專利名稱：一種核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸疫苗，更具體地說，本發(fā)明涉及一種含有恒河猴絨毛膜促性腺激素β亞單位(rmCGβ)的抗生殖系統(tǒng)腫瘤核酸疫苗。
背景技術(shù)：
自1778年天花疫苗問世以來，疫苗在對(duì)人和家畜的疾病防治方面顯示了巨大的作用，是其它手段不能與之相比的。人體對(duì)疾病的預(yù)防是靠非特異和特異免疫系統(tǒng)來完成的，理想的疫苗應(yīng)能產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答，提供免疫保護(hù)而不致病。
隨著基因重組技術(shù)及基因載體傳遞系統(tǒng)的迅速發(fā)展，1992年美國有四個(gè)實(shí)驗(yàn)室(Robinson，Johoston，Li，David)同時(shí)開發(fā)研究出了DNA疫苗，即核酸疫苗的雛形，并在1992年9月召開的疫苗學(xué)新進(jìn)展大會(huì)上同時(shí)進(jìn)行了報(bào)告。從此核酸疫苗的新技術(shù)引起世界各國的高度重視，被人們視為疫苗研究領(lǐng)域的一場革命。核酸疫苗不僅滿足免疫保護(hù)而不致病，而且還具有治病的效應(yīng)。使用核酸疫苗的基因免疫新技術(shù)的核心是將編碼抗原的核酸序列組裝到含有必要表達(dá)調(diào)控元件的真核表達(dá)載體中構(gòu)建核酸疫苗，然后將其導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，重組的核酸疫苗可以利用動(dòng)物體內(nèi)的酶系合成外源基因編碼的蛋白，從而誘發(fā)動(dòng)物對(duì)該外源蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，達(dá)到免疫目的。許多動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)都證明了核酸疫苗能激發(fā)有效的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，既可激活體液免疫，又能激活細(xì)胞免疫，這表明基因免疫技術(shù)不僅能通過產(chǎn)生抗體預(yù)防病毒感染，更重要的是核酸疫苗具有可誘導(dǎo)極有效的專一性T殺傷細(xì)胞的能力，清除已經(jīng)被感染的機(jī)體細(xì)胞，達(dá)到治療的目的，而且沒有副作用反應(yīng)，這一點(diǎn)是該技術(shù)最誘人之處，也充分顯示出核酸疫苗的巨大潛力和應(yīng)用前景。1994年美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)以國家生物戰(zhàn)略發(fā)展計(jì)劃的專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助開展核酸疫苗治療HIV的研究工作。1994年美國食品和藥物管理署(FDA)批準(zhǔn)了在人體進(jìn)行核酸疫苗治療愛滋病的臨床試驗(yàn)。1995年5月，報(bào)導(dǎo)了世界第一例核酸疫苗的臨床試驗(yàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)撥款把核酸疫苗納入WHO全球免疫研制開發(fā)計(jì)劃之中。近十年來，核酸疫苗在治療腫瘤、肺結(jié)核、控制動(dòng)物繁殖等許多方面的基礎(chǔ)研究有重大突破。核酸疫苗的開發(fā)和應(yīng)用的研究引起了世界各國的高度重視，許多企業(yè)相繼投入巨資使之產(chǎn)品化。
國內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道，人絨毛膜促性腺激素β亞基(為方便起見，以下均簡稱hCGβ)蛋白除了在正常的妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中分泌外，許多腫瘤細(xì)胞也大量分泌特征性hCGβ蛋白。多種組織的腫瘤選擇性地分泌單鏈hCGβ或hCGβ的核心片段hCGβ-cf，如在生殖系統(tǒng)中的絨毛膜癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌，其他系統(tǒng)中如胃癌、膀胱癌、肺癌、肝癌，甚至口腔中的鱗狀細(xì)胞癌都能檢測到hCGβ蛋白。完整的hCG及其他內(nèi)分泌激素在癌細(xì)胞中則未檢測到。hCGβ蛋白作為一項(xiàng)重要的血清學(xué)指標(biāo)已被廣泛用于早期腫瘤的診斷。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測hCGβmRNA的方法可靈敏的檢測到早期的細(xì)胞癌變，hCGβ與hCG的比值可作為癌癥檢測的靈敏指標(biāo)。hCGβ在癌細(xì)胞中高表達(dá)，并與腫瘤的擴(kuò)增與衰退呈相關(guān)性變化。因此，hCGβ作為腫瘤細(xì)胞分泌的特征分子之一，亦是防治癌癥的有效靶分子之一。
我國現(xiàn)有癌癥病人300多萬人，每年死于惡性腫瘤的患者約為130萬人，并以3％的速度遞增。子宮頸癌、乳腺癌等生殖系統(tǒng)的腫瘤是十大高發(fā)性腫瘤，攻克生殖系統(tǒng)腫瘤是關(guān)系到全人類健康的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)還沒有將核酸疫苗應(yīng)用于抗生殖系統(tǒng)癌癥的空白，從而提供一種可以預(yù)防和治療生殖系統(tǒng)癌癥的恒河猴絨毛膜促性腺激素β亞單位(為方便起見，以下均簡稱rmCGβ)抗生殖系統(tǒng)腫瘤核酸疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供一種該核酸疫苗的構(gòu)建。
本發(fā)明的再一目的是提供該核酸疫苗的用途。
本發(fā)明的目的是由如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的核酸疫苗由編碼絨毛膜促性腺激素β亞單位-CGβ蛋白的基因和真核表達(dá)載體PCR 3.1組成，其特征在于所述編碼絨毛膜促性腺激素β亞單位-CGβ蛋白的基因?yàn)楹愫雍锏娜L互補(bǔ)脫氧核糖核酸基因，此基因已登入基因文庫rmCGβAY011015。
本發(fā)明提供的核酸疫苗的構(gòu)建，包括如下步驟1)提取雌性恒河猴妊娠胎盤組織總核糖核酸；2)設(shè)計(jì)特異性引物上游引物5′-CACGGGCCCGGCGACGCACCAAGGATG-3′；下游引物5′-GCGGATTCAGTAGCCTTTATTG-3′；3)通過溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆得到恒河猴的全長基因rmCGβ，該基因已登入基因文庫rmCGβAY011015；4)將步驟3)擴(kuò)增的rmCGβ，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化rmCGβcDNA片段；5)將rmCGβcDNA片段重組到真核表達(dá)載體PCR3.1中，構(gòu)建成核酸疫苗-抗生殖系統(tǒng)腫瘤的PCR3.1-rmCGβ。
所述步驟3)的溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在48℃反應(yīng)45分鐘，接著在95℃滅活5分鐘，并啟動(dòng)溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法擴(kuò)增反應(yīng)在第一個(gè)變性步驟時(shí)加入聚合酶，變性溫度為94℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從65℃開始，持續(xù)1分鐘，然后以每兩個(gè)循環(huán)下降1℃的速度降至55℃，持續(xù)1分鐘，延伸溫度為68℃，持續(xù)40秒；最后在以退火溫度60℃分鐘繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘。
所述步驟5)中的真核質(zhì)粒表達(dá)載體為可用于人的真核表達(dá)載體是經(jīng)美國FDA認(rèn)可的，pDNA3。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了該核酸疫苗在制備用于預(yù)防生殖系統(tǒng)腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了所述的核酸疫苗在制備用于治療生殖系統(tǒng)腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的抗生殖系統(tǒng)腫瘤的核酸疫苗優(yōu)益之處在于本發(fā)明利用異種同源CGβ核酸疫苗防治生殖腫瘤，在理論上首次提出異種同源核酸疫苗用于預(yù)防和治療生殖系統(tǒng)癌癥；首次制備了可以用于抗生殖系統(tǒng)癌癥的核酸疫苗，其不僅能通過B淋巴細(xì)胞免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，而且可以誘導(dǎo)極有效的專一性T殺傷細(xì)胞的能力，這種抗癌新疫苗通過調(diào)動(dòng)患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)殺滅癌細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的目的，從而達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的；并且不會(huì)產(chǎn)生常規(guī)化療和放療所帶來的劇烈惡性反應(yīng)和其毒性對(duì)患者身體的傷害；與當(dāng)前常用的疫苗相比，該核酸疫苗達(dá)到相同免疫效果所需的量小，20-100微克即可；該核酸疫苗能同時(shí)高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比常用免疫手段免疫效果更強(qiáng)；使用本核酸疫苗免疫安全、長效、穩(wěn)定、操作便捷。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.本發(fā)明的核酸疫苗的構(gòu)建本發(fā)明的PCR3.1-rmCGβ的構(gòu)建步驟如下1)胎盤組織總RNA提取選用成年、育齡的雌性恒河猴，體重為7.3kg，取其妊娠第三個(gè)月的胎盤；在冰浴中，將0.5克恒河猴胎盤組織投入6mL RNA變性提取液，用組織勻漿機(jī)充分破碎；加入0.6mL 2mol/L乙酸鈉、6mL體積比為125∶24∶1的酚∶氯仿∶異丙醇的混合液，充分振搖15秒，冰浴15分鐘；在4℃以10,000g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，分出上層清液，加入等體積的異丙醇，于-20℃放置30分鐘；在4℃以10,000g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，分出沉淀物，用70％乙醇洗滌沉淀兩次，真空干燥，加入無核酸酶水500μL溶解后，得到恒河猴胎盤組織總RNA提取液，于-80℃保存；取此恒河猴胎盤組織總RNA提取液5μL，進(jìn)行1.5％甲醛變性瓊脂糖凝膠(含EB0.2μg/mL)電泳檢測，凝膠條帶分析結(jié)果顯示所制備的樣品中28SrRNA的量約為18SrRNA的二倍。
2)設(shè)計(jì)特異性引物上游引物5′-CACGGGCCCGGCGACGCACCAAGGATG-3′；下游引物5′-GCGGATTCAGTAGCCTTTATTG-3′；克隆得到恒河猴CGβ(rmCGβ)的全長基因，該基因已登入基因文庫rmCGβAY011015；3)通過TDRT-PCR(溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增rmCG mRNA50μL的反應(yīng)體系由10μL的AMV/Tfl 5×反應(yīng)緩沖液、2mM的dNTPs混合物、2mM的MgSO4、1μM的上游引物及上游引物、0.1U/μL的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、0.1U/μL的RNasin核糖核酸酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor)、2μg的總RNA和無核酸酶的水組成，并在此水溶液上覆蓋50μL無核酸酶礦物油；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在48℃反應(yīng)45分鐘，接著在95℃滅活5分鐘，并啟動(dòng)TDRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)在第一個(gè)變性步驟時(shí)加入0.1U/μL的Tfl DNA聚合酶，在降落TDRT-PCR擴(kuò)增階段，變性溫度為94℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從65℃開始，持續(xù)1分鐘，然后以每兩個(gè)循環(huán)下降1℃的速度降至55℃，出現(xiàn)1分鐘，延伸溫度為68℃，持續(xù)40秒；最后在以退火溫度60℃分鐘繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘；4)通過TDRT-PCR擴(kuò)增的rmCGβ，方法同3)，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化rmCGβ cDNA片段；與克隆質(zhì)粒PCR2.1建立連接反應(yīng)將25ng/μL質(zhì)粒載體DNA和外源DNA片段，再加入無核酸酶的水至8.0μL，于45℃保溫5分鐘，以使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻至0℃，然后加入10×T4 DNA連接酶緩沖液1μL和1U/μL T4DNA連接酶，混勻后用微量離心機(jī)甩至管底，于14℃保溫12-16小時(shí)，得到擴(kuò)增的rmCGβ與克隆質(zhì)粒PCR2.1連接反應(yīng)產(chǎn)物；
5)質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化將50μL的感受態(tài)細(xì)胞INVαF′在冰上化凍后加入2μL0.5Mβ-ME，1-2μL步驟4)得到的連接反應(yīng)產(chǎn)物，并在冰上放置30分鐘。然后在42℃水浴中熱激30秒，再迅速置于冰上冷卻2分鐘。加入250μLSOC培養(yǎng)基，于37℃在恒溫?fù)u床上以225轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生抗藥性(Amp+)；將上述菌液搖勻后取50μL涂布于篩選LB平板上，其含有75μg/mL Amp，且表面涂有50μg/mL X-gal，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)；用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含有75μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；使用堿裂法提取質(zhì)粒DNA，選擇有正向插入外源DNA片斷的重組克隆質(zhì)粒；6)rmCGβ重組克隆質(zhì)粒利用Hind III和Xbal雙酶切反應(yīng)將步驟5)得到的PCR2.1-rCGβ克隆載體和pCR3.1真核表達(dá)載體的相關(guān)片段切下，經(jīng)低熔點(diǎn)膠回收；根據(jù)PCR3.1載體試劑盒的使用說明選用真核質(zhì)粒表達(dá)載體PCR3.1含有真核啟動(dòng)子CMV，能夠在真核細(xì)胞中高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)，將rmCGβ全長氨基酸編碼序列的cDNA片段重組到PCR3.1真核表達(dá)質(zhì)粒中用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top10F’，取80ul轉(zhuǎn)化的菌液涂布LB(含氨芐青霉素)平板，于37℃培養(yǎng)過夜；挑取菌落搖菌過夜，用堿裂法提取質(zhì)粒DNA，即本實(shí)施例的PCR3.1-rmCGβ，進(jìn)行酶切鑒定并對(duì)陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序；將有正向插入了rmCGβ擴(kuò)增產(chǎn)物外源DNA片斷的重組克隆質(zhì)粒經(jīng)純化后利用克隆質(zhì)粒測序引物M13反向引物(reverse primer)和T7啟動(dòng)子引物(promoter primer)對(duì)rmCGβ擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測序。
實(shí)施例2.外源rmCGβ基因的體外表達(dá)和表達(dá)含量的鑒定建立Hela細(xì)胞、JEG3細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，將實(shí)施例1中構(gòu)建的PCR3.1-rmCGβ真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，分別于24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)收集培養(yǎng)液，采用免疫印跡(Dot Blot和Western Blot)和ELISA分析鑒定rmCGβ基因的體外表達(dá)及含量，可知PCR3.1-rmCGβ真核表達(dá)質(zhì)粒在Hela細(xì)胞、JEG3細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中在mRNA水平上能高效表達(dá)，mRNA水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高出129％。
實(shí)施例3.體外表達(dá)rCGβ蛋白的生物活性鑒定建立BALB/C小鼠Leydig細(xì)胞無血清培養(yǎng)系統(tǒng)取出BALB/C小鼠睪丸組織，經(jīng)Collagase消化，采用DMEM-F12無血清培養(yǎng)基在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。利用Leydig細(xì)胞的特異性酶3β-HSD(3β-羥類固醇脫氫酶)，檢測出分離純化的Leydig細(xì)胞純度達(dá)到80％以上。將實(shí)施例2中Hela細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)PCR3.1-rmCGβ時(shí)收集的培養(yǎng)液與Mycoy’s 5A無血清培養(yǎng)基混合稀釋，加入24孔Leydig細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)2.5小時(shí)，收集培養(yǎng)液。采用RIA方法測定培養(yǎng)液的孕酮含量。其結(jié)果表明PCR3.1-rmCGβ能在Hela細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生具有生物活性的rmCGβ蛋白，蛋白水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高215％。
實(shí)施例4.在體內(nèi)rmCGβ mRNA表達(dá)的檢測提取PCR3.1-rmCGβ免疫小鼠肌肉細(xì)胞后第6周時(shí)收集的肌肉組織總RNA，利用擴(kuò)增rmCGβ的cDNA序列時(shí)采用的引物及TDRT-PCR方法，擴(kuò)增cDNA條帶，由檢測結(jié)果可知，PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗免疫后肌肉細(xì)胞中rmCGβ在mRNA水平上表達(dá)，mRNA水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高出487％。
實(shí)施例5.ELISA檢測小鼠體液免疫應(yīng)答用1∶50倍稀釋的正常血清作為對(duì)照，收集PCR3.1-rmCGβ免疫BALB/C小鼠的血清按1∶100和1∶1000的比例稀釋，以1μg/mL的hCGβ標(biāo)準(zhǔn)蛋白50μL/孔作包被抗原，采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測體液免疫應(yīng)答。由檢測結(jié)果可知，PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗免疫后機(jī)體能產(chǎn)生高滴度抗體(抗體滴度＞1∶7400)。
實(shí)施例6.T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雌性BALB/c純系小鼠，體重18-22克，由中國科學(xué)院遺傳所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均按二級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，實(shí)驗(yàn)組1肌肉注射20μg PCR3.1-rmCGβ；實(shí)驗(yàn)組2肌肉注射50μgPCR3.1-rmCGβ；對(duì)照組肌肉注射20μg空質(zhì)粒PCR3.1；未處理組不作任何處理。將不同實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及未處理組的淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液作為CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)檢測效應(yīng)細(xì)胞(Effector cells)按大約5×106細(xì)胞/mL與1μg/mL的hCGβ標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為特異性刺激抗原作用，在CTL培養(yǎng)液(1640-10％FBS)中于37℃，5％CO2共培養(yǎng)5天，同樣設(shè)立5μg/mL的PHA陽性對(duì)照和5μg/mL的BSA陰性對(duì)照。因?yàn)镠eLa細(xì)胞能夠自分泌CGβ蛋白，可以作為目標(biāo)細(xì)胞(Target cells)而不需作任何處理。50μL的人子宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)(2×106細(xì)胞/mL)與50μL的經(jīng)過刺激處理的效應(yīng)淋巴細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，Effector∶Target(E∶T)比例從50∶1、25∶1到12.5∶1，作用6小時(shí)后，每孔加入20μL的CellTiter 96Aqueous One Solution細(xì)胞增殖檢測試劑，于37℃，5％CO2中培養(yǎng)4小時(shí)，讀取樣品OD490nm吸收值。檢測結(jié)果為PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗免疫后機(jī)體能產(chǎn)生細(xì)胞免疫作用即具有特異性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性作用，實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2結(jié)果相似，T淋巴細(xì)胞特異裂解能力達(dá)52％。
實(shí)施例7.NK細(xì)胞活性檢測不同實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及未處理組(分組情況如實(shí)施例6所述)的未作致敏處理的淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液作為NK細(xì)胞活性檢測的效應(yīng)細(xì)胞(Effector cells)，用含50μM2-ME的1640-5％FBS培養(yǎng)液調(diào)整濃度至2×106細(xì)胞/mL，人子宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLacells)作為目標(biāo)細(xì)胞(Target cells)。50μL的HeLa cells與50μL的脾臟淋巴細(xì)胞在37℃，5％CO2中作用18小時(shí)，設(shè)50∶1、25∶1到12.5∶1的Effector∶Target(E∶T)比例。同樣地，再加入CellTiter 96Aqueous One Solution細(xì)胞增殖檢測試劑培養(yǎng)4小時(shí)后讀取樣品OD490nm吸收值。檢測結(jié)果為PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗免疫后機(jī)體能產(chǎn)生細(xì)胞免疫作用即NK(自然殺傷細(xì)胞)細(xì)胞活性具有特異性殺傷活性作用，NK細(xì)胞自然殺傷活性達(dá)46％。
實(shí)施例8.PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗防治腫瘤的動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn)PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，通過普魯卡因鹽酸鹽(bupivacaine-HCI)藥物誘導(dǎo)法，經(jīng)CGβDNA免疫接種BALB/C小鼠，20μg的劑量能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。從檢測的第2周開始，免疫反應(yīng)的滴度持續(xù)升高，在第6周時(shí)上升接近頂峰，抗體滴度最高可達(dá)1∶8000以上，特異性的體液免疫反應(yīng)能持續(xù)至少20周以上。實(shí)驗(yàn)表明PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗能有效激發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生抗原特異性的體液免疫應(yīng)答。
取肌肉免疫后8周時(shí)的T淋巴細(xì)胞來檢測CTL的抗原特異性殺傷活性。肌肉接種20μgCGβDNA免疫小鼠在8周時(shí)的T細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的抗原特異性殺傷活性在不同的E∶T比例中50∶1達(dá)到45％，25∶1時(shí)達(dá)到26％，與對(duì)照組(空質(zhì)粒)相比差異顯著(p＜0.01)，同時(shí)結(jié)果也說明PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實(shí)施例9.PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗防治腫瘤動(dòng)物安全性檢測進(jìn)行不同劑量rmCGβDNA疫苗注射動(dòng)物后的毒理性和常規(guī)生理指標(biāo)的觀察測定，利用組織化學(xué)方法確定注射疫苗后動(dòng)物組織病理變化將相應(yīng)組織器官進(jìn)行冰凍切片，在顯微鏡下觀察，沒有發(fā)現(xiàn)動(dòng)物組織有病理變化。
實(shí)施例10.PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗的離體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)采用TUNEL(TDT3’末端標(biāo)記)實(shí)驗(yàn)，在PCR3.1-rmCGβDNA免疫小鼠后第8周的取T淋巴細(xì)胞，以及免疫血清進(jìn)行的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR3.1-rmCGβDNA疫苗免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞能夠在體外攻擊HeLa細(xì)胞，導(dǎo)致HeLa細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡；同時(shí)免疫小鼠的血清也能夠作用HeLa細(xì)胞，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。
說明PCR3.1-rmCGβDNA疫苗不僅能夠激發(fā)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且激發(fā)的這兩種類型的免疫應(yīng)答均能夠作用于HeLa細(xì)胞，誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡，有高效殺死腫瘤細(xì)胞的作用。
實(shí)施例11.PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)首先建立CGβ依賴性和非依賴性的腫瘤模型利用SP2/0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)細(xì)胞導(dǎo)入rmCGβ和HN基因(禽類一種病毒cDNA作為非rmCGβ依賴性基因)，建立CGβ依賴性和非依賴性的腫瘤模型；小鼠宮頸瘤U-14實(shí)體注入法，建立實(shí)體腫瘤動(dòng)物模型。
然后將小鼠分成五組，每組10只第1組不接種任何物質(zhì)，2周后注射表達(dá)rmCGβ蛋白的SP2/0腫瘤細(xì)胞；第2組接種100μl生理鹽水，2周后注射表達(dá)rmCGβ蛋白的SP2/0腫瘤細(xì)胞；第3組接種100μlPCR3.1空質(zhì)粒，2周后注射表達(dá)rmCGβ蛋白的SP2/0腫瘤細(xì)胞；第4組接種100μlPCR3.1-rmCGβ核酸疫苗，2周后注射表達(dá)rmCGβ蛋白的SP2/0腫瘤細(xì)胞；第5組接種100μlPCR3.1-rmCGβ核酸疫苗，2周后注射表達(dá)HN蛋白的SP2/0腫瘤細(xì)胞。
從注射表達(dá)rmCGβ蛋白的SP2/0腫瘤細(xì)胞開始計(jì)時(shí)觀察，結(jié)果為第1組、第2組、第3組共30只小鼠10天后均發(fā)現(xiàn)腫瘤塊，其大小為8-12mm3；20天時(shí)檢查，其中兩只小鼠死亡，另28只小鼠均仍有腫瘤塊，其大小為15-18mm3，且鼠毛松疏，呈病態(tài)；60天時(shí)檢查，其中3只小鼠仍有腫瘤塊，其大小為25-38mm3，其它小鼠全部死亡。
第4組的10只小鼠在10天后檢查，僅發(fā)現(xiàn)1只小鼠有腫瘤塊，其大小為4.5mm3，其它小鼠均健康活潑；20天后檢查，這只小鼠仍有腫瘤塊，其大小為6.4mm3，其它小鼠均健康活潑；60天后檢查，又有2只小鼠有腫瘤塊，其大小約7.2mm3，其它小鼠仍健康活潑。
第5組的10只小鼠在10天后檢查，僅發(fā)現(xiàn)2只小鼠有腫瘤塊，其大小為3mm3，其它小鼠均健康活潑；20天后檢查，有3只小鼠有腫瘤塊，其大小為4.6mm3，其它小鼠均健康活潑；60天后檢查，有5只小鼠有腫瘤塊，其大小為6.3mm3，其它小鼠均健康活潑。
由此結(jié)果可知，在p＜0.01時(shí)，PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗具有極顯著的抗CG依賴型腫瘤作用，對(duì)非CG依賴型腫瘤的預(yù)防作用亦十分明顯，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
進(jìn)行多次平行實(shí)驗(yàn)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗具抗CG依賴型腫瘤作用(p＜0.01)是穩(wěn)定可靠的。
實(shí)施例12.PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗的殺傷腫瘤細(xì)胞作用實(shí)驗(yàn)(1)從實(shí)施例11的第1組、第2組、第3組中隨機(jī)取有腫瘤塊的存活小鼠中6只，其腫瘤塊大小在13-28mm3之間，然后分別注射100μlPCR3.1-rmCGβDNA疫苗，3天后患腫瘤的小鼠精神好轉(zhuǎn)，6天后腫塊開始減小，10天后2只小鼠腫瘤塊開始消失，20天后4只小鼠腫瘤塊消失。
(2)收集自然狀態(tài)下患腫瘤的小鼠4只，其腫瘤塊大小在22.5-37.3mm3之間，接種100μlPCR3.1-rmCGβ+PCR3.1-HN核酸疫苗，一周后腫瘤塊開始萎縮，三周后腫瘤塊基本消失。并且152天后仍健康存活。
由此結(jié)果可知，PCR3.1-rmCGβ核酸疫苗不僅具有體內(nèi)抗腫瘤作用，而且對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞還具有較強(qiáng)的殺傷作用。
權(quán)利要求
1.一種核酸疫苗，由編碼絨毛膜促性腺激素β亞單位-CGβ蛋白的基因和真核表達(dá)載體PCR 3.1組成，其特征在于所述編碼絨毛膜促性腺激素β亞單位-CGβ蛋白的基因?yàn)楹愫雍锏娜L互補(bǔ)脫氧核糖核酸基因，此基因已登入基因文庫rmCGβAY011015。
2.一種權(quán)利要求1所述的核酸疫苗的構(gòu)建，包括如下步驟1)提取雌性恒河猴妊娠胎盤組織總核糖核酸；2)設(shè)計(jì)特異性引物上游引物5′-CACGGGCCCGGCGACGCACCAAGGATG-3′；下游引物5′-GCGGATTCAGTAGCCTTTATTG-3′；3)通過溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆得到恒河猴的全長基因rmCGβ，該基因已登入基因文庫rmCGβAY011015；4)將步驟3)擴(kuò)增的rmCGβ，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化rmCGβ cDNA片段；5)將rmCGβ cDNA片段重組到含有真核表達(dá)載體PCR 3.1中，構(gòu)建成核酸疫苗-抗生殖系統(tǒng)腫瘤的PCR3.1-rmCGβ。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸疫苗的構(gòu)建，其特征在于所述步驟3)的溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在48℃反應(yīng)45分鐘，接著在95℃滅活5分鐘，并啟動(dòng)溫度降落逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法擴(kuò)增反應(yīng)在第一個(gè)變性步驟時(shí)加入聚合酶，變性溫度為94℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從65℃開始，持續(xù)1分鐘，然后以每兩個(gè)循環(huán)下降1℃的速度降至55℃，持續(xù)1分鐘，延伸溫度為68℃，持續(xù)40秒；最后在以退火溫度60℃分鐘繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘。
4.如權(quán)利要求2所述的核酸疫苗的構(gòu)建，其特征在于所述步驟5)中的真核表達(dá)載體為pDNA3。
5.一種權(quán)利要求1所述的核酸疫苗在制備用于預(yù)防生殖系統(tǒng)腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.一種權(quán)利要求1所述的核酸疫苗在制備用于治療生殖系統(tǒng)腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及的核酸疫苗PCR3.1－rmCGβ由編碼恒河猴絨毛膜促性腺激素β亞單位－CGβ蛋白的全長互補(bǔ)脫氧核糖核酸基因和真核表達(dá)載體PCR 3.1組成。該核酸疫苗的構(gòu)建是通過如下步驟提取雌性恒河猴妊娠胎盤組織的總核糖核酸、設(shè)計(jì)特異性引物、通過TDRT－PCR擴(kuò)增，克隆得到恒河猴的全長基因rmCGβ、將純化后的rmCGβ cDNA片段重組到真核表達(dá)載體PCR 3.1中。本核酸疫苗可以用于預(yù)防和治療生殖系統(tǒng)腫瘤的藥物。與當(dāng)前常用的疫苗相比，本核酸疫苗達(dá)到相同免疫效果所需的量小，并且安全、長效、穩(wěn)定、操作便捷。
文檔編號(hào)C12N15/16GK1537637SQ0312196
公開日2004年10月20日 申請(qǐng)日期2003年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月18日
發(fā)明者彭景楩, 石樹群, 陳云, 彭景 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院動(dòng)物研究所