專利名稱：一種快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗植物病害真菌海洋微生物的篩選，具體的說是一種快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，一些真菌對作物產(chǎn)生病害作用，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到很大危害；像紫青霉菌產(chǎn)生毒素對大豆生長產(chǎn)生毒害作用，使大豆減產(chǎn)，造成很大損失?，F(xiàn)有技術(shù)中，針對有害真菌，人們不斷在自然界中尋找能夠殺滅或拮抗有害真菌的微生物和其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，有害真菌往往是被作為靶子菌來參加篩選及檢測的過程，但絕大多數(shù)有害真菌因生長緩慢(48-72hr)、易擴(kuò)散(產(chǎn)生飛散的孢子等)的特性，在實(shí)際檢測中費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率低，有時(shí)還影響檢測結(jié)果的時(shí)效并造成實(shí)驗(yàn)室污染，而令人頭痛，其方法的局限性與先進(jìn)性不足之處顯而易見。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、結(jié)果可靠、效率高的快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1)以皺褶假絲酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素作標(biāo)準(zhǔn)單位，進(jìn)行平行抑菌試驗(yàn)，選出可作為指示菌的皺褶假絲酵母菌株；2)以步驟1)得到的皺褶假絲酵母菌株作指示菌，篩選對其有抑制作用的海洋微生物。
篩選過程中的抑菌時(shí)間通常為10～24小時(shí)；抑菌篩選過程中皺褶假絲酵母菌于培養(yǎng)基中的菌體濃度最好應(yīng)≥106個/毫升；抑菌篩選一般在26～32℃下進(jìn)行；抗真菌抗生素可為制霉菌素、酮康唑或兩性霉素等；篩選過程中一般采用平板抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作；平板抑菌實(shí)驗(yàn)常用的有挖塊法、杯碟法、打孔法或?yàn)V紙片法。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.效率高。本發(fā)明以同是真菌但生長速度快的類似細(xì)菌的皺褶假絲酵母代替植物病原菌測定抗菌活性，結(jié)果快速(10-24hr)。
2.操作簡單。本發(fā)明所用的皺褶假絲酵母無害、無毒、無孢子飛散，菌落形態(tài)酷似細(xì)菌，在微生物生物測定抗真菌活性的方法中，代替生長緩慢、易擴(kuò)散，檢測抑菌邊緣不清晰，易于污染的病原真菌作為靶子菌，無污染，抑菌邊緣清晰，方法簡單易行。
3.結(jié)果可靠。本發(fā)明所用的指示菌是從多種無害酵母菌中篩選出來的，對其有抑菌活性的海洋微生物對植物病害真菌也有抑制作用，準(zhǔn)確穩(wěn)定。
總之，本發(fā)明原則上可應(yīng)用到各種來源的微生物及其它抗真菌物質(zhì)的抗菌活性測定，采用雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測或平皿涂菌培養(yǎng)檢測的方法，可以方便快速測定海洋微生物(主要是海洋放線菌)及其它來源的微生物的抗菌活性，促進(jìn)了從微生物中篩選抗真菌資源的工作效率，并簡化了已有相關(guān)測定技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.快速篩選指示菌的選取選取無害、生長速度快皺褶假絲酵母菌28株和三株植物病害真菌紫青霉菌(Penicillum purpurogenum)、鐮刀菌(Fusarium solani)及葡萄孢菌(Botrytis fuckeliana)，用制霉菌素(也可為其它的抗真菌藥物)進(jìn)行平行抑菌試驗(yàn)，確定植物病害真菌和無害酵母對抗生物質(zhì)的反應(yīng)及敏感的相關(guān)性；其中有3株皺褶假絲酵母菌株和紫青霉菌對制霉菌素具有相同的反應(yīng)(對皺褶假絲酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素進(jìn)行平行抑菌試驗(yàn)，它們會同時(shí)出現(xiàn)抑菌圈)，從而選出它們皺褶假絲酵母菌株作為快速篩選指示菌；1)指示菌的制備(檢測菌培養(yǎng))取一環(huán)酵母菌的培養(yǎng)瓊脂斜面種子接種于裝有10ml液體培養(yǎng)基的試管中，28℃培養(yǎng)24小時(shí)備用；選用常規(guī)的酵母菌培養(yǎng)基即可，液體培養(yǎng)基組成為葡萄糖2％、酵母膏1％、蛋白胨0.2～0.3％，調(diào)PH6.5-7.0，115℃滅菌20分鐘；固體培養(yǎng)基既在液體培養(yǎng)基中加入2％瓊脂；2)雙層平板的制備將新培養(yǎng)的指示菌制成菌懸液用移液管取28℃培養(yǎng)24小時(shí)的菌液0.3ml，加入裝有50ml溫度在50～55℃之間的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻后取5ml加入含有約15ml凝固培養(yǎng)基作下層的平皿中，即得雙層平板。
2.抗植物病害海洋微生物的快速篩選采用挖塊法看分純的海洋鏈霉菌和海洋細(xì)菌對選出的皺褶假絲酵母菌株產(chǎn)生的抑菌效果，從而快速篩選出對植物病害有抑制作用的海洋微生物；具體為在制成雙層平板上放入長有試驗(yàn)菌的瓊脂塊，培養(yǎng)10～24小時(shí)，即可獲得其抗菌活性結(jié)果。
1)試驗(yàn)菌的制備從中國沿海采樣分離得到海洋鏈霉菌941株，將分純的海洋鏈霉菌涂于其適于生長的固體平板上，28℃培養(yǎng)7天后備用；2)檢測雙層培養(yǎng)液化固體培養(yǎng)基倒底層平板，冷凝后再將在54℃水浴中保溫的混有酵母菌的固體培養(yǎng)基(每50ml培養(yǎng)基加0.3ml液體培養(yǎng)物)，倒上層平板，凝固后，平皿中放入待檢測的海洋鏈霉菌樣品瓊脂塊，28℃靜置培養(yǎng)10-24hr，獲得有抗菌活性的海洋鏈霉菌38株。
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于，抗植物病害海洋微生物的快速篩選，1)試驗(yàn)菌的制備從中國沿海采樣分離得到海洋芽孢菌71株，將分純的海洋芽孢菌涂于其適于生長的固體平板上，28℃培養(yǎng)1天后備用；檢測雙層培養(yǎng)液化Y76固體培養(yǎng)基200ml倒底層(木框或不銹鋼框)，冷凝后再將在54℃水浴中保溫的混有Y76酵母菌的固體Y76培養(yǎng)基(每50ml培養(yǎng)基加0.3ml液體培養(yǎng)物)，倒上層，待凝后，放入待檢測樣品海洋芽孢菌瓊脂塊，28℃靜置培養(yǎng)10-24hr，獲得有抗菌活性的海洋芽孢菌9株。
實(shí)施例3篩選出菌株的檢測以假絲酵母為靶子菌篩選得到有拮抗作用的海洋細(xì)菌和海洋鏈霉菌47株，平行測定對紫青霉菌和假絲酵母的抑菌活性，確定靶子菌與紫青霉菌對篩選到菌株的反應(yīng)及敏感相關(guān)性，測定結(jié)果顯示篩選出的菌株對紫青霉菌同樣有抑制作用；用篩選出的菌株對植物致病菌鐮刀菌及葡萄孢菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果同樣有效。
其中有一株皺褶假絲酵母菌株Y76的應(yīng)用效果極好。
權(quán)利要求
1.一種快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于1)以皺褶假絲酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素進(jìn)行平行抑菌試驗(yàn)，選出可作為指示菌的皺褶假絲酵母菌株；2)以步驟1)得到的皺褶假絲酵母菌株作指示菌，篩選對其有抑制作用的海洋微生物。
2.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于篩選過程中的抑菌時(shí)間為10～24小時(shí)。
3.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于抑菌篩選過程中皺褶假絲酵母菌于培養(yǎng)基中的菌體濃度應(yīng)≥106個/毫升。
4.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于抑菌篩選在26～32℃下進(jìn)行。
5.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于所述抗真菌抗生素為制霉菌素、酮康唑或兩性霉素。
6.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于篩選過程中采用平板抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作。
7.按照權(quán)利要求6所述的快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，其特征在于所述平板抑菌實(shí)驗(yàn)為挖塊法、杯碟法、打孔法或?yàn)V紙片法。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗植物病害真菌海洋微生物的篩選，具體的說是一種快速篩選抗植物病害真菌海洋微生物的方法，1)以皺褶假絲酵母菌株和植物病害真菌用抗真菌抗生素進(jìn)行平行抑菌試驗(yàn)，選出可作為指示菌的皺褶假絲酵母菌株；2)以步驟1)得到的皺褶假絲酵母菌株作指示菌，篩選對其有抑制作用的海洋微生物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)效率高，操作簡單，結(jié)果可靠，促進(jìn)了從微生物中篩選抗真菌資源的工作效率，并簡化了已有相關(guān)測定技術(shù)。
文檔編號C12Q1/18GK1566359SQ03133879
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者馬成新, 胡江春, 薛德林, 劉全永, 王書錦 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所