專利名稱：基于納米顆粒團(tuán)聚的dna去甲基化酶的生物傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種定量分析DNA去甲基化酶的生物傳感技術(shù)，具體是指DNA的去甲基化，酶切降解功能化的納米顆粒探針，納米顆粒的表面等離子體共振現(xiàn)象，納米顆粒團(tuán)聚產(chǎn)生的耦合增強(qiáng)和光吸收性質(zhì)的改變。
背景技術(shù)：
DNA去甲基化酶對(duì)于研究全基因組范圍內(nèi)的DNA去甲基化問題以及表觀遺傳重編排過程具有極其重要的意義。目前對(duì)于DNA去甲基化酶的檢測技術(shù)有夾心免疫方法和磷32 放射性同位素標(biāo)記方法，洗脫步驟多，操作復(fù)雜，耗時(shí)長，靈敏度不高，試劑穩(wěn)定性不好，同位素的衰變會(huì)影響結(jié)果以及放射性污染問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種基于納米顆粒團(tuán)聚的DNA去甲基化酶的生物傳感方法，不需要對(duì)酶的底物進(jìn)行標(biāo)記，靈敏度高，并且操作過程簡便、快速。金屬納米顆粒存在表面等離子體共振現(xiàn)象，當(dāng)表面等離子體受到激發(fā)，在顆粒表面產(chǎn)生電磁場，顯著增強(qiáng)了表面吸附分子的拉曼信號(hào)，而當(dāng)納米顆粒出現(xiàn)團(tuán)聚時(shí)，表面等離子體發(fā)生耦合作用，在顆粒之間產(chǎn)生了更強(qiáng)的電磁場，對(duì)表面吸附分子的拉曼信號(hào)能達(dá)到 IO12倍的增強(qiáng)作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是，制備核酸功能化的納米顆粒探針，特定的核酸序列中包含了限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)并進(jìn)行了甲基化處理，激活的DNA去甲基化酶使甲基化的DNA 發(fā)生去甲基化作用，從而對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶同時(shí)消化降解DNA，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生耦合增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)SERS檢測。同時(shí)，該方法會(huì)產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化， 也可以通過比色法進(jìn)行檢測。所述基于納米顆粒團(tuán)聚的DNA去甲基化酶的定量分析可以通過兩種技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一種技術(shù)方案中，基于納米顆粒團(tuán)聚的DNA去甲基化酶的生物傳感方法，包括如下步驟(I)制備修飾有拉曼染料和甲基化DNA的納米顆粒探針；(2) DNA去甲基化酶使修飾有拉曼染料和甲基化DNA的納米顆粒探針發(fā)生去甲基化作用；(3)對(duì)于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶同時(shí)消化降解DNA，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生耦合增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)SERS檢測； (4)利用SERS分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。其中，所述的甲基化DNA是包含限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)并對(duì)該位點(diǎn)處的胞嘧啶進(jìn)行了甲基化處理的DNA。本發(fā)明的另一種實(shí)方式中，基于納米顆粒團(tuán)聚的DNA去甲基化酶的生物傳感方法，包括如下步驟(I)制備修飾有甲基化DNA的納米顆粒探針；(2) DNA去甲基化酶使修飾有甲基化DNA的納米顆粒探針發(fā)生去甲基化作用；(3)對(duì)于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶同時(shí)消化降解DNA，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生光吸收的變化；(4)利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。其中，所述的甲基化DNA是包含限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)并對(duì)該位點(diǎn)處的胞嘧啶進(jìn)行了甲基化處理的DNA。以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。對(duì)于采用拉曼技術(shù)手段來實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA去甲基化酶的定量分析，操作過程是取修飾有拉曼染料和甲基化DNA的納米顆粒探針儲(chǔ)備液以及緩沖溶液于微量管中，加入包含有待測物的樣品溶液，37°C反應(yīng)I小時(shí)后，再加入對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶，繼續(xù)在37V反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，取一定體積的樣品對(duì)其進(jìn)行SERS檢測。本發(fā)明中，制備修飾有拉曼染料和甲基化DNA的納米顆粒探針通過已有的標(biāo)記方法來實(shí)現(xiàn)。具體步驟是取O. 3nM納米金溶液ImL, 10000r/min離心IOmin,用滅菌水定容為300 μ L，邊攪拌邊加入500 μ M 5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸)150 μ L，30分鐘后，再加入HS-DNA2. 8ηΜ，置于4°C冰箱；24小時(shí)后，進(jìn)行第一次老化，邊攪拌邊加入PB(100mM， PH 7. 4)57“1^，10分鐘后，加入？85(101111，含2皿NaCl) 30 μ L，使溶液中NaCl的終濃度達(dá)到 O. 1Μ，置于4°C冰箱；48小時(shí)后，進(jìn)行第二次老化，邊攪拌邊加入PBS 70 μ L，使溶液中NaCl 的終濃度達(dá)到O. 3Μ，置于4°C冰箱；24小時(shí)后，離心洗滌三次以除去分散在溶液中的DNA，用滅菌水定容置于4°C冰箱備用。本發(fā)明中，所述基于拉曼染料標(biāo)記的納米顆粒團(tuán)聚產(chǎn)生SERS信號(hào)增強(qiáng)的DNA去甲基化酶定量分析方法，檢測步驟是20μ L反應(yīng)體系中，加入2μ L IOX甘氨酸緩沖溶液 (670mMGlycine-K0H,67mM MgCl2, PH 9. 5)和6 μ L上述合成的金納米顆粒探針于微量管中， 再加入包含有待測物的樣品溶液，充分混勻后，放入37°C恒溫水浴中；反應(yīng)30分鐘后，加入限制性內(nèi)切酶Bshl236I I μ L和核酸外切酶I I μ L繼續(xù)反應(yīng)30分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，放入 80°C恒溫水浴中使酶失活，取反應(yīng)后的樣品溶液10 μ L滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描，得到樣品的拉曼光譜數(shù)據(jù)。對(duì)于采用光吸收技術(shù)手段來實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA去甲基化酶的定量分析，操作過程中不需要對(duì)納米顆粒進(jìn)行拉曼染料標(biāo)記，其它步驟完全一致，最后得到的產(chǎn)物溶液用滅菌水稀釋至60 μ L，移入微量石英比色皿中，通過紫外可見光吸收分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。注意，以上反應(yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。改變比例或試劑加入順序可使信號(hào)的變化程度在1% 100%內(nèi)變化。本發(fā)明制備了核酸功能化的納米顆粒探針，特定的核酸序列中包含了限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)并進(jìn)行了甲基化處理，激活的DNA去甲基化酶使甲基化的DNA發(fā)生去甲基化作用，從而對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶同時(shí)消化降解DNA，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，表面等離子體發(fā)生耦合作用，在顆粒之間產(chǎn)生了巨大的電磁場，顯著增強(qiáng)了顆粒表面吸附分子的拉曼信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的SERS檢測。同時(shí)，該方法會(huì)產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化， 也可以通過比色法進(jìn)行檢測。操作步驟簡單、快速，不需要對(duì)底物進(jìn)行標(biāo)記，靈敏度高、特異性強(qiáng)，有望成為研究全基因組范圍內(nèi)的DNA去甲基化問題以及表觀遺傳重編排過程的新方法之一，對(duì)于生物大分子的功能研究、活性分析和抑制劑考察也提供了技術(shù)手段。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :DNA去甲基化酶參考品的含量分析(I)制備修飾有拉曼染料和甲基化DNA的金納米顆粒探針稱取I. 58mg 5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用滅菌水稀釋為500 μ M(避光，備用)，取ImL納米金溶液在10000r/min離心lOmin，用滅菌水定容為300 μ L，邊攪拌邊加入500 μ M 5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸)150 μ L，30分鐘后，加入2. 8ηΜ末端修飾巰基的DNA，置于4°C冰箱；24小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢地加入PB (IOOmM, PH 7. 4) 57 μ L，10分鐘后，再加入PBS (IOmM,含2M NaCl) 30 μ L，使溶液中NaCl的終濃度達(dá)到
0.1Μ，置于4°C冰箱；48小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢的加入PBS 70 μ L，使溶液中NaCl的終濃度達(dá)到0. 3Μ，置于4°C冰箱；24小時(shí)后，用滅菌水稀釋為lmL，在15000r/min離心15min，除去上層溶液，用滅菌水分散離心下來的沉淀，定容為lmL，此過程重復(fù)三次以除去多余的DNA， 用滅菌水定容為30(^1^，置于41冰箱備用。(2)激活的DNA去甲基化酶使金納米顆粒探針發(fā)生去甲基化作用和雙酶切同時(shí)降解DNA導(dǎo)致金納米顆粒團(tuán)聚取濃度為lOyg/ml的DNA去甲基化酶參考品，用滅菌水分別稀釋到2 μ g/ml， 200ng/ml,20ng/ml,2ng/ml,200pg/ml,20pg/ml,2pg/ml。20μ L反應(yīng)體系中，包含有2μ L IOX甘氨酸緩沖溶液(670mM Glycine-KOH, 67mM MgCl2, PH 9. 5)，6 μ L上述合成的金納米顆粒探針，2 μ L含有DNA去甲基化酶的樣品溶液， IOyL滅菌水，充分混勻后，放入37°C恒溫水浴中，反應(yīng)30分鐘，得到了去甲基的金納米顆粒探針產(chǎn)物；取出后加入甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Bshl236I I μ L和核酸外切酶I IyL 繼續(xù)在37°C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，放入80°C恒溫水浴中使酶失活。(3)利用SERS分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測取10 μ L產(chǎn)物溶液滴在硅片上，利用激光共聚焦拉曼光譜儀對(duì)溶液進(jìn)行掃描，選用632nmHeNe激發(fā)器，曝光時(shí)間10秒，掃描圈數(shù)I圈，掃描范圍200nm-2000nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果待測物DNA去甲基化酶的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是200fg/ mL 200ng/mL,能達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí),檢測下限是120ng/mL。實(shí)施例2 :肺癌細(xì)胞中提取的DNA去甲基化酶的含量檢測(I)從A549 (ATCC)肺癌細(xì)胞中提取和純化DNA去甲基化酶按照細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，從A549細(xì)胞中得到了核蛋白抽提物，通過親和層析方法對(duì)核蛋白進(jìn)行純化，用Tris-HCl緩沖溶液(IOmM Tris, IOmM MgCl2, PH 7. 5)進(jìn)行洗脫，得到較高純度的DNA去甲基化酶。(2)制備修飾有甲基化DNA的金納米顆粒探針稱取I. 58mg 5，5' - 二硫雙(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用滅菌水稀釋為500 μ M (避光，備用)，取ImL納米金溶液在10000r/min離心lOmin，用滅菌水定容為450 μ L，加入2. 8ηΜ末端修飾巰基的DNA，置于4°C冰箱；24小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢地加入 PB(100mM，PH 7. 4) 57 μ L，10 分鐘后，再加入 PBS(IOmM，含 2M NaCl) 30 μ L，使溶液中 NaCl的終濃度達(dá)到O. 1Μ，置于4°C冰箱；48小時(shí)后，邊攪拌邊緩慢的加入PBS 70 μ L，使溶液中NaCl的終濃度達(dá)到O. 3Μ，置于4°C冰箱；24小時(shí)后，用滅菌水稀釋為lmL，在15000r/ min離心15min，除去上層溶液，用滅菌水分散離心下來的沉淀，定容為lmL，此過程重復(fù)三次以除去多余的DNA，用滅菌水定容為300 μ L，置于4°C冰箱備用。(3)激活的DNA去甲基化酶使金納米顆粒探針發(fā)生去甲基化作用和雙酶切同時(shí)降解核酸導(dǎo)致金納米顆粒團(tuán)聚20μ L反應(yīng)體系中，包含有2μ L IOX甘氨酸緩沖溶液(670mM Glycine-KOH, 67mM MgCl2, PH 9. 5)，6 μ L上述合成的金納米顆粒探針，2 μ L含有DNA去甲基化酶的樣品溶液， 10 μ L滅菌水，充分混勻后，放入37°C恒溫水浴中，反應(yīng)30分鐘，得到了去甲基的金納米顆粒探針產(chǎn)物；取出后加入甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Bshl236I I μ L和核酸外切酶I IyL 繼續(xù)在37°C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，放入80°C恒溫水浴中使酶失活。(4)利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測取20 μ L產(chǎn)物溶液用蒸懼水稀釋至60 μ L,移入微量石英比色皿,利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行定量分析，掃描范圍800nm-400nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果待測物DNA去甲基化酶濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是2pg/mL 200ng/mL,能達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí),檢測下限是I. 3pg/mL。
權(quán)利要求
1.一種基于納米顆粒團(tuán)聚的DNA去甲基化酶的生物傳感方法，包括如下步驟(1)制備修飾有甲基化DNA的納米顆粒探針；(2)DNA去甲基化酶使修飾有甲基化DNA的納米顆粒探針發(fā)生去甲基化作用；(3)對(duì)于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶同時(shí)消化降解DNA；(4)產(chǎn)物溶液的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，所述的甲基化DNA是包含有限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)并對(duì)該位點(diǎn)處的胞嘧啶進(jìn)行了甲基化修飾的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(4)所述的檢測方法是利用紫外可見光吸收分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)所述的納米顆粒探針是修飾有拉曼染料的納米顆粒探針；步驟(4)所述的檢測方法是利用SERS分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于納米顆粒團(tuán)聚的DNA去甲基化酶的生物傳感方法。制備了核酸功能化的納米顆粒探針，特定的核酸序列中包含了限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)并進(jìn)行了甲基化處理，激活的DNA去甲基化酶使甲基化的DNA發(fā)生去甲基化作用，從而對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶和核酸外切酶同時(shí)消化降解DNA，導(dǎo)致納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生耦合增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的SERS檢測。同時(shí)，該方法會(huì)產(chǎn)生光吸收性質(zhì)的變化，也可以通過比色法進(jìn)行檢測。操作步驟簡單、快速，靈敏度高、特異性強(qiáng)，有望成為研究全基因組范圍內(nèi)的DNA去甲基化問題以及表觀遺傳重編排過程的新方法之一，對(duì)于生物大分子的功能研究、活性分析和抑制劑考察也提供了技術(shù)手段。
文檔編號(hào)G01N21/33GK102586463SQ20121007384
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者俞汝勤, 唐麗娟, 楚霞, 王玉, 蔣健暉, 譚蔚泓 申請人:湖南大學(xué)