專利名稱：端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程的細(xì)胞修飾領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，具 體涉及一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正常組織來(lái)源的細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下可生長(zhǎng)、分裂，但經(jīng)過(guò)有限次數(shù)的 傳代以后，就會(huì)停止增殖，進(jìn)而衰老和死亡。這樣限制了體外培養(yǎng)細(xì)胞的進(jìn)一步應(yīng)用。為 了給細(xì)胞組織工程提供標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞系，學(xué)者們提出了多種建立永生化細(xì)胞株的方法。所謂 “永生化”(immortalization)，就是指細(xì)胞處于連續(xù)的細(xì)胞周期而終止其發(fā)育進(jìn)程，使細(xì)胞 獲得了無(wú)限的增殖能力。建立永生化細(xì)胞至少具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)可以在體外研究軟骨細(xì) 胞的分化與生長(zhǎng)及增殖之間的關(guān)系。永生化的組織細(xì)胞可以考慮作為組織細(xì)胞工程的細(xì) 胞庫(kù)或基因治療的靶細(xì)胞，前者為組織組織工程提供大量的經(jīng)過(guò)預(yù)先處理和優(yōu)化的組織細(xì) 胞，真正做到“組織工程化”;后者則使基因治療應(yīng)用于組織細(xì)胞成為可能，因?yàn)檎＝M織細(xì) 胞傳代、增殖有限的缺點(diǎn)妨礙了基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)性靶細(xì)胞的挑選、鑒定及回輸。另外可以作為藥 理或毒理研究的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，有利于對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，因?yàn)楦鱾€(gè)實(shí)驗(yàn)室的組織細(xì)胞 來(lái)源不同，培養(yǎng)方法各異，傳代千差萬(wàn)別，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以比較。而采用永生化細(xì)胞使得 實(shí)驗(yàn)采用的組織細(xì)胞保持統(tǒng)一。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞 系(Infinite Cell Line)，也稱連續(xù)細(xì)胞系(Continuous Cell Line)。建立永生化細(xì)胞系 的方法包括腫瘤病毒、原癌基因、P53突變體等轉(zhuǎn)染正常組織細(xì)胞來(lái)構(gòu)建。腫瘤病毒包括腺 病毒、猴腎細(xì)胞病毒、多瘤病毒等。其中猴腎細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染比較常見(jiàn)。猴腎細(xì)胞病毒(simian virus 40，SV40)，于60年代初被發(fā)現(xiàn)并分離，屬多瘤病毒 科，直徑45nm，為20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，殼粒數(shù)目為72，DNA分子量為3400kDa，由5，243 個(gè)堿基對(duì)組成，它由結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3)和兩種腫瘤抗原(大T和小T抗原)組成。 SV40病毒早期轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)化基因(A基因)編碼大T和小T抗原。大T抗原(95kDa)98%定 位于細(xì)胞核內(nèi)，具有ATP酶和DNA解旋酶活性，使蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化、ADP核 糖基化和己?；约盎罨拗骷?xì)胞核糖體基因、誘導(dǎo)DNA合成、修飾蛋白質(zhì)合成起始因 子等作用，為細(xì)胞轉(zhuǎn)化啟動(dòng)所必需，對(duì)轉(zhuǎn)化起決定作用，而且轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型的維持必須有大 T抗原的連續(xù)表達(dá)。小T抗原(20kDa)定位于核內(nèi)及胞質(zhì)內(nèi)，能反式激活RNA多聚酶II和 III基因的啟動(dòng)子，以及c-myc和c-fos癌基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白缺失和細(xì)胞粘附性 下降，它不是細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必需的，但可起加強(qiáng)作用，與大T抗原一道共同維持轉(zhuǎn)化表型。SV40介導(dǎo)的永生化受多種因素影響，涉及到病毒DNA的整合、端粒酶的活化、生長(zhǎng) 抑制因子的失活等多個(gè)方面。研究證實(shí)，SV40的大T抗原能延長(zhǎng)細(xì)胞壽命、使細(xì)胞永生化的 功能與其滅活三種生長(zhǎng)抑制因子_pRB、p53和SEN6的功能有關(guān)。①視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因產(chǎn) 物(product of retinoblastoma gene，pRB)在脫磷酸化時(shí)，借助RB功能區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子E2F 形成穩(wěn)定的復(fù)合物(PRB-E2F)，從而抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞不能進(jìn)入S期。而SV40大T抗原能與脫磷酸化的pRB結(jié)合形成復(fù)合物，而使E2F游離，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。②p53基 因定位于17號(hào)染色體(17pl3. 1)，編碼由393個(gè)氨基酸組成的核磷蛋白，具有轉(zhuǎn)錄因子作 用。正常的P53蛋白(野生型)在細(xì)胞周期Gl期停滯時(shí)，檢查DNA的完整性，并通過(guò)其過(guò) 度表達(dá)使受損細(xì)胞進(jìn)入凋亡，以確保DNA復(fù)制的完整性，避免子細(xì)胞出現(xiàn)DNA丟失。SV40大 T抗原能與p53結(jié)合而滅活其轉(zhuǎn)錄功能，使細(xì)胞避開(kāi)Gl期停滯，進(jìn)入增殖。③6號(hào)染色體長(zhǎng) 臂存在生長(zhǎng)抑制因子SEN6，定位于6q27，它與受體蛋白酪氨酸激酶EphB3相作用，SEN6功 能的丟失將會(huì)導(dǎo)致永生化。SEN6在復(fù)制衰老和永生化中的具體作用尚不清楚，但推測(cè)可能 與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)永生化上調(diào)蛋白-1和永生化上調(diào)蛋白_2與SV40介 導(dǎo)的永生化也密切相關(guān)。RyooZY等將IMUP-I和IMUP-2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到NIH/3T3小鼠成纖 維細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)IMUP-I和IMUP-2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖特性發(fā)生改變，喪失停泊依賴 生長(zhǎng)特性，在裸鼠體內(nèi)浸潤(rùn)生長(zhǎng)并形成腫瘤，表明IMUP-I和IMUP-2的異位過(guò)表達(dá)在轉(zhuǎn)化基 因表型的獲得、體外致瘤性中發(fā)揮重要作用。SV40轉(zhuǎn)染是目前研究AST永生化使用最多的方法。感染人和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞后，病 毒DNA隨機(jī)整合入宿主基因組，其早期區(qū)基因編碼的大T抗原可導(dǎo)致細(xì)胞的永生化，這是建 立永生化細(xì)胞株最常用的方法。SV40能使幾乎任何一種人類細(xì)胞發(fā)生永生化，但其永生化 率非常低。人乳頭瘤病毒(HPV) 16型或18型的E6和E7蛋白已經(jīng)成功的將人的包皮細(xì)胞、 角化上皮細(xì)胞等永生化。其它如腺病毒ElA基因和EB病毒可分別有效永生化大鼠腎細(xì)胞 和人淋巴細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)許多原癌基因可編碼生長(zhǎng)因子等蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。如 myc、c-Jim、C-ras等通過(guò)基因轉(zhuǎn)染可介導(dǎo)目的細(xì)胞的永生化。P53是一種腫瘤抑制因子，而 其突變體則能夠使嚙齒動(dòng)物原代細(xì)胞永生化。以上將細(xì)胞永生化均是通過(guò)把外源性病毒、原癌基因等導(dǎo)入目的細(xì)胞，其整合是 隨機(jī)的，其表達(dá)產(chǎn)物可干擾細(xì)胞內(nèi)生理途徑，發(fā)生非預(yù)期的改變，如失去分化特征和細(xì)胞周 期檢查點(diǎn)的控制。同時(shí)，通過(guò)外源性病毒、原癌基因等轉(zhuǎn)染獲得的是轉(zhuǎn)化細(xì)胞而非正常細(xì) 胞，其表型、核型等可發(fā)生改變，如接觸抑制喪失、多倍體改變等。本發(fā)明從現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行 細(xì)胞永生化時(shí)減少諸如這些表型、核型等的發(fā)生改變、基因隨機(jī)性整合等問(wèn)題出發(fā)得到本 發(fā)明的研究成果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，解決 了現(xiàn)有技術(shù)中構(gòu)建永生化皮膚成纖維細(xì)胞時(shí)存在的基因隨機(jī)性整合、基因產(chǎn)物干擾細(xì)胞內(nèi) 生理途徑等問(wèn)題。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系，發(fā)明目的是提供一種所述的端粒酶永生 化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)傳代培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞；(2)用pCIneo-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常成纖維細(xì)胞；(3)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pCIneo-hTERT質(zhì)粒的人成纖維細(xì)胞陽(yáng)性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。優(yōu)選的，所述步驟(1)中傳代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞是對(duì)人體皮膚采用植塊法進(jìn)行分離皮膚成纖維細(xì)胞。優(yōu)選的，所述步驟(3)中篩選陽(yáng)性克隆是采用G418藥物進(jìn)行篩選。優(yōu)選的，所述步驟(3)中篩選是在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行。優(yōu)選的，所述開(kāi)始篩選時(shí)采用的G418藥物的濃度為400μ g/ml，挑單后維持濃度 為 200 μ g/ml。優(yōu)選的，所述方法還包括對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pCIneo-hTERT質(zhì)粒的人成纖維細(xì)胞陽(yáng)性 克隆的檢測(cè)步驟。優(yōu)選的，所述的檢測(cè)方法是通過(guò)RT-PCR法來(lái)進(jìn)行的；其使用的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA hTERT上下游引物為上游引物5'CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3，；下游引物5，GGATGAAGCGGAGTCTGGA3，；PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 2min ；PCR循環(huán)94°C 30s，53°C 45s, 72°C lmin，共 30 個(gè) 循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。優(yōu)選的，所述檢測(cè)方法中采用的內(nèi)參照GAPDH上下游引物為上游引物5，ACCACAGTCCATGCCATCAC3，；下游引物5，TCCACCACCCTGTTGCTGTA3，。本發(fā)明的又一目的在于提供一種所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系在用 作人類皮膚疾病研究和治療相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人經(jīng)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞缺乏端粒酶導(dǎo)致分裂過(guò)程中端粒長(zhǎng)度不斷丟失是 細(xì)胞衰老的主要機(jī)制之一，而導(dǎo)入外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerase reverse transcriptase, hTERT)基因可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)端粒酶的活性，從而使端粒長(zhǎng)度保持穩(wěn)定，延 長(zhǎng)細(xì)胞生存期和增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力。而且最重要的是，它類似于胚胎干細(xì)胞內(nèi)存在的生理 途徑，因此，hTERT激活端粒酶而誘導(dǎo)細(xì)胞永生化是一種接近生理過(guò)程的途徑，這樣就為獲 得理想的組織工程皮種子細(xì)胞提供了有力保障。本發(fā)明皮膚成纖維細(xì)胞永生化的方法，是選取人端粒酶催化亞單位hTERT對(duì)皮膚 成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，最終得到與正常成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為接近、性狀相對(duì)穩(wěn)定的永生 化皮膚成纖維細(xì)胞系。該細(xì)胞系不僅可以成為細(xì)胞組織工程皮膚的種子細(xì)胞來(lái)源之一，同 時(shí)是一種延長(zhǎng)體外培養(yǎng)細(xì)胞壽命并防止衰老的有效手段。本發(fā)明的構(gòu)建方法通過(guò)將hTERT的真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneo-hTERT轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的 正常人皮膚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后經(jīng)篩選藥物G418進(jìn)行篩選兩周后，挑取陽(yáng)性抗性克隆，用 有限稀釋法將細(xì)胞克隆移至96孔板，待單個(gè)細(xì)胞克隆長(zhǎng)大后擴(kuò)大培養(yǎng)，用多種指標(biāo)檢測(cè)獲 得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的永生化情況得到比較滿意的結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)中已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明技術(shù)方案得到的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系為一種安全、接近生理 過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)的種子細(xì)胞；本發(fā)明技術(shù)方案中構(gòu)建端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的方法 是一種接近生理過(guò)程的途徑，通過(guò)hTERT激活端粒酶而誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，為細(xì)胞組織工程 提供一種安全、接近生理過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)的種子細(xì)胞，解決了目前技術(shù)中存在的基因隨機(jī)性整 合、基因產(chǎn)物干擾細(xì)胞內(nèi)生理途徑等問(wèn)題。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為本發(fā)明實(shí)施例組織塊法原代培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞；其中普通光鏡X 100 ；圖2為本發(fā)明實(shí)施例穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT質(zhì)粒的人成纖維細(xì)胞圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例端粒酶活性檢測(cè)圖；其中1為Hela細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)(陽(yáng) 性對(duì)照)；2為第5代穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT質(zhì)粒的人成纖維細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)；3為第 5代未轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)；圖4為本發(fā)明實(shí)施例瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中hTERT表達(dá)；其中M為 DL2000 Marker，分子量從小到大依次為100，250，500，750，1000，2000bp ；圖5為本發(fā)明實(shí)施例第80代經(jīng)轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞；圖6為本發(fā)明實(shí)施例第40代未經(jīng)轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞；圖7為本發(fā)明實(shí)施例第80代經(jīng)轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞核型分析；圖8為本發(fā)明實(shí)施例Hela細(xì)胞的軟瓊脂培養(yǎng)(陽(yáng)性對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做 進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建人皮膚成纖維細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)手術(shù)切取患者腹部皮膚(其它手術(shù)部位皮膚也可滿足條件)，置于含有10萬(wàn)u/ L氨芐青霉素和100mg/L硫酸鏈霉素的含0. 05%吐溫-20的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS) 中，反復(fù)漂洗3-5次后，直到漂洗液清亮透明為止。剪棄表皮，脂肪和結(jié)締組織后，再將皮膚 盡量剪碎，越小越好，用PBS沖洗剪刀上的組織塊。用彎頭吸管將組織塊在瓶底均勻擺置， 每小塊間距5mm左右。組織塊放置好后，向瓶?jī)?nèi)滴入少許培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶慢慢平放入37°C 培養(yǎng)箱中，靜止培養(yǎng)，動(dòng)作要輕柔以免影響細(xì)胞貼壁。前3天內(nèi)盡量減少觀察次數(shù)或不做觀 察，以免影響組織貼壁以至培養(yǎng)失敗。約一周左右組織塊周圍有成纖維細(xì)胞游離出，初次傳 代前不必勤換培養(yǎng)液，有代謝產(chǎn)物嚴(yán)重時(shí)才需更換培養(yǎng)液。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞 生長(zhǎng)狀況。直到成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底并能順利穿代者視為培養(yǎng)成功；圖1為組織塊法原代 培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞。正常人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT質(zhì)粒和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陽(yáng)性克隆的挑選擴(kuò)增并提取pCIneo-hTERT質(zhì)粒。將培養(yǎng)的第3代人皮膚成纖維細(xì)胞接種入6孔 板，按Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)以1 10比例進(jìn)行傳 代，48小時(shí)后加入400 μ g/ml篩選藥物G418進(jìn)行篩選。待對(duì)照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡后， 將濃度減半為200 μ g/ml繼續(xù)維持篩選，直至出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞克隆，用有限稀釋法將細(xì)胞克 隆移至96孔板，待單個(gè)細(xì)胞克隆長(zhǎng)大后擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)施例2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞系的檢測(cè)和確證研究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)檢測(cè)顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞能穩(wěn)定地表達(dá)端粒酶活性，反映端粒酶陽(yáng)性的以6堿基間距逐級(jí)遞增的特征性梯度條帶，最小堿基片段為50bp、其次為56、62及68片段。細(xì) 胞傳代超過(guò)80代后，檢測(cè)端粒酶活性，同樣可見(jiàn)特征性條帶出現(xiàn)。RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞hTERT的表達(dá)提取第5代未轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞、第5代轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞和HeLa細(xì) 胞的總RNA，HeLa細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA hTERT上游引物5' CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3，，下游引物5，GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3，，PCR 產(chǎn)物大小為 145bp。內(nèi)參照 GAPDH 上游引物5，ACCACAGTCCATGCCATCAC 3，，下游引物5，TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，， PCR 產(chǎn)物 452bp。PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 2min ；PCR 循環(huán)94°C 30s, 53°C 45s, 72°C lmin, 共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。細(xì)胞形態(tài)觀察未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)楸馄綘?，胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多顆粒。 而轉(zhuǎn)染細(xì)胞則一直呈長(zhǎng)梭形，胞漿內(nèi)很少見(jiàn)顆粒。細(xì)胞倍增時(shí)間測(cè)定經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，傳代次數(shù)已經(jīng)超過(guò)80代，細(xì)胞的倍增時(shí)間約為3天，未出現(xiàn)細(xì)胞生 長(zhǎng)停滯現(xiàn)象。而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞在培養(yǎng)至30代左右即出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞傳代時(shí)間明顯延 長(zhǎng)，約2周傳代一次。細(xì)胞衰老檢測(cè)半乳糖甘酶活性檢測(cè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞傳代至第25代就開(kāi)始出現(xiàn) β -半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞，至30 40代，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)80% 90%，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代至80 代后很少有半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞。染色體核型分析取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第30代轉(zhuǎn)染毛乳頭細(xì)胞，加入終濃度為0. 4g/ml的秋水仙 素，37培養(yǎng)4h，收集細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、制片后行Giemsa染色，油鏡觀察?，F(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞已傳 代至80代，其細(xì)胞核型顯示，共23對(duì)染色體，仍為2倍體細(xì)胞，染色體結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，未見(jiàn) 斷裂、異位和缺失等。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的懸浮生長(zhǎng)能力。首先在24孔板中制備0. 5% 瓊脂培養(yǎng)基的底層凝膠，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代未轉(zhuǎn)染毛乳頭細(xì)胞、第30代轉(zhuǎn)染毛乳 頭細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，按照500個(gè)/孔的密度制備0. 3 %瓊脂培養(yǎng)基作為上 層凝膠，培養(yǎng)2 3周，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成情況。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染培養(yǎng)90代細(xì)胞經(jīng)3周培養(yǎng)后均不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)，而Hela 細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞株)則可經(jīng)3周培養(yǎng)后在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)形成較大的細(xì)胞克隆。上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是 能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精 神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110> 柯明哲<120>端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法<130>
7[0069<160>4[0070<210>1[0071<211>20[0072<212>DNA[0073<213>[0074<400>1[0075CGGAAGAGTG[0076<210>2[0077<211>19[0078<212>DNA[0079<213>[0080<400>2[0081GGATGAAGCG[0082<210>3[0083<211>20[0084<212>DNA[0085<213>[0086<400>3[0087ACCACAGTCC[0088<210>4[0089<211>20[0090<212>DNA[0091<213>[0092<400>4[0093TCCACCACCC
說(shuō)明書
6/6頁(yè)
TCTGGAGCAA
20
GAGTCTGGA
19
ATGCCATCAC
20
TGTTGCTGTA
20
權(quán)利要求
一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)傳代培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞；(2)用pCIneo hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常成纖維細(xì)胞；(3)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pCIneo hTERT質(zhì)粒的人成纖維細(xì)胞陽(yáng)性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟(1)中傳代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞是對(duì)人體皮膚采用植塊法進(jìn)行分離皮膚成纖 維細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟(3)中篩選陽(yáng)性克隆是采用G418藥物進(jìn)行篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟(3)中篩選是在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于 所述開(kāi)始篩選時(shí)采用的G418藥物的濃度為400 μ g/ml，挑單后維持濃度為200μ g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于 所述方法還包括對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pCIneo-hTERT質(zhì)粒的人成纖維細(xì)胞陽(yáng)性克隆的檢測(cè)步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于 所述的檢測(cè)方法是通過(guò)RT-PCR法來(lái)進(jìn)行的；其使用的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA hTERT上下游 引物為上游引物5' CGGAAGAGT GTCTGGAGCAA 3’ ；下游引物5，GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3，；PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 2min ；PCR 循環(huán)94°C 30s, 53°C 45s, 72°C lmin，共 30 個(gè)循 環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于 所述檢測(cè)方法中采用的內(nèi)參照GAPDH上下游引物為上游引物5' ACCACAGTCCATGCCATCAC 3'；下游引物5’ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，。
9.一種權(quán)利要求1所述的端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系在用作人類皮膚疾病研 究和治療相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種端粒酶永生化的皮膚成纖維細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，屬于遺傳工程的細(xì)胞修飾領(lǐng)域，該方法包括傳代培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞；用pCIneo-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常成纖維細(xì)胞；篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pCIneo-hTERT質(zhì)粒的人成纖維細(xì)胞陽(yáng)性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。該方法為細(xì)胞組織工程提供一種安全、接近生理過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)的種子細(xì)胞，解決了現(xiàn)有方法中基因隨機(jī)性整合、基因產(chǎn)物干擾細(xì)胞內(nèi)生理途徑等問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101921729SQ20101010927
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日
發(fā)明者柯明哲 申請(qǐng)人:柯明哲