專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病原菌的分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法
背景技術(shù)：
菊花(Dendranthema morifolium Tzvel. (Chrysanthemum morifolium Ramat.)) 為菊科菊屬多年生宿根草本植物，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花，世界上最早栽培的觀(guān)賞植物之一， 具有很高的經(jīng)濟(jì)和觀(guān)賞價(jià)值，在花卉產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要的地位。菊花在移栽、扦插、以及種植過(guò)程中易感染真菌病害，其中以菊花黑斑病和枯萎病最為普遍，本專(zhuān)利將以這兩種菊花真菌病害為例。菊花黑斑病癥狀為發(fā)病初，葉片出現(xiàn)大小不等的淺黃和褐色斑，逐漸發(fā)展成邊緣黑褐色、中間灰黑色的近圓形不規(guī)則斑塊，后期病斑上長(zhǎng)出黑色小點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)病斑相連，葉片發(fā)黑焦枯乃至脫落，病株從下部葉片開(kāi)始順次向上枯死至全株。菊花枯萎病癥狀為發(fā)病初時(shí)葉色變淺發(fā)黃，萎蔫下垂，莖部、枝條、根部逐漸變成淡褐色直至變黑腐爛壞死，濕度大時(shí)病部產(chǎn)生白霉。以往檢測(cè)植物真菌病害病原菌主要有形態(tài)學(xué)觀(guān)察法、酶聯(lián)免疫法、基因芯片法、質(zhì)譜技術(shù)等。常規(guī)直接或培養(yǎng)后鏡檢的形態(tài)學(xué)鑒定來(lái)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)病原菌，其操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、 并且需要高度的專(zhuān)業(yè)知識(shí)。尤其對(duì)于那些生長(zhǎng)條件特殊、形態(tài)相似的菌株要通過(guò)傳統(tǒng)的表型特征鑒定方法來(lái)加以鑒別顯得非常困難，許多時(shí)候只能鑒定到屬這一級(jí)別。酶聯(lián)免疫法在國(guó)外已經(jīng)形成商品化生產(chǎn)，但是每種病原菌都需要特異的酶標(biāo)記抗體，標(biāo)記過(guò)程比較復(fù)雜，價(jià)格比較昂貴，且存在假陰性和假陽(yáng)性問(wèn)題?；蛐酒夹g(shù)雖然能夠同時(shí)進(jìn)行多種真菌的鑒定，但只局限于已知的常見(jiàn)病原真菌，對(duì)非常見(jiàn)菌、突變菌或者新菌種則無(wú)能為力，且成本過(guò)高。質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定中具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但由于質(zhì)譜鑒定必須是純化培養(yǎng)的單克隆菌落，操作復(fù)雜且所需的專(zhuān)業(yè)技術(shù)要求較高，設(shè)備購(gòu)置和維護(hù)費(fèi)高昂。隨著分子生物學(xué)手段的發(fā)展與應(yīng)用，利用真菌核糖體DNA上的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)進(jìn)行真菌種類(lèi)鑒定已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。但現(xiàn)有方法利用ITS序列對(duì)病原真菌進(jìn)行鑒定前，須先經(jīng)過(guò)純菌株的分離純化，真菌DNA的提取，PCR擴(kuò)增以及亞克隆等一系列繁瑣的過(guò)程。這種方法存在如下缺點(diǎn)(1)至少需要7天時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；(2)對(duì)目前無(wú)法培養(yǎng)或難培養(yǎng)的真菌很難進(jìn)一步鑒定和分析；( 分離和培養(yǎng)單胞存在較高的技術(shù)難度；(4)繁瑣的真菌DNA提取步驟；( PCR擴(kuò)增片段需要經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取等步驟后才能測(cè)序。這些缺點(diǎn)極大地限制了田間病原菌的快速鑒定，貽誤了病情。目前，大量的真菌病害導(dǎo)致了菊花觀(guān)賞品質(zhì)下降，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法， 能夠快速鑒定菊花真菌病害的病原菌種類(lèi)。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法，包括如下步驟(1)植物病樣制備用蒸餾水沖洗干凈待檢病樣品(葉片、莖或根部)，從其中取一塊5mmX5mm左右大小的病害組織，置于2ml離心管中，加入無(wú)菌水200 μ 1，劇烈震蕩10s， 其溶液作為步驟O) PCR反應(yīng)中的模板；(2)PCR、電泳檢測(cè)、片段純化及測(cè)序取步驟(1)離心管中的溶液作為模板，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，引物分別為ITS-F :5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3，(SEQ ID NO. 1)，ITS-R 5' -TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3' (SEQ ID NO. 2) ；PCR 反應(yīng)后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增條帶后，采用Biospin Gel Extraction kit (BioFlux)試劑盒進(jìn)行切膠純化回收，將回收產(chǎn)物上ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序引物分別為SEQ-F 5，-GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3，(SEQ ID NO. 3)，SEQ-R :5，-GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3，( SEQ ID N0. 4)；(3)測(cè)序結(jié)果比對(duì)確定病原菌種類(lèi)將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (NCBI)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，從而確定導(dǎo)致菊花真菌病害的病原菌種類(lèi)。步驟(2)所述PCR 反應(yīng)體系 50 μ 1 中包括 25 μ 1 2XMightAmp Buffer Ver. 2, 1 μ IMightAmp DNA Polymerase (TaKaRa)，1 μ 1 上游引物 ITS-F，1 μ 1 下游引物 ITS-R，1 μ 1 步驟(1)離心管中的溶液作為模板，加滅菌水補(bǔ)足至50 μ 1。步驟⑵所述PCR反應(yīng)設(shè)定為98°C預(yù)變性anin，98°C變性10s，55°C退火30s，72°C 延伸lmin，循環(huán)30 35次，72°C延伸7min。步驟(3)所述的測(cè)序結(jié)果比對(duì)確定病原菌種類(lèi)為將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行 BLAST比對(duì)，與所測(cè)序列最接近的且相似率達(dá)98%以上的即為導(dǎo)致該菊花真菌病害的病原菌種類(lèi)。有益效果本發(fā)明通過(guò)比對(duì)真菌和菊花ITS序列，設(shè)計(jì)了只能擴(kuò)增出真菌ITS序列的引物，采用極高PCR反應(yīng)性能的MightyAmp DNA Polymerase擴(kuò)增菊花病原真菌的ITS序列，產(chǎn)物純化后直接測(cè)序，通過(guò)BLAST在線(xiàn)比對(duì)，能在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)和鑒定。相對(duì)于之前的PCR鑒定植物病原真菌的方法(至少需要7天時(shí)間)，省去了純菌株的分離純化、真菌DNA的提取以及亞克隆等繁瑣過(guò)程，減少了技術(shù)難度，省力省時(shí)，還能鑒定出不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)的真菌，大大提高了鑒定的效率和范圍。本發(fā)明提供了一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法，能在6小時(shí)內(nèi)鑒定出病原菌種類(lèi)，為有針對(duì)性地開(kāi)展菊花真菌病害的防治，及時(shí)解決菊花的真菌病害問(wèn)題提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，推動(dòng)菊花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。


圖1為實(shí)施例1中病葉樣本2為實(shí)施例2中病根樣本3為實(shí)施例1中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳4為實(shí)施例2中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳5本發(fā)明快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法流程圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1取田間表現(xiàn)葉片發(fā)黃、發(fā)黑的菊花植株為材料(如圖1所示)，將病葉用蒸餾水沖洗干凈，從其中取一塊5mmX5mm左右大小的病害組織，置于2ml離心管中，加入無(wú)菌水 200 μ 1，劇烈震蕩10s，其溶液作為下一步PCR反應(yīng)中的模板；PCR反應(yīng)所用上下游引物分別為ITS-F :5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3，(SEQ ID NO. 1)，ITS-R :5，-TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3，(SEQ ID NO. 2)。PCR50 μ 1 ^1 25 μ 1 2 XMightAmp Buffer Ver. 2,1 μ 1 MightAmp DNAPolymerase(TaKaRa)，1 μ 1 上游引物 ITS-F, 1 μ 1 下游引物 ITS-R，1 μ 1 步驟(1)離心管中的溶液作為模板，加滅菌水補(bǔ)足至50 μ 1。PCR反應(yīng)設(shè)定為98°C預(yù)變性anin，98°C變性 10s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循環(huán) 30 35 次，72°C延伸 7min。PCR反應(yīng)后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增條帶后(如圖3所示)，采用 Biospin GelExtraction kit (BioFlux)試劑盒進(jìn)行切膠純化回收。將回收產(chǎn)物上ABI PRISM 3730XL DNAAnalyzer測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序引物分別為SEQ_F，SEQ-R ；SEQ-F :5，-GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3，(SEQ ID NO. 3)，SEQ-R :5，-GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3，(SEQ ID NO. 4)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與所測(cè)序列最接近的且相似率達(dá)98%以上的為鏈格孢Alternaria alternate，說(shuō)明導(dǎo)致該田間菊花黑斑病的病原菌為鏈格孢A/ ternariaalternata0實(shí)施例2取田間表現(xiàn)葉色變淺發(fā)黃，萎蔫下垂，莖部、枝條、根部逐漸變成淡褐色的菊花植株為材料(如圖2所示)，將根莖部用蒸餾水沖洗干凈，從其中取一塊5mmX 5mm左右大小的病害組織，置于2ml離心管中，加入無(wú)菌水200 μ 1，劇烈震蕩10s，其溶液作為下一步PCR反應(yīng)中的模板；PCR反應(yīng)所用上下游引物分別為ITS-F :5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3，(SEQ ID NO. 1)，ITS-R :5，-TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3，(SEQ ID NO. 2)。PCR50 μ 1 ^1 25 μ 1 2 XMightAmp Buffer Ver. 2,1 μ 1 MightAmp DNAPolymerase(TaKaRa)，1 μ 1 上游引物 ITS-F, 1 μ 1 下游引物 ITS-R, 1 μ 1 步驟(1)離心管中的溶液作為模板，加滅菌水補(bǔ)足至50 μ 1。PCR反應(yīng)設(shè)定為98°C預(yù)變性anin，98°C變性 10s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循環(huán) 30 35 次，72°C延伸 7min。PCR反應(yīng)后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增條帶后(如圖4所示)，采用 Biospin GelExtraction kit (BioFlux)試劑盒進(jìn)行切膠純化回收。將回收產(chǎn)物上ABI PRISM 3730XL DNAAnalyzer測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序引物分別為SEQ_F，SEQ-R ；SEQ-F :5，-GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3，(SEQ ID N0. 3)，SEQ-R :5，-GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3，(SEQ ID N0. 4)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與所測(cè)序列最接近的且相似率達(dá)98%以上的為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum,說(shuō)明導(dǎo)致該田間菊花枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum。
權(quán)利要求
1.一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)植物病樣制備用蒸餾水沖洗干凈待檢病樣品，從其中取一塊5mmX5mm左右大小的病害組織，置于2ml離心管中，加入無(wú)菌水200 μ 1，劇烈震蕩10s，其溶液作為步驟(2) PCR 反應(yīng)中的模板；(2)PCR、電泳檢測(cè)、片段純化及測(cè)序取步驟⑴離心管中的溶液作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物分別為=ITS-F :SEQ ID NO. 1, ITS-R =SEQ ID NO. 2 ;PCR反應(yīng)后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)擴(kuò)增條帶后，采用Biospin Gel Extraction kit試劑盒進(jìn)行切膠純化回收， 將回收產(chǎn)物上ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序引物分別為SEQ-F SEQ ID NO. 3，SEQ-R :SEQ ID NO. 4 ；(3)測(cè)序結(jié)果比對(duì)確定病原菌種類(lèi)將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上進(jìn)行 BLAST比對(duì)，從而確定導(dǎo)致菊花真菌病害的病原菌種類(lèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法，其特征在于步驟(1)所述的待檢病樣品為待檢菊花的葉片、莖或根部。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法，其特征在于步驟(2)所述 PCR 反應(yīng)體系共 50 μ 1，包括25 μ 1 2 XMightAmp Buffer Ver. 2，1 μ 1 MightAmpDNA Polymerase, 1 μ 1 上游引物 ITS-F, 1 μ 1 下游引物 ITS-R，1 μ 1 步驟(1)離心管中的溶液作為模板，加滅菌水補(bǔ)足至50 μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法，其特征在于步驟(2)所述PCR反應(yīng)程序設(shè)定為981預(yù)變性&^11，981變性10s，55°C退火30s，72°C 延伸lmin，循環(huán)30 35次，72°C延伸7min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法，其特征在于步驟⑶將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與所測(cè)序列最接近的且相似率達(dá)98%以上的即為導(dǎo)致該菊花真菌病害的病原菌種類(lèi)。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物病原菌的分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種快速鑒定菊花真菌病害病原菌種類(lèi)的方法。該方法包括(1)植物病樣制備；(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、電泳檢測(cè)及片段純化；(3)測(cè)序及結(jié)果比對(duì)確定病原菌種類(lèi)。本方法突破了傳統(tǒng)的植物真菌病害鑒定周期長(zhǎng)、專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)等局限性，提供的檢測(cè)方法可在6小時(shí)內(nèi)即可完成檢測(cè)與鑒定菊花真菌病害，檢測(cè)廣譜性強(qiáng)，靈敏度高，工序簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12R1/77GK102559923SQ201210073698
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者宋愛(ài)萍, 房偉民, 李會(huì)云, 管志勇, 蔣甲福, 陳發(fā)棣, 陳思思, 陳素梅 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)