專(zhuān)利名稱(chēng)：霍亂毒素b亞單位和蚓激酶融合基因及包括該基因的重組載體及宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域基因重組技術(shù)，具體涉及一種融合基因以及基因工程菌的構(gòu)建 方法。
背景技術(shù)：
蚓激酶(Lumbrokinase， LK)，又稱(chēng)作蚯蟲(chóng)引纖溶酶(Earthworm plasminogen activator, EPA)， 是從蚯弼l體內(nèi)提取的一種具有纖溶活性的蛋白水解酶。它廣泛分布于蚯蚓的消化道內(nèi)腔中， 能直接降解血中纖維蛋白原并激活纖溶酶原為纖溶酶。大量研究表明蚓激酶無(wú)論靜脈或口服 給藥，均具有溶栓作用。頓激酶既可直接溶栓，又能激活溶栓；并能降低血小板聚集率(抑制 內(nèi)源凝血功能亢進(jìn))，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生t-PA[Iannucci NB， Camperi SA， Cascone O， Purification of lumbrokinase from Eisenia fetida using aqueous two-phase systems and anion-exchange chromatography, Separation and Purification Technology, 2008, 64(1): 13卜134]，并抑制PAI生成(增強(qiáng)內(nèi)源纖溶活性)， 抑制內(nèi)皮素(ET)的縮血管作用(舒張平滑肌，緩解血管痙攣)，降低血液粘度(促進(jìn)微循環(huán))。作 為溶栓藥物，頓激酶先后在韓國(guó)和中國(guó)上市，在腦血管血栓性疾病治療中顯示出明顯的療效。 霍亂毒素(CT)是由霍亂弧菌產(chǎn)生的分子量為84kD的腸毒素，由1個(gè)A亞早位(CTA)和5 個(gè)B亞單位(CTB)形成的五聚體共價(jià)連接而成。CTA為毒性亞單位，CTB為無(wú)毒的受體結(jié)合 亞單位，可以和所有,有核細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)受體結(jié)合。A亞單位通過(guò)B亞單位的 作用進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮其毒性作用[Sprander BD Structure and function of cholera toxin and related Escherichia coil heat lable enterotoxin [J] Microl， Rew. 1992， 56: 622-643]。 CTB具有較強(qiáng)的免 疫佐劑活性，特別是當(dāng)其經(jīng)化學(xué)方法或基因融合技術(shù)使其與不相關(guān)抗原形成偶聯(lián)蛋白或融合 蛋白時(shí)，其免疫佐劑活性強(qiáng)于其與不相關(guān)抗原混合免疫時(shí)的佐劑活性。由于CTB可以和所有 有核細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)受體結(jié)合，基于此特性，研究發(fā)現(xiàn)CTB不僅可以用于免 疫佐劑，還能夠作為有效的藥物呈遞載體。藥物在腸道中的通透性成為藥物蛋白穿過(guò)腸上皮 細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的主要障礙。然而受體接導(dǎo)的口服呈遞系統(tǒng)為藥物蛋白的吸收提供了 可行的途徑。為了驗(yàn)證CTB是否能夠成為有效的蛋白藥物呈遞載體，Arati等人將CTB與 GFP蛋白基因，并在煙草葉綠體中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。用這種煙草喂食小鼠，并對(duì)服用這種煙草的 小鼠作了詳盡的生理生化分析[Arati Limaye, Vijay Koya，l Mohtashem Samsam, and Henry Daniell. Receptor-mediated oral delivery of a bioencapsulated green fluorescent protein expressed in transgenic chloroplasts into the mouse circulatory system. 7Tze FJ5^ Jbwm" /2006， 20:37-46.]。 在這項(xiàng)研究中，他們發(fā)現(xiàn)，CTB-GFP融合蛋白能被腸道上皮細(xì)胞和腸相關(guān)淋巴組織吸收。五 聚體融合蛋白能夠結(jié)合到細(xì)胞膜表面的GM1受體上，并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入吞噬小體。隨后這種融合蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在此處，胞內(nèi)廣泛存在的Furin酶將融合蛋白切開(kāi)，CTB和GFP蛋 白分開(kāi)，CTB被帶到細(xì)胞的基底一側(cè)，仍然與GM1受體結(jié)合著。而GFP分子則通過(guò)高爾基 體被排除細(xì)胞外，從而進(jìn)入淋巴循環(huán)，進(jìn)一步進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種CTB和LK融合基因。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種構(gòu)建含CTB與LK融合基因的畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9k-Cr5-Fw〃力-丄^。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有CTB和LK融合基因工程菌。 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種CTB和LK融合基因編碼的蛋白。 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供CTB和LK融合基因編碼的蛋白在制備口服溶栓藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
一種霍亂毒素B亞單位和蚓激酶融合基因，由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序 歹U，所述霍亂毒素B亞單位簡(jiǎn)寫(xiě)為CTB，所述蚓激酶簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)K。
一種含CTB與LK融合基因的重組載體pPIC9k-Cr5-F^/"-i^:,由下述步驟構(gòu)建而成
(1) 構(gòu)建含有CTB與LK融合基因的中間載體pBluescript SK-C7^-i^r/"-^::
① 將SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽連接序列基因用全合成方 法連接，置于載體pBluescript SK-C7^;
② 將SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方法合成置于載體pUCm-T-iX;
③ 設(shè)計(jì)由SEQ ID N0.5所示的上游引物Pl，和由SEQ ID N0.6所示的下游引物P2，以 pUCm-T-i:A:質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Furin-LK融合基因，所述Furin基因序列如 SEQ ID N0.4所示；
將Furin-LK融合基因經(jīng)五coRI和///"dill雙酶切，將載體pBluescript SK-C715經(jīng)￡coRI和 歷"dIII雙酶切，二者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到含SEQ ID NO.l所示的CTB基因、SEQ ID N0.3 所示的柔性肽連接序列基因、SEQ ID N0.4所示的Fw/w基因和SEQ ID N0.2所示的LK基因 的中間載體pBluescript SK-Cr5-Fw〃"-ZA:;
(2) 構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9k-C7^-尸wW"-丄/::
設(shè)計(jì)由SEQ IDN0.7所示的上游引物P3，和由SEQ ID N0.8所示的下游引物P4，以pBluescript SK-Cra-Fwn77-iX為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)M^I酶切，將畢赤酵母表達(dá) 載體pPIC9k經(jīng)酶切，二者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到含CTB與LK融合基因的重組載體 pPIC9k-C7^-F,'w-仏
一種含CTB和LK融合基因工程菌，將pPIC9k-C7^-Fw/"-Lfi:線(xiàn)性化后整合于畢赤酵母 GS115的基因組上。
一種由CTB和LK融合基因編碼的蛋白，是序列表中SEQ IDN0.9所示氨基酸序列。一種CTB和LK融合基因編碼的蛋白在制備口服溶栓藥物中的應(yīng)用。 .
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由CTB和LK融合而成的融合基因，通過(guò)畢赤酵母GS115能高效表達(dá) CTB與LK融合蛋白，其表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)率較高，畢赤酵母表達(dá)穩(wěn)定，應(yīng)用十分廣泛，經(jīng)純化 的融合蛋白經(jīng)檢驗(yàn)具有生物學(xué)活性，可以制備成為融合蛋白藥物，融合蛋白藥物對(duì)治療血栓 有明顯功效，同時(shí)CTB作為佐劑可明顯提高LK的口服吸收利用率，大大提高了LK的藥效 作用。


圖1 pPIC9k-C7^-Fwn力-丄咒酶切及PCR驗(yàn)證結(jié)果。 圖2畢赤酵母菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。 圖3發(fā)酵粗提液SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳結(jié)果。 圖4小鼠尾部血栓長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
中間載體pBluescript SK-Cr5-Fwn'"-丄AT的構(gòu)建
首先，將SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽連接序列基因用 全合成方法連接，置于載體pBluescript SK-Cr5;將SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方 法合成置于載體pUCm-T-丄《。其次，以pUCm-T-iX為模版，PI和P2分別為上下游引物擴(kuò) 增LK片段，其反應(yīng)條件為94°C， 30s， 55°C， 30s, 72°C， 90s，循環(huán)30次。在PI中引入 五coRI酶切位點(diǎn)(GAATTC)，在P2中引入歷wdlll酶切位點(diǎn)(AAGCTT)。然后，PCR產(chǎn)物 與pBluescript SK-Cra質(zhì)粒分別經(jīng)&oRI和歷wdUI雙酶切，將二者酶切產(chǎn)物連接16°C，過(guò) 夜連接(2 pi 10xT4 buffer, 0.5 pi T4 DNA連接酶，5 pi載體DNA， 7.5 pi外源DNA， 5 pi ddH20)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡-Co//. Z)^5ct，涂布于含氨芐的LB平板。以目的基因?yàn)橐镞M(jìn)行PCR 得到850bp產(chǎn)物，酶切鑒定得到目的條帶，最后測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明載體構(gòu)建正確。 實(shí)施例2
表達(dá)載體pPIC9k-CZS-iX構(gòu)建過(guò)程 首先，以pBluescript SK-CTff-fV/w-iX為模版，P3和P4分別為上下游引物擴(kuò)增 Cr5-尸w/"-L^片段，其反應(yīng)條件為94。C， 30s， 54°C， 30s， 72'C， 120s，循環(huán)30次。在P3 中引入A^I酶切位點(diǎn)(GCGGCCGC)，在P4中引入M^I酶切位點(diǎn)(GCGGCCGC)。然后， PCR產(chǎn)物與pPIC9k質(zhì)粒分別經(jīng)AWI單酶切，將二者酶切產(chǎn)物連接16。C，過(guò)夜連接(2 pi 10xT4 buffer, 0.5 lalT4DNA連接酶，5 ^載體DNA， 7.5 pi外源DNA， 5plddH20)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化￡-CW/. D/Z5a，涂布于含氨芐的LB平板。以目的基因?yàn)橐镞M(jìn)行PCR得到1200bp左右產(chǎn) 物，酶切鑒定得到目的條帶，暈后測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明載體構(gòu)建IH確。見(jiàn)圖1，圖1中，M為 Marker DNADL 10 000,右側(cè)電泳圖為Marker各條帶代表片段大小示意圖；1為載體使用iVo/1進(jìn)行單酶切，產(chǎn)生l 200bp左右和9 OOObp左右片斷，說(shuō)明有CTB-LK大小片斷連接到pPIC9k 載體上；2為使用五coRI對(duì)載體進(jìn)行單酶切，產(chǎn)生500bp左右和9 000bp左右片斷，說(shuō)明目標(biāo) 片斷已經(jīng)被正向連接到pPIC9k載體上；3為PCR擴(kuò)增CTB-LK產(chǎn)物，獲得了很清晰的1 200 bp左右的目的條帶，進(jìn)一步說(shuō)明目的基因CTB-LK已經(jīng)連接于pPIC9k載體上。 實(shí)施例3
重組酵母菌的轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定
將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pPIC9k-Cra-Fw/"-^:用feci線(xiàn)性化后，用電擊法轉(zhuǎn)入GS115中， 涂布于MD平板上，30。C培養(yǎng)2-3天后，用含不同濃度(0， 0.50， 1.00， 1.50， 2.00， 2.5禾口 3.00mg/mL) G418YPD平板篩選高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子基因組，以目的基因?yàn)橐?PCR后經(jīng)核酸電泳鑒定，得到預(yù)期1200bp條帶，表明目的基因已整合到酵母染色體上。如圖 2，挑取的10個(gè)扭5+(由MD平板篩選)和3.00mg/mLG418抗性克隆進(jìn)行菌落PCR， 1、 3、 4、 5、 7、 9和10泳道為陽(yáng)性克隆，而2、 6和8泳道沒(méi)有明顯條帶。M為Marker III，右側(cè) 電泳圖為Marker各條帶代表片段大小示意圖。 實(shí)施例4
重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
將篩選得到的重組酵母菌轉(zhuǎn)化子接種到BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D值6左右，離心 (4000r/min， 5min)，將菌體轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中進(jìn)行表達(dá)，每隔24h取樣并補(bǔ)加甲 醇至1%，培養(yǎng)5天后，離心(4000r/min， 5min)，收集培養(yǎng)上清，取不同量的培養(yǎng)液上清進(jìn) 行SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，目的基因獲得高效表達(dá)，得到目的蛋白條帶，序列如序列表SEQ ID N0.9所示氨基酸序列。見(jiàn)圖3，圖3為發(fā)酵粗提液SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳結(jié)果，泳道M 為蛋白Marker,右側(cè)電泳圖為Marker各條帶代表片段大小示意圖；泳道1為表達(dá)LK的上清 液中提取物SDS-PAGE電泳圖；泳道2為表達(dá)CTB和LK融合基因編碼的蛋白上清液中提取 物SDS-PAGE電泳圖；泳道3為空白對(duì)照。從圖3中可以看出LK分子量約為30kD， CTB 和LK融合基因編碼的蛋白約為45kD，分子量與預(yù)期相符。 實(shí)施例5
發(fā)酵上清液中蛋白的提取
1. 畢赤酵母上清液的濃縮
(1) 大量的發(fā)酵上清液首先進(jìn)行抽濾泵的抽濾，抽濾漏斗上放置三層定性濾紙，除去大量 的酵母細(xì)胞和發(fā)酵液中的雜質(zhì)；
(2) 抽濾得到的發(fā)酵上清液再過(guò)0.22pm的濾膜，進(jìn)一步除去發(fā)酵液中的雜質(zhì)；
(3) 澄清的發(fā)酵上清液進(jìn)行硫酸銨濃縮，沉淀蛋白，在發(fā)酵上清液中緩緩加入無(wú)水硫酸銨， 并用磁力攪拌器均勻攪拌，避免速度過(guò)快導(dǎo)致蛋白變性，直到硫酸銨達(dá)到55%的濃度，此時(shí) 絕大部分蛋白均以沉淀形式析出；
(4) 12 000 r/min， 4。C離心20min，去掉上清，沉淀用適量的PBS緩沖液溶解(pH7.2)，儲(chǔ) 存在4'C備用。
2. 透析袋透析(1) 對(duì)透析袋進(jìn)行浸泡、煮沸等預(yù)處理，由于市場(chǎng)所出售透析袋含有化學(xué)雜質(zhì)，為了除去 這些雜質(zhì)，通常用1Ommol/L的NaHC03和lmmol/L的EDTA溶液煮沸透析袋30min，煮沸 后，用雙蒸水充分洗滌透析袋，洗畢，于4。C儲(chǔ)存于lmmol/EDTA溶液中，以防微生物污染。
(2) 將透析袋的一端打兩個(gè)死結(jié)，用移液管或漏斗將硫酸銨沉淀的蛋白溶液移于透析袋 中。在透析袋的另一端打兩個(gè)死結(jié)，并將其放入20mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)中透析過(guò)夜， 并在期間更換緩沖液，使硫酸銨充分透析掉，這個(gè)過(guò)程蛋白溶液不要超過(guò)袋體積的1/3，否則 透析過(guò)程中透析袋容易漲破。
3.冷凍干燥
(1) 將透析過(guò)的蛋白溶液置于三角瓶中，-20^迅速冷凍，錫箔紙封口，同時(shí)將錫箔紙上用 針穿一些小洞；
(2) 將已經(jīng)冷凍的蛋白溶液置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥48h;
(3) 將冷凍干燥的蛋白粉末用lmL20mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)溶解，儲(chǔ)存在4。C備用。 實(shí)施例6
小鼠的飼養(yǎng)及血栓模型的建立驗(yàn)證CTB和LK融合基因編碼的蛋白活性 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)向小鼠背部皮下注射卡拉膠可誘發(fā)小鼠尾部形成血栓模型，此模型 可以從體表測(cè)量尾部變換的范圍和程度來(lái)反映血栓形成發(fā)展的全過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用昆明雄性
小鼠，SPF級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK-(軍)2002001，體重20g左右，誘發(fā)血栓形成藥物 卡拉膠用生理鹽水配置成0.5%溶液，小鼠腰背部皮下注射。見(jiàn)圖4，圖4為小鼠尾部血栓長(zhǎng) 度測(cè)量結(jié)果，1:灌喂水對(duì)照組；2:灌喂空載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母提取物對(duì)照組；3:灌喂LK 蛋白提取物組；4:灌喂CTB和LK融合基因編碼的蛋白提取物組。灌喂水對(duì)照組和灌喂空 載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母提取物對(duì)照組結(jié)果比較相似，小鼠尾部血栓長(zhǎng)度約為占整尾長(zhǎng)度35%左 右，而灌喂LK蛋白提取物組小鼠尾部血栓長(zhǎng)度約為占整尾長(zhǎng)度28。/。左右，灌喂CTB和LK 融合基因編碼的蛋白提取物組小鼠尾部血栓長(zhǎng)度約為占整尾長(zhǎng)度17%左右，二者相對(duì)于水對(duì) 照組皆有顯著性差異，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)中所得到的CTB和LK融合基因編碼的蛋白不但具有抑制 血栓形成的作用，而且佐劑CTB可以發(fā)揮其增強(qiáng)LK吸收利用的效果。
<110>天津大學(xué)
<120>霍亂毒素B亞單位和弼l激酶融合基因及包括該基因的重組載體及宿主細(xì)胞
<160>10
<210>1
<211>372
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(372)<400>1
atgattaaat taaaaitttgg ggaacacctc aaaatattac ctaaatgata agata/ttttc attactttta agaatggtgc tcacaaaaaa aagcgattga gctaaagtcg aaaagttatg agtatggcaa at 372
<210>2
<211>849
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222〉 (1)…(849) <400>2
atgttacttctcgctcttgcatcactcgtagc敏gggctttgcccaaccaccaatctgg60
taccccggtggtc犯tgcggtctcagccagtactcagatgctggtgacatggaacttcct120
cccggaacaaaaattgtcggaggaattgaagctsgaccatacgagttcccatggcaggtg180
tccgtcagaaggaagtcttccgattcccatttctgcggaggtagcatcatcaacgatagg240
tgggttgtctgcgctgctcactgcatgcaggg卿ggcccccgctctggtttcattggtc300
gtgggtgagcacgacaggagtgcagctagtgcagtaaggcagactcatgscgttgat3gc360
atcttcgttcacgagg已ctacaacacaaataccctagagaacgacgtttctgtcatc犯g420
acatctgttgccatcactttcgacatcaacgttggtccaatctgtgccccagatccagct480
caacagtacgtctacagaaagagccagtgctccggatggggaactatcaattcaggtgga540
atctgctgtcccaacattctgagatacgtaactctg犯tgccaattctgc600
gaagatgtatacccac taaattcaatcttcgacgatatgatttgcgcttc660
gggggt獄gacagagactcctgccagggtgactccggcggccctctgagcgtcaaggat720
ggcagtggaatcttcagcctgattggtattgtgtcttggggaattggttgcgcttctggc780
tatccaggagtctactccagggtcggatttcacac agcatggatcaccgacatcatcacc840
aacaactaa 849
〈210>3
<211〉45
<212〉DNA
tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60
tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatatatacg 120
gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180
aatttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240
aaggatgaag galaccctga ggattgcata tcttactgaa 300
tgtatggaat aataa犯cgc ctcatgcgat tgccgcaatt 360〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉 (1)…(45)
〈400〉3
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45
〈210>4
〈211〉12
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
<220〉
<221>gene
〈222〉 (1)…(12)
〈400>4
cgcgctaggc gg 12
〈210〉5
〈211〉43
〈212〉DNA
〈213>人工序列
〈220〉
〈221〉gene
<222〉 (1)…(43)
<400〉5
gggcccgaat tccgcgctag gcggttactt ctcgctcttg cat 43
〈210〉6
<211〉31
〈212〉腿
<213>人工序列
〈220〉
〈221〉gene
<222> (1)…(31)
〈400>6gggcccaagc ttttagttgt tggtgatgat g 31
〈210〉7
<211>30
〈212>DNA
〈213>人工序列
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉 (1)…(30)
〈400〉7
gcgcggccgc gattaaatta aaatttggtg 30
〈210〉8
<211>31
〈212〉腿
<213>人工序列
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉 (1)…(31)
〈400〉8
gcgcggccgc ttagttgttg gtgatgatgt c 31
<210〉9
〈211〉427aa
<212〉pro
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉MUTAGEN 〈222〉 (1)…(427) <400>9
Met lie Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser 16 Ala Tyr Ala Hi; Gly Thr Pro Gin Asn lie Thr Asp Leu Cys Ala Glu 32 Tyr His Asn Thr Gin He Tyr Thr Leu Asn Asp Lys lie Phe Ser Tyr 48 Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala He lie Thr Phe Lys 64 Asn Gly Ala He Phe Gin Val Glu Val Pro Gly Ser Gin His lie Asp 80Ser Gin Lys Lys Ala He Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg lie Ala 96 Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys 112 Thr Pro His Ala lie Ala Ala lie Ser Met Ala Asn Gly Gly Gly Gly 128 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Arg Ala Arg 144 Arg Met Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ser Leu Val Ala Val Gly Phe Ala 160 Gin Pro Pro lie Trp Tyr Pro Gly Gly Gin Cys Gly Leu Ser Gin Tyr 176 Ser Asp Ala Gly Asp Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys He Val Gly 192 Gly He Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg 208 Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie He Asn Asp 224 Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ala Pro Ala 240 Leu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Ala 256 Val Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val His Glu Asp Tyr 272 Asn Thr Asn Thr Leu Glu Asn Asp Val Ser Val He Lys Thr Ser Val 288 Ala lie Thr Phe Asp lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro 304 Ala Gin Gin Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr 320 He Asn Ser Gly Gly He Cys Cys Pro Asn lie Leu Arg Tyr Val Thr 336 Leu Asn Val Thr Thr Asn Gin Phe Cys Glu Asp Val Tyr Pro Leu Asn 352 Ser lie Phe Asp Asp Met lie Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn 368 Asp Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys 384 Asp Gly Ser Gly lie Phe Ser Leu lie Gly lie Val Ser Trp Gly lie 400 Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His 416 Thr Ala Trp lie Thr Asp He lie Thr Asn Asn 427
<210>10
〈211〉1284
〈212〉DNA
<213>人工序列
〈220〉
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ggttgcgcttctggctatccaggagtctactccagggtcggatttcacacagcatggatc1260
accgacatcat caccaacaactaa 128權(quán)利要求
1. 一種霍亂毒素B亞單位和蚓激酶融合基因，其特征是由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，所述霍亂毒素B亞單位簡(jiǎn)寫(xiě)為CTB，所述蚓激酶簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)K。
2. —種含CTB與LK融合基因的重組載體pPIC9k-Cra-FwWw-L^其特征是由下述步驟構(gòu)建而成(1) 構(gòu)建含有CTB與LK融合基因的中間載體pBluescript SK-Cra-fwn'"-L^① 將SEQ ID NO.l所示的CTB基因和SEQ ID N0.3所示的柔性肽連接序列基因用全合成方 法連接，置于載體pBluescript SK-Cr5;② 將SEQ ID N0.2所示的LK基因用全合成方法合成置于載體pUCm-T-ZX;③ 設(shè)計(jì)由SEQ ID N0.5所示的上游引物Pl，和由SEQ ID N0.6所示的下游引物P2，以 pUCm-T-ZX質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Furin-LK融合基因，所述Furin基因序列如 SEQ ID N0.4所示； 將Furin-LK融合基因經(jīng)￡coRI和州"dIII雙酶切，將載體pBluescript SK-C775經(jīng)￡coRI和 州wdIII雙酶切，二者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到含SEQ ID NO.l所示的CTB基因、SEQ ID N0.3 所示的柔性肽連接序列基因、SEQ ID N0.4所示的Fw/"基因和SEQ ID NO.2所示的LK基因 的中間載體pBluescript SK-C7^-Fw/"-ZX;(2) 構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9k-C7S-Fw〃'"-Z^::設(shè)計(jì)由SEQ ID N0.7所示的上游引物P3，和由SEQ ID NO.8所示的下游引物P4，以pBluescript SK-C7^-F,' -Z《為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)A^I酶切，將畢赤酵母表達(dá) 載體pPIC9k經(jīng)AWI酶切，二者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到含CTB與LK融合基因的重組載體pPiC9k-cr5-Fw〃力-i:A:。
3. —種含有權(quán)利要求1所述的CTB和LK融合基因工程菌，其特征在于將由權(quán)利要求2所 構(gòu)建的pPIC9k-Cr5-Fwn'"-ZA:線(xiàn)性化后整合于畢赤酵母GS115的基因組上。
4. 一種由權(quán)利要求1所述的CTB和LK融合基因編碼的蛋白，其特征是序列表中SEQ ID N0.9 所示氨基酸序列。
5. —種CTB和LK融合基因編碼的蛋白在制備口服溶栓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了霍亂毒素B亞單位和蚓激酶融合基因及包括該基因的重組載體及宿主細(xì)胞，霍亂毒素B亞單位和蚓激酶融合基因是由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由CTB和LK融合而成的融合基因，通過(guò)畢赤酵母GS115能高效表達(dá)CTB與LK融合蛋白，其表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)率較高，畢赤酵母表達(dá)穩(wěn)定，應(yīng)用十分廣泛，經(jīng)純化的融合蛋白經(jīng)檢驗(yàn)具有生物學(xué)活性，可以制備成為融合蛋白藥物，融合蛋白藥物對(duì)治療血栓有明顯功效，同時(shí)CTB作為佐劑可明顯提高LK的口服吸收利用率，大大提高了LK的藥效作用。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101434964SQ20081015423
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者關(guān)春峰, 靜 季, 罡 王 申請(qǐng)人:天津大學(xué)