專利名稱：一種使皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾的細(xì)胞融合技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種使皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法。
背景技術(shù)：
人類和動(dòng)物中那些經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響，可以從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而具有無(wú)限增殖的能力的細(xì)胞，稱之為“永生化”細(xì)胞。自發(fā)永生化細(xì)胞的幾率非常小，嚙齒類動(dòng)物為10-5～10-6，而人的細(xì)胞則更為罕見，小于1012。因此，學(xué)者們通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)，將外源性基因轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，或誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因突變，以增加永生化的發(fā)生機(jī)率。隨著生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的不斷發(fā)展，使得永生化成纖維細(xì)胞作為細(xì)胞生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞或組織工程的種子來(lái)源，成為迫切需要解決的當(dāng)務(wù)之急。目前，國(guó)內(nèi)外在此技術(shù)領(lǐng)域中也開展了不少的工作，涉及皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法主要有以下幾種SV40法SV40大T抗原是60年代發(fā)現(xiàn)的一種猴腎細(xì)胞病毒，人為其自然宿主，它有結(jié)構(gòu)蛋白(VP1，VP2，VP3)和兩種抗原LT和st組成。1983年lubbe L等選擇三例Lesch-Nyhan患者的皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)后，利用SV40大T抗原進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功將其培養(yǎng)到200代以上。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞表現(xiàn)對(duì)血清的要求降低，呈現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)，無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，無(wú)錨著依賴性可在軟瓊脂中生長(zhǎng)。以后有人先后將其應(yīng)用于Wilms瘤等病人皮膚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，細(xì)胞壽命明顯延長(zhǎng)。由于對(duì)SV40的認(rèn)識(shí)已比較全面，所以被廣泛用于生命期、衰老和永生化機(jī)理的研究。但是以上所述的細(xì)胞均來(lái)源于病體，即所獲得的細(xì)胞是非正常的。正常體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染相對(duì)較難，在少數(shù)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中都是以病毒作為介質(zhì)。利用病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞只能用于基礎(chǔ)研究，若將其作為治療用細(xì)胞或組織工程的種子細(xì)胞，則存在誘發(fā)腫瘤或其它疾患的可能性。
端粒酶法端粒酶是近年來(lái)生命科學(xué)研究的新熱點(diǎn)。運(yùn)用端粒酶來(lái)延長(zhǎng)細(xì)胞的生命周期，也是永生化的一個(gè)新領(lǐng)域。端粒(telomere)是位于染色體末端具有特殊功能的DNA帽，它在穩(wěn)定染色體及防止染色體末端融合等方面具有重要的作用。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，端粒進(jìn)行性縮短，當(dāng)縮短到一定的限度即不能維持染色體的穩(wěn)定時(shí)，細(xì)胞失去分裂增殖的能力，進(jìn)而衰老死亡。端粒酶(telomerase)則是催化合成并維持端粒一定序列的核糖核蛋白，由RNA和蛋白組成，具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。其中端粒酶的催化亞單位〔被命名為hTERT〕在端粒酶的激活中起關(guān)鍵作用。1996年，Wight等首次發(fā)現(xiàn)端粒的縮短會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖危機(jī)。1998年Homayoun等，在正常的缺乏端粒酶活性的人的二倍體成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)入端粒酶催化亞單位，結(jié)果表明，由病毒介導(dǎo)的hTERT的表達(dá)激活了正常細(xì)胞端粒酶的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致端粒DNA的增長(zhǎng)和細(xì)胞生命周期的延伸。端粒酶異位表達(dá)的正常人成纖維細(xì)胞，其體外培養(yǎng)超過170PD，至今仍在培養(yǎng)中。
放射性因素法1996年，Razmik等從高劑量原子彈輻射后的幸存者身上得到了自發(fā)永生化的皮膚成纖維細(xì)胞。此后相繼產(chǎn)生了X射線、電離輻射、50Co等放射性因素進(jìn)行細(xì)胞永生化的方法，多可使細(xì)胞生命周期得到延伸。推測(cè)可能是由于放射性元素破環(huán)了維持衰老機(jī)制的穩(wěn)定性，促進(jìn)了與生命延長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)。
癌基因、抑癌基因法基于癌基因、抑癌基因的生物學(xué)特性，有人用ras，c-myc，N-myc，c-fos，Ab5等原癌基因進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，或使抑癌基因突變，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化后發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)利用癌基因轉(zhuǎn)化原代成纖維細(xì)胞永生化的情況非常少見，甚至促進(jìn)了細(xì)胞的衰老。而對(duì)于傳代細(xì)胞有一定的促生殖作用。例如，c-myc的表達(dá)恢復(fù)了端粒酶的活性，并使P53發(fā)生突變，阻斷了NK4A/ARF通路，而后兩相事件又反過來(lái)促進(jìn)了端粒酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)永生化。
其他方法此外還有人利用HPV、四硝基喹啉一氧化物、黃曲霉毒素等，或以上幾種方法聯(lián)合使用轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞。
在以上幾種轉(zhuǎn)化方式中，雖然所有實(shí)驗(yàn)尚不能明確細(xì)胞在永生化過程中所發(fā)生的變化，但給了我們新的啟示，那就是在發(fā)揮LT抗原滅活P53和PRb兩種蛋白的基礎(chǔ)上，再轉(zhuǎn)入外源性的hTERT，恢復(fù)端粒酶的活性，有可能使細(xì)胞發(fā)生永生化轉(zhuǎn)變或提高永生化轉(zhuǎn)變率。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，本發(fā)明的目的在于，繼前人已經(jīng)進(jìn)行的研究工作，提出一種在猴腎細(xì)胞病毒(SV40大T抗原)轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上，再對(duì)其進(jìn)行端粒酶催化亞單位(hTERT)的轉(zhuǎn)染，以期獲得具有穩(wěn)定生物學(xué)性狀并能夠長(zhǎng)期傳代的皮膚成纖維細(xì)胞系方法，使該細(xì)胞的獲得可對(duì)皮膚組織工程的體外實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞，有利于組織工程皮膚構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的建立。并力求使該細(xì)胞應(yīng)具有如下特征(1)與正常細(xì)胞相比，永生化細(xì)胞系可在體外長(zhǎng)期傳代，至少在50代以上。
(2)具有相對(duì)穩(wěn)定的，與正常細(xì)胞接近的生物學(xué)性狀。無(wú)致瘤性，可在體外合成分泌I型、III型膠原，并有能力修復(fù)病損的組織。
根據(jù)上述構(gòu)思和所設(shè)計(jì)永生化成纖維細(xì)胞特征的要求，本發(fā)明使皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法，其特征在于將猿猴病毒40大T抗原LT的互補(bǔ)脫氧核糖核酸cDNA和帶有熒光蛋白表達(dá)基因的人端粒酶催化亞單位hTERT的cDNA，共同轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細(xì)胞，以建立永生化細(xì)胞系，包括以下步驟步驟l培養(yǎng)原代皮膚成纖維細(xì)胞；步驟2分別用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亞單位hTERT轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染后鑒定；步驟3帶有熒光蛋白表達(dá)基因和端粒酶催化亞單位hTERT cDNA的載體pIRES2-EGFP-hTERT的構(gòu)建；步驟4LT、hTERT共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞取已轉(zhuǎn)染LT的細(xì)胞進(jìn)行pIRES2-EGFP-hTERT的轉(zhuǎn)染，利用熒光顯微鏡分離獲得陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
所述的步驟1原代皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的過程為；應(yīng)用酶消化法獲取正常人皮膚成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁后呈典型的纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，用抗波形絲蛋白Vimentin抗體免疫組織化學(xué)染色，確定皮膚成纖維細(xì)胞。
所述的步驟2用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亞單位hTERT轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的過程為(1)將傳至第16代的皮膚成纖維細(xì)胞，接種含有LT和hTERT的質(zhì)粒，用氨基甙類藥物篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)雙酶切含有LT和hTERT cDNA的質(zhì)粒psv3-neo和pCl-Neo-hTERT；(3)將酶切后所得片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記，將其作為脫氧核糖核酸DNA探針；
(4)取標(biāo)記好的探針對(duì)轉(zhuǎn)染后第3代和第16代細(xì)胞進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，解剖顯微鏡下觀察LT、hTERT信使核糖核酸mRNA的表達(dá)情況。
所述的步驟3構(gòu)建的有熒光蛋白表達(dá)基因和端粒酶催化亞單位hTERTcDNA的載體pIRES2-EGFP-hTERT的過程為(1)pIRES2-EGFP質(zhì)粒和PCL-Neo-hTERT質(zhì)粒同時(shí)用內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；(2)將上述酶切后的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收；(3)DNA片斷水浴連接；(4)取感受態(tài)細(xì)菌融化后，加入連接產(chǎn)物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(5)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和單酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析電泳條帶，確定構(gòu)建成功的載體。
所述的步驟4取已轉(zhuǎn)染LT的細(xì)胞進(jìn)行pIRES2-EGFP-hTERT的轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)LT和hTERT cDNA的共轉(zhuǎn)染，過程為(1)以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞倍增次數(shù)(即PD)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；(2)采取有限稀釋法，獲得單個(gè)細(xì)胞克??；(3)核型分析取轉(zhuǎn)染并篩選后的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)行核型分析檢測(cè)；(4)取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞注入到裸鼠皮下，進(jìn)行致瘤性檢測(cè)；(5)利用圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行膠原分泌能力檢測(cè)。


圖1以時(shí)間為橫軸、細(xì)胞倍增次數(shù)(即PD)為縱軸繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
圖2轉(zhuǎn)染并篩選后的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞核型分析圖例。
圖3三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞膠原分泌能力比較圖。
上述附圖結(jié)合下述具體實(shí)施例可對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步了解。
具體實(shí)方式1.原代皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)具體過程為應(yīng)用酶消化法獲取正常人皮膚成纖維細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后呈典型的纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)?？共ㄐ谓z蛋白(即Vimentin)抗體免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，細(xì)胞漿為棕黃色，胞核不著色，呈陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組細(xì)胞中無(wú)著色，均為陰性，確定該細(xì)胞為皮膚成纖維細(xì)胞。
2.分別用LT、hTERT轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的鑒定方法為1)將傳至第16代的皮膚成纖維細(xì)胞，接種到六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為2×105，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)液換為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液。取50μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，分組加入0.8-1.0μg含有LT cDNA的質(zhì)粒psv3-neo和含有hTERT cDNA的質(zhì)粒pCl-Neo-hTERT，再吸取50μlDMEM培養(yǎng)液，加入脂質(zhì)體1-3μl，室溫孵育5分鐘后.將兩者混合，繼續(xù)孵育20分鐘后直接將混合液加入培養(yǎng)液，輕輕搖勻。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞放入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換為正常培養(yǎng)液，細(xì)胞接近匯合時(shí)，按1∶10密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng).待密度接近50％～70％時(shí)，加0.4g/L的G418進(jìn)行篩選，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。待出現(xiàn)抗性克隆，濾紙法分離細(xì)胞克隆，重新接種培養(yǎng)。分別取轉(zhuǎn)染后第3代和第16代細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
2)EcoRI/PvuII雙酶切質(zhì)粒psv3-neo，EcoRI/SalI雙酶切質(zhì)粒pCl-Neo-hTERT。
酶切反應(yīng)液為脫氧核糖核酸DNA 3μg10倍濃度的酶切緩沖液 2μl內(nèi)切酶I 1μl內(nèi)切酶II 1μl用去離子雙蒸水使總體積達(dá) 20μl將上述酶切后產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳后，分離片段，按照DNA回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行片斷回收，分光光度法測(cè)定回收后DNA的含量。
3)吸出(1-3μg)回收后的DNA在沸水中熱變性10分鐘，放入氯化鈉冰中驟冷，按照DNA回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行片斷的地高辛標(biāo)記，將其作為DNA探針。
4)取出標(biāo)記好的探針離心，推算出標(biāo)記后可能標(biāo)記上的探針量，用雜交液稀釋，使其濃度為1-2μg/ml。分別取轉(zhuǎn)染后第3代和第16代細(xì)胞爬片，滴加探針，進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，觀察LT、hTERT mRNA的表達(dá)情況(正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照)。
5)分別取轉(zhuǎn)染后第3代和第16代細(xì)胞爬片進(jìn)行抗LT或抗hTERT抗體的常規(guī)免疫組織化學(xué)檢測(cè)(染色的同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)。
3.帶有熒光蛋白表達(dá)基因和hTERT cDNA載體pIRES2-EGFP-hTERT的構(gòu)建過程為1)pIRES2-EGFP質(zhì)粒(含有熒光蛋白表達(dá)基因)和PCL-Neo-hTERT質(zhì)粒同時(shí)用EcoRI、SalI內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。
酶切反應(yīng)液為DNA3μg10倍濃度的酶切緩沖液 2μl內(nèi)切酶I1μl內(nèi)切酶II 1μl用去離子雙蒸水使總體積達(dá) 20μl37℃酶切3小時(shí)。
2)將上述酶切后的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，使載體與外源基因片段充分分離；分別切下含有hTERT的長(zhǎng)為3.45kb的目的基因片段和長(zhǎng)為5.3kb的載體片段膠條，用DNA回收試劑盒(上海華舜)進(jìn)行回收。
3)DNA片段連接，其反應(yīng)液為目的基因片段 0.3μg載體DNA0.1μg10倍濃度的連接緩沖液 2μlT4DNA連接酶1μl用去離子雙蒸水使總體積為 20μl16℃水浴反應(yīng)12-16小時(shí)。
4)取DH5α感受態(tài)細(xì)菌融化后，加入連接產(chǎn)物混勻，冰上放置30分鐘，42℃休克90秒；冰上冷卻1-2分鐘；加入450μl預(yù)熱的LB培養(yǎng)液，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至含卡那霉素的瓊脂板上涂勻；待液體被完全吸收后倒置平皿，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。
5)從瓊脂板中挑取單菌落接種與含卡那霉素的培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI、SalI雙酶切，和SalI單酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，分析電泳條帶，確定構(gòu)建成功的載體。
4.LT、hTERT共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞具體過程為取已轉(zhuǎn)染LT的細(xì)胞進(jìn)行pIRES2-EGFP-hTERT的轉(zhuǎn)染(方法同前)，利用熒光顯微鏡分離獲得陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
5.三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞生物學(xué)行為的比較的具體方法為1)以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞倍增次數(shù)(即PD)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(見圖1)。可以看出正常細(xì)胞在接近60PD時(shí)，開始出現(xiàn)增殖緩慢，此后在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，一直處于這種緩慢增殖狀態(tài)；轉(zhuǎn)染LT的細(xì)胞在最初的1-2個(gè)月內(nèi)，迅速擴(kuò)增，其增殖速度是所有細(xì)胞中最快的，但在接近70PD時(shí)，速度急速減慢，處于不增殖狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)量不但沒有增加而且逐漸減少，直到最后死亡；轉(zhuǎn)染hTERT的細(xì)胞雖然在一段時(shí)間內(nèi)保持類似于正常細(xì)胞的增殖速率，與正常組相比，明顯地延長(zhǎng)了細(xì)胞的體外培養(yǎng)壽命，但最終不能逃脫衰老的發(fā)生；只有LT-hTERT組細(xì)胞一直處于旺盛的增殖狀態(tài)，至今細(xì)胞的總代數(shù)已超過50代。
2)收集待檢細(xì)胞，75％的乙醇4℃固定檢測(cè)(每份細(xì)胞數(shù)量為5×105～1×106)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果如下Group G1S G2+MPrI(S+G2+M)P3 N 75 10.814.2 25.0P32 N 80.8 11.87.4 19.2P3 LT 69.9 15.814.3 30.1
P16 LT91.85.8 2.48.2P3 hTERT 74.320.84.925.7P30 hTERT 80.218.21.519.7P30 LT-hTERT 74.815.59.725.2表中，P3 N、P32 N為第3、32代正常細(xì)胞；P3 LT、P16 LT為轉(zhuǎn)染LT后第3、16代細(xì)胞；P3 hTERT、P30 hTERT為轉(zhuǎn)染hTERT后第3、30代細(xì)胞；P30 LT-hTER為共染LT、hTERT后第30代細(xì)胞。表中G1、S、G2、M為細(xì)胞生長(zhǎng)周期的不同階段。
由表中可見，P3 LT組的細(xì)胞增殖指數(shù)最大，而P16 LT組的增殖指數(shù)又變?yōu)樽钚?，其間由大到小依次排列的是P3 hTERT、P30 LT-hTERT和P30 hTERT。這與生長(zhǎng)曲線所反映的趨勢(shì)一致。
3)核型分析 取轉(zhuǎn)染并篩選后的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，于檢測(cè)前一天消化傳代，次日細(xì)胞達(dá)60-80％，進(jìn)行核型分析，結(jié)果表明核型均屬正常。見圖2。
4)致瘤性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM制備成單細(xì)胞懸液。選8只6周左右的裸鼠，兩側(cè)各選一注射點(diǎn)，以107/ml密度的細(xì)胞，注射到裸鼠皮下。舌癌細(xì)胞系T8113作為對(duì)照組。細(xì)胞種入裸鼠皮下2月后，進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照細(xì)胞組裸鼠背部長(zhǎng)出2×2cm大小的腫瘤，而LT組、hTERT組、LT-hTERT均未見腫瘤出現(xiàn)。
5)膠原分泌能力檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞消化計(jì)數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液至同一密度，做細(xì)胞爬片(正常皮膚成纖維細(xì)胞作為對(duì)照)。12小時(shí)后4％多聚甲醛固定，PBS沖洗。細(xì)胞經(jīng)0.3％Triton X-100/PBS、H2O2/PBS處理后，將LT、hTERT、LT-hTERT和正常細(xì)胞分別分為兩組，每組含10個(gè)標(biāo)本。第一組滴加抗I型膠原抗體，第二組滴加抗III型膠原抗體，4℃過夜；37℃復(fù)溫1小時(shí)，滴加生物素化二抗37℃溫育1小時(shí)(上述各步之間均經(jīng)PBS緩沖液充分漂洗)；顯色液(終濃度為0.5g/L DAB)用0.05mol/L Tris-Hcl緩沖液(PH7.6)與DAB和新鮮的H2O2配制，進(jìn)行顯色。(染色的同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)。染色后的標(biāo)本應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)做蛋白灰度值測(cè)定。將測(cè)得數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，四組標(biāo)本之間無(wú)顯著性差異P＞0.05。說(shuō)明轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞其膠原分泌同正常細(xì)胞無(wú)顯著性差別，見圖3。
本實(shí)驗(yàn)中采用較為安全的脂質(zhì)體作為介質(zhì)結(jié)合含有目的基因的質(zhì)粒，針對(duì)SV40T抗原和hTERT cDNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞效果不佳，很難獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代細(xì)胞的情況，在本實(shí)驗(yàn)中采用SV40T抗原和hTERT cDNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染的方法。而且有人用SV40T和hTERT聯(lián)合用于乳房腺上皮細(xì)胞，并有實(shí)驗(yàn)已證明，兩者聯(lián)合轉(zhuǎn)染的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染的效果，間接地證實(shí)了該方法和可行性。為了避免兩種帶有相同篩選基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果(若細(xì)胞只轉(zhuǎn)染了SV40T或只轉(zhuǎn)染了hTERT，都可存在抗藥性而存活)，我們將原有質(zhì)粒的hTERT cDNA接合到新的帶有熒光蛋白表達(dá)基因的載體上，建立了完全不同的篩選系統(tǒng)，達(dá)到SV40T和hTERT cDNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的目的。
本發(fā)明方法建立的細(xì)胞系可在體外長(zhǎng)期傳代，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染LT cDNA或hTERT cDNA的皮膚成纖維細(xì)胞相比，顯著延長(zhǎng)了皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)壽命，目前為止無(wú)衰老表征出現(xiàn)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的蛋白分泌功能與正常細(xì)胞無(wú)明顯差異，其核型和分泌功能類似正常細(xì)胞。與其它方法相比，該方法獲得的細(xì)胞具有與正常細(xì)胞接近的生物學(xué)性狀、核型正常、無(wú)致瘤性，可在體外正常合成分泌I型膠原。本方法獲得的細(xì)胞不僅有助于進(jìn)一步研究細(xì)胞永生化發(fā)生的機(jī)理，而且可以成為解決組織工程中種子細(xì)胞來(lái)源的行之有效的方法。
權(quán)利要求
1.一種使皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法，其特征在于將猿猴病毒40大T抗原LT的互補(bǔ)脫氧核糖核酸cDNA和帶有熒光蛋白表達(dá)基因的人端粒酶催化亞單位hTERT的cDNA，共同轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細(xì)胞，以建立永生化細(xì)胞系，包括以下步驟步驟1培養(yǎng)原代皮膚成纖維細(xì)胞；步驟2分別用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亞單位hTERT轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染后鑒定；步驟3帶有熒光蛋白表達(dá)基因和端粒酶催化亞單位hTERT cDNA的載體pIRES2-EGFP-hTERT的構(gòu)建；步驟4LT、hTERT共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞取已轉(zhuǎn)染LT的細(xì)胞進(jìn)行pIRES2-EGFP-hTERT的轉(zhuǎn)染，利用熒光顯微鏡分離獲得陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟1原代皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的過程為應(yīng)用酶消化法獲取正常人皮膚成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁后呈典型的纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，用抗波形絲蛋白Vimentin抗體免疫組織化學(xué)染色，確定皮膚成纖維細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亞單位hTERT轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的過程為(1)將傳至第16代的皮膚成纖維細(xì)胞，接種含有LT和hTERT的質(zhì)粒，用氨基甙類藥物篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)雙酶切含有LT和hTERT cDNA的質(zhì)粒psv3-neo和pCl-Neo-hTERT；(3)將酶切后所得片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記，將其作為脫氧核糖核酸DNA探針；(4)取標(biāo)記好的探針對(duì)轉(zhuǎn)染后第3代和第16代細(xì)胞進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，解剖顯微鏡下觀察LT、hTERT信使核糖核酸mRNA的表達(dá)情況。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3構(gòu)建的有熒光蛋白表達(dá)基因和端粒酶催化亞單位hTERT cDNA的載體pIRES2-EGFP-hTERT的過程為(1)將pIRES2-EGFP質(zhì)粒和PCL-Neo-hTERT質(zhì)粒同時(shí)用內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；(2)將上述酶切后的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收；(3)將DNA片斷水浴連接；(4)取感受態(tài)細(xì)菌融化后，加入連接產(chǎn)物。進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(5)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和單酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析電泳條帶，確定構(gòu)建成功的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將所述的步驟4已取得的LT和hTERT cDNA共轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)鑒定的方法有(1)以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞倍增次數(shù)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；(2)核型分析取轉(zhuǎn)染并篩選后的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)行核型分析檢測(cè)；(3)取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞注入到裸鼠皮下，進(jìn)行致瘤性檢測(cè)；(4)利用圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行膠原分泌能力檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳工程的細(xì)胞修飾、融合技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種使皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法。特征是選取猿猴病毒40大T抗原LT和人端粒酶催化亞單位hTERT對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合轉(zhuǎn)染，最終得到與正常成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為接近、性狀相對(duì)穩(wěn)定的永生化皮膚成纖維細(xì)胞系。該細(xì)胞的獲得可以使其成為皮膚研究的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞或組織工程皮膚的種子細(xì)胞來(lái)源之一，同時(shí)有助于細(xì)胞永生化研究的深入發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1590539SQ0313454
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者金巖, 王新文 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院