將與靶mRNA互補(bǔ)的RNA導(dǎo)入細(xì)胞，然后通過反義底物與靶mRNA的堿基配對(duì)形成特異的RNA:RNA雙鏈(Green等，Annu.Rev.Biochem.55569-597(1986))。在一個(gè)實(shí)施方案中，過程涉及到了反義基因序列的導(dǎo)入和表達(dá)。反義序列指的是這樣的序列，其中將正?；蛐蛄械牟糠只蛉糠聪蛑糜趩?dòng)子的下游，以便“錯(cuò)誤的”或互補(bǔ)的鏈轉(zhuǎn)錄為非編碼的反義RNA，從而與靶RNA雜交并干擾其表達(dá)(Takayama和Inouye，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25155-184(1990))。反義載體的構(gòu)建體用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射及感染等導(dǎo)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的類型及載體的選擇將決定是瞬時(shí)表達(dá)還是穩(wěn)定表達(dá)。反義基因所用的啟動(dòng)子會(huì)影響反義抑制的水平、時(shí)間、組織、特異性或誘導(dǎo)性?？梢岳斫猓绻参锛?xì)胞含有一種核酸，其非轉(zhuǎn)錄鏈編碼一種蛋白或其片段，那么該植物細(xì)胞中此種蛋白的活性便會(huì)降低或受到抑制。活性通過任何方法降低或受到抑制的蛋白優(yōu)選tMT2。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選δ-生育酚或δ-生育三烯酚的濃度升高?；钚酝ㄟ^任何方法降低或受到抑制的另一個(gè)優(yōu)選蛋白是尿黑酸雙加氧酶。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)會(huì)導(dǎo)致植物的病毒免疫或基因沉默。PTGS由dsRNA誘導(dǎo)，通過胞漿RNA-依賴性RNA聚合酶(要求有dsRNA模板)介導(dǎo)。dsRNA通過互補(bǔ)的轉(zhuǎn)基因mRNA或該轉(zhuǎn)錄子的互補(bǔ)區(qū)域區(qū)域雜交形成。雙鏈形成可以通過共同定位于植物基因組的正義基因和反義基因的轉(zhuǎn)錄子、自身互補(bǔ)的單轉(zhuǎn)錄子以及通過雜交而到一起的正義和反義轉(zhuǎn)錄子來完成。dsRNA依賴性的RNA聚合酶從轉(zhuǎn)基因mRNA和附著于這一互補(bǔ)鏈(cRNA)的RNAse分子形成互補(bǔ)的鏈。這些cRNA-RNAse分子與內(nèi)源mRNA雜交，并切割與雜交體相鄰的單鏈RNA。切割的單鏈RNA進(jìn)一步被其他宿主Rnases降解，因?yàn)槠淙狈ζ渲幸粋€(gè)缺乏5’端帽狀結(jié)構(gòu)，另一個(gè)缺乏poly(A)尾(Waterhouse等，PNAS9513959-13964(1998))。可以理解，將本發(fā)明的一或多個(gè)核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)源轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。已有抗體在植物中表達(dá)(Hiatt等，Nature34276-78(1989)；Conrad和Fielder，PlantMol.Biol.261023-1030(1994))。已報(bào)道，一種scFv(單鏈Fv抗體)的胞漿表達(dá)可以延緩artichokemottledcrinkle病毒感染。表達(dá)抗內(nèi)源蛋白抗體的轉(zhuǎn)基因植物也會(huì)呈現(xiàn)生理效應(yīng)(Hiatt等，Nature34276-78(1989)；Conrad和Fielder，PlantMol.Biol.261023-1030(1994))。例如，已報(bào)道，表達(dá)的抗脫落的抗體導(dǎo)致總體種子發(fā)育的干擾(Philips等，EMBOJ164489-4496(1997))。催化性的抗體也可以在植物表達(dá)(抗體酶)?？贵w酶的機(jī)理是這樣的抗體可以針對(duì)許多分子，這種識(shí)別能力也可以定向的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換態(tài)結(jié)合的抗體，促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)(Persidas，NatureBiotechnology151313-1315(1997))?？贵w酶的催化能力可以通過定點(diǎn)突變得到增強(qiáng)。示例性抗體酶如U.S.Patent5,658,753；U.S.Patent5,632,990；U.S.Patent5,631,137；U.S.Patent5,602,015；U.S.Patent5,559,538；U.S.Patent5,576,174；U.S.Patent5,500,358；U.S.Patent5,318,897；U.S.Patent5,298,409；U.S.Patent5,258,289和U.S.Patent5,194,585，所述?？梢岳斫猓景l(fā)明的任何抗體都可以在植物表達(dá)，這種表達(dá)可導(dǎo)致一定的生理效應(yīng)。也可以理解，任何表達(dá)的抗體都可以是催化性的。本發(fā)明也提供植物的部分，尤其是繁殖和儲(chǔ)藏部分。植物的部分無任何限制的包括種子、胚乳、胚珠和花粉。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，植物部分指種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，種子是動(dòng)物飼料的一個(gè)組成。在另一實(shí)施方案中，植物部分是果實(shí)，更優(yōu)選貨架期增強(qiáng)的果實(shí)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，果實(shí)中的一種生育酚水平升高。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，果實(shí)中的一種生育三烯酚水平升高。本發(fā)明還提供一種容器，其中種子的含量超過約10,000，優(yōu)選約20,000，更優(yōu)選約40,000，其中衍生于本發(fā)明所述植物的種子含量超過約10％，優(yōu)選約25％，更優(yōu)選約50％，更優(yōu)選約75％，更優(yōu)選約90％。本發(fā)明還提供一種容器，其中種子的重量超過約10kg，優(yōu)選約25kg，更優(yōu)選約50kg，其中衍生于本發(fā)明所述植物的種子含量超過約10％，優(yōu)選約25％，更優(yōu)選約50％，更優(yōu)選約75％，更優(yōu)選約90％。本發(fā)明的任何一種植物或其部分都可加工成飼料、食物、蛋白活油制劑，包括總生育酚含量高的油制劑以及此處所述任何一種或多種生育酚含量高的油制劑。優(yōu)選的植物部分是種子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，飼料、食物、蛋白或油制劑為家畜或人或兩者而設(shè)計(jì)?，F(xiàn)有技術(shù)已有制備飼料、食物、蛋白或油制劑的方法。參見，如U.S.Patent4,957,748，5,100,679，5,219,596，5,936,069，6,005,076，6,146,669和6,156,227。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白制劑是一種高蛋白制劑。高蛋白制劑優(yōu)選蛋白含量超過約5％，更優(yōu)選約10％，更優(yōu)選約15％w/v。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，油制劑是一種液體，體積超過約1，5，10或50升。本發(fā)明提供從本發(fā)明的植物制備或用本發(fā)明的方法制備的油。這種油表現(xiàn)出增強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性。而且，這種油也可以是其他產(chǎn)物的一小部分或一大部分。另外，這種油還可以與其他油混合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從本發(fā)明的植物制備或用本發(fā)明的方法制備的油，在一種產(chǎn)物的體積或重量中的百分比超過約0.5％、1％、5％、10％、25％、50％、75％或90％。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，油制劑可以混合，在一種產(chǎn)物的體積中的百分比超過約10％、25％、35％、50％或75％。從本發(fā)明的植物制備的油可以與一或多種有機(jī)溶劑或石油蒸餾物混合。本發(fā)明的植物可以是育種項(xiàng)目的一部分或來自于育種項(xiàng)目。育種方法的選擇有賴于植物繁殖的方式、要改進(jìn)的遺傳性狀以及商業(yè)用的品種的類型(如F1雜交品種、純系品種等)。如下提供了培育本發(fā)明的植物的可選方法，但方法并不僅限于此。通過使用輔助篩選雜交子代的標(biāo)記，可以促進(jìn)育種項(xiàng)目。可以理解，任何商業(yè)或非商業(yè)的品種均可以在雜交項(xiàng)目中使用。一些因素如突出勢(shì)、營養(yǎng)勢(shì)、壓力耐受、疾病抗性、分支、開花、結(jié)籽率(seedset)、種子體積、種子密度、堅(jiān)韌度以及脫粒率等都會(huì)影響選擇。對(duì)于高遺傳性的性狀，通過單位點(diǎn)的評(píng)價(jià)來選擇個(gè)體植株是有效的。但對(duì)于低遺傳性性狀，篩選應(yīng)當(dāng)在對(duì)相關(guān)植物家族的重復(fù)評(píng)價(jià)的平均值基礎(chǔ)上進(jìn)行。常用的篩選方法包括譜系篩選、改進(jìn)的譜系篩選、群體篩選和回復(fù)篩選。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)行了回交或回復(fù)育種項(xiàng)目。遺傳的復(fù)雜性影響育種方法的選擇?？梢杂没亟挥N的方法將一個(gè)或一些具有高度遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移入一個(gè)理想的品種。這種方法已在培育疾病抗性品種中廣泛應(yīng)用。各種回復(fù)篩選的技術(shù)被用來提高大量基因控制的數(shù)量遺傳性狀?；貜?fù)篩選在自身授粉作物的使用取決于授粉的難易、每次授粉成功雜交的機(jī)率以及從成功雜交產(chǎn)生雜交子代的數(shù)量等。對(duì)培育的種系進(jìn)行檢測(cè)，并與合適的標(biāo)準(zhǔn)在商業(yè)目標(biāo)區(qū)域的代表性環(huán)境中進(jìn)行兩或更多代的對(duì)比。優(yōu)良種系作為新的商業(yè)品種的候選；那些仍就缺乏性狀的種系可作為親本，產(chǎn)生新的子代，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。其他識(shí)別優(yōu)良植物的方法是觀察其相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)植物和廣泛生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)品系的表現(xiàn)。如果單一的觀察不具有結(jié)論性，則進(jìn)行重復(fù)的觀察，提供對(duì)其遺傳價(jià)值的更好的估計(jì)。育種者可以篩選和雜交兩個(gè)或更多的親本，然后重復(fù)自交和篩選，產(chǎn)生許多新的遺傳組合。新的品系的形成需要經(jīng)過對(duì)多個(gè)植株的培育和篩選、這些植株的雜交以及較好雜交體的篩選。雜交種子可以通過選擇的雄性生育親本之間的人工雜交或者通過利用雄性生育系統(tǒng)來產(chǎn)生。雜交體通過特定的表明種子是一個(gè)真的雜交體的單基因性狀如莢的顏色、花的顏色、種子的產(chǎn)量、軟毛顏色或殺蟲劑抗性等來進(jìn)行篩選。另外一些雜交體的表型以及親本的數(shù)據(jù)影響育種者的判斷，來決定是否繼續(xù)進(jìn)行特異的雜交交配。可以利用純種育種和回復(fù)篩選育種的方法從育種群體中形成品系。育種項(xiàng)目將來源于兩個(gè)或多個(gè)品系或各種各樣更為廣泛基礎(chǔ)上的性狀結(jié)合起來，形成培育庫，然后通過自交和理想表型的篩選來培育品系。進(jìn)一步對(duì)新的品系進(jìn)行評(píng)價(jià)，以確定哪個(gè)具有商業(yè)潛力。純種培育被廣泛用于自身授粉作物的改進(jìn)。兩個(gè)攜帶有理想的互補(bǔ)性狀的親本互相雜交，產(chǎn)生F1。通過一個(gè)或幾個(gè)F1的自身交配得到F2。從最優(yōu)家族篩選最優(yōu)個(gè)體。家族的重復(fù)檢測(cè)可以從F4代開始，以提高低遺傳性狀篩選的有效性。在近交的高級(jí)階段(即F6和F7)，對(duì)最優(yōu)種系和表型相似種系的混合物進(jìn)行檢測(cè)，來確定其作為新品系的潛力。回復(fù)育種已被用于將一個(gè)簡(jiǎn)單遺傳的具有高度遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移入一個(gè)理想的同源品系或近交品系(作為回復(fù)親本)。被轉(zhuǎn)移的性狀的來源稱為供體親本。所得的植物應(yīng)該具有回復(fù)親本的特性(如品系)以及從供體親本來的理想性狀。起始雜交后，選擇具有供體親本表型的個(gè)體，與回復(fù)親本進(jìn)行重復(fù)雜交(回交)。所得的植物應(yīng)該具有回復(fù)親本的特性(如品系)以及從供體親本來的理想性狀。從嚴(yán)格意義上講，單種子世代方法指每株植物單種子收集一個(gè)樣品。利用單種子樣品種植下一代。當(dāng)群體已從F2進(jìn)展到近交的理想水平時(shí)，追蹤其種系衍生的不同F(xiàn)2個(gè)體。因?yàn)橐恍┓N子不發(fā)芽，或者一些植物沒有產(chǎn)生至少一個(gè)種子，所以群體中植物的數(shù)量隨傳代而減少。因而，當(dāng)傳代完成時(shí)，不是所有從群體中采樣的F2植株都能在子代中找到其代表。多種子方法中，育種者通常從群體的每個(gè)植株中收獲一或多個(gè)莢，然后一起脫粒，形成一批。一批中的一部分種植產(chǎn)生下一代，一部分保存下來。這種方法稱為改良的單種子世代方法或莢批技術(shù)。多種子方法已被用于節(jié)省收獲時(shí)的勞動(dòng)力。用機(jī)器脫粒顯著快于單種子方法中的手工脫粒。而且，多種子方法還使每代近交每個(gè)群體種植同樣數(shù)量的種子稱為可能。常用的其他不同性狀不同作物的育種方法在一些參考書中可以找到(例如Fehr，PrinciplesofCultivarDevelopmentVol.1，pp.2-3(1987))。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物也可以通過無配生殖來繁殖。無配生殖是植物中的一種遺傳控制的繁殖方法，其中胚胎不經(jīng)過卵和精子的結(jié)合而形成。有四種基本的無配生殖方式1)無孢子生殖，其中胚胎從衍生于細(xì)胞核的胚囊中的染色體未降解的卵發(fā)育而來，2)二倍性孢子形成，其中胚胎從衍生于巨孢子母細(xì)胞的胚囊中的未降解的卵發(fā)育而來，3)不定胚，其中胚胎直接來源于體細(xì)胞。在多數(shù)的無配生殖方式中，假受精或極核受精以產(chǎn)生胚乳對(duì)種子活力是必須的。在無孢子生殖，保育品系可作為種子胚乳形成的花粉源。保育品系不影響無孢子生殖的無配生殖品系，因?yàn)殡m然品系的未降解的卵單性生殖而來，但卻使胚乳的產(chǎn)生成為可能。無配生殖在經(jīng)濟(jì)上非常重要，尤其在轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)樗谷魏位蛐?無論多么外源)的培育稱為現(xiàn)實(shí)。因而，通過無配生殖繁殖，外源基因經(jīng)過反復(fù)的生活周期，仍能保留其遺傳保真性。產(chǎn)生無配生殖植物的方法在現(xiàn)有技術(shù)中為已知。參見U.S.Patent5,811,636。其他生物本發(fā)明的核酸分子可以導(dǎo)入任何細(xì)胞或生物體，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物、魚的細(xì)胞、魚、鳥的細(xì)胞、鳥、藻類細(xì)胞、藻類、真菌細(xì)胞、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白可以在適當(dāng)?shù)募?xì)胞或生物體產(chǎn)生。優(yōu)選的宿主或轉(zhuǎn)化體包括真菌細(xì)胞如曲霉、酵母、哺乳動(dòng)物、尤其是牛和豬、昆蟲、細(xì)菌和藻類。更優(yōu)選的細(xì)菌是根瘤農(nóng)桿菌和大腸桿菌?，F(xiàn)有技術(shù)已有轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞或生物體的方法(EP0238023；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，811470-1474(1984)；Malardier等，Gene，78147-156(1989)；Becker和Guarente，InAbelsonandSimon(eds.)，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodEnzymol.，Vol.194，pp.182-187，AcademicPress，Inc.，NewYork；Ito等，J.Bacteriology，153163(1983)Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，751920(1978)；Bennett和LaSure(eds.)，MoreGeneManipualtioninsinfungi，AcademicPress，CA(1991))。也已有產(chǎn)生本發(fā)明蛋白的方法(Kudla等，EMBO，91355-1364(1990)；Jarai和Buxton，CurrentGenetics，262238-2244(1994)；Verdier，Yeast，6271-297(1990；MacKenzie等，JournalofGen.Microbiol.，1392295-2307(1993)；Hartl等，TIBS，1920-25(1994)；Bergenron等，TIBS，19124-128(1994)；Demolder等，J.Biotechnology，32179-189(1994)；Craig，Science，2601902-1903(1993)；Gething和Sambrook，Nature，35533-45(1992)；Puig和Gilbert，J.Biol.Chem.，2697764-7771(1994)；Wang和Tsou，F(xiàn)ASEBJournal，71515-1517(1993)；Robinson等，Bio/Technology，1381-384(1994)；Enderlin和Ogrydziak，Yeast，1067-79(1994)；Fuller等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，861434-1438(1989)；Julius等，Cell，371075-1089(1984)；Julius等，Cell32839-852(1983))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種蛋白或其片段在細(xì)胞或生物體的過表達(dá)，使該細(xì)胞或生物體相對(duì)于與其具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體來講，生育酚的含量增高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種蛋白或其片段在細(xì)胞或生物體的過表達(dá)，使該細(xì)胞或生物體相對(duì)于與其具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體來講，α-生育酚的含量增高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種蛋白或其片段在細(xì)胞或生物體的過表達(dá)，使該細(xì)胞或生物體相對(duì)于與其具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體來講，γ-生育酚的含量增高。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種蛋白或其片段在細(xì)胞或生物體的過表達(dá)，使該細(xì)胞或生物體相對(duì)于與其具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體來講，α-生育三烯酚的含量增高。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種蛋白或其片段在細(xì)胞或生物體的過表達(dá)，使該細(xì)胞或生物體相對(duì)于與其具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體來講，γ-生育三烯酚的含量增高?？贵w本發(fā)明一方面涉及抗體，單鏈抗原結(jié)合分子或其他與本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)蛋白或多肽分子特異結(jié)合的蛋白及其直向同源物、融合或片段。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體特異的與具有SEQIDNOs16-38所示氨基酸序列的蛋白或其片段結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，抗體特異的與包含SEQIDNOs16-38所示氨基酸序列的融合蛋白或其片段結(jié)合。本發(fā)明的抗體可用于對(duì)本發(fā)明的蛋白或多肽分子或蛋白的翻譯后修飾進(jìn)行定量或定性檢測(cè)。此處所謂的一種抗體或多肽“特異結(jié)合”于本發(fā)明的一種蛋白或多肽分子，是指其結(jié)合不受非相關(guān)分子出現(xiàn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。編碼本發(fā)明的蛋白或其片段的核酸分子可以經(jīng)由重組的方式進(jìn)行表達(dá)，所產(chǎn)生的蛋白或多肽又可以反過來用于激發(fā)能與其結(jié)合的抗體。這些抗體可以用于所述蛋白的免疫分析。這樣的蛋白編碼分子或其片段可以是一種“融合”分子(即大的核酸分子的一部分)，因而，表達(dá)后會(huì)產(chǎn)生一種融合蛋白?？梢岳斫?，本發(fā)明的任何核酸分子均可以經(jīng)由重組的方式進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生由這些核酸分子編碼的蛋白或多肽。與本發(fā)明的蛋白或其片段特異結(jié)合的抗體可以是多克隆或單克隆的，可以包含完整的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的抗原結(jié)合部分(如((F(ab′)，F(xiàn)(ab′)2)或單鏈免疫球蛋白，經(jīng)由如重組等方式產(chǎn)生。容易理解，操作者熟悉描述抗體構(gòu)建、操作及分離的特異條件和程序的標(biāo)準(zhǔn)的參考資料(參見Harlow和Lane，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1988))。如下所討論，這些抗體分子或其片段可用于診斷的目的。當(dāng)用于診斷目的時(shí)，最好將其與如一個(gè)配體基團(tuán)(如生物素)或一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記基團(tuán)(如熒光基團(tuán)、放射性同位素或酶)相結(jié)合。產(chǎn)生能與本發(fā)明的蛋白或多肽分子結(jié)合的抗體的能力允許對(duì)衍生于這些分子的擬態(tài)化合物的識(shí)別。這些擬態(tài)化合物可以包含蛋白或多肽的一個(gè)片段或僅僅一個(gè)結(jié)構(gòu)類似區(qū)，但卻呈現(xiàn)出與該化合物的抗體特異結(jié)合的能力。示例性應(yīng)用本發(fā)明的核酸分子或其片段可以用于從同類來獲得其他的核酸分子(玉米來源的核酸分子可以用于獲得其他玉米來源的核酸分子)。這樣的核酸分子包括編碼一種蛋白的完整的編碼序列的核酸分子和啟動(dòng)子及其這些分子的側(cè)翼序列。而且，這樣的核酸分子還包括編碼其他同工酶或基因家族成員的核酸分子。通過利用上述的核酸分子或其片段來篩選cDNA或基因組文庫，可以很容易的獲得這樣的分子?，F(xiàn)有技術(shù)已知構(gòu)建這些文庫的方法。本發(fā)明的核酸分子或其片段還可以用于獲得核酸直向同源物。這樣的直向同源物包括植物及其他生物體(包括細(xì)菌和真菌)的核酸分子，包括全部或部分編碼其他植物種類和其他生物體的蛋白直向同源物的核酸分子，還包括基因元件序列(如啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件)。通過利用上述的核酸分子或其片段來篩選這樣的植物種類的cDNA或基因組文庫，可以很容易的獲得這樣的分子?，F(xiàn)有技術(shù)已知構(gòu)建這些文庫的方法。這樣的直向同源物的核酸序列與一或多個(gè)來自于SEQIDNOs1-15及其互補(bǔ)序列的序列可以不同，因?yàn)橥耆パa(bǔ)并非穩(wěn)定雜交所必須。因而，本發(fā)明的核酸分子還包括能與核酸分子特異雜交但又缺乏“完全互補(bǔ)性”的分子。多種方法中的任何一種均可用來獲得一或多個(gè)上述的核酸分子(Zamechik等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)834143-4146(1986)；Goodchild等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)855507-5511(1988)；Wickstrom等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)851028-1032(1988)；Holt等，Molec.Cell.Viol.8963-973(1988)；Gerwirtz等，Science2421303-1306(1988)；Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)863379-3383(1989)；Becker等，EMBOJ.83685-3691(1989))。自動(dòng)核酸合成儀可用于達(dá)到此目的。在此情況下，公開的核酸分子可用來定義一對(duì)可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物(Mullis等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51263-273(1986)；Erlich等，EuropeanPatent50,424；EuropeanPatent84,796；EuropeanPatent258,017；EuropeanPatent237,362；Mullis，EuropeanPatent201,184；Mullis等，U.S.Patent4,683,202；Erlich，U.S.Patent4,582,788；和Saiki等，U.S.Patent4,683,194))，從而擴(kuò)增得到任何理想的核酸分子或其片段。還可以用此處公開的核酸序列來獲得與一或多個(gè)公開的核酸序列相連的啟動(dòng)子序列及其他基因元件(包括但不限于轉(zhuǎn)錄調(diào)控側(cè)翼序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將本發(fā)明的核酸分子與基因組文庫成員孵育，回收與這些核酸分子雜交的克隆。在另一實(shí)施方案中，用“染色體步移(walking)”或反向PCR方法來獲得這樣的序列(Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)858998-9002(1988)；Ohara等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)865673-5677(1989)；Pang等，Biotechniques221046-1048(1977)；Huang等，MethodsMol.Biol.6989-96(1997)；Huang等，MethodMol.Biol.67287-294(1997)；Benkel等，Genet.Anal.13123-127(1996)；Hartl等，MethodsMol.Biol.58293-301(1996))。“染色體步移”這一術(shù)語指通過連續(xù)的雜交步驟來擴(kuò)展基因圖譜的過程。本發(fā)明的核酸分子可以用來分離細(xì)胞增強(qiáng)的、細(xì)胞特異的、組織增強(qiáng)的、組織特異的、發(fā)育或環(huán)境調(diào)節(jié)表達(dá)分布圖的啟動(dòng)子。用基因組篩選方法和PCR技術(shù)從基因組文庫對(duì)這些基因的5’側(cè)翼啟動(dòng)子序列進(jìn)行分離和功能分析，會(huì)分離出有用的啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。這些方法在現(xiàn)有技術(shù)為已知，已有相關(guān)描述(參見，例如Birren等，GenomeAnalysisAnalyzingDNA，1，(1997)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.)。可以對(duì)用本發(fā)明的核酸分子獲得的啟動(dòng)子進(jìn)行修飾以影響其控制特性。示例性的修飾方法包括但不局限于增強(qiáng)子序列。此類基因元件可以用來增強(qiáng)新的或已存在的性狀的基因表達(dá)，以改進(jìn)作物。本發(fā)明的另一核酸分子子集包括作為標(biāo)記的核酸分子。標(biāo)記在分子遺傳學(xué)中廣為應(yīng)用。此類標(biāo)記包括SEQIDNos1-15及其互補(bǔ)序列或兩者的片段中可以作為標(biāo)記的核酸分子或本發(fā)明的其他可作為標(biāo)記的核酸分子。本發(fā)明的基因標(biāo)記包括“顯性”或“共顯性”標(biāo)記?！肮诧@性標(biāo)記”表明一個(gè)基因座有兩個(gè)或以上的等位基因(每個(gè)二倍體個(gè)體兩個(gè))?！帮@性標(biāo)記”表明每個(gè)基因座只有一個(gè)等位基因。顯性標(biāo)記表型的出現(xiàn)(例如DNA的一條帶)表明一種等位基因處于純合或雜合的狀況。顯性標(biāo)記表型的缺失(如DNA條帶的消失)僅表明“一些其他的”未定義的等位基因出現(xiàn)了。在一個(gè)其中的個(gè)體主要是純合，基因座主要是雙態(tài)的群體中，顯性或共顯性標(biāo)記具有同等價(jià)值。隨著群體越來越雜合和多-等位基因，共顯性標(biāo)記比顯性標(biāo)記更能體現(xiàn)基因型。標(biāo)記分子可以用來檢測(cè)如多態(tài)性，如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。動(dòng)物和植物在其連續(xù)的進(jìn)化過程中，會(huì)經(jīng)歷自發(fā)的變異(Gusella，Ann.Rev.Biochem.55831-854(1986))?！岸鄳B(tài)性”是指在某個(gè)種類的一些成員中出現(xiàn)的基因或其側(cè)翼區(qū)的序列的改變或差異。改變的序列和“原始”序列共存于該種類的群體中。某些情況下，這樣的共存處于穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的平衡中。多態(tài)性也可以稱為“等位的”，因?yàn)橛捎诙鄳B(tài)性的存在，群體中的一些成員具有原始序列(即原來的“等位基因”)，而其他成員可能含有變異的序列(即變異的“等位基因”)。在最簡(jiǎn)單的例子中，只有一種變異序列存在，多態(tài)性因而被稱為雙等位的。在其他例子中，種類的群體可以包括多個(gè)等位基因，多態(tài)性被稱為三等位的，等等。單基因可以有多個(gè)非相關(guān)的多態(tài)性。例如，它可以在一個(gè)位點(diǎn)有雙等位的多態(tài)性，而在另一個(gè)位點(diǎn)有多等位的多態(tài)性。限定多態(tài)性的突變可以從單核苷酸突變到基因內(nèi)擴(kuò)展區(qū)域的插入或缺失。某些情況下，基因組中DNA序列的突變位于具有短串聯(lián)重復(fù)(STRs)特征的區(qū)域，包括兩個(gè)或三個(gè)核苷酸重復(fù)基序。以串聯(lián)重復(fù)為特征的多態(tài)性稱為“數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)”(VNTR)多態(tài)性。VNTRs已被用于鑒定分析(Weber，U.S.Patent5,075,217；Armour等，F(xiàn)EBSLett.307113-115(1992)；Jones等，Eur.J.Haematol.39144-147(1987)；Horn等，PCTPatentApplicationW091/14003；Jeffreys，EuropeanPatentApplication370,719；Jeffreys，U.S.Patent5,175,082；Jeffreys等，Amer.J.Hum.Genet.3911-24(1986)；Jeffreys等，Nature31676-79(1985)；Gray等，Proc.R.Acad.Soc.Lond.243241-253(1991)；Moore等，Genomics10654-660(1991)；Jeffreys等，Anim.Genet.181-15(1987)；Hillel等，Anim.Genet.20145-155(1989)；Hillel等，Genet.124783-789(1990))。使用核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以很方便地檢測(cè)樣品DNA中的多態(tài)位點(diǎn)。這些方法可以特異地提高多核苷酸的濃度，其中多核苷酸跨越多態(tài)位點(diǎn)或包含多態(tài)位點(diǎn)以及多態(tài)位點(diǎn)近端或遠(yuǎn)端的序列。這樣的擴(kuò)增分子可以很容易的通過凝膠電泳或其他方式進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，可以通過使用與多態(tài)位點(diǎn)物理連接的標(biāo)記核酸分子檢測(cè)多態(tài)性。其中，標(biāo)記的核酸分子包含位于多態(tài)性1mb范圍內(nèi)的多核苷酸，更優(yōu)選位于100kb范圍內(nèi)，最優(yōu)選位于10kb范圍內(nèi)。多態(tài)性的識(shí)別有多種方式。在植物，通過將其出現(xiàn)與缺失與一種表型的出現(xiàn)或缺失相聯(lián)系，可以預(yù)測(cè)植物的表型。如果多態(tài)性增加或破壞了一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，或者它導(dǎo)致DNA的缺失或插入(如VNTR多態(tài)性)，那么將會(huì)改變用該限制性內(nèi)切酶消化后所產(chǎn)生DNA片段的大小和分布圖。因此，可以用限制性片段分析將突變序列與原始序列區(qū)別開來。可以用此方式識(shí)別的多態(tài)性稱為“限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性”(“RFLPs”)(Glassberg，UKPatentApplication2135774；Skolnick等，Cytogen.CellGenet.3258-67(1982)；Botstein等，Ann.J.Hum.Genet.32314-331(1980)；Fischer等，(PCTApplicationWO90/13668；Uhlen，PCTApplicationWO90/11369))。多態(tài)性還可以通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析來識(shí)別(Elles，MethodsinMolecularMedicineMolecularDiagnosisofGeneticDiseases，HumanaPress(1996))；Orita等，Genomics5874-879(1989))。大量的方案描述了SSCP，包括但不限于Lee等，Anal.Biochem.205289-293(1992)；Suzuki等，Anal.Biochem.19282-84(1991)；Lo等，NucleicAcidsResearch201005-1009(1992)；Sarkar等，Genomics13441-443(1992)?？梢岳斫猓景l(fā)明的一或多個(gè)核酸可以作為標(biāo)記或探針通過SSCP分析來檢測(cè)多態(tài)性。多態(tài)性還可以通過稱為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)的DNA指紋技術(shù)來檢測(cè)，該技術(shù)以從總的基因組DNA消化產(chǎn)物中，選擇性PCR擴(kuò)增限制性片段為基礎(chǔ)來分析DNA(Vos等，NucleicAcidsRes.234407-4414(1995))。該方法特異地共擴(kuò)增大量的限制性片段，不需知道核酸序列也可以通過PCR識(shí)別?？梢岳斫?，本發(fā)明的一或多個(gè)核酸可以作為標(biāo)記或探針，通過AFLP分析來檢測(cè)多態(tài)性，也可以作為指紋RNA中的標(biāo)記或探針。多態(tài)性還可以通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)(Williams等，Nucl.AcidsRes.186531-6535(1990))和切割擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)分析來識(shí)別(Lyamichev等，Science260778-783(1993))?？梢岳斫?，本發(fā)明的一或多個(gè)核酸可以作為標(biāo)記或探針通過RAPD或CAPS分析來檢測(cè)多態(tài)性。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)較其他多態(tài)性標(biāo)記發(fā)生的頻率高，而且較其他已報(bào)道的多態(tài)性方式在整個(gè)基因組所處的位置也更一致。SNPs的更高的發(fā)生頻率和一致性意味著，在目的基因位點(diǎn)內(nèi)或其鄰近發(fā)現(xiàn)SNPs的可能性較其他多態(tài)性為高。SNPs位于基因組的蛋白編碼區(qū)或非編碼區(qū)。一些SNPs會(huì)導(dǎo)致缺陷或突變的蛋白表達(dá)(如突變或缺陷性拼接的結(jié)果)。特征性SNPs的分析(基因型)只要求+/-，而不要求長(zhǎng)度檢測(cè)，更容易自動(dòng)化?？梢杂枚喾N方法對(duì)SNPs進(jìn)行特征性分析。其中包括位點(diǎn)的直接或間接測(cè)序、限制酶的使用(Botstein等，Am.J.Hum.Genet.32314-331(1980)；Konieczny和Ausubel，PlantJ.4403-410(1993))、酶及化學(xué)錯(cuò)配分析(Myers等，Nature313495-498(1985))、等位基因特異PCR(Newton等，Nucl.AcidsRes.172503-2516(1989)；Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862757-2760(1989))、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88189-193(1991))、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Labrune等，Am.J.Hum.Genet.481115-1120(1991))、單堿基引物延伸(Kuppuswamy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA881143-1147(1991))，GoeletUS6,004,744；Goelet5,888,819))、固相ELISA為基礎(chǔ)的寡核苷酸連接分析(Nikiforov等，Nucl.AcidsRes.224167-4175(1994))、雙脫氧指紋(Sarkar等，genomics13441-443(1992))、寡核苷酸熒光淬滅分析(Livak等，PCRMethodsAppl.4357-362(1995a))、5’-核酸酶等位基因-特異雜交TaqManTM分析(Livak等，NatureGenet.9341-342(1995))、模板定向染色終止劑整合(TDI)分析(ChenandKwok，Nucl.AcidsRes.25347-353(1997))、等位基因特異分子信標(biāo)分析(Tyagi等，NatureBiotech.1649-53(1998))、PinPoint分析(Haff和Smirnov，GenomeRes.7378-388(1997))、dCAPS分析(Neff等，PlantJ.14387-392(1998))、pyrosequencing(Ronaghi等，AnalyticalBiochemistry26765-71(1999)；Ronaghi等PCTapplicationWO98/13523；Nyren等PCTapplicationWO98/28440；www.pyrosequencing.com)、用質(zhì)譜分析，如MasscodeTM系統(tǒng)(Howbert等PCTapplication，WO99/05319；Howbert等PCTapplicationWO97/27331；www.rapigene.com；Becker等PCTapplicationWO98/26095；Becker等PCTapplication；WO98/12355；Becker等PCTapplicationWO97/33000；Monforte等US5,965,363))、寡核苷酸探針的攻擊性切割(Lyamichev等NatureBiotechnology17292-296；www.twt.com)以及使用高密度寡核苷酸分析(Hacia等NatureGenetics22164-167；www.affymetrix.com))。多態(tài)性還可以通過使用等位基因-特異寡核苷酸(ASO)進(jìn)行檢測(cè)，ASO可以，例如，與基于雜交的技術(shù)聯(lián)合使用。后者包括Southern、Northern、斑點(diǎn)印記雜交、反向斑點(diǎn)印記雜交以及微陣列上進(jìn)行的雜交及其相關(guān)技術(shù)。多態(tài)性檢測(cè)時(shí)雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性高度依賴于各種因素，包括等位基因特異的寡核苷酸的長(zhǎng)度、序列組成、互補(bǔ)的程度(即堿基錯(cuò)配的出現(xiàn)或缺失)、鹽濃度及其他因素如甲酰胺和溫度。這些因素在雜交以及隨后的洗脫過程都很重要，洗脫的目的是去除未特異雜交的靶多核苷酸。實(shí)際操作中。最后的最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南疵摋l件是最關(guān)鍵的。而且，能與等位基因特異的寡核苷酸雜交的靶多核苷酸的量也受以下因素影響ASO和靶多核苷酸的濃度、“鎖定”水分子的因子的出現(xiàn)及濃度，“鎖定”水分子的目的是為了有效地濃縮試劑(如PEG、葡聚糖、硫酸葡聚糖等)，無論核酸分子是固相化的還是處于溶液中，以及雜交的持續(xù)和洗脫步驟。雜交優(yōu)選在ASO的融解溫度(Tm)之下進(jìn)行。雜交和/或洗脫步驟的溫度越接近Tm，嚴(yán)謹(jǐn)性越高。寡核苷酸的Tm值可以估計(jì)出來，例如，按如下的公式Tm＝81.5+16.6×(log10[Na+])+0.41×(％G+C)-675/n；其中，[Na+]是Na+或其他合適陽離子濃度的摩爾數(shù)，n＝寡核苷酸的堿基數(shù)。還有其他一些估算Tm值的公式，為現(xiàn)有技術(shù)中已知的普通技術(shù)。優(yōu)選對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)性進(jìn)行調(diào)整，以便給定的ASO能與含有正確等位基因的靶寡核苷酸以及含有錯(cuò)誤等位基因的靶寡核苷酸分別雜交。優(yōu)選，ASO與含有正確等位基因的靶寡核苷酸雜交所產(chǎn)生的信號(hào)與ASO與含有錯(cuò)誤等位基因的靶寡核苷酸交叉雜交(如突變等位基因特異的ASO與野生型等位基因交叉雜交)所產(chǎn)生的信號(hào)至少有兩倍的差異。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，有至少五倍的信號(hào)差異。特別優(yōu)選，有至少一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。盡管這里提出一些檢測(cè)多態(tài)性的方法，但其他方法也可以使用。例如，如下提出的一些已知方法Birren等，GenomeAnalysis，4135-186，ALaboratoryManual.MappingGenomes，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1999)；Maliga等，MethodsinPlantMolecularBiology.ALaboratoryCourseManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1995)；Paterson，BiotechnologyIntelligenceUnitGenomeMappinginPlants，R.G.LandesCo.，Georgetown，TX，andAcademicPress，SanDiego，CA(1996)；TheCornHandbook，F(xiàn)reelingandWalbot，eds.，Springer-Verlag，NewYork，NY(1994)；MethodsinMolecularMedicineMolecularDiagnosisofGeneticDiseases，Elles，ed.，HumanaPress，Totowa，NJ(1996)；Clark，ed.，PlantMolecularBiologyALaboratoryManual，Clark，ed.，Springer-Verlag，Berlin，Germany(1997)。在植物育種項(xiàng)目中，標(biāo)記輔助篩選的因素有(1)標(biāo)記應(yīng)當(dāng)共分離或與理想性狀密切相連；(2)應(yīng)該有從大批群體中篩選分子標(biāo)記的有效方法；(3)篩選技術(shù)在不同實(shí)驗(yàn)室之間有較好的重復(fù)性，優(yōu)選使用上較為經(jīng)濟(jì)較為友好的。標(biāo)記分子的基因連接可以通過以下的基因圖譜模式來建立，例如(無限制)Lander和Botstein在Genetics121185-199(1989)中所報(bào)道的側(cè)翼標(biāo)記模式以及Lander和Botstein在Genetics121185-199(1989)中所報(bào)道的基于最大可能性方法的間隔圖譜以及軟件包MAPMAKER/QTL中所實(shí)施的(Lincoln和Lander，MappingGenesControllingQuantitativeTraitsUsingMAPMAKER/QTL，WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch，Massachusetts，(1990))。其他的軟件包括Qgene，Version2.23(1996))。優(yōu)選使用Qgene軟件。計(jì)算標(biāo)記出現(xiàn)的最大可能性估計(jì)值(MLE)，結(jié)合假定無QTL效應(yīng)的MLE，以避免假陽性。優(yōu)勢(shì)比率的常用對(duì)數(shù)(LOD)如下式計(jì)算LOD＝1g(QTL出現(xiàn)的MLE/無連鎖QTL的MLE).LOD值表明QTL出現(xiàn)比不出現(xiàn)的可能性大多少。避免假陽性的LOD閾值(給定的可信度為95％)依賴于標(biāo)記的數(shù)目和基因組的長(zhǎng)度。表明LOD閾值的圖由Lander和Botstein在Genetics121185-199(1989)中提出，并進(jìn)一步由ArusandMoreno-González，PlantBreeding，Hayward等，(eds.)Chapman&Hall，London，pP.314-331(1993)所描述。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，目的性狀或表型的核酸標(biāo)記的LOD值優(yōu)選超過2.0，更優(yōu)選2.5，特別優(yōu)選超過3.0或4.0。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，目的性狀是改變的生育酚水平或組合物或改變的生育三烯酚或組合物。另外，還可以使用其他的模式。已經(jīng)報(bào)道了許多間隔圖譜的修飾和改變方法，包括非參數(shù)方法的使用(Kruglyak和Lander，Genetics1391421-1428(1995))。也可以使用多回歸方法或模式，其中性狀就大量標(biāo)記回歸(Jansen，BiometricsinPlantBreeding，vanOijen和Jansen(eds.)，ProceedingsoftheNinthMeetingoftheEucarpiaSectionBiometricsinPlantBreeding，TheNetherlands，pp.116-124(1994)；Weber和Wricke，AdvancesinPlantBreeding，Blackwell，Berlin，16(1994))。Jansen和Stam，Genetics1361447-1455(1994)，以及Zeng，Genetics1361457-1468(1994)已報(bào)道將間隔圖譜與回歸分析相結(jié)合的方法，其中表型在一個(gè)給定的標(biāo)記間隔回歸為單個(gè)推斷QTL，同時(shí)回歸為作為輔因子的大量標(biāo)記。通常，輔因子的使用可以降低估計(jì)QTL位點(diǎn)的偏性和樣品誤差(Utz和Melchinger，BiometricsinPlantBreeding，vanOijen和Jansen(eds.)ProceedingsoftheNinthMeetingoftheEucarpiaSectionBiometricsinPlantBreeding，TheNetherlands，pp.195-204(1994))。這些模式還可以擴(kuò)展到多環(huán)境實(shí)驗(yàn)，分析基因型和環(huán)境的相互作用(Jansen等，Theo.Appl.Genet.9133-37(1995))?？梢岳斫?，本發(fā)明的一或多個(gè)核酸可以作為分子標(biāo)記。也可以理解，本發(fā)明的一或多個(gè)蛋白分子也可以作為分子標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，出現(xiàn)了多態(tài)性，并在一個(gè)作圖群體(例如帶有多態(tài)性等標(biāo)記的一個(gè)植物群體)中進(jìn)行篩選，以便作出性狀的基因位點(diǎn)圖。適當(dāng)?shù)淖鲌D群體的選擇通常依賴于所用標(biāo)記系統(tǒng)的類型(Tanksley等，J.P.Gustafson和R.Appels(eds.).PlenumPress，NewYork，pp.157-173(1988))。在作圖群體中必須考慮親本的來源(適應(yīng)種對(duì)引進(jìn)種)。在廣交(適應(yīng)種×引進(jìn)種)時(shí)，染色體配對(duì)和重組率會(huì)受到嚴(yán)重干擾(抑制)，通常導(dǎo)致連接距離的大大降低。與狹交(引進(jìn)種×引進(jìn)種)相比，廣交通常提供給分離群體相對(duì)高數(shù)量的多態(tài)性。雜交體種子產(chǎn)生后，F(xiàn)2群體是自交(自身授粉)的第一代。通常，單個(gè)F1植株自交，產(chǎn)生按照孟德爾規(guī)律(1∶2∶1)分離所有基因的群體。最大的基因信息是通過使用共顯性標(biāo)記系統(tǒng)(Mather，MeasurementofLinkageinHeredityMethuenandCo.，(1938))，從完全分類的F2群體中獲得的。為了給群體分類，在顯性標(biāo)記情況下，要進(jìn)行子代實(shí)驗(yàn)(如F3、BCF2)來識(shí)別雜合子。然而，子代實(shí)驗(yàn)所耗費(fèi)的時(shí)間和資金使該方法的使用受到限制。F2個(gè)體的子代實(shí)驗(yàn)常常在圖譜構(gòu)建中使用，其中表型未必總是反應(yīng)基因型(如疾病抗性)或者性狀表達(dá)受控于QTL。子代實(shí)驗(yàn)(如F3、BCF2)的分離數(shù)據(jù)可用于圖譜構(gòu)建。在標(biāo)記性狀圖譜結(jié)合的基礎(chǔ)上，標(biāo)記輔助篩選可用于交叉子代(F2，F(xiàn)3)，其中連鎖基團(tuán)還沒有被重組完全分離開(即最大失衡)。重組的近交系(RIL)(遺傳相關(guān)品系；通常＞F5，從F2品系向純合子的連續(xù)自交發(fā)育而來)可以作為作圖群體。通過使用RIL，可以使從顯性標(biāo)記而來的信息最大化，因?yàn)樗形稽c(diǎn)都是純合或近似純合的。在緊密連鎖的情況下(即大約＜10％的重組)，在RIL群體評(píng)價(jià)的顯性和共顯性標(biāo)記比在回交群體的評(píng)價(jià)能提供更多的每個(gè)個(gè)體的信息(Reiter.Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)891477-1481(1992))然而，隨著標(biāo)記間距離的增大(即基因座更為獨(dú)立)，RIL群體的信息與共顯性標(biāo)記對(duì)比，顯著降低?；亟蝗后w(即由成功的品種(回復(fù)親本)和攜帶前者不具有性狀的品種(供體親本)雜交而來)也可以作為作圖群體?？梢赃M(jìn)行一系列的向回復(fù)親本的回交，以恢復(fù)其多數(shù)理想性狀。由此，構(gòu)建一個(gè)由與回復(fù)親本近似的個(gè)體組成的群體，但每個(gè)個(gè)體攜帶不同數(shù)量的供體親本的基因組區(qū)域或嵌合體。如果回復(fù)親本所有的基因座都是純合的且供體和回復(fù)親本具有相對(duì)比的多態(tài)性標(biāo)記等位基因，那么回交群體可用于給顯性標(biāo)記作圖(Reiter等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)891477-1481(1992))。用共顯性或顯性標(biāo)記從回交群體獲得的信息比從F2群體獲得的信息要少，因?yàn)槊總€(gè)植株只取一個(gè)而不是兩個(gè)重組配子。然而，回交群體又比RILs能提供更多的信息(低標(biāo)記飽和時(shí))，因?yàn)镽IL群體中連鎖基因座之間的距離增大(即大約0.15％的重組)。重組的增加有利于對(duì)緊密連鎖的分辨，單對(duì)于低標(biāo)記飽和的圖譜構(gòu)建則不太理想。近純合系(由許多次回交，產(chǎn)生一群除所研究的性狀或基因組區(qū)域外在基因組成上相近似的群體)也可以作為作圖群體。用NILs作圖時(shí)，只有多態(tài)性基因座的一部分可以對(duì)所選區(qū)域作圖。集團(tuán)分離分析(BSA)是一種發(fā)展起來的快速識(shí)別標(biāo)記和目的性狀之間連鎖的方法(0。BSA中，從單雜交來源的分離群體采集兩個(gè)集團(tuán)的DNA樣品。這些集團(tuán)包含某種性狀或基因組區(qū)域(對(duì)某種疾病的抗性或易感性)相似但不連鎖區(qū)域不同(即雜合)的個(gè)體。BSA許多個(gè)體的集團(tuán)樣品之間，與靶區(qū)域不連鎖的區(qū)域不一定不同。一方面，本發(fā)明的一或多個(gè)核酸分子用來判定植物(優(yōu)選卡諾拉、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、油菜子、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花、油棕、亞麻或向日葵)中的水平(即樣品中mRNA的濃度)以及部分或全部由本發(fā)明的一或多個(gè)核酸分子編碼的蛋白的表達(dá)模式(集體用語，細(xì)胞或組織的“表達(dá)應(yīng)答”)此處細(xì)胞或組織的表達(dá)應(yīng)答發(fā)生改變是指，與不呈現(xiàn)該表型的植物相比，細(xì)胞或組織的表達(dá)應(yīng)答有所不同。要判斷表達(dá)應(yīng)答是否發(fā)生改變，要將呈現(xiàn)該表型的植物的細(xì)胞或組織與不呈現(xiàn)該表型的相似的細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行對(duì)比。令人欣慰的是，不需要每次對(duì)比都對(duì)不呈現(xiàn)該表型的細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，而是某種植物的表達(dá)應(yīng)答可以與以前獲得的正常植物的表達(dá)應(yīng)答進(jìn)行對(duì)比。此處所指的生物體的表型指生物體的一或多個(gè)特征(如疾病抗性、害蟲耐受、環(huán)境耐受如非生物壓力耐受、雄性不育、質(zhì)量改善或產(chǎn)量等)?；蛐突虮硇偷母淖兛梢允撬矔r(shí)的也可以是永久的。此處的組織樣品指任何包含多于一個(gè)細(xì)胞的樣品。優(yōu)選組織樣品包含具有共同特征的細(xì)胞(如衍生于根、種子、花、葉、莖或花粉等)。本發(fā)明一方面可以進(jìn)行評(píng)價(jià)，來判斷某個(gè)mRNA分子是否出現(xiàn)。本發(fā)明的一或多個(gè)核酸分子用于檢測(cè)mRNA種類的出現(xiàn)及數(shù)量。在足以允許核酸雜交的條件下，將這些分子與植物細(xì)胞或組織提取物孵育。檢測(cè)到雙鏈探針-mRNA雜交分子則表明有mRNA出現(xiàn)；形成的雜交體的數(shù)量與mRNA的數(shù)量成正比。因此，這種探針可用于對(duì)植物細(xì)胞或組織中mRNA的種類和含量進(jìn)行檢測(cè)。這種核酸雜交也可以在定量條件下進(jìn)行(因而提供一個(gè)mRNA出現(xiàn)含量的數(shù)值)。另外，這種分析也可以作為一個(gè)定性分析，表明mRNA的出現(xiàn)或者其水平超過用戶預(yù)先設(shè)定值。有許多方法可以用來對(duì)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織樣品的表達(dá)應(yīng)答進(jìn)行對(duì)比。這些方法包括雜交分析，如Northern、RNA酶保護(hù)分析及原位雜交。此外，還包括PCR類型的分析。在一個(gè)優(yōu)選方法中，將兩個(gè)或多個(gè)樣品的核酸分子與一個(gè)核酸陣列進(jìn)行雜交，比較其表達(dá)應(yīng)答。陣列包括大量已知的可疑序列或可疑在樣品細(xì)胞或組織出現(xiàn)的序列。在檢測(cè)核酸方面，原位雜交較其他更常規(guī)的技術(shù)有一個(gè)優(yōu)勢(shì)，即可以精確判斷空間上的群體(Angerer等，Dev.Biol.101477-484(1984)；Angerer等，Dev.Biol.112157-166(1985)；Dixon等，EMBOJ.101317-1324(1991))。原位雜交可用于檢測(cè)RNA積累的穩(wěn)定狀態(tài)水平(Hardin等，J.Mol.Biol.202417-431(1989))。關(guān)于原位雜交已設(shè)計(jì)出大量的程序，均包括組織制備、雜交和洗脫條件(Meyerowitz，PlantMol.Biol.Rep.5242-250(1987)；Cox和Goldberg，InPlantMolecularBiologyAPracticalApproach，Shaw(ed.)，pp.1-35，IRLPress，Oxford(1988)；Raikhel等，InsituRNAhybridizationinplanttissues，InPlantMolecularBiologyManual，vol.B91-32，KluwerAcademicPublisher，Dordrecht，Belgium(1989))。原位雜交還可以對(duì)蛋白進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)定位(Wilkinson，InSituHybridization，OxfordUniversityPress，Oxford(1992)；Langdale，InSituHybridizationInTheCornHandbook，F(xiàn)reeling和Walbot(eds.)，pp.165-179，Springer-Verlag，NewYork(1994))。可以理解，本發(fā)明的一或多個(gè)分子，優(yōu)選一或多個(gè)核酸分子及其片段或一或多個(gè)抗體，可以用于原位雜交來檢測(cè)蛋白或mRNA水平及模式。通過原位雜交的熒光可以對(duì)特定DNA序列進(jìn)行染色體定位，可以用于基因作圖、追蹤雜交品系中的染色體或檢測(cè)染色體中的轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)換或缺失，當(dāng)然還有其他應(yīng)用。原位雜交已被用于在一些植物種類中識(shí)別染色體(Griffor等，PlantMol.Biol.17101-109(1991)；Gustafson等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)871899-1902(1990)；Mukai和Gill，Genome34448-452(1991)；Schwarzacher和Heslop-Harrison，Genome34317-323(1991)；Wang等，Jpn.J.Genet.66313-316(1991)；Parra和Windle，NatureGenetics517-21(1993))?？梢岳斫猓景l(fā)明的核酸分子可以作為探針或標(biāo)記，對(duì)序列進(jìn)行染色體定位。另一個(gè)對(duì)分子的表達(dá)進(jìn)行定位的方法是組織印跡。組織印跡提供了一種同時(shí)，在同一張膜上篩選許多不同植物不同發(fā)育階段來源的組織樣品的方法(Yomo和Taylor，Planta11235-43(1973)；Harris和Chrispeels，PlantPhysiol.56292-299(1975)；Cassab和Varner，J.Cell.Biol.1052581-2588(1987)；Spruce等，Phytochemistry262901-2903(1987)；Barres等，Neuron5527-544(1990)；Reid和Pont-Lezica，TissuePrintingToolsfortheStudyofAnatomy，HistochemistryandGeneExpression，AcademicPress，NewYork，NewYork(1992)；Reid等，PlantPhysiol.93160-165(1990)；Ye等，PlantJ.1175-183(1991))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參照通常的參考書，對(duì)此處討論的已有技術(shù)或相當(dāng)技術(shù)的詳細(xì)描述進(jìn)行了解。這些參考書包括CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubel，等，eds.，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，andsupplementsthroughSeptember(1998)，MolecularCloning，ALaboratoryManual，Sambrook等，2ndEd.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)，GenomeAnalysisALaboratoryManual1AnalyzingDNA，Birren等，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1997)；GenomeAnalysisALaboratoryManual2DetectingGenes，Birren等，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1998)；GenomeAnalysisALaboratoryManual3CloningSystems，Birren等，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1999)；GenomeAnalysisALaboratoryManual4MappingGenomes，Birren等，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1999)；PlantMolecularBiologyALaboratoryManual，Clark，Springer-Verlag，Berlin，(1997)，MethodsinPlantMolecularBiology，Maliga等，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1995)。當(dāng)然，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)也可以參考這些書?？梢岳斫?，本發(fā)明的任何因子都是基本純化的和/或具有生物活性的和/或重組的。以上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了大體的描述。通過參考以下提供的一些說明性的例子，將更容易理解。除非特別指明，這些例子并不用來限制本發(fā)明。實(shí)施例1突變的hdt2擬南芥生態(tài)型Landsberg的識(shí)別和特征誘變的(M2)擬南芥種子生態(tài)型Landsberg，購自LehleSeeds(RoundRock，Texas，U.S.A.)，并經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的EMS突變方法獲得。將種子M2在溫室條件下培養(yǎng)，每株植株用一個(gè)2.5英寸的罐，得到M2植株。從M2植株獲得M3種子，并分析其生育酚含量。用下述方法，對(duì)從大約10,000個(gè)M3品系獲得的擬南芥種子生態(tài)型Landsberg或Col-O，進(jìn)行生育酚含量的分析。將5mg從個(gè)體植株來的種子種植于用1/8”鋼球產(chǎn)生的優(yōu)質(zhì)粉末中，劇烈振搖。然后，加入200微升99.5％乙醇/0.5％鄰苯三酚，混合30秒，40℃孵育1h。每個(gè)樣品加入50μg/ml母育酚(Matreya，Inc.，PleasantGap，PA)，將此作為注射標(biāo)準(zhǔn)品。離心后，去除殘?jiān)锨暹^濾(PVDF0.45μm，Whatman)。然后用高效液相層析(HPLC)分析濾液中的生育酚含量，用無梯度級(jí)90％己烷/10％甲基-t-丁基酯，Zorbax硅柱(4.6×250mm，AgilentTechnologies，Atlanta，GA)及熒光檢測(cè)(model2790HPLCwithmodel474detector；WatersCorporation，Bedford，MA)(激發(fā)290nm，發(fā)射336nm，30nm帶通和狹縫)。然后檢測(cè)α，β，γ，δ-生育酚含量以及注射標(biāo)準(zhǔn)品母育酚。δ-生育酚含量較野生型升高的個(gè)體植株品系在下一代(M4)再進(jìn)行分析，以確認(rèn)其可遺傳性。分離出δ-生育酚含量升高的5株擬南芥高δ-生育酚(hdt)突變株。下表1顯示了5個(gè)突變株δ-生育酚含量的百分比(測(cè)量干重)及其相對(duì)于野生型親本生態(tài)型的升高。結(jié)果表明，相對(duì)于相應(yīng)的野生型對(duì)照，5個(gè)突變株δ-生育酚含量均有明顯升高。升高倍數(shù)為2-25倍。表1實(shí)施例2擬南芥，Landsbergerecta(Ler)高δ-生育酚突變株中突變hdt2基因的識(shí)別和序列測(cè)定使用圖譜為基礎(chǔ)的克隆技術(shù)(USSN09/803,736，PlantPolymorphicMarkersandUsesThereof，filedMarch12，2001)，突變hdt2基因定位于染色體3端粒標(biāo)記T12C14_1563,85cM。這一區(qū)域包含大約60個(gè)預(yù)測(cè)基因。我們對(duì)該區(qū)域的分析表明，其中的一個(gè)基因，MAA21_40，與已知的輔酶Q甲基轉(zhuǎn)移酶同源?；谶@種同源以及MAA21_40靶向于原生質(zhì)體的預(yù)測(cè)，推測(cè)該基因可能包含導(dǎo)致hdt2突變株高δ-生育酚表型的突變。PCR擴(kuò)增野生型及hdt2突變株中MAA21_40基因座的序列，然后用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法測(cè)序。用下述的測(cè)序引物對(duì)基因座進(jìn)行擴(kuò)增。引物對(duì)名稱MAA21_40_1正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGAAAGTTGAAAAGAGCAA(SEQIDNO55)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCCAATTTGATCAATGTTCCACGA(SEQIDNO56)引物對(duì)名稱MAA21_40_2正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTAGCTATGCGGATTGATGGTC(SEQIDNO57)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCTCCTCCTGGGAACTCTAGCA(SEQIDNO58)引物對(duì)名稱MAA21_40_3正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGACTTGCGAGTTTTTG(SEQIDNO59)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCCCTGTCAACAACCCCTTCTC(SEQIDNO60)引物對(duì)名稱MAA21_40_4正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCACAAGAGGGGTTTACAATG(SEQIDNO61)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCACCCAACCTTCTGGCTCTCT(SEQIDNO62)引物對(duì)名稱MAA21_40_5正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCTTTGGGAACGATCTGA(SEQIDNO63)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCAGGGAAGCGTACAGGGTTCT(SEQIDNO64)引物對(duì)名稱MAA21_40_6正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTTGAGCTGAACGTCCT(SEQIDNO65)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCGGCGGAACTGGTTTCACTAC(SEQIDNO66)引物對(duì)名稱MAA21_40_7正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGTCAGCATAATCGGTTGGA(SEQIDNO67)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCTCCCCAAAGGTTTAGGTTCC(SEQIDNO68)引物對(duì)名稱MAA21_40_8正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTAAGCCTCCTTCTTGTGCTGA(SEQIDNO69)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCCGACTTTTCCCTTCCATTTG(SEQIDNO70)引物對(duì)名稱MAA21_40_9正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGGAGGTTCGGGTAACTGAG(SEQIDNO71)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCCATCCTCTCGCTAGCAGGTC(SEQIDNO72)引物對(duì)名稱MAA21_40_10正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCAGGGGAACCTAAAC(SEQIDNO73)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCGCCGTGAGAAACAGACTCCT(SEQIDNO74)引物對(duì)名稱MAA21_40_11正向引物TGTAAAACGACGGCCAGTCAAATGGAAGGGAAAAGTCG(SEQIDNO75)反向引物CAGGAAACAGCTATGACCGATCCAAAGAGAACCCAGCA(SEQIDNO76)每個(gè)引物對(duì)制備如下的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物PCR混合物5μl10XTaqBuffer5μl25mMMgCl24μl10mMdNTPs2μl模板DNA0.5ulTaqGold5μlF/R測(cè)序引物28.5uldH2O用如下的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增1.94℃10min2.94℃15sec3.56℃15sec4.72℃1min30sec5.步驟2-4重復(fù)44次6.72℃10min7.4℃保持PCR產(chǎn)物用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法測(cè)序。野生型Col-0MMAA21_40基因座的序列見SEQIDNO1.野生型LerMMAA21_40基因座的序列見SEQIDNO2。Columbia和Landsberg生態(tài)型野生型編碼DNA和肽序列分別見SEQIDNO15和16。hdt2突變株中MAA21_40基因的序列測(cè)出后，將其與野生型基因的序列進(jìn)行對(duì)比。高δ-生育酚突變株hdt2的MAA21_40基因被認(rèn)為含有SEQIDNO3所示的核酸序列。相對(duì)于SEQIDNO17所示的擬南芥MAA21_40的ATG，這個(gè)序列在氨基酸位點(diǎn)292處谷氨酸被替換為賴氨酸。另一個(gè)高δ-生育酚突變株hdt6的MAA21_40基因被認(rèn)為含有SEQIDNO4所示的核酸序列。相對(duì)于SEQIDNO18所示的野生型擬南芥MAA21_40，這個(gè)序列在氨基酸位點(diǎn)72處谷氨酸被替換為賴氨酸。另一個(gè)高δ-生育酚突變株hdt9的MAA21_40基因被認(rèn)為含有SEQIDNO5所示的核酸序列。相對(duì)于SEQIDNO19所示的野生型擬南芥MAA21_40，這個(gè)序列在氨基酸位點(diǎn)13處脯氨酸被替換為絲氨酸。另一個(gè)高δ-生育酚突變株hdt10的MAA21_40基因被認(rèn)為含有SEQIDNO6所示的核酸序列。相對(duì)于SEQIDNO20所示的野生型擬南芥MAA21_40，這個(gè)序列在氨基酸位點(diǎn)116處天冬氨酸被替換為天冬酰胺。另一個(gè)高δ-生育酚突變株hdt16的MAA21_40基因被認(rèn)為含有SEQIDNO7所示的核酸序列。相對(duì)于SEQIDNO21所示的野生型擬南芥MAA21_40，這個(gè)序列在氨基酸位點(diǎn)94處蘇氨酸被替換為異亮氨酸。表2總結(jié)了上述突變。表2實(shí)施例3與擬南芥tMT2基因同源的各種來源的基因的識(shí)別用TBLASTN(Altschul等，NucleicAcidsRes.253389-3402(1997)；也可以參見(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，在數(shù)據(jù)庫的植物序列中，對(duì)擬南芥tMT2蛋白序列(NCBIGeneralIdentifierNumbergi7573324)進(jìn)行同源性檢索；發(fā)現(xiàn)SEQIDNO8-15與擬南芥序列具有高度同源性。>CPR19219歐洲油菜tMT2類似物1-LIB4153-013-R1-K1-B7ATGGCTTCTCTCATGCTCAACGGGGCCATCACCTTCCCCAAGGGATTAGGCTTCCCCGCTTCCAATCTACACGCCAGACCAAGTCCTCCGCTGAGTCTCGTCTCAAACACAGCCACGCGGAGACTCTCCGTGGCGACAAGATGCAGCAGCAGCAGCAGCGTGTCGGCGTCAAGGCCATCTGCGCAGCCTAGGTTCATCCAGCACAAGAAAGAGGCCTACTGGTTCTACAGGTTCCTGTCCATCGTGTACGACCACATCATCAATCCCGGCCACTGGACGGAGGATATGAGGGACGACGCTCTCGAGCCTGCGGATCTGAGCCATCCGGACATGCGAGTTGTCGACGTCGGAGGCGGAACGGGTTTCACCACGCTGGGAATCGTCAAGACGGTGAAGGCTAAGAACGTGACGATTCTGGACCAGTCGCCGCATCAGCTGGCAAAGGCGAAGCAGAAGGAGCCGTTGAAGGAGTGCAAGATCGTTGAAGGAGATGCGGAGGATCTCCCTTTTCCTACTGATTATGCTGACAGATACGTCTCTGCTGGAAGCATTGAGTACTGGCCCGACCCGCAGAGGGGGATAAGGGAAGCGTACAGAGTTCTCAAGATCGGTGGGAAAGCATGTCTCATTGGCCCTGTCCACCCGACGTTTTGGCTTTCTCGTTTCTTTGCAGATGTGTGGATGCTTTTCCCCAAGGAGGAGGAGTACATTGAGTGGTTCAAGAATGCTGGTTTCAAGGACGTTCAGCTTAAGAGGATTGGCCCCAAGTGGTACCGTGGTGTTCGCAGGCACGGACTTATCATGGGATGCTCTGTTACTGGTGTCAAACCTGCCTCTGGAGACTCTCCTCTCCAGCTTGGACCAAAGGAAGAGGACGTGGAGAAGCCTGTAAACAATCCTTTCTCCTTCTTGGGACGCTTCCTCTTGGGAACCTTAGCGGCTGCCTGGTTTGTGTTAATCCCAATCTACATGTGGATCAAGGATCAGATCGTTCCCAAAGACCAACCCATCTGA(SEQIDNO13)>蛋白序列，歐洲油菜tMT2類似物1-LIB4153-013-R1-K1-B7MASLMLNGAITFPKGLGFPASNLHARPSPPLSLVSNTATRRLSVATRCSSSSSVSASRPSAQPRFIQHKKEAYWFYRFLSIVYDHIINPGHWTEDMRDDALEPADLSHPDMRVVDVGGGTGFTTLGIVKTVKAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIVEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIREAYRVLKIGGKACLIGPVHPTFWLSRFFADVWMLFPKEEEYIEWFKNAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNNPFSFLGRFLLGTLAAAWFVLIPIYMWIKDQIVPKDQPI(SEQIDNO27)>CPR19220歐洲油菜tMT2類似物2-LIB80-011-Q1-E1-E9ATGGCTTCTCTCATGCTCAACGGGGCCATCACCTTCCCCAAGGGATTAGGCTTCCCCGCTTCCAATCTACACGCCAGACCAAGTCCTCCGCTGAGTCTCGTCTCAAACACAGCCACGCGGAGACTCTCCGTGGCGACAAGATGCAGCAGCAGCAGCAGCGTGTCGGCGTCAAGGCCATCTGCGCAGCCTAGGTTCATCCAGCACAAGAAAGAGGCCTACTGGTTCTACAGGTTCCTGTCCATCGTGTACGACCACATCATCAATCCCGGCCACTGGACGGAGGATATGAGGGACGACGCTCTCGAGCCTGCGGATCTGAGCCATCCGGACATGCGAGTTGTCGACGTCGGAGGCGGAACGGGTTTCACCACGCTGGGAATCGTCAAGACGGTGAAGGCTAAGAACGTGACGATTCTGGACCAGTCGCCGCATCAGCTGGCAAAGGCGAAGCAGAAGGAGCCGTTGAAGGAGTGCAAGATCGTGGAAGGAGATGCGGAGGATCTCCCTTTTCCTACTGATTATGCTGACAGATACGTCTCTGCTGGAAGCATTGAGTACTGGCCCGACCCGCAGAGGGGTATAAGGGAAGCGTACAGAGTTCTCAAGATCGGTGGGAAAGCATGTCTCATTGGCCCTGTCCACCCGACGTTTTGGCTTTCACGCTTCTTTGCAGATGTGTGGATGCTTTTCCCCAAGGAGGAGGAGTACATTGAGTGGTTCAAGAATGCTGGTTTCAAGGACGTTCAGCTTAAGAGGATTGGCCCCAAGTGGTACCGTGGTGTTCGCAGGCACGGACTTATCATGGGATGCTCTGTTACTGGTGTCAAACCTGCCTCTGGAGACTCTCCTCTCCAGCTTGGACCAAAGGAAGAGGACGTGGAGAAGCCTGTAAACAATCCTTTCTCCTTCTTGGGACGCTTCCTCTTGGGTACCCTAGCGGCTGCCTGGTTTGTGTTAATCCCAATCTACATGTGGATCAAGGATCAGATCGTTCCCAAAGACCAACCCATCTGA(SEQIDNO14)>CPR193223水稻tMT2-LIB4371-041-R1-K1-F7ATGGCGATGGCCTCCTCCGCCTACGCCCCAGCGGGCGGCGTTGGCACCCACTCCGCGCCGGGCAGGATCAGGCCGCCGCGCGGCCTCGGCTTCTCCACCACCACCACCAAGTCGAGGCCCCTCGTGCTCACCAGGCGTGGGGGAGGCGGCGGCAACATCTCCGTGGCTCGGCTGAGGTGCGCGGCGTCGTCGTCGTCGGCGGCGGCGAGGCCGATGTCGCAGCCGCGGTTCATCCAGCACAAGAAGGAGGCGTTCTGGTTCTACCGCTTCCTCTCCATCGTCTACGACCACGTCATCAACCCGGGCCACTGGACGGAGGACATGCGGGACGACGCCCTCGAGCCCGCCGACCTCTACAGCCGCAAGCTCAGGGTCGTCGACGTCGGCGGCGGGACGGGGTTCACCACGCTCGGGATCGTCAAGCGCGTCGACCCGGAGAACGTCACGCTGCTCGACCAGTCCCCGCACCAGCTCGAGAAGGCCCGGGAGAAGGAGGCCCTCAAGGGCGTCACCATCATGGAGGGCGACGCCGAGGACCTCCCCTTCCCCACCGACACCTTCGACCGCTACGTCTCCGCCGGCAGCATCGAGTATTGGCCCGATCCGCAGCGAGGAATCAAGGAAGCTTACAGGGTTTTGAGGCTTGGTGGAGTGGCTTGCATGATTGGCCCCGTGCACCCAACCTTCTGGCTGTCTCGCTTTTTCGCTGACATGTGGATGCTCTTCCCGAAGGAAGAGGAGTATATTGAGTGGTTCAAAAAGGCAGGGTTCAAGGATGTCAAGCTCAAAAGGATTGGACCAAAATGGTACCGTGGTGTCCGAAGGCATGGCCTGATTATGGGATGCTCTGTGACGGGCGTCAAAAGAGAACATGGAGACTCCCCTTTGCAGCTTGGTCCAAAGGTTGAGGATGTCAGCAAACCTGTGAATCCTATCACCTTCCTCTTCCGCTTCCTCATGGGAACAATATGTGCTGCATACTATGTTCTGGTGCCTATCTACATGTGGATAAAGGACCAGATTGTGCCCAAAGGCATGCCGATCTAA(SEQIDNO12)>蛋白翻譯，水稻tMT2-LIB4371-041-R1-K1-F7MAMASSAYAPAGGVGTHSAPGRIRPPRGLGFSTTTTKSRPLVLTRRGGGGGNISVARLRCAASSSSAAARPMSQPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLYSRKLRVVDVGGGTGFTTLGIVKRVDPENVTLLDQSPHQLEKAREKEALKGVTIMEGDAEDLPFPTDTFDRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLRLGGVACMIGPVHPTFWLSRFFADMWMLFPKEEEYIEWFKKAGFKDVKLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKREHGDSPLQLGPKVEDVSKPVNPITFLFRFLMGTICAAYYVLVPIYMWIKDQIVPKGMPI(SEQIDNO26)>CPR193225中193226玉米tMT2-LIB3587-273-Q1-K6-C5/LIB3600-046-Q1-K6-G1ATGGCGATGGCCTCCACCTACGCGCCGGGCGGAGGCGCGCGGGCGCTCGCGCAGGGTAGATGCAGGGTCCGCGGTCCCGCGGGGCTGGGCTTCCTCGGCCCCTCCAAGGCCGCCGGCCTCCCCCGCCCCCTCGCCCTCGCCCTCGCCAGGCGGATGAGCAGCCCCGTCGCGGTGGGCGCCAGGCTGCGATGCGCGGCGTCGTCGTCCCCCGCGGCGGCGCGGCCCGCCACGGCGCCGCGCTTCATCCAGCACAAGAAGGAGGCCTTCTGGTTCTACCGCTTCCTCTCCATCGTGTACGACCACGTCATCAATCCGGGCCACTGGACCGAGGACATGCGCGACGACGCGCTGGAACCTGCCGACCTCTTCAGCCGCCACCTCACGGTCGTCGACGTCGGCGGCGGCACGGGGTTCACCACGCTCGGCATCGTCAAGCACGTCAACCCGGAGAACGTCACGCTGCTCGACCAGTCCCCGCACCAGCTCGACAAGGCCCGGCAGAAGGAGGCCCTCAAGGGGGTCACCATCATGGAGGGCGACGCCGAGGACCTCCCGTTCCCCACCGACTCCTTCGACCGATACATCTCCGCCGGCAGCATCGAGTACTGGCCAGACCCACAGCGGGGGATCAAGGAAGCCTACAGGGTCCTGAGATTTGGTGGGCTAGCTTGTGTGATCGGCCCGGTCTACCCGACCTTCTGGCTGTCCCGCTTCTTCGCCGACATGTGGATGCTCTTCCCCAAGGAGGAAGAGTACATCGAGTGGTTCAAGAAGGCTGGGTTTAGGGATGTCAAGCTGAAGAGGATTGGACCGAAGTGGTACCGCGGTGTCCGAAGGCATGGCCTCATCATGGGCTGCTCCGTCACAGGCGTCAAGAGAGAGCGCGGTGACTCTCCCTTGGAGCTTGGTCCCAAGGCGGAGGATGTCAGCAAGCCAGTGAATCCGATCACCTTCCTCTTCCGCTTCCTCGTAGGAACGATATGTGCTGCCTACTATGTTCTGGTGCCTATTTACATGTGGATAAAGGACCAGATCGTGCCAAAAGGCATGCCAATCTGA(SEQIDNO8)>蛋白翻譯，玉米tMT2-LIB3587-273-Q1-K6-C5/LIB3600-046-Q1-K6-G1MAMASTYAPGGGARALAQGRCRVRGPAGLGFLGPSKAAGLPRPLALALARRMSSPVAVGARLRCAASSSPAAARPATAPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLFSRHLTVVDVGGGTGFTTLGIVKHVNPENVTLLDQSPHQLDKARQKEALKGVTIMEGDAEDLPFPTDSFDRYISAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLRFGGLACVIGPVYPTFWLSRFFADMWMLFPKEEEYIEWFKKAGFRDVKLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKRERGDSPLELGPKAEDVSKPVNPITFLFRFLVGTICAAYYVLVPIYMWIKDQIVPKGMPI(SEQIDNO22)>CPR193234大豆tMT2-LIB3049-032-Q1-E1-G8ATGGGTTCAGTAATGCTCAGTGGAACTGAAAAGCTCACTCTCAGAACCCTAACCGGGAACGGCTTAGGTTTCACTGGTTCGGATTTGCACGGTAAGAACTTCCCAAGAGTGAGTTTCGCTGCTACCACTAGTGCTAAAGTTCCCAACTTTAGAAGCATAGTAGTACCCAAGTGTAGTGTCTCGGCTTCCAGGCCAAGCTCGCAGCCAAGGTTCATTCAGCACAAAAAAGAGGCCTTTTGGTTCTATAGGTTTCTCTCAATTGTGTATGACCATGTCATTAACCCTGGCCATTGGACCGAGGACATGAGGGATGATGCCCTTGAACCCGCTGATCTCAATGACAGGAACATGATTGTGGTGGATGTTGGTGGCGGCACGGGTTTCACCACTCTTGGTATTGTCAAGCACGTGGATGCCAAGAATGTCACCATTCTTGACCAGTCACCCCACCAGCTCGCCAAGGCCAAGCAGAAGGAGCCACTCAAGGAATGCAAAATAATCGAAGGGGATGCCGAGGATCTCCCCTTTCGAACTGATTATGCCGATAGATATGTATCCGCAGGAAGTATTGAGTACTGGCCGGATCCACAGCGTGGCATCAAGGAGGCATACAGGGTTTTGAAACTTGGAGGCAAAGCGTGTCTAATTGGTCCGGTCTACCCAACATTTTGGTTGTCACGTTTCTTTGCAGATGTTTGGATGCTTTTCCCCAAGGAGGAAGAGTATATTGAGTGGTTTCAGAAGGCAGGGTTTAAGGACGTCCAACTAAAAAGGATTGGCCCAAAATGGTATCGTGGGGTTCGCCGTCATGGCTTGATTATGGGTTGTTCAGTGACCGGTGTTAAACCTGCATCTGGAGATTCTCCTTTGCAGCTTGGTCCAAAGGAAGAAGATGTTGAAAAGCCCGTTAATCCTTTTGTCTTTGCACTGCGCTTCGTTTTGGGTGCCTTGGCAGCGACATGGTTTGTGTTGGTTCCTATTTACATGTGGCTGAAAGATCAAGTTGTTCCCAAAGGTCAGCCAATCTAA(SEQIDNO11)>蛋白翻譯，大豆tMT2-LIB3049-032-Q1-E1-G8MGSVMLSGTEKLTLRTLTGNGLGFTGSDLHGKNFPRVSFAATTSAKVPNFRSIVVPKCSVSASRPSSQPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLNDRNMIVVDVGGGTGFTTLGIVKHVDAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIIEGDAEDLPFRTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLKLGGKACLIGPVYPTFWLSRFFADVWMLFPKEEEYIEWFQKAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNPFVFALRFVLGALAATWFVLVPIYMWLKDQVVPKGQPI(SEQIDNO2S)>CPR193236韭蔥-LIB4521-015-Q1-K1-D6ATGGCTTCCTCCATGCTCAGCGGAGCAGAAAGCCTCTCAATGCTCCGAATCCACCACCAACCCAAACTCACCTTCTCGAGCCCATCCCTCCATTCCAAACCCACAAACCTCAAAATGGATCTCATCCCTTTCGCCACCAAGCATCAAAAAACGAAAAAAGCTTCGATCTTTACATGCAGCGCGTCCTCATCATCCCGACCTGCTTCTCAGCCGAGGTTCATCCAGCACAAGCAGGAGGCGTTCTGGTTCTACAGGTTCCTGTCGATAGTGTACGACCATGTGATAAACCCAGGGCACTGGACCGAGGACATGAGAGACGATGCGTTGGAGCCAGCCGAGCTGTACGATTCCAGGATGAAGGTGGTGGACGTAGGAGGAGGAACTGGGTTCACCACCTTGGGGATTATAAAGCACATCGACCCTAAAAACGTTACGATTCTGGATCAGTCTCCGCATCAGCTTGAGAAGGCTAGGCAGAAGGAGGCTTTGAAGGAGTGTACTATTGTTGAAGGTGATGCTGAGGATCTCCCTTTTCCTACTGATACTTTCGATCGATATGTATCTGCTGGCAGCATAGAATACTGGCCAGACCCACAAAGAGGGATAAAGGAAGCATACCGGGTTCTAAAACTGGGAGGCGTTGCCTGCTTGATAGGACCCGTGCACCCTACCTTCTGGCTTTCCAGGTTCTTCGCCGACATGTGGATGTTGTTCCCCACCGAAGAAGAATACATAGAGTGGTTTAAAAAGGCCGGGTTCAAAGATGTGAAGTTGAAGAGGATTGGCCCAAAATGGTACCGTGGTGTGCGTAGACACGGGCTCATCATGGGCTGTTCCGTCACTGGTGTTAAACGTCTCTCTGGTGACTCCCCTCTTCAGCTTGGACCGAAGGCGGAGGATGTGAAGAAGCCGATCAATCCATTCTCGTTCCTTCTGCGCTTCATTTTGGGTACGATAGCAGCTACTTACTACGTTTTGGTGCCGATATACATGTGGATAAAGGATCAGATTGTACCGAAAGGCCAGCCCATATGA(SEQIDNO10)>蛋白翻譯，韭蔥-LIB4521-015-Q1-K1-D6MASSMLSGAESLSMLRIHHQPKLTFSSPSLHSKPTNLKMDLIPFATKHQKTKKASIFTCSASSSSRPASQPRFIQHKQEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPAELYDSRMKVVDVGGGTGFTTLGIIKHIDPKNVTILDQSPHQLEKARQKEALKECTIVEGDAEDLPFPTDTFDRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLKLGGVACLIGPVHPTFWLSRFFADMWMLFPTEEEYIEWFKKAGFKDVKLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKRLSGDSPLQLGPKAEDVKKPINPFSFLLRFILGTIAATYYVLVPIYMWIKDQIVPKGQPI(SEQIDNO24)>CPR20406S陸地棉tMT2-LIB3272-054-P1-K1-C11ATGGCTTCTTCCATGCTGAATGGAGCTGAAACCTTCACTCTCATCCGAGGTGTTACCCCAAAAAGTATTGGTTTTTTGGGGTCAGGTTTACATGGGAAACAGTTTTCCAGTGCGGGTTTAATCTACAGTCCGAAGATGTCCAGGGTAGGAACGACGATAGCCCCGAGGTGCAGCTTATCAGCGTCAAGGCCAGCTTCACAACCAAGATTCATACAACACAAAAAAGAGGCCTTTTGGTTCTACAGGTTCCTCTCAATTGTCTATGACCATGTCATAAACCCAGGTCACTGGACTGAAGACATGAGGGATGATGCACTTGAGCCGGCTGATCTCAATGACAGGGACATGGTAGTTGTAGATGTTGGTGGTGGAACTGGTTTCACTACTTTGGGTATTGTTCAGCATGTGGATGCTAAGAATGTTACAATCCTTGACCAATCTCCTCACCAGCTTGCAAAGGCTAAACAGAAGGAGCCTCTCAAGGAATGCAACATAATTGAAGGTGATGCAGAAGATCTTCCTTTTCCTACTGATTATGCCGATAGATATGTGTCTGCTGGAAGCATAGAGTACTGGCCAGACCCACAACGGGGGATCAAGGAAGCATACAGGGTGTTGAAACAAGGAGGAAAAGCTTGCTTAATTGGTCCTGTGTACCCTACATTTTGGTTGTCTCGTTTCTTTGCAGACGTTTGGATGCTTTTCCCTAAGGAGGAAGAATATATAGAGTGGTTTGAAAAGGCTGGATTTAAGGATGTCCAACTCAAAAGGATTGGCCCTAAATGGTATCGTGGAGTTCGCCGACATGGTTTGATCATGGGGTGCTCTGTAACCGGTGTTAAACCCGCATCTGGGGACTCTCCTTTGCAGCTTGGACCTAAGGCAGAGGATGTATCAAAGCCGGTAAATCCGTTTGTATTTCTCTTACGCTTCATGTTGGGTGCCACTGCAGCAGCATATTATGTACTGGTTCCTATCTACATGTGGCTCAAAGATCAAATTGTACCAGAGGGTCAACCAATCTAA(SEQIDNO9)>蛋白翻譯，陸地棉tMT2-LIB3272-054-P1-K1-C11MASSMLNGAETFTLIRGVTPKSIGFLGSGLHGKQFSSAGLIYSPKMSRVGTTIAPRCSLSASRPASQPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLNDRDMVVVDVGGGTGFTTLGIVQHVDAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECNIIEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLKQGGKACLIGPVYPTFWLSRFFADVWMLFPKEEEYIEWFEKAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKAEDVSKPVNPFVFLLRFMLGATAAAYYVLVPIYMWLKDQIVPEGQPI(SEQIDNO23)用BLASTP將擬南芥tMT2蛋白序列與上述的tMT2植物蛋白序列進(jìn)行對(duì)比(Altschul等，NucleicAcidsRes.253389-3402(1997)；也可以參見(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。圖2顯示每個(gè)序列與擬南芥序列相比的蛋白一致性計(jì)算值。還顯示了用Prettyalignmentprogram(GeneticsComputerGroup，MadisonWI))進(jìn)行的蛋白序列對(duì)比。實(shí)施例4在原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)擬南芥野生型和突變tMT2基因序列以及其他農(nóng)作物植物種類tMT2基因序列的構(gòu)建體的制備用計(jì)算機(jī)程序預(yù)測(cè)植物tMT2蛋白原生質(zhì)靶向肽切割位點(diǎn)(″ChloroP″，CenterforBiologicalSequenceAnalysis，Lyngby，Denmark)。搜索結(jié)果如下基于該信息，用基因工程方法，將擬南芥生態(tài)型Landsberg的tMT2蛋白的預(yù)測(cè)的原生質(zhì)體靶向肽去除，以便在大腸桿菌中表達(dá)成熟的蛋白。蛋白在原核系統(tǒng)表達(dá)，氨基端需要有蛋氨酸。為了加入5’ATG，從擬南芥生態(tài)型Columbia的野生型及高δ-生育酚突變株hdt6和hdt16以及擬南芥生態(tài)型Landsberg高δ-生育酚突變株hdt2和hdt10的cDNA擴(kuò)增tMT2編碼序列。用基于RocheMolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)的“mRNACaptureKit”的改進(jìn)的生物素/鏈親合素程序，從每一來源中分離PolyA+RNA。將一個(gè)大約1Gm高的根組織去除的胚珠在CTAB緩沖液(50mMTris-HClpH9，0.8MNaCl，0.5％CTAB，10mMEDTA)中勻漿，然后用氯仿抽提，離心沉淀。如制造商的說明書所述，將在溶液部分的PolyA+RNA與生物素標(biāo)記的oligo-dT雜交，固相化于鏈親合素包被的PCR管，然后洗脫。按照制造商的說明書，用“RT-PCR第一鏈cDNA合成試劑盒”(RocheMolecularBiochemicals)在50μl體積中合成第一鏈cDNA。CDNA合成后，試管里的溶液部分用等體積的擴(kuò)增反應(yīng)液替換?；旌弦褐薪M分的終濃度如下·1XBuffer2(ExpandHighFidelityPCRSystem，RocheMolecularBiochemicals)·200μMdNTPs·300nM各寡核苷酸引物#17180正向-NcoI5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAGGAGATAGAACCATGGCTACTAGATGCAGCAGCAGCAGC3′(SEQIDNO79)和#17181反向-Sse8387I5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTCAGATGGGTTGGTCTTTGGGAAGG3′.(SEQIDNO78)每種引物含有進(jìn)行GATEWAYTM克隆的區(qū)域(LifeTechnologiesDivision，InVitrogenCorporation)以及常規(guī)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)·0.4μlExpandTMHighFidelityPolymerase(RocheMolecularBiochemicals)另外，還進(jìn)行構(gòu)建，在原核表達(dá)載體直接表達(dá)歐洲油菜、稻、玉米、大豆、韭蔥及陸地棉等的工程株tMT2序列。用下述的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從質(zhì)粒DNA擴(kuò)增帶有氨基端蛋氨酸的每個(gè)tMT2成熟蛋白編碼區(qū)(如上所述)。用下述合成的寡核苷酸引物，從LIB4153-013-R1-K1-B7(SEQIDNO13)擴(kuò)增成熟的歐洲油菜tMT2編碼序列油菜正向(17509)GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAGGAGATAGAACCATGGCGACAAGATGCAGCAGCAGCAGCAG(SEQIDNO77).油菜反向(17181)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTCAGATGGGTTGGTCTTTGGGAACG(SEQIDNO78).用下述合成的寡核苷酸引物，從LIB4371-041-R1-K1-F7(SEQIDNO12)擴(kuò)增成熟的稻tMT2編碼序列水稻正向(17512)GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAGGAGATAGAACCATGCGGCTGAGGTGCGCGGCGTCGTCG(SEQIDNO79).水稻反向(17513)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTTAGATCGGCATGCCTTTGGGCAC(SEQIDNO80).用下述合成的寡核苷酸引物，從LIB3587-273-Q1-K6-C5(SEQIDNO8)擴(kuò)增成熟的玉米tMT2編碼序列玉米正向(17510)GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAGGAGATAGAACCATGAGGCTGCGATGCGCGGCGTCGTCG(SEQIDNO81).玉米反向(17511)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTCAGATTGGCATGCCTTTTGGCACG(SEQIDNO82).用下述合成的寡核苷酸引物，從LIB3049-032-Q1-E1-G8(SEQIDNO11)擴(kuò)增成熟大豆tMT2編碼序列大豆正向(17516)GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAGGAGATAGAACCATGGTACCCAAGTGTAGTGTCTCGGC(SEQIDNO83).大豆反向(17517)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTTAGATTGGCTGACCTTTGGGAAC(SEQIDNO84).用下述合成的寡核苷酸引物，從LIB4521-015-Q1-K1-D6(SEQIDNO10)擴(kuò)增成熟的韭蔥tMT2編碼序列韭蔥正向(17518)GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAGGAGATAGAACCATGATCTTTACATGCAGCGCGTCCT(SEQIDNO85).韭蔥反向(17519)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTCATATGGGCTGGCCTTTCGGTAC(SEQIDNO86).用下述合成的寡核苷酸引物，從LIB3272-054-P1-K1-C11(SEQIDNO9)擴(kuò)增成熟的陸地棉tMT2編碼序列陸地棉正向(17514)GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAGGAGATAGAACCATGGCCCCGAGGTGCAGCTTATCAGCG(SEQIDNO87).陸地棉反向(17515)GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTTAGATTGGTTGACCCTCTGGTAC(SEQIDNO88).每100μlPCR反應(yīng)液中各組分的終濃度組成如下·0.5μl質(zhì)粒DNA用1∶20水稀釋·1XBuffer2(ExpandHighFidelityPCRSystem，RocheMolecularBiochemicals)·200μMdNTPs·300nM各寡核苷酸引物·0.8μlExpandHighFidelityPolymerase(RocheMolecularBiochemicals)用下述的“touchdown”循環(huán)程序，將每一來源的tMT2基因PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。每次反應(yīng)，都將PCR反應(yīng)混合液在95℃預(yù)孵育5分鐘，以使聚合酶摻入。然后擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由94℃30sec變性，60℃30sec退火以及72℃1.5min延伸組成。前15個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)退火溫度較前降低1℃。接著再進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由94℃30sec，45℃30sec以及72℃1.5min組成，接著在72℃再保持7分鐘。每個(gè)種類的擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％的凝膠電泳上均可以看到合適大小的清晰的條帶。然后用GATEWAY克隆系統(tǒng)(LifeTechnologies，ADivisionofInvitrogenCorp.，Rockville，MD)，將PCR產(chǎn)物亞克隆入pDONRTM201(LifeTechnologies，ADivisionofInvitrogenCorp.，Rockville，MD)。為了驗(yàn)證PCR擴(kuò)增未引入錯(cuò)誤，用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序技術(shù)對(duì)雙鏈DNA測(cè)序。然后，用GATEWAY克隆系統(tǒng)(LifeTechnologies，ADivisionofInvitrogenCorp.，Rockville，MD)，將tMT2序列置于原核表達(dá)載體pET-DEST42(LifeTechnologies，ADiVisionofInvitrogenCorp.，Rockville，MD)中T7啟動(dòng)子之后。以下序列表示野生型和突變基因的成熟氨基酸序列，在加入氨基端蛋氨酸后，可以在大腸桿菌表達(dá)。黑體和斜體氨基酸殘基表示每個(gè)突變中的替換位點(diǎn)。大腸桿菌中表達(dá)的成熟野生型擬南芥tMT2蛋白ATRCSSSSVSSSRPSAQPRFIQHKKEAYWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLSHPDMRVVDVGGGTGFTTLGIVKTVKAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIVEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIREAYRVLKIGGKACLIGPVYPTFWLSRFFSDVWMLFPKEEEYIEWFKNAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNNPFSFLGRFLLGTLAAAWFVLIPIYMWIKDQIVPKDQPI(SEQIDNO28)大腸桿菌中表達(dá)的成熟突變體hdt2擬南芥tmt2蛋白ATRCSSSSVSSSRPSAQPRFIQHKKEAYWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLSHPDMRVVDVGGGTGFTTLGIVKTVKAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIVEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIREAYRVLKIGGKACLIGPVYPTFWLSRFFSDVWMLFPKEEEYIEWFKNAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEKDVEKPVNNPFSFLGRFLLGTLAAAWFVLIPIYMWIKDQIVPKDQPI(SEQIDNO29)大腸桿菌中表達(dá)的成熟突變體hdt6擬南芥tmt2蛋白ATRCSSSSVSSSRPSAQPRFIQHKKKAYWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLSHPDMRVVDVGGGTGFTTLGIVKTVKAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIVEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIREAYRVLKIGGKACLIGPVYPTFWLSRFFSDVWMLFPKEEEYIEWFKNAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNNPFSFLGRFLLGTLAAAWFVLIPIYMWIKDQIVPKDQPI(SEQIDNO30)大腸桿菌中表達(dá)的成熟突變體hdt10擬南芥tmt2蛋白ATRCSSSSVSSSRPSAQPRFIQHKKEAYWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLSHPDMRVVNVGGGTGFTTLGIVKTVKAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIVEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIREAYRVLKIGGKACLIGPVYPTFWLSRFFSDVWMLFPKEEEYIEWFKNAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNNPFSFLGRFLLGTLAAAWFVLIPIYMWIKDQIVPKDQPI(SEQIDNO31)大腸桿菌中表達(dá)的成熟突變體hdt16擬南芥tmt2蛋白ATRCSSSSVSSSRPSAQPRFIQHKKEAYWFYRFLSIVYDHVINPGHWIEDMRDDALEPADLSHPDMRVVDVGGGTGFTTLGIVKTVKAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIVEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIREAYRVLKIGGKACLIGPVYPTFWLSRFFSDVWMLFPKEEEYIEWFKNAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNNPFSFLGRFLLGTLAAAWFVLIPIYMWIKDQIVPKDQPI(SEQIDNO32)大腸桿菌中表達(dá)的成熟歐洲油菜tMT2ATRCSSSSSVSASRPSAQPRFIQHKKEAYWFYRFLSIVYDHIINPGHWTEDMRDDALEPADLSHPDMRVVDVGGGTGFTTLGIVKTVKAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIVEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIREAYRVLKIGGKACLIGPVHPTFWLSRFFADVWMLFPKEEEYIEWFKNAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNNPFSFLGRFLLGTLAAAWFVLIPIYMWIKDQIVPKDQPI.(SEQIDNO33)大腸桿菌中表達(dá)的成熟水稻tMT2RLRCAASSSSAAARPMSQPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLYSRKLRVVDVGGGTGFTTLGIVKRVDPENVTLLDQSPHQLEKAREKEALKGVTIMEGDAEDLPFPTDTFDRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLRLGGVACMIGPVHPTFWLSRFFADMWMLFPKEEEYIEWFKKAGFKDVKLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKREHGDSPLQLGPKVEDVSKPVNPITFLFRFLMGTICAAYYVLVPIYMWIKDQIVPKGMPI(SEQIDNO34)大腸桿菌中表達(dá)的成熟玉米tMT2RLRCAASSSPAAARPATAPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALERADLFSRHLTVVDVGGGTGFTTLGIVKHVNPENVTLLDQSPHQLDKARQKEALKGVTIMEGDAEDLPFPTDSFDRYISAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLRFGGLACVIGPVYPTFWLSRFFADMWMLFPKEEEYIEWFKKAGFRDVKLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKRERGDSPLELGPKAEDVSKPVNPITFLFRFLVGTICAAYYVLVPIYMWIKDQIVPKGMPI(SEQIDNO35)大腸桿菌中表達(dá)的成熟大豆tMT2VPKCSVSASRPSSQPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLNDRNMIVVDVGGGTGFTTLGIVKHVDAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECKIIEGDAEDLPFRTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLKLGGKACLIGPVYPTFWLSRFFADVWMLFPKEEEYIEWFQKAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKEEDVEKPVNPFVFALRFVLGALAATWFVLVPIYMWLKDQVVPKGQPI(SEQIDNO36)大腸桿菌中表達(dá)的成熟韭蔥tMT2IFTCSASSSSRPASQPRFIQHKQEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPAELYDSRMKVVDVGGGTGFTTLGIIKHIDPKNVTILDQSPHQLEKARQKEALKECTIVEGDAEDLPFPTDTFDRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLKLGGVACLIGPVHPTFWLSRFFADMWMLFPTEEEYIEWFKKAGFKDVKLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKRLSGDSPLQLGPKAEDVKKPINPFSFLLRFILGTIAATYYVLVPIYMWIKDQIVPKGQPI(SEQIDNO37).大腸桿菌中表達(dá)的成熟陸地棉tMT2APRCSLSASRPASQPRFIQHKKEAFWFYRFLSIVYDHVINPGHWTEDMRDDALEPADLNDRDMVVVDVGGGTGFTTLGIVQHVDAKNVTILDQSPHQLAKAKQKEPLKECNIIEGDAEDLPFPTDYADRYVSAGSIEYWPDPQRGIKEAYRVLKQGGKACLIGPVYPTFWLSRFFADVWMLFPKEEEYIEWFEKAGFKDVQLKRIGPKWYRGVRRHGLIMGCSVTGVKPASGDSPLQLGPKAEDVSKPVNPFVFLLRFMLGATAAAYYVLVPIYMWLKDQIVPEGQPI(SEQIDNO38)實(shí)施例52-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶的活性分析在大腸桿菌成熟克隆基因表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，來驗(yàn)證編碼蛋白的功能。過夜培養(yǎng)大腸桿菌BL21(DE3)，其中含有實(shí)施例4所述原核表達(dá)載體。然后將其接種入100mL的LB培養(yǎng)基中，同時(shí)加入適當(dāng)?shù)目股亍＝臃N后的光密度為OD600＝0.1，然后在25℃培養(yǎng)，至終密度為OD600＝0.6。接著加入終濃度為0.4mM的IPTG來誘導(dǎo)表達(dá)，將細(xì)胞在25℃孵育3小時(shí)直到收獲。將細(xì)胞冰浴5分鐘，然后5000×g離心10分鐘。細(xì)胞沉淀在完全去除上清后，置于-80℃過夜。細(xì)胞沉淀在冰上融化，重懸于4mL提取緩沖液XB(1OmMHEPES-KOHpH7.8，5mMDTT，1mMAEBSF，0.1mM抑肽酶，1mg/mlleupeptin)。用Frenchpress以20,000psi兩次通過壓力細(xì)胞來破壞細(xì)胞。加入終濃度為1％的TritonX-100，然后冰浴1小時(shí)。接著將細(xì)胞勻漿在5000×g，4℃離心10分鐘。細(xì)胞提取的當(dāng)天進(jìn)行酶分析。分析在10mL的聚丙烯管中進(jìn)行，終體積為1mL。制備如下組成的反應(yīng)混合液，加入雙蒸水至終體積為950μl。反應(yīng)混合液50mMTris-HClpH8.05mM二硫蘇糖醇(DTT，100mM水儲(chǔ)存液)100μM2-甲基葉綠基質(zhì)體醌(404g/mol)0.5％Tween80(溶劑蒸發(fā)完之后，直接加入葉綠基質(zhì)體醌)1.7μM14C-SAM(58pCi/pmole)2-甲基葉綠基質(zhì)體醌和2-甲基-香葉香葉基質(zhì)體醌用如下方法合成新鮮BF3-醚合物(0.3ml)逐滴加入含400mg甲基醌醇、1000mg異植醇的10ml干二噁烷溶液中，混合液在暗處N2下攪拌，然后50℃保持2小時(shí)。反應(yīng)混合液用冰水解，用3×15ml石油醚/二乙醚(1∶1)，提取物用水洗幾次，以去除未用的甲基醌，然后用MgSO4干燥。接著，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑蒸發(fā)，產(chǎn)生含有甲基質(zhì)體醌混合物的象原油反應(yīng)產(chǎn)物一樣的油。在這個(gè)階段，反應(yīng)混合液通過急驟層析及隨后的HPLC純化，被分離成各種甲基葉綠基質(zhì)體醌，或者氧化產(chǎn)生更穩(wěn)定的甲基質(zhì)體醌。這一步通過加入少量的Ag2O(200mg)于溶解于二乙醚的反應(yīng)產(chǎn)物中作用1小時(shí)完成。過濾除去Ag2O，即可得甲基葉綠基質(zhì)體醌混合物。上述甲基葉綠基質(zhì)體醌的合成得到6個(gè)同分異構(gòu)體，即2-甲基-3-葉綠基質(zhì)體醌、2-甲基-5-葉綠基質(zhì)體醌以及2-甲基-6-葉綠基質(zhì)體醌的2’-順式和2’-反式同分異構(gòu)體。將甲基葉綠基質(zhì)體醌混合物在TLC(PSC-FertigplattenKieselgel60F254+366，Merck，Darmstadt)上分離成兩條帶，所用溶劑系統(tǒng)為石油醚∶二乙醚(7∶3)，從而將6種同分異構(gòu)體純化。同分異構(gòu)體的最終純化通過半制備型HPLC完成。HPLC在由HPG1329AAutoSampler，HPG1311AQuaternaryPump，HPG1315ADiodeArrayDetector，HPG1321AFluorescenceDetector組成的HP1100系列HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行。激發(fā)在290nm進(jìn)行，發(fā)射在336nm檢測(cè)。相應(yīng)地，吸收用設(shè)置為210和254nm的二極陣列檢測(cè)儀檢測(cè)。流速控制在5ml/min。質(zhì)體醌用90％己烷∶甲基-叔丁基-醚(90∶10)，AgilentZorbaxSilica9.4×250mm柱，無梯度HPLC進(jìn)行分離。2-甲基-香葉基香葉基質(zhì)體醌的合成如2-甲基-6-葉綠基質(zhì)體醌，只是將其中的異植醇替換為香葉基芳樟醇。純化如前所述，通過急驟層析及其隨后的重復(fù)TLC進(jìn)行。為了進(jìn)行甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析，將50μL細(xì)胞提取液加入分析混合液中，充分混合。然后加入14C-SAM(ICN)，置于暗處30℃孵育1小時(shí)。然后轉(zhuǎn)入配有Teflon帽的15mL螺帽玻璃管。然后將反應(yīng)混合物用含有1mg/mL丁化羥基甲苯(BHT)的4mL2∶1CHCl3/MeOH提取，渦漩振蕩30秒混合。接著離心5分鐘分層，將有機(jī)相(底部)轉(zhuǎn)入一個(gè)新的玻璃管。在氮?dú)饬鞔嬖谙拢?7℃15分鐘，使其中的CHCl3揮發(fā)。殘留物進(jìn)一步溶于含1％焦焙酚的200μLEtOH中，渦漩振蕩30秒混合。重懸液過濾入一個(gè)帶蓋的棕色LC小瓶中，然后用正常相柱(Agilent4.6×250mmZorbaxSil，AgilentTechnologies)HPLC分析。洗脫條件為無梯度洗脫，己烷中含10％甲基-叔-丁基-醚(MTBE)，流速1.5ml/分，12分鐘。每次注射前，用75％MTBE的己烷清洗3分鐘，10％MTBE的己烷再平衡3分鐘。已知含有tMT2活性的豌豆葉綠體濃縮液，通過Arango和Heise，BiocheJ.336531-533(1998)所述方法制備，作為陽性對(duì)照。酶分析的結(jié)果見圖4-8。一系列層析譜表明，用Anabaena(已知具有tMT2活性)的MT1及擬南芥(圖5)的tMT2轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有與2，3-二甲基-5-葉綠基質(zhì)體醌標(biāo)準(zhǔn)品共遷移的甲基化產(chǎn)物的積累。擬南芥(hdt2)的突變tMT2基因積累的甲基化產(chǎn)物(圖6)明顯少于野生型tMT2基因(圖5)，表明其tMT2活性降低。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，底物受到Ahabaena的MT1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞抑制的陰性對(duì)照沒有一個(gè)明顯的對(duì)應(yīng)于甲基化產(chǎn)物的峰(圖7)。另外，作為陽性對(duì)照的豌豆葉綠體有相應(yīng)于甲基化產(chǎn)物的峰，其中的甲基化產(chǎn)物來自于攜帶有MT1和tMT2表達(dá)構(gòu)建體的大腸桿菌的提取物(圖8)。農(nóng)作物tMT2直向同源物的表達(dá)和酶分析來自于蕓苔(pMON67223)、玉米(pMON67234)、韭蔥(pMON67235)、大豆(pMON67245)、稻(pMON67232)和棉花(pMON67244)以及野生型擬南芥(pMON67191)、hdt2突變株(pMON67207)和hdt10突變株(pMON67243)的tMT2直向同源物在大腸桿菌中表達(dá)為成熟蛋白(實(shí)施例4)。魚腥藻hdt2直向同源物表達(dá)自pMON67190。魚腥藻MT1(pMON67174)及空載體(pMON67179)分別作為陽性和陰性對(duì)照。細(xì)胞生長(zhǎng)、收獲、破壞以及酶分析按照實(shí)施例5進(jìn)行。HPLC-純化的2-甲基-6-葉綠基質(zhì)體醌作為甲基基團(tuán)的受體。表3重組表達(dá)的tMT2基因的2-甲基-6-葉綠基質(zhì)體醌活性用HPLC-純化的2-甲基-6-葉綠基質(zhì)體醌、2-甲基-5-葉綠基質(zhì)體醌或2-甲基-3-葉綠基質(zhì)體醌作為甲基基團(tuán)的受體，按照實(shí)施例5的方法，對(duì)擬南芥tMT2、稻tMT2、棉花tMT2和大豆tMT2的成熟蛋白以及表達(dá)魚腥藻MT1的大腸桿菌提取物進(jìn)行分析。分析表明tMT2直向同源物比細(xì)菌MT1的底物范圍寬(圖24)。用2-甲基-6-香葉基質(zhì)體醌、δ-生育酚、γ-生育酚、β-生育酚作為甲基基因的受體，對(duì)表達(dá)擬南芥、稻、棉花和大豆tMT2成熟蛋白以及魚腥藻MT1的無細(xì)胞大腸桿菌提取物進(jìn)行甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析。所有四個(gè)底物，酶活性均在檢測(cè)限以下。實(shí)施例6野生型擬南芥tMT2基因在擬南芥中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)tMT2的編碼區(qū)從EST克隆Lib3177-021-P1-K1-A3(SEQIDNO1)擴(kuò)增而來，所用引物如下#17286正向GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGGCCGCTGAACAATGGCCTCTTTGATGCTCAACG(SEQIDNO89)和#17181反向GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGGTCAGATGGGTTGGTCTTTGGGAACG(SEQIDNO90).擴(kuò)增反應(yīng)液組成如下1.0μl的EST模板、2.5μl的20×dNTPs，寡核苷酸引物各2.5μl，5μl的10×PCR緩沖液，35.75μl的H2O以及0.75μl的ExpandHighFidelityDNAPolymerase。PCR擴(kuò)增條件如下●1個(gè)循環(huán)94℃2min，10個(gè)循環(huán)的94℃-15sec；55℃-30sec；72℃-1.5min，●15個(gè)循環(huán)94℃-15sec；55℃-30sec；72℃-1.5min，每個(gè)循環(huán)72℃延伸增加5sec，●1個(gè)循環(huán)72℃7min，擴(kuò)增后，樣品用QiagenPCR純化柱(QiagenCompany，Valencia，California)進(jìn)行純化，懸于30μl水中。然后用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離和檢測(cè)。用GATEWAY克隆系統(tǒng)(LifeTechnologies，ADivisionofInvitrogenCorp.，Rockville，MD)，將PCR產(chǎn)物亞克隆入pDONRTM201(LifeTechnologies，ADivisionofInVitrogenCorp.，Rockville，MD)，將由此而得質(zhì)粒命名為pMON67204，并進(jìn)一步用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序方法證實(shí)tMT2基因。然后用GATEWAYTecnology試劑盒(LifeTechnologies，ADivisionofInVitrogenCorp.，Rockville，MD)，按照制造商的說明，將野生型擬南芥tMT2序列從pMON67204供體載體克隆到目的載體pMON671510。目的載體是一個(gè)從pCGN3223(如U.S.PatentNo.5,639,790所述)衍生而來的含有napin盒的GATEWAY兼容雙元載體。所得的表達(dá)載體命名為pMON67205(圖9)，用于驅(qū)動(dòng)tMT2序列在種子的表達(dá)。上述的植物雙元構(gòu)建體用于擬南芥轉(zhuǎn)化，指導(dǎo)tMT2基因在胚胎的表達(dá)。用Holsters等，Mol.Gen.Genet.163181-187(1978)的方法，將雙元載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入ABI株農(nóng)桿菌細(xì)胞。如Valverkens等，Proc.Nat.Acad.Sci.855536-5540(1988)，Bent等，Science2651856-1860(1994)，和Bechtold等，C.R.Acad.Sci.，LifeSciences3161194-1199(1993)。所述通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥野生型、δ-生育酚突變株hdt2，hdt10和hdt16的轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植物。將轉(zhuǎn)化的T1種子直接噴灑入土壤中，4℃無光情況下，春化4天。然后，將種子轉(zhuǎn)移到21℃，有光處16小時(shí)。并在播種后7天和14天，噴灑1∶200稀釋的Finale(AgrEvoEnvironmentalHealth，Montvale，NJ)。轉(zhuǎn)化植株發(fā)育成熟后，所得的T2種子用于分析生育酚含量。表4和5所得的生育酚的數(shù)據(jù)證實(shí)，在高δ-生育酚突變株和野生型擬南芥品系，δ-生育酚的降低有利于γ和α-生育酚的升高。表4和5包含用Savidge等，PlantPhys.129321-332(2000)，集胞藻spPCC6803和擬南芥來源的尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶基因的分離和特征中所述方法(稍做變動(dòng))，進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果。表4詳細(xì)列出了T2種子分析的結(jié)果表4mp表示“代謝特征(profiling)”表5描述了含有pMON67205的hdt2突變品系的T3種子數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表5實(shí)施例7制備大豆和擬南芥表達(dá)的雙基因構(gòu)建體的方法構(gòu)建含有啟動(dòng)子，可以使tMT2基因單獨(dú)或與GMT基因聯(lián)合在大豆種子特異表達(dá)的載體。另外，tMT2基因克隆于一個(gè)含有擬南芥的HPT基因的雙元載體中，napin啟動(dòng)子之后。在另一個(gè)雙基因構(gòu)建體中，則是與Synechocystis的異戊烯轉(zhuǎn)移酶(PT)基因(slr1736)一起(分別如圖14和15所示的pMON67224和pMON67223)。大豆構(gòu)建體將野生型擬南芥tMT2基因克隆于載體pCGN3892的7S啟動(dòng)子和豌豆SSURubisco3’UTR之間，得到pMON67220(圖10)。然后用NotI消化該克隆，所得表達(dá)盒亞克隆于植物雙表達(dá)載體pCGN11121，得到pMON67226(圖11)。將此載體轉(zhuǎn)化大豆。另外，將pMON36503載體7S啟動(dòng)子和豌豆SSURubisco3’UTR之間的擬南芥GMT基因切下來，克隆入pMON67220，得到pMON67225(圖12)。進(jìn)而，用NotI將pMON67225中7S啟動(dòng)子控制之下的兩個(gè)基因切下來，克隆入pCGN11121的NotI位點(diǎn)，得到pMON67227(圖13)。然后將此雙基因構(gòu)建體，按照WO00/61771A3的99-100頁的方法，轉(zhuǎn)入大豆，培育成熟，所得種子用于分析總生育酚含量和組成。表3和5所示的生育酚數(shù)據(jù)表明，在含有tMT2表達(dá)構(gòu)建體的大豆種子中，β-生育酚含量的降低有利于γ和α-生育酚，δ-生育酚更是如此。表4和6表明，在含有tMT2和γ-甲基轉(zhuǎn)移酶雙基因表達(dá)構(gòu)建體的大豆種子中，生育酚幾乎全部(R0代98％)轉(zhuǎn)換為α-生育酚。下面的表6描述了含有pMON67226大豆的各種大豆品系分析的結(jié)果。表6和9包含用Savidge等，PlantPhys.129321-332(2000)，集胞藻spPCC6803和擬南芥來源的尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶基因的分離和特征中所述方法(稍做變動(dòng))，進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果。表6下面的表7給出了用pMON67227轉(zhuǎn)化的各種大豆品系的分析結(jié)果。表7下面的表8給出了用pMON67226轉(zhuǎn)化的單一大豆種子的分析結(jié)果。表8下面的表9給出了用pMON67227轉(zhuǎn)化的單一大豆種子的分析結(jié)果。表9表6至9中％β之后的*表示β-生育酚與未知化合物共遷移(comigrates)，使得它難以定量。擬南芥雙構(gòu)建體用限制酶NotI(平端)/PstI，將tMT2基因從載體pMON67204上切割下來，克隆入用SalI(平端)/PstI消化的napin穿梭載體pCGN3223中。然后用NotI將含有tMT2基因的napin盒從載體上切割下來，并用Klenow酶dNTPs將其末端補(bǔ)平。進(jìn)而將所得片段插入載體pMON16602(用PmeI消化)和pCGN10822(用SnaBI消化)中，分別得到pMON67224和pMON67223(圖14和15)。載體pMON16602和pCGN10822在PCT申請(qǐng)WO0063391中有描述。這種雙構(gòu)建體在napin種子特異啟動(dòng)子控制下，表達(dá)來源于擬南芥(HPT)或集胞藻(slr1736)的tMT2基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶。這種構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)化植株發(fā)育成熟，詳見實(shí)施例6。所得的T2種子，用實(shí)施例1所述分析方法分析總的生育酚含量和組成。序列表<110>Lincoln，KimValentin，HenryVanEenennaam，AlisonStein，JoshuaNorris，Susan<120>芳族甲基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用<130>MONS043CN<150>60/330,563<151>2001-10-25<160>108<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1184<212>DNA<213>擬南芥<400>1atggcctctttgatgctcaacggggccattaccttccccaaaggtttaggttcccctggt60tccaatttgcatgccagatcgattcctcggccgaccttactctcagttacccgaacctcc120acacctagactctcggtggctactagatgcagcagcagcagcgtgtcgtcttcccggcca180tcggcgcaacctaggttcattcagcacaagaaggaggcttactggttctacaggttctta240tccatcgtatacgaccatgtcatcaatcctgggcattggaccgaggatatgagagacgac300gctcttgagccagcggatctcagccatccggacatgcgagtggtcgatgtcggcggcgga360actggtttcactactctgggcatagtcaagacagtgaaggccaagaatgtgaccattctg420gaccagtcgccacatcagctggccaaagcaaagcaaaaggagccgttgaaagaatgcaag480atcgtcgagggagatgctgaggatcttccttttccaaccgattatgctgacagatacgtt540tctgctggaaggtatccttttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttataatc600gtcttctttccggtgggtttgattgtgtgtctcatcatcacacagcattgagtactggcc660ggacccgcagaggggaataagggaagcgtacagggttctcaagatcggtggcaaagcgtg720tctcatcggccctgtctacccaaccttctggctctctcgcttcttttctgatgtctggat780gctcttccccaaggaggaagagtacattgagtggttcaagaatgccggtttcaaggacgt840tcagctcaagaggattggccccaagtggtaccgtggtgttcgcaggcacggccttatcat900gggatgttctgtcactggtgttaaacctgcctccggtgactctcctctccaggtctttta960cctcccacttcaccttttttactttcttctctctttgatacactaaacttatcactcaaa1020tgctgcagcttggtccaaaggaagaggacgtagagaagcctgtcaacaaccccttctcct1080tcttgggacgcttcctcctgggaactctagcagctgcctggtttgtgttaatccctatct1140acatgtggatcaaggatcagatcgttcccaaagaccaacccatc1184<210>2<211>1181<212>DNA<213>擬南芥<400>2atggcctctttgatgctcaacggggccattaccttccccaaaggtttaggttcccctggt6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aa65707580XaaProArgPheIleGlnHisLysXaaGluAlaXaaTrpPheTyrArg859095PheLeuSerIleValTyrAspHisXaaIleAsnProGlyHisTrpThr100105110GluAspMetArgAspAspAlaLeuGluProAlaXaaLeuXaaXaaXaa115120125XaaXaaXaaValValAspValGlyGlyGlyThrGlyPheThrThrLeu130135140GlyIleXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaAsnValThrXaaLeuAspGln145150155160SerProHisGlnLeuXaaLysAlaXaaXaaLysGluXaaLeuLysXaa165170175XaaXaaIleXaaGluGlyAspAlaGluAspLeuProPheXaaThrAsp180185190XaaXaaAspArgTyrXaaSerAlaGlySerIleGluTyrTrpProAsp195200205ProGlnArgGlyIleXaaGluAlaTyrArgValLeuXaaXaaGlyGly210215220XaaAlaCysXaaIleGlyProValXaaProThrPheTrpLeuSerArg225230235240PhePheXaaAspXaaTrpMetLeuPheProXaaGluGluGluTyrIle245250255GluTrpPheXaaXaaAlaGlyPheXaaAspValXaaLeuLysArgIle260265270GlyProLysTrpTyrArgGlyValArgArgHisGlyLeuIleMetGly275280285CysSerValThrGlyValLysXaaXaaXaaGlyAspSerProLeuXaa290295300LeuGlyProLysXaaGluAspValXaaLysProXaaXaaAsnProXaa305310315320XaaPheXaaXaaArgPheXaaXaaGlyXaaXaaXaaAlaXaaXaaXaa325330335ValLeuXaaProIleTyrMetTrpXaaLysAspGlnXaaValProXaa340345350XaaXaaProIle35權(quán)利要求1.一種基本純化的核酸分子，其編碼具有2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶活性的植物多肽。2.權(quán)利要求1的基本純化的核酸分子，其中所述植物選自擬南芥Columbia生態(tài)型、擬南芥Landsberg生態(tài)型、玉米、大豆、稻、蔥屬植物、蕓苔屬植物和棉屬植物。3.權(quán)利要求1的基本純化的核酸分子，其中所述核酸分子編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16-38的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1的基本純化的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶活性的突變的植物多肽。5.權(quán)利要求4的基本純化的核酸分子，其中所述核酸分子是選自hdt2、hdt6、hdt9、hdt10和hdt16的突變基因。6.一種基本純化的核酸分子，其包含選自SEQIDNOs3-14及其互補(bǔ)序列的核酸序列。7.一種基本純化的植物多肽分子，其具有2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶活性。8.權(quán)利要求7的基本純化的植物多肽分子，其中所述多肽分子是選自擬南芥Columbia生態(tài)型、擬南芥Landsberg生態(tài)型、玉米、大豆、稻、蔥屬植物、蕓苔屬植物和棉屬植物的生物體所固有的。9.一種包含導(dǎo)入的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中的核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列。10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、柑橘、卡諾拉、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、鷹嘴豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。11.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化植物，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的核酸分子的植物相比，所述轉(zhuǎn)化植物所產(chǎn)生的種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。12.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子進(jìn)一步包括一種可操作性連接于所述核酸序列的外源啟動(dòng)子，方向?yàn)?’到3’。13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。14.一種包含導(dǎo)入的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列。15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、柑橘、卡諾拉、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。16.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)化植物，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的核酸分子的植物相比，所述轉(zhuǎn)化植物所產(chǎn)生的種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。17.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子進(jìn)一步包括一種可操作性連接于所述核酸序列的外源啟動(dòng)子，方向?yàn)?’到3’。18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。19.一種包含導(dǎo)入的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列。20.權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、柑橘、卡諾拉、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。21.一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736、HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，它們的互補(bǔ)序列、植物直向同源物以及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。22.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、柑橘、卡諾拉、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。23.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化植物，其中所述導(dǎo)入的第二核酸編碼GMT，所述轉(zhuǎn)化植物含有具有如下特性的組織與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和所述導(dǎo)入的第二核酸分子的植物相比，該組織中α-生育酚和α-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。24.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化植物，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和所述導(dǎo)入的第二核酸分子的植物相比，所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。25.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化植物，其中所述導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子中至少有一個(gè)還包括可操作性連接的外源啟動(dòng)子，方向?yàn)?’到3’。26.權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。27.一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736、HPT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、GMT、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，及其互補(bǔ)序列。28.權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、柑橘、卡諾拉、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。29.權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化植物，其中所述導(dǎo)入的第二核酸分子編碼GMT，所述轉(zhuǎn)化植物含有具有如下特性的組織與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和所述導(dǎo)入的第二核酸分子的植物相比，該組織中α-生育酚和α-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。30.權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化植物，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和所述導(dǎo)入的第二核酸分子的植物相比，所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。31.權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化植物，其中所述導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子中至少有一個(gè)包括可操作性連接的外源啟動(dòng)子，方向?yàn)?’到3’。32.權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。33.一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列。34.權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、柑橘、卡諾拉、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。35.權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)化植物，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和所述導(dǎo)入的第二核酸分子的植物相比，所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子中γ-生育酚的含量升高。36.權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)化植物，其中所述導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子中至少有一個(gè)包括可操作性連接的外源啟動(dòng)子，方向?yàn)?’到3’。37.權(quán)利要求36的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。38.一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子具有選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列。39.權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、柑橘、卡諾拉、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。40.權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)化植物，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和所述導(dǎo)入的第二核酸分子的植物相比，所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子中α-生育酚和α-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。41.權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)化植物，其中至少有一個(gè)核酸分子還包括可操作性連接的外源啟動(dòng)子，方向?yàn)?’到3’。42.權(quán)利要求41的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。43.一種在植物中降低基因表達(dá)的方法，所述基因編碼具有2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶活性的植物多肽，所述方法包括(A)用核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子具有導(dǎo)入的啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)子在植物細(xì)胞引導(dǎo)mRNA分子的產(chǎn)生，所述導(dǎo)入的啟動(dòng)子區(qū)域與具有轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈的轉(zhuǎn)錄核酸分子相連接，其中的轉(zhuǎn)錄鏈與含有選自SEQIDNos1-15的核酸序列的核酸分子互補(bǔ)，所述轉(zhuǎn)錄核酸分子與3’非翻譯序列相連接，后者在植物細(xì)胞中終止轉(zhuǎn)錄，并在mRNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核糖核苷酸；(B)培育所述轉(zhuǎn)化植物。44.包含一種核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，所述核酸分子包含導(dǎo)入的啟動(dòng)子區(qū)域，該啟動(dòng)子區(qū)域在植物細(xì)胞中引導(dǎo)mRNA分子的產(chǎn)生，所述導(dǎo)入的啟動(dòng)子區(qū)域與具有轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈的轉(zhuǎn)錄核酸分子相連接，其中的轉(zhuǎn)錄鏈與含有選自SEQIDNos1-14的核酸序列的核酸分子互補(bǔ)，所述轉(zhuǎn)錄核酸分子與3’非翻譯序列相連接，后者在植物細(xì)胞中終止轉(zhuǎn)錄，并在mRNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核糖核苷酸。45.權(quán)利要求44的轉(zhuǎn)化植物，與具有相似遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的核酸分子的植物相比，編碼一種具有2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基轉(zhuǎn)移酶活性的植物多肽的基因的表達(dá)降低。46.產(chǎn)生種子中γ-生育酚含量升高的植物的方法，包括(A)用一種導(dǎo)入的核酸分子轉(zhuǎn)化植物，所述核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2以及8-15的核酸序列；(B)培育所述轉(zhuǎn)化植物。47.權(quán)利要求46的產(chǎn)生植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、荼、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。48.產(chǎn)生種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者含量升高的植物的方法，包括(A)用一種導(dǎo)入的核酸分子轉(zhuǎn)化植物，所述核酸分子包含一段核酸序列，所述核酸序列編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列；(B)培育轉(zhuǎn)化的植物。49.權(quán)利要求48的產(chǎn)生植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。50.產(chǎn)生種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者含量升高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736、HPT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物以及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體；(B)培育轉(zhuǎn)化的植物。51.權(quán)利要求50的產(chǎn)生植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。52.產(chǎn)生種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者含量升高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含一段核酸序列，所述核酸序列編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736、HPT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物以及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體；(B)培育轉(zhuǎn)化的植物。53.權(quán)利要求52的產(chǎn)生植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。54.產(chǎn)生種子中α-生育酚和α-生育三烯酚中的一種或兩者含量升高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的核酸序列；(B)培育轉(zhuǎn)化的植物。55.權(quán)利要求54的產(chǎn)生植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。56.產(chǎn)生種子中α-生育酚和α-生育三烯酚中的一種或兩者含量升高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中第一核酸分子編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼的多肽序列選自SEQIDNOs39-54，及其互補(bǔ)序列；(B)培育轉(zhuǎn)化的植物。57.權(quán)利要求56的產(chǎn)生植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。58.來源于一種轉(zhuǎn)化植物的種子，其中所述轉(zhuǎn)化植物包含導(dǎo)入的核酸分子，該核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列。59.權(quán)利要求58的種子，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的核酸分子的植物的種子相比，所述種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。60.來源于一種轉(zhuǎn)化植物的種子，其中所述轉(zhuǎn)化植物包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736、HPT、GMT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，及其互補(bǔ)序列、植物直向同源物以及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。61.權(quán)利要求60的種子，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的植物的種子相比，所述種子中γ-生育酚和γ-生育三烯酚中的一種或兩者的含量升高。62.來源于一種轉(zhuǎn)化植物的種子，其中所述轉(zhuǎn)化植物包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的核酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列。63.權(quán)利要求62的種子，其中與具有相似的遺傳背景但缺乏所述導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的植物的種子相比，所述種子中α-生育酚和α-生育三烯酚中的一種或幾種的含量升高。64.一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15及其互補(bǔ)序列的序列，導(dǎo)入的第二核酸分子包含選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的序列，導(dǎo)入的第三核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736、HPT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，其互補(bǔ)序列、植物直向同源物以及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。65.一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子編碼的多肽分子包含選自SEQIDNOs16，22-28及33-38的氨基酸序列，導(dǎo)入的第二核酸分子具有選自SEQIDNOs39-54及其互補(bǔ)序列的核酸序列，導(dǎo)入的第三核酸分子編碼一種酶，該酶選自tyrA、slr1736、HPT、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、slr1737、IDI、GGH，其互補(bǔ)序列、植物直向同源物以及尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體。66.一種包含導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中導(dǎo)入的第一核酸分子編碼tMT2酶，導(dǎo)入的第二核酸分子編碼GMT酶。67.產(chǎn)生種子中α-生育酚含量升高的植物的方法，包括(A)用編碼tMT2酶的第一核酸分子和編碼GMT酶的第二核酸分子轉(zhuǎn)化植物；(B)培育所述植物。68.來源于權(quán)利要求58、60或62的種子的油。69.包含權(quán)利要求58、60或62的種子的動(dòng)物飼料。70.產(chǎn)生種子中總生育酚含量升高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子包含選自SEQIDNOs1，2，8-15的核酸序列；(B)培育轉(zhuǎn)化的植物。71.權(quán)利要求70的產(chǎn)生植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、蕓苔、歐洲油菜、油籽油菜、花椰菜、卷心菜、卡諾拉、柑橘、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬植物、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、土豆、油菜子、稻、裸麥、高粱、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、小扁豆、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉花子、亞麻子、紅花和油棕。全文摘要本發(fā)明涉及與生育酚生物合成通路相關(guān)的基因。更具體地說，本發(fā)明提供并且包括與編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因有關(guān)的核酸分子、蛋白和抗體。本發(fā)明也提供了應(yīng)用這些因子的方法，例如用于基因分離、基因分析和轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。此外，本發(fā)明包括經(jīng)修飾而表達(dá)上述多肽的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也包括從生育酚生物合成通路生成產(chǎn)物的方法。文檔編號(hào)C12N15/82GK1578835SQ02821210公開日2005年2月9日申請(qǐng)日期2002年10月24日優(yōu)先權(quán)日2001年10月25日發(fā)明者S·R·諾里斯,K·林科恩,J·C·斯泰因,H·E·瓦倫廷,A·范埃寧納爾姆申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司

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