專利名稱：豬瘟病毒感染性cDNA載體的制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種豬瘟病毒感染性cDNA載體的制備方法，載體表達產(chǎn)生的病毒以及其在豬瘟病毒的鑒別診斷和疫苗研究中的應用。
背景技術(shù)：
豬瘟是豬的一種最重要的急性、接觸性傳染病，死亡率高達90％以上。國際獸疫局制定的《國際動物衛(wèi)生法典》中，豬瘟被列入16種法定傳染病之一。我國是豬瘟的高發(fā)國，豬瘟頻繁的爆發(fā)流行給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了我國畜牧業(yè)的發(fā)展和出口貿(mào)易。
豬瘟在世界范圍內(nèi)廣泛流行，南美、歐洲和遠東的一些國家和地區(qū)尤為嚴重。豬瘟流行的特點是具有高度接觸傳染性，流行廣泛，發(fā)病率、死亡率高，危害極大。豬體間的直接接觸是CSFV傳播的重要途徑，病豬的遷移、豬肉和豬肉制品的流通以及人群活動可能是導致豬瘟大面積流行的重要原因。此外，CSFV可在野豬和山羊中傳播，吸血節(jié)肢動物在一定條件下也會傳播CSFV。50年代我國研制出的豬瘟兔化弱毒疫苗應用后，豬瘟在全球的急性發(fā)生和大流行得到了有效的控制。但上世紀70年代后期，我國豬瘟的流行又重新抬頭，并在形式上發(fā)生了很大的變化(Artois et al，2002)從頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)為無規(guī)律的散發(fā)流行，流行速度緩慢，疫點顯著減少，病程由急性轉(zhuǎn)為慢性，臨床癥狀由典型變?yōu)榉堑湫?，病原毒力降低，出現(xiàn)持續(xù)感染、胎盤感染、母豬繁殖障礙等(Elber et al，1999；Carrascol et al，2001；Gomez-villamandos et al，2003)。增加免疫劑量和免疫次數(shù)，也不能控制豬瘟的發(fā)生，而且呈蔓延的趨勢。因此，研制新一代疫苗已成當務之急。
自豬瘟發(fā)生后，人們一直在尋找其致病機制，但直到現(xiàn)在關(guān)于豬瘟病毒致病機制的研究仍進展緩慢，其原因很大一部分歸因于缺少合適的細胞研究模型，而缺少細胞研究模型的直接原因則是由于豬瘟病毒進行離體細胞培養(yǎng)時一般不產(chǎn)生致細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)。最近國外從自然界中分離到3株致細胞病變型(cp型)CSFV毒株。已有研究表明，cp型瘟病毒其實是一對病毒的混合物，由非致細胞病變(ncp型)的野生病毒與干擾缺損顆粒組成，其中干擾缺損顆粒具有典型的亞基因組結(jié)構(gòu)，缺失了從Npro到NS2的整個編碼區(qū)域，實驗證明這樣的DI顆粒能引起宿主細胞產(chǎn)生CPE的特性是可以遺傳的。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，野生型CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2和NS3以二聯(lián)體形式存在，而在干擾顆粒中，NS2基因連同上游的全部編碼區(qū)被缺失，二聯(lián)體變成NS3單體，故認為致細胞病變型豬瘟病毒NS3蛋白單體的過量表達是細胞產(chǎn)生CPE的標志。
為了構(gòu)建新一代豬瘟疫苗，張楚瑜等在完成了具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的三株病毒即豬瘟病毒標準強毒石門株，兔化弱毒疫苗株(C strain)和低毒株39基因組全序列后，又成功構(gòu)建了豬瘟病毒標準強毒石門株的全基因組感染性cDNA克隆(吳海祥，張楚瑜等，2003年4月 科學通報第8期)，但是這種全基因組感染性cDNA克隆表達產(chǎn)生的是干擾缺損顆粒，這種干擾缺損顆粒并不能單獨引起實驗動物產(chǎn)生病變，并引起動物產(chǎn)生免疫反應，它必須要有輔助病毒才能致細胞病變。更重要的是，它不能直接作滅活病毒疫苗應用，也不能作減毒疫苗應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人工構(gòu)建的表達缺陷型豬瘟病毒的載體，該載體能復制，表達和裝配成缺失NS2基因的缺陷型豬瘟病毒。表達產(chǎn)生的病毒能在無其他任何輔助病毒的情況下產(chǎn)生致細胞病變，并能由感然細胞釋放子代缺陷型豬瘟病毒作疫苗使用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種缺失NS2基因的缺陷型豬瘟病毒。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種由缺失NS2基因的缺陷型豬瘟病毒在制備豬瘟病毒疫苗或豬瘟病毒檢測試劑盒中的應用。
一種表達豬瘟病毒標準強毒石門株的載體，該載體含有T7啟動子和豬瘟病毒標準強毒石門株基因組的cDNA，其特征是，在T7啟動子下游的cDNA中，缺失NS2基因中的1260個堿基對，僅保留5’端第3752堿基對至PshAI位點第3881堿基對之間130bp的NS2基因片段，其余cDNA序列與石門株感染性克隆cDNA相同，該cDNA具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，將cDNA片段插入到質(zhì)粒載體pBR322的SalI和EcoRI雙酶切位點之間而獲得。該載體由下列方法制備A)構(gòu)建豬瘟病毒標準強毒石門株的有感染性全長基因組克隆，分別得到克隆質(zhì)粒pGEM70-1，pBlue12-4，pBR456-6；B)PCR擴增豬瘟病毒標準強毒石門株NS3基因；C)酶切pBlue12-4，去除大部分NS2基因片段，并同B中產(chǎn)物同框融合，得到重組質(zhì)粒pD8-8；D酶切pGEM70-1并連接至pD8-8中，獲得缺失NS2基因的重組質(zhì)粒p5D8-1；E)將p5D8-1中的5’大片段與pBR456-6中完整的基因組3’大片段連接，連接產(chǎn)物克隆至pBR322載體中，轉(zhuǎn)化E.coli DH10B，提取質(zhì)粒pSMD8-6，形成表達缺陷型豬瘟病毒的載體。
本發(fā)明進一步公開了該載體在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的病毒，在轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的是缺失NS2基因的缺陷型豬瘟病毒。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，表達載體由下列方法制備A)構(gòu)建野毒株的有感染性基因組克隆，分別得到重組質(zhì)粒pGEM70-1，pBlue12-4，pBR456-6；B)PCR法擴增NS3基因，用BamHI對PCR產(chǎn)物進行酶切消化，酶切產(chǎn)物在37℃反應3小時后，用苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提純化，并對回收的酶切產(chǎn)物進行磷酸化處理，反應結(jié)束后回收并純化出NS3基因片段。
C)對pBlue12-4先進行BamHI酶切反應，純化出酶切產(chǎn)物后繼續(xù)用PshAI對線性化質(zhì)粒進行第二次酶切，去除PshAI位點后面大部分NS2基因片段，僅保留其5’端(3752nt)-PshAI位點(3881nt)之間130bp的小片段。PshAI的切點同C中PCR擴增所得到的NS3基因磷酸化的5’平末端同框融合，二者在共有的BamHI粘性末端環(huán)化，得到NS2基因大部分缺失的重組質(zhì)粒pD8-8。
D)將cDNA0片段重組質(zhì)粒pGEM70-1利用SalI和ClaI進行雙酶切消化，在瓊脂糖凝膠中回收cDNA插入片段，并連接至重組質(zhì)粒pD8-8的SalI和ClaI之間，獲得缺失NS2基因的5’大片段重組質(zhì)粒p5D8-1。
E)將p5D8-1攜帶缺失突變的5’大片段用SalI和BamHI雙酶切的方法分離出來，與pBR456-6中完整的基因組3’大片段在BamHI位點連接，然后將連接產(chǎn)物克隆到經(jīng)SalI和EcoRI雙酶切處理的pBR322載體中，連接產(chǎn)物以常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coli DH10B，利用載體上的Ampicillin抗性標記篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒pSMD8-6，得到了表達缺陷型豬瘟病毒的載體CCTCC M203072.
在本發(fā)明中，將載體轉(zhuǎn)染入宿主細胞采用常規(guī)的脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染法。在一個具體的實施例中，采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體試劑，將pSMD8-6，CCTCCM203072轉(zhuǎn)染PK15細胞系，培養(yǎng)液是含10％胎牛血清無雙抗的DMEM。轉(zhuǎn)染按Lipofectamine2000操作說明書進行，轉(zhuǎn)染6小時后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含1％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有107pfu vTF7-1，ATCC No.VR-2153。病毒感染2小時后，除去病毒上清液，加入細胞培養(yǎng)基，細胞在含10％胎牛血清的DMEM中進行培養(yǎng)。經(jīng)72小時的溫育后，收集細胞培養(yǎng)上清液即為含有缺陷型豬瘟病毒的液體。
在本發(fā)明中，收集病毒采用常用的方法，如反復凍融，差速離心等。
本發(fā)明還提供了一種由載體表達產(chǎn)生的缺陷型豬瘟病毒，該載體進行體外轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)染PK-15細胞，傳代后電鏡觀察到成熟的病毒粒子，感染非免疫豬，證實有致病性。該病毒能在無其他任何輔助病毒的情況下產(chǎn)生致細胞病變現(xiàn)象，并能由感染細胞釋放子代缺陷性豬瘟病毒。由本發(fā)明產(chǎn)生的缺陷型豬瘟病毒可制備成豬瘟病毒疫苗，也可制備成豬瘟病毒檢測試劑盒。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點①在本發(fā)明提供的表達載體基礎上，在基因組操作水平上，可對其中任意一段序列進行結(jié)構(gòu)分析，開發(fā)出診斷或鑒別診斷試劑；②表達載體因在基因組操作水平缺失毒力基因，表達產(chǎn)生的病毒可研制基因缺失疫苗；③表達載體因在基因操作水平上缺失非必須基因后，加上多聚接頭，可構(gòu)建雙價或多價基因工程疫苗；④在本發(fā)明提供的表達載體基礎上，在基因操作水平上，在闡明在某一段RNA序列或基因功能后，就可開發(fā)阻斷病毒復制的藥物。


圖1基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建示意2基因組7個cDNA片段重組質(zhì)粒PCR鑒定1.pGEMT6-1；2-3.pGEMT5-1；4-5.pGEMT4-15；6.PCRmarker；7.pGEMT3-1；8.pGEMT2-4；9-10.pGEMT1-a；11-12.pGEMT70-1
圖3全基因組cDNA克隆質(zhì)粒pT7SM PCR擴增鑒定圖1.95-348nt，254bp；2.517-911nt，395bp；3.2422-2599nt，178bp；4.4848-5088nt，241bp；5.6524-7228nt，705bp；6.10915-11340nt，426bp；7.12108-12290nt，183bp；8.DL2000 marker.
圖4全基因組cDNA克隆質(zhì)粒pT7SM酶切鑒定圖1.λ/H marker；2.pT7SM/BamHI 16038bp；3.pT7SM/KpnI 7074+8964bp；4.pT7SM/HindIII6017+5062+4456+503bp.
圖5缺失NS2基因的克隆質(zhì)粒pSMD8的圖譜圖6克隆質(zhì)粒pSMD8的酶切鑒定圖譜1.pT7SM/BamHI 16038bp；2.pSMD8/BamHI 14778bp；3.pSMD8/HindIII6017+5062+3196+503bp；4.λ/H marker.圖7克隆質(zhì)粒pSMD8的PCR擴增鑒定圖1.1-348nt，348bp；2.95-911nt，817bp；3.517-1735nt，1218bp；4.4265-5088nt，0bp；5.3350-5671nt，1062bp；6.11678-12298nt，620bp；7.DL2000 marker.
圖8缺陷型病毒vSMD8特意性片斷的RT-PCR檢測圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例。進一步闡述本發(fā)明，應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南等書中所述的條件，或接照制造廠商所建議的條件。
實施例1 豬瘟病毒全基因的克隆及表達載體的構(gòu)建①將生理鹽水10倍稀釋豬瘟病毒Shimen株凍干毒(由北京中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)，耳靜脈接種2月齡非免疫豬(由湖北省畜牧獸醫(yī)研究所提供)。接毒24h后豬體溫達40℃，出現(xiàn)豬瘟臨床癥狀，第7天體溫由42℃轉(zhuǎn)而下降時，立即前腔靜脈采血，加EDTA抗凝作為實驗材料。
②用Promega公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒從抗凝全血分離總RNA。在Shimen株病毒已測全基因組序列的基礎上，設計7對引物，利用RT-PCR的方法分相互重疊的7個片段擴增出全基因組cDNA，設計引物時在5’UTR上游添加SalI位點和T7啟動子序列，在3’UTR的下游添加SacII基因組線性化位點和EcoRI克隆位點，以便于全基因組克隆和在體內(nèi)進行的轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄酶采用M-MLV(Promega)；PCR采用Expand高保真系統(tǒng)(Roche)，擴增產(chǎn)物在3’端有一個突出的A，經(jīng)純化后用TA法克隆至pGEM-T(Promega)中。
③各片段PCR產(chǎn)物篩選出陽性克隆經(jīng)測序驗證后用于連接基因組全長cDNA。以基因組中部的BamHI單一酶切位點為界，全基因組分成5’和3’半分子，兩部分單獨進行連接。連接過程中所得的每一個片斷都進行鑒定，5’和3’半分子在BamHI位點相連并克隆至低拷貝pBR322質(zhì)粒的SacI和EcoRI位點之間，獲得全基因組cDNA克隆pT7SM。
實施例2 豬瘟病毒全基因組表達載體的確認全基因組克隆質(zhì)粒pT7SM的鑒定采用PCR擴增和酶切鑒定同時進行。PCR鑒定選用基因組上隨機分布的7對引物，對全基因組的酶切簽定選用BamHI、KpnI和HindIII三種限制性內(nèi)切酶。
實施例3 表達載體缺陷型豬瘟病毒載體的制備在獲得豬瘟病毒全基因克隆的基礎上構(gòu)建缺失NS2基因的缺陷性豬瘟病毒①NS3基因的擴增。在豬瘟病毒基因組中，NS2基因與NS3基因緊密相連，對NS2基因的缺失首先采用了PCR方法，擴增下游的NS3基因，再在NS2基因上游P7基因的后面用酶切方法將NS2基因切除，并將NS3基因同框融合到P7的下游。NS3基因擴增時，將上游引物NS3(+)與cDNA3的下游引物P3D配對(如圖所示)，以質(zhì)粒pGEMT3-1為模板，使用Pfu DNA聚合酶，進行PCR擴增，目標產(chǎn)物在3’端包含了基因組中部的單一酶切位點BamHI。Pfu PCR反應體系在冰浴中配制，pGEMT3-1質(zhì)粒100倍稀釋溶液1ul作為擴增模板，在50ul反應體系中加入0.85ul Pfu DNA聚合酶，延伸時間2min，運行33個循環(huán)后擴增結(jié)束。目標產(chǎn)物5’平末端起始于NS3基因第一個三聯(lián)體密碼子的第二個堿基。
②NS3基因3’端的BamHI酶切反應。PCR擴增的NS3基因產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢查，將符合預期大小的特異性DNA條帶用手術(shù)刀切下，用NucleoTrap凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。約1.5ug PCR產(chǎn)物在50ul體系中用BamHI進行酶切消化，便于下一步將NS3基因克隆到載體中。酶切產(chǎn)物在37℃反應3小時后，用苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提純化，為在NS3基因5’端的磷酸化提供模板。
③NS3基因5’端的磷酸化。PCR擴增的NS3基因在5’平末端為-OH基團，為了能夠與載體進行有效的連接，5’平末端必須為磷酸基團，為此對上一步回收的酶切產(chǎn)物進行了磷酸化處理，反應按照前述程序在T4多聚核苷酸激酶介導下進行，反應結(jié)束后同樣用Nucleo Trap凝膠回收試劑盒純化出NS3基因片段。
④pBlue12-4質(zhì)粒的雙酶切反應。取cDNA1與cDNA2連接產(chǎn)物的克隆質(zhì)粒pBlue12-4首先進行BamHI酶切反應，反應結(jié)束后進行酶切產(chǎn)物純化，并繼續(xù)用切點位于基因組3881nt位置的PshAI位點對線性化質(zhì)粒進行第二次酶切 在pBlue12-4中去除PshAI位點后面全部的NS2基因片段，僅保留其5’端(3752nt)-PshAI位點(3881nt)之間130bp的小片段，該片段編碼NS2蛋白N端43個氨基酸，并多出第44個三聯(lián)密碼子的第一個核苷酸A。pBlue12-4質(zhì)粒在PshAI位點消化得到的是平末端，而且PshAI的切點位于NS2基因第44個三聯(lián)密碼子的第一個核苷酸A后面，正好可以同上述PCR擴增所得到的NS3基因磷酸化的5’平末端同框融合(NS3基因5’端第1個三聯(lián)密碼子少一個核苷酸G)，然后二者在共有的BamHI粘性末端環(huán)化，得到NS2基因大部分缺失的重組質(zhì)粒，缺失片段從NS2基因3882nt位置開始，到NS3基因5’端第一個核苷酸5141nt位置止，長度為1260bp，屬于同框缺失。pBlue12-4的雙酶切反應參照前述進行，BamHI酶切酶切后對酶切產(chǎn)物進行純化，繼續(xù)用PshAI酶切，產(chǎn)物用凝膠電泳分離出載體片段，后者與已處理好的NS3基因進行同框融合。連接反應體系于16℃反應過夜，進行兩個平末端的連接。次日將反應管移至4℃下繼續(xù)連接16h。所得連接產(chǎn)物用大腸桿菌DH5a轉(zhuǎn)化、篩選，獲得重組質(zhì)粒pD8-8。
⑤在pD8-8中插入cDNA0。所獲得的pD8-8重組質(zhì)粒攜帶了cDNA1片段、NS2基因已缺失1260bp的cDNA2以及與其同框融合的NS3基因5’端部分片段，不包含cDNA0片段。將cDNA0片段重組質(zhì)粒pGEM70-1利用SalI和ClaI進行雙酶切消化，在瓊脂糖凝膠中回收cDNA插入片段，并連接至重組質(zhì)粒pD8-8SalI和ClaI之間，獲得缺失NS2基因的5’大片段重組質(zhì)粒p5D8-1(如圖所示)。
⑥缺陷性病毒亞基因組cDNA的連接。將p5D8-1攜帶缺失突變的5’大片段用SalI和BamHI雙酶切的方法分離出來，與前述的pBR456-6中完整的基因組3’大片段在BamHI位點連接，然后將連接產(chǎn)物克隆到經(jīng)SalI和EcoRI雙酶切處理的pBR322載體中(如圖所示)，連接產(chǎn)物以常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coli DH10B，利用載體上的Ampicillin抗性標記篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒pSMD8-6(簡稱pSMD8)。該表達載體于2003年9月30日送交國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的，位于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCC-M203072。
實施例4 缺陷型豬瘟病毒的制備用質(zhì)粒pSMD8-6轉(zhuǎn)染PK-15和PK-15/SM兩種宿主細胞，均出現(xiàn)了典型的致細胞病變效應。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學<120>豬瘟病毒感染性cDNA克隆載體，產(chǎn)生的病毒及其應用<130>豬瘟病毒感染性cDNA克隆載體，產(chǎn)生的病毒及其應用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>11038<212>DNA<213>豬瘟病毒<400>1gtatacgagg ttagttcatt ctcgtatgca tgattggaca aaacaaaatt tcaatttggt 60tcagggcctc cctccagcga cggccgaact gggctagcca tgcccatagt aggactagca 120aacggaggga ctagccgtag tggcgagctc cctgggtggt ctaagtcctg agtacaggac 180agtcgtcagt agttcgacgt gagcagaagc ccacctcgag atgctatgtg gacgagggca 240tgcccaagac acaccttaac cctagcgggg gtcgctaggg tgaaatcaca ccacgtgatg 300ggagcacgac ctgatagggc gctgcagagg cccactatta ggctagtata aaaatctctg 360ctgttcatgg cacatggagt tgaatcattt tgaactttta tacagaacaa acaaacaaaa 420accaatggga gtggaggaac cggtatacga tgccacgggg aggccattgt ttggagaccc 480gagtgaggta cacccacaat caacactgaa gctaccacat gataggggga gaggtaacat 540caaaacaaca ctgaataacc tacctaggaa aggagactgc aggagtggca accatctagg 600cccggttagc gggatatatg taaagcccgg ccctgtcttt tatcaggact acatgggccc 660ggtctaccat agggcccctc tagagttttt caatgagacg cagttttgtg aggtgaccaa 720aaggataggt agggtgacag gtagtgacgg aaagctttac catatatatg tgtgcatcga 780tggttgcata ctgctgaagc tagccaagag aggcgagcca agaaccctga agtggattag 840aaatttcacc gactgtccat tgtgggttac cagttgctct gatgatggcg caagtggaag 900taaagagaag aagccagata ggatcaacaa gggtaaatta aaaatagccc caaaagagca 960tgagaaggac agcagaacta agccacccga cgctacgatt gtagtggaag gagtaaaata 1020ccaggtcaaa aagaaaggta aagttaaagg aaagaatacc caagacggcc tgtaccacaa 1080caagaataaa ccaccagaat ctaggaagaa attagaaaaa gccctattgg catgggcggt 1140aataacaatt atgttgtatc aaccagttga agccgaaaat ataactcaat ggaacctgag 1200cgataacggc actaatggta ttcagcatgc tatgtacctt agaggggtta gtagaagctt 1260gcatgggatc tggccggaaa aaatatgcaa aggagtcccc acctacctgg ccacagacac 1320ggaactgaaa gaaatacagg gaatgatgga tgccagcgag gggacaaact atacgtgctg 1380taagttacag agacatgaat ggaacaaaca tggatggtgt aactggtaca atatagaccc 1440atggatacag ctgatgaata gaacccaagc aaacttggca gaaggccctc cggccaagga 1500gtgcgctgtg acttgcaggt acgataaaga tgccgacatc aacgtggtca cccaggccag 1560aaacaggcca acaaccctga ccggctgtaa gaaaggaaaa aatttttctt ttgtgggtac 1620aattatagag ggcccatgta atttcaatgt ttccgtggag gatatcttgt acggggatca 1680tgagtgcggc agtttgctcc aggacacggc tctgtaccta gtagatggaa tgaccaacac 1740tatagagaat gccagacagg gagcagccag ggtaacatct tggctcggga ggcaactcag 1800cactgccggg aagaggttgg agggtagaag caaaacctgg tttggtgcct atgccctatc 1860accttactgt aatgtaacga gcaaaatagg gtacatatgg tatactaaca actgcacccc 1920
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權(quán)利要求
1.一種豬瘟病毒感染性cDNA載體的制備方法，該載體含有T7啟動子和豬瘟病毒標準強毒石門株基因組的cDNA，其特征是，在T7啟動子下游的cDNA中，缺失NS2基因中的1260個堿基對，保留5’端第3752堿基對至PshAI位點第3881堿基對之間130bp的NS2基因片段，其余cDNA序列與石門株感染性克隆cDNA相同，該cDNA具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列且位于到質(zhì)粒載體pBR322的SalI和EcoRI雙酶切位點之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒感染性cDNA載體的制備方法，其特征是該載體為CCTCC M203072。
3.一種權(quán)利要求1所述的載體在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的缺失NS2基因的缺陷型豬瘟病毒。
4.一種權(quán)利要求2所述的載體在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的缺失NS2基因的缺陷型豬瘟病毒。
5.權(quán)利要求3或4中任何一種病毒在制備豬瘟病毒疫苗或豬瘟病毒檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬瘟病毒感染性cDNA載體的制備方法和應用，該載體含有T7啟動子和豬瘟病毒標準強毒石門株基因組的cDNA，在T7啟動子下游的cDNA中，缺失NS2基因中的1260個堿基對，保留5’端第3752堿基對至PshAI位點第3881堿基對之間130bp的NS2基因片段，其余cDNA序列與石門株感染性克隆cDNA相同。本發(fā)明方法簡單，操作方便，可構(gòu)建雙價或多價基因工程疫苗，適合豬瘟病毒的鑒別診斷和疫苗的研究中的應用。
文檔編號C12N7/01GK1603418SQ03134959
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者張楚瑜, 吳海祥, 鄭從義, 屈三甫 申請人:武漢大學