專利名稱：一種多形漢遜酵母表達(dá)重組霍亂毒素b亞單位基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)表達(dá)基因工程領(lǐng)域，具體地講是涉及利用一種重組霍亂毒素CTB亞單位基因和利用含有該基因的多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)作為細(xì)胞工廠高效表達(dá)CTB以及利用CTB及其融合蛋白在制備霍亂疫苗和佐劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
霍亂(Cholera)是世界七大流行病之一，我國(guó)定為甲類傳染病，它是由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的一種腸道傳染病，發(fā)病時(shí)導(dǎo)致人及哺乳動(dòng)物的急性腹瀉，若不及時(shí)治療很快就會(huì)死亡?；魜y毒素(Cholera toxin，CT)是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素。CT的毒性非常強(qiáng)，人對(duì)CT尤其敏感，8μg CT就可以導(dǎo)致強(qiáng)烈腹瀉。CT由兩種亞單位組成，即一個(gè)A亞單位(CTA，毒性部分)和5個(gè)B亞單位(CTB，結(jié)合部分，無毒性)以非共價(jià)形式組成的AB5多聚體活性蛋白。其中B亞單位(CTB)成熟蛋白由108個(gè)氨基酸組成。CTB能與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面都有的神經(jīng)節(jié)苷脂GMl結(jié)合，結(jié)合后能激活G蛋白，活化的G蛋白隨之激活腺苷酸環(huán)化酶，繼而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，致使氯離子濃度增加，鈉離子吸收受抑制，導(dǎo)致嚴(yán)重的水樣腹瀉綜合癥。
消化道、呼吸道、泌尿生殖道等具有巨大表面積的粘膜表面是與外源物質(zhì)包括有危害的微生物接觸的主要場(chǎng)所，為保護(hù)粘膜組織，此處的免疫系統(tǒng)十分復(fù)雜并相互聯(lián)系，構(gòu)成在解剖學(xué)和功能上實(shí)際與系統(tǒng)免疫相對(duì)獨(dú)立的體系。其中含有體內(nèi)70％以上淋巴細(xì)胞的腸道是這一免疫系統(tǒng)中最大的部分，而對(duì)腸道和其他粘膜表面提供特異免疫保護(hù)的主要免疫球蛋白是分泌型IgA(sIgA)。CTB具有很強(qiáng)的免疫原性和佐劑活性，是當(dāng)今研究最多的粘膜免疫佐劑之一。McKenzie and Halsey證實(shí)，CTB和HRP偶聯(lián)物產(chǎn)生的抗HRP抗體(IgA)和粘膜免疫應(yīng)答比單獨(dú)注射HRP或者CTB和HRP混合物(不是偶聯(lián)物)強(qiáng)數(shù)10倍。Guyon-Gruaz發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)口服CTB之30-50AA或者50-75AA也能產(chǎn)生較高滴度的IgA。1988年，Bessenand Fischetti等將A群鏈球菌M蛋白與CTB偶聯(lián)后，口服免疫小鼠，可以顯著降低小鼠對(duì)鏈球菌的感染。1989年，Tamura將CTB和流感病毒(A/PR/8/34(PR-8)，H1N1)疫苗同時(shí)鼻飼小鼠，16周后仍能完全保護(hù)小鼠免受強(qiáng)毒攻擊。Hirabayashi又發(fā)現(xiàn)對(duì)于CTB和流感病毒而言，鼻飼比口服和非胃腸道途徑(皮下注射等)更好。Rudin對(duì)瑞典15例男性志愿者的研究也表明，經(jīng)鼻途徑接種CTB比經(jīng)口途徑更優(yōu)。1992年，Vajdy andLycke對(duì)KLH的研究發(fā)現(xiàn)，利用CTB作為粘膜免疫佐劑可以激發(fā)長(zhǎng)期的免疫應(yīng)答(至少22個(gè)月)，從而更有效的抵抗病原微生物的侵襲。因此，CTB的作用不僅僅在于增加抗體水平，而且還能增加抗原向粘膜的遞呈力度，其作為免疫原還在于它可以結(jié)合腸上皮細(xì)胞上的Peyer’s集結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)并能激發(fā)持久免疫應(yīng)答。1998年，Wu and Russell利用鏈球菌表面抗原，研究了重組CTB(rCTB)的佐劑效果，他發(fā)現(xiàn)rCTB可以顯著增強(qiáng)粘膜IgA和全身的IgG抗體水平，如果加入痕量全毒素CT(5mg)，可以使抗體水平達(dá)到最大。雖然加入痕量的CT能提高佐劑效果，但從健康的角度考慮，重組CTB更安全、可靠。最近幾年，人們對(duì)CTB的研究一直位于粘膜免疫的前沿。例如Isaka，M利用重組CTB來提高破傷風(fēng)類毒素的免疫效果，在rCTB存在下，采用鼻飼接種的方法，可使成本大大降低，他用同樣的方法也提高了白喉毒素和重組肝炎B表面抗原的免疫效果；Shen和Olive和Dunn利用CTB也提高了鏈球菌肽疫苗在小鼠中的免疫效果。Mattos Areas分別根據(jù)大腸桿菌/乳酸菌/鼠傷寒沙門氏菌密碼子偏好合成了359bp的6XHis-tagged CTB，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)13mg/L。Sun將血吸蟲卵抗原與CTB偶聯(lián)物免疫小鼠，可以顯著降低血吸蟲感染小鼠的死亡率。近年來，研究人員對(duì)CTB的免疫效果的認(rèn)識(shí)也更加清楚，比如，George-Chandy分別通過用化學(xué)方法和基因融合方法與CTB偶聯(lián)的小肽來研究CTB對(duì)抗原遞呈細(xì)胞的促進(jìn)作用，結(jié)果表明CTB的存在可以使小肽對(duì)T細(xì)胞的激活能力提高10000倍，單獨(dú)的小肽或者小肽與CTB的簡(jiǎn)單混合物卻達(dá)不到這種效果，他進(jìn)而發(fā)現(xiàn)CTB可以增加抗原遞呈細(xì)胞表面CD40和CD86的上調(diào)作用，從而促進(jìn)IL-12和r-IFN的分泌。Maeyama的研究也證實(shí)了將rCTB和OVA偶聯(lián)物免疫小鼠后，能刺激IL-2，IL-4，IL-5，和IL-10的分泌。
關(guān)于CTB口服疫苗安全性和免疫效力問題，Pitisuttithum給泰國(guó)和美國(guó)志愿者服用CTB和滅活的霍亂弧菌疫苗，發(fā)現(xiàn)兩組自愿者的抗體產(chǎn)生水平?jīng)]有差異；Jertborn，M給瑞典志愿者同樣服用CTB和滅活的霍亂弧菌疫苗兩次(間隔10個(gè)月)，血清IgA和IgG抗體檢測(cè)表明自愿者能夠激發(fā)對(duì)霍亂的抗毒免疫。Lewis給英國(guó)自愿者單獨(dú)服用CTB，加強(qiáng)免疫后，細(xì)胞除了自發(fā)產(chǎn)生IgA和IgG外，還可產(chǎn)生IgM。后來他又給英國(guó)和肯尼亞HIV自愿者服用CTB，他發(fā)現(xiàn)CTB可以激發(fā)早期和中期HIV患者的粘膜免疫應(yīng)答，這對(duì)CTB在HIV粘膜免疫疫苗中的研究提供了思路。后來，Backstrom在大腸桿菌中融合表達(dá)了不同長(zhǎng)度的HIV之gp120片段和CTB，免疫小鼠后能產(chǎn)生針對(duì)gp120的高效價(jià)抗體。Lehner將SIV之p27gag表達(dá)產(chǎn)物與CTB偶聯(lián)，免疫恒河猴，結(jié)果表明恒河猴能抵抗SIV對(duì)粘膜的侵襲和病毒在淋巴結(jié)的釋放。Lian研究了CTB對(duì)HIV囊膜蛋白的粘膜免疫作用，他發(fā)現(xiàn)CTB能將HIV囊膜蛋白遞呈到GM1上，并顯著增加IgA、IgG1和IgG2a的抗體水平。最近幾年，Hall和Savarino給不同年齡的埃及人(成人、小學(xué)生和嬰兒)接種滅活的產(chǎn)毒型大腸桿菌腸毒素和rCTB(ETEC-rCTB)來評(píng)估ETEC-rCTB的安全性，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，血清學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明該疫苗安全、可靠并可以作為腹瀉流行地區(qū)的疫苗使用。
目前CTB作為抗霍亂疫苗已被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)使用，并進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，同時(shí)它也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的、能刺激機(jī)體粘膜反應(yīng)的、應(yīng)用最多的胃腸道免疫原。目前獲得CTB的方法有兩種一種方法是從天然霍亂弧菌中分離得到，但這種方法有污染CTA的風(fēng)險(xiǎn)，無法產(chǎn)業(yè)化。另一種方法是利用基因工程菌生產(chǎn)重組CTB(rCTB)；目前報(bào)道的生產(chǎn)rCTB的基因工程菌僅有大腸桿菌，但表達(dá)量較低，而且成本較高。當(dāng)今國(guó)際社會(huì)上rCTB的價(jià)格是40$/mg。因此如何更能廉價(jià)的得到rCTB引起了研究人員的普遍關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)屬于甲醇酵母，又稱作Pichiaaugusta。它的最適生長(zhǎng)溫度高，生長(zhǎng)速率快，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，可以高效表達(dá)許多在其它系統(tǒng)中難以高效表達(dá)的基因。由于多形漢遜酵母能夠按一定的基因劑量比分步整合多個(gè)基因，重組菌可按最佳的比例表達(dá)所需的基因，這在其它甲醇酵母中未見報(bào)道。此外，多形漢遜酵母具有遺傳操作簡(jiǎn)單、外源基因拷貝數(shù)高、外源蛋白產(chǎn)量高、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)優(yōu)于大腸桿菌和其它酵母(如巴斯德畢赤酵母和啤酒酵母等)的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，已得到廣泛關(guān)注。尤其是在分泌型表達(dá)中，外源蛋白通過分泌途徑可完成蛋白水解成熟、糖基化修飾和二硫鍵形成等翻譯后加工過程，使所表達(dá)的蛋白更接近具有生物學(xué)活性的天然蛋白形式，又避免了啤酒酵母中的過糖基化現(xiàn)象。但是，霍亂弧菌與酵母在進(jìn)化關(guān)系上親緣較遠(yuǎn)，且屬于原核生物，在蛋白翻譯過程中其密碼子用法與漢遜酵母差別很大，從而導(dǎo)致翻譯異常停頓。至今尚未見到利用漢遜酵母系統(tǒng)表達(dá)CTB的報(bào)道。我們利用多形漢遜酵母AS 2.2412(中國(guó)微生物菌種包藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC)表達(dá)CTB時(shí)，為了提高表達(dá)量，按照多形漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法重新設(shè)計(jì)了CTB的編碼基因。然后構(gòu)建胞內(nèi)和分泌型表達(dá)載體，并在多形漢遜酵母中分別以胞內(nèi)表達(dá)和分泌型表達(dá)方式進(jìn)行了高效表達(dá)。
為此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組霍亂毒素B亞單位(CTB)基因和利用含有該基因的多形漢遜酵母作為細(xì)胞工廠高效表達(dá)CTB以及利用CTB及其融合蛋白在制備霍亂疫苗和佐劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的多形漢遜酵母重組霍亂毒素B亞單位編碼基因的核甘酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼CTB的氨基酸序列如(SEQ ID NO2)所示。為達(dá)此目的，本發(fā)明的技術(shù)路線是通過登錄Genbank網(wǎng)站http//www.ncbi.nlm.nih.gov檢索得到Hansenula porlymorpha DNA序列。然后登錄http//bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/codonw.html網(wǎng)站，采用多變異統(tǒng)計(jì)分析方法，利用Codon W在線程序進(jìn)行Correspondenceanalysis(CA)；得到漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法表。將漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法表嵌入DNAStar軟件的EditSeq程序。根據(jù)Genbank上報(bào)道的天然霍亂毒素B亞單位(登錄號(hào)M23050)的編碼基因的核甘酸序列如圖1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，按照漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法將CTB氨基酸序列轉(zhuǎn)變成核苷酸序列，即得到按照漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法設(shè)計(jì)的CTB編碼基因(SEQ IDNO1)。該基因(SEQ ID NO1)與天然霍亂毒素B亞單位的編碼基因編碼的氨基酸同源性為100％，其編碼的氨基酸序列如(SEQ ID NO2)所示，核苷酸序列同源性為73.8％，考慮到漢遜酵母高表達(dá)基因?qū)€(gè)別同義密碼子偏好的擺動(dòng)，因此，編碼重組霍亂毒素B亞單位(CTB)氨基酸序列的核苷酸序列(除圖1序列)與它至少具有75％的同源性。由本發(fā)明得到的按照漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法設(shè)計(jì)的CTB編碼基因，它克服了天然CTB編碼基因在漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)中的不適應(yīng)性，從而使該基因可在漢遜酵母中高效表達(dá)霍亂毒素B亞單位。在漢遜酵母中表達(dá)的CTB安全可靠，經(jīng)純化后可直接在臨床上用于預(yù)防霍亂弧菌引起的腹瀉，或者作為粘膜免疫佐劑增加通過粘膜途徑接種的多種疫苗的免疫效果。一種利用漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法制備CTB及其融合蛋白的方法包括以下步驟1.多形漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法的建立；2.按照多形漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法設(shè)計(jì)CTB編碼基因；3.通過基因合成，人工合成新設(shè)計(jì)的CTB編碼基因；4.可利用BspHI限制性酶切位點(diǎn)在CTB 5’端(或者在CTB 3’端利用NcoI位點(diǎn))插入HIV、HBV、HCV和FMDV等外源基因，表達(dá)帶有特異性抗原決定簇的CTB融合蛋白；5.構(gòu)建漢遜酵母表達(dá)載體pHMOXZ-A(胞內(nèi)表達(dá))、pHFMDHZ-A(胞內(nèi)表達(dá))、pHMOXZα-A(分泌型表達(dá))、pHFMDHZα-A(分泌型表達(dá))；6.構(gòu)建重組表達(dá)載體pHMOXZ-CTB(胞內(nèi)表達(dá))、pHFMDHZ-CTB(胞內(nèi)表達(dá))、pHMOXZα-CTB(分泌型表達(dá))和pHFMDHZα-CTB(分泌型表達(dá))；轉(zhuǎn)化和重組子的篩選；7.重組CTB的誘導(dǎo)表達(dá)；
8.表達(dá)產(chǎn)物鑒定和生物學(xué)活性鑒定。
與其它甲醇酵母(如巴斯德畢赤酵母)不同，本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)載體不用線化，直接采用電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母，本發(fā)明中的電穿孔轉(zhuǎn)化法是發(fā)明人對(duì)(Faber，Haima et al.，1994)的改進(jìn)，按照上述方法步驟獲得漢遜酵母(Hansenula polymorpha)高效表達(dá)霍亂毒素B亞單位重組子，制備CTB及其融合蛋白是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。
迄今為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)CTB在漢遜酵母中的表達(dá)還未見報(bào)道。本發(fā)明設(shè)計(jì)的CTB在漢遜酵母中的表達(dá)無論表達(dá)生物量以及提取制備步驟都優(yōu)于其它表達(dá)體系，使重組CTB的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)。


圖1天然霍亂毒素B亞單位(登錄號(hào)M23050)的編碼基因的核甘酸序列圖2漢遜酵母高表達(dá)基因和低表達(dá)基因同義密碼子用法比較。高表示高表達(dá)基因；低表示低表達(dá)基因。N為Codon W程序?qū)Ω?、低表達(dá)基因進(jìn)行分類時(shí)，每個(gè)氨基酸的密碼子數(shù)目。RSCU(Relative synonymouscodon usage，相對(duì)同義密碼子用法)，RSCU反映的是一個(gè)基因中各個(gè)同義密碼子的使用情況，其數(shù)值等于某個(gè)密碼子在基因中的實(shí)際觀測(cè)值與各密碼子以相同的頻率出現(xiàn)時(shí)的期望值之間的比值；引入RSCU值可以使不同氨基酸組成的數(shù)據(jù)庫(kù)之間進(jìn)行密碼子用法比較。*@表示高表達(dá)基因?qū)?yīng)的優(yōu)越密碼子，其中*為經(jīng)卡方檢驗(yàn)后差異極顯著；@為經(jīng)卡方檢驗(yàn)后差異顯著。 為本發(fā)明中設(shè)計(jì)CTB基因時(shí)選用的密碼子圖3重組表達(dá)載體的構(gòu)建路線具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例
1.漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法的建立登錄Genbank網(wǎng)站http//www.ncbi.nlm.nih.gov檢索得到Hansenulaporlymorpha DNA序列，排除工作草圖及其它非必需序列。下載到本地硬盤后用DNAStar軟件去除每個(gè)序列的5’和3’非翻譯區(qū)得到編碼序列(CDS)，然后將所有基因的ORF(開放閱讀框架)利用DNAStar軟件MegAlign程序繪制進(jìn)化樹，文件保存為hansenula.pau。然后登錄http//bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/codonw.html網(wǎng)站，進(jìn)入Codonw程序入口，調(diào)入hansenula.pau文件，利用Codon W程序進(jìn)行correspondence analysis(CA)。程序自動(dòng)對(duì)漢遜酵母高表達(dá)基因和低表達(dá)基因進(jìn)行分類，其中高表達(dá)基因和低表達(dá)基因的樣本數(shù)目各占總體數(shù)據(jù)的5％，得到漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法表(見圖2)。將漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法表嵌入DNAStar軟件的EditSeq程序。
2.按照多形漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法設(shè)計(jì)CTB基因根據(jù)Genbank上報(bào)道的天然霍亂毒素B亞單位(登錄號(hào)M23050)的編碼基因(圖1)對(duì)應(yīng)的氨基酸(SEQ ID NO2)，通過DNAStar程序按照漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法將CTB氨基酸序列轉(zhuǎn)變成核苷酸序列，即得到按照漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法設(shè)計(jì)的CTB編碼基因(SEQ ID NO1)。
3.重組表達(dá)載體的構(gòu)建為連接方便，合成CTB的5’端加了EcoRI、BspHI酶切位點(diǎn)，3’端加了XbaI酶切位點(diǎn)。酶切后，分別與pHMOXZ-A(胞內(nèi)表達(dá))、pHFMDHZ-A(胞內(nèi)表達(dá))、pHMOXZα-A(分泌型表達(dá))、pHFMDHZα-A(分泌型表達(dá))四個(gè)表達(dá)載體進(jìn)行連接。得到pHMOXZ-CTB(胞內(nèi)表達(dá))、pHFMDHZ-CTB(胞內(nèi)表達(dá))、pHMOXZα-CTB(分泌型表達(dá))和pHFMDHZα-CTB(分泌型表達(dá))重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體的構(gòu)建路線見圖3。上述任何一種重組表達(dá)載體都可在多形漢遜酵母中高效表達(dá)。
4.重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和篩選與其它甲醇酵母(如巴斯德畢赤酵母)不同，發(fā)明人構(gòu)建的重組表達(dá)載體不用線化，直接采用電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母。轉(zhuǎn)化子在涂有Zeocin抗生素的YPD(1％酵母提取物、1％蛋白胨、2％葡萄糖)平板上生長(zhǎng)，兩天后即可在平板上出現(xiàn)大、中、小三種不同類型的菌落。大的菌落一般都是拷貝數(shù)高的克隆。提取大菌落酵母的DNA利用PCR方法檢測(cè)CTB是否插入。挑取經(jīng)PCR鑒定正確的克隆進(jìn)行發(fā)酵。
5.電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母AS 2.2412(Leu缺陷型)的方法本發(fā)明中的電穿孔轉(zhuǎn)化法是發(fā)明人對(duì)(Faber，Haima et al.，1994)的改進(jìn)，即避免了電擊過程中的短路現(xiàn)象又提高了轉(zhuǎn)化效率(轉(zhuǎn)化率高達(dá)106)。步驟如下1)挑多形漢遜酵母NCYC495單克隆于5mlYPD液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)2)取2ml菌液加入200ml預(yù)溫的YPD中，37℃培養(yǎng)至OD600＝1.2-1.5之間(約6h)3)室溫6000rpm離心5min，棄上清4)用500mlTED(100mM Tris-HCl；50mM EDTA；25mM DTT；pH＝8.0)懸浮細(xì)胞5)37℃搖床，200rpm搖15min6)4℃離心6000rpm×5min，棄上清7)用200ml預(yù)冷的270mM的蔗糖輕輕懸浮細(xì)胞8)4℃離心6000rpm×5min，棄上清9)用100ml預(yù)冷的270mM的蔗糖輕輕懸浮細(xì)胞10)4℃離心6000rpm×5min，棄上清11)用1ml預(yù)冷的270mM的蔗糖輕輕懸浮細(xì)胞，分裝成60ul/管，液氮或者-80℃以下冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 12)在60ul的感受態(tài)細(xì)胞中加5ul質(zhì)粒DNA(約100-500ng)，輕輕混勻后加入2mm孔徑的電擊杯中13)電擊參數(shù)50uF，100Ω，1.5KV14)電擊后立即加940ul的YPDTM(1％酵母提取物；1％蛋白胨；2％葡萄糖；1mM Tris-HCl；1mM MgCl2)，吸至2-5ml的小管中，37℃搖床，200rpm搖1h15)取100ul涂含有Zeocin抗生素(終濃度100ug/ml)的YPD平板，37℃培養(yǎng)2天后，平板上出現(xiàn)大、中、小三種形態(tài)的菌落，挑克隆PCR鑒定重組子，用Southern雜交鑒定拷貝數(shù)6.發(fā)酵(制備重組CTB亞單位)將含有多拷貝基因的陽性重組子酵母克隆在YPD培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，按照1∶20的比例接種新鮮的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中(含1.5％甘油)，維持發(fā)酵溫度30-37℃，pH3-5，溶氧量20％，空氣流速5-10L/min。24小時(shí)后當(dāng)O2壓力急劇升高時(shí)(提示培養(yǎng)基中的甘油已經(jīng)消耗完畢)，開始加料(含50％甘油的YPD)，嚴(yán)格控制加料速度，使發(fā)酵液中甘油的終濃度維持在0.05％-0.4％之間。發(fā)酵24-48小時(shí)后，即可收獲。對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)的發(fā)酵液，4℃ 12000rpm×2min離心收獲菌體；對(duì)于分泌型表達(dá)的發(fā)酵液，4℃離心收獲上清。進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting分析。此外，除用甘油誘導(dǎo)發(fā)酵外，多形漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)也可以用1％的甲醇和1％葡萄糖誘導(dǎo)發(fā)酵。
7.表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性鑒定用ELISA方法，鑒定酵母表達(dá)的CTB與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的結(jié)合能力。步驟是用GM1包被酶標(biāo)板；1％干酪素封閉；加表達(dá)的CTB；加HRP標(biāo)記的CT抗體。OPD或TMB顯色。酶標(biāo)儀判讀。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>多形漢遜酵母表達(dá)重組霍亂毒素B亞單位基因及其應(yīng)用<130>03-邱<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>324<212>DNA<213>synthetic construct<400>1tacgctcacg gtaccccaca aaacatcacc gacttgtgtg ctgagtacca caacacccaa 60atccacacct tgaacgacaa gatcttctcc tacaccgagt ccttggctgg taagagagag 120atggctatca tcaccttcaa gaacggtgct accttccaag tcgaggtccc aggttcccaa 180cacatcgact cccaaaagaa ggctatcgag agaatgaagg acaccttgag aatcgcttac 240ttgaccgagg ctaaggtcga gaagttgtgt gtctggaaca acaagacccc acacgctatc 300gctgctatct ccatggctaa ctga324<210>2<211>107<212>PRT<213>Vibrio cholerae<400>1TyrAlaHisGlyThrProGlnAsnIleThrAspLeuCysAlaGluTyr 16HisAsnThrGlnIleHisThrLeuAsnAspLysIlePheSerTyrThr 32GluSerLeuAlaGlyLysArgGluMetAlaIleIleThrPheLysAsn 48GlyAlaThrPheGlnValGluValProGlySerGlnHisIleAspSer 64GlnLysLysAlaIleGluArgMetLysAspThrLeuArgIleAlaTyr 80LeuThrGluAlaLysValGluLysLeuCysValTrpAsnAsnLysThr 96ProHisAlaIleAlaAlaIleSerMetAlaAsn10權(quán)利要求
1.一種來源于多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)表達(dá)的重組霍亂毒素B亞單位(CTB)，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的重組霍亂毒素B亞單位(CTB)氨基酸序列的基因，除天然霍亂毒素B亞單位基因所示的核苷酸序列外，其核苷酸序列與它至少具有75％的同源性。
3.按照權(quán)利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.一種按照權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)表達(dá)的重組霍亂毒素B亞單位(CTB)，其制備方法包括以下步驟a) 多形漢遜酵母高表達(dá)基因密碼子用法的建立；b) 按照多形漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法設(shè)計(jì)CTB編碼基因；c) 通過基因合成儀，人工合成新設(shè)計(jì)的CTB編碼基因；d) 構(gòu)建漢遜酵母表達(dá)載體pHMOXZ-A(胞內(nèi)表達(dá))、pHFMDHZ-A(胞內(nèi)表達(dá))、pHMOXZα-A(分泌型表達(dá))、pHFMDHZα-A(分泌型表達(dá))；e) 構(gòu)建重組表達(dá)載體pHMOXZ-CTB(胞內(nèi)表達(dá))、pHFMDHZ-CTB(胞內(nèi)表達(dá))、pHMOXZα-CTB(分泌型表達(dá))和pHFMDHZα-CTB(分泌型表達(dá))；轉(zhuǎn)化和重組子的篩選；f) 多形漢遜酵母重組CTB的誘導(dǎo)表達(dá)；g) 表達(dá)產(chǎn)物鑒定和生物學(xué)活性鑒定。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中多形漢遜酵母重組子CTB的誘導(dǎo)表達(dá)是將含有多拷貝基因的陽性重組子酵母克隆在YPD培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，按照1∶20的比例接種新鮮的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中(含1.5％甘油)，維持發(fā)酵溫度30-37℃，pH3-5，溶氧量20％，空氣流速5-10L/min。24小時(shí)后當(dāng)O2壓力急劇升高時(shí)(提示培養(yǎng)基中的甘油已經(jīng)消耗完畢)，開始加料(含50％甘油的YPD)，嚴(yán)格控制加料速度，使發(fā)酵液中甘油的終濃度維持在0.05％-0.4％之間。發(fā)酵24-48小時(shí)后，對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)，4℃ 12000rpm×2min離心發(fā)酵液收獲菌體；對(duì)于分泌型表達(dá)的發(fā)酵液經(jīng)4℃離心收獲上清。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)表達(dá)的重組霍亂毒素B亞單位(CTB)在制備霍亂治療性疫苗和其它抗原佐劑中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的編碼CTB氨基酸序列的基因，在其5’或3’端連上其它抗原基因，成為融合基因，并在多形漢遜酵母中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物(即融合蛋白)在制備口服疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)表達(dá)基因工程領(lǐng)域，具體地說是利用漢遜酵母作為細(xì)胞工廠表達(dá)外源基因的產(chǎn)業(yè)化研究領(lǐng)域。由于霍亂弧菌與漢遜酵母在進(jìn)化關(guān)系上親緣較遠(yuǎn)，且屬于原核生物，霍亂毒素B亞單位基因(CTB)在蛋白翻譯過程中其密碼子用法與漢遜酵母差別很大，從而導(dǎo)致翻譯異常停頓。為了提高CTB在漢遜酵母中的表達(dá)量，本發(fā)明通過多變異統(tǒng)計(jì)分析方法，按照漢遜酵母高表達(dá)基因的密碼子用法重新設(shè)計(jì)CTB的編碼基因。表達(dá)產(chǎn)物可用于預(yù)防霍亂弧菌引起的腹瀉和作為粘膜免疫佐劑增加通過粘膜途徑接種的多種疫苗的免疫效果。本發(fā)明設(shè)計(jì)的CTB基因也可與其它抗原基因在漢遜酵母中融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可作為口服疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1513995SQ0311044
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月15日
發(fā)明者邱并生, 宋厚輝, 李勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所