專利名稱：一種蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一種細(xì)胞模型及其應(yīng)用，特別是涉及蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默癥(Alzheimer’s Disease，AD)、亨廷頓舞蹈綜合癥(Huntington’s disease，HD)、帕金森運(yùn)動(dòng)綜合癥(Parkinson’s disease，PD)、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(amyotrophiclateral sclerosis，ALS)等蛋白構(gòu)象病是一類嚴(yán)重影響人類生命健康的疾病，這類疾病的一個(gè)共同特征是存在關(guān)鍵蛋白分子如AD中的Aβ42、HD中的不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n等的不正確折疊與聚集沉淀。蛋白折疊狀態(tài)是一種非直觀的、無(wú)法高通量鑒定的指標(biāo)，為了對(duì)其方便、快捷、高效分析，必須將它轉(zhuǎn)化為一種可直觀分析的指標(biāo)如抗性選擇、顏色指示等。
目前針對(duì)以上蛋白構(gòu)象病，雖然存在各自獨(dú)特的各種各樣的細(xì)胞甚至動(dòng)物模型(Holcomb L，Gordon MN，McGowan E，et al.Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic micecarrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 transgenes.NatureMed，1998，497-100；Davies SW，Turmaine M，Cozens BA，et al.Formation of neuronalintranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic forthe HD mutation，Cell 1997，90537-548)，但缺乏一種適用以上所有蛋白構(gòu)象病的一種共同的細(xì)胞模型。此外，由于AD等蛋白構(gòu)象病通常都是一種多因素、退行性疾病，并且涉及到一些主觀性很強(qiáng)的癥狀，因此就象腫瘤、心血管疾病一樣，一種真正意義上的“精確”、“完善”的動(dòng)物模型幾乎是不可能的，相反針對(duì)主要病理特征分子如Aβ42肽聚集沉淀的一種通用細(xì)胞模型的建立，對(duì)于AD等蛋白構(gòu)象病的致病機(jī)理的研究、防治藥物的篩選與設(shè)計(jì)，具有重要意義。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種建立在大腸桿菌中的研究蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子折疊規(guī)律以及適合防治藥物高通量篩選的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型。
本發(fā)明所提供的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型，是含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的大腸桿菌，所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT和β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-片段雙報(bào)導(dǎo)基因，且所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因或β-半乳糖苷酶Lac-Z基因α-片段的上游框內(nèi)融合有不同蛋白構(gòu)象病相關(guān)靶蛋白分子及其衍生物的編碼基因。
在實(shí)際操作中，所述大腸桿菌可為大腸桿菌DH5α、DH5αMCR、JM109、JM109(DE3)或HB101等菌株。
氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因(GenBank accession numberE15555)或β-半乳糖苷酶Lac-Z基因的α-片段(Ullmann A，Jacob F，Monod J，Characterization by in vitrocomplementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of thebeta-galactosidase structural gene of Escherichia coli.J Mol Biol.1967，24(2)339-43)的上游框內(nèi)融合有阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白分子Aβ42或其衍生物的編碼基因；也可融合有亨廷頓舞蹈癥關(guān)鍵分子不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，其中，n可為7-103的正整數(shù)，如Poly(Q)10的編碼基因(CAG/A)10。其中阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白分子是Aβ42，其編碼基因序列(GenBank accession numberBC004369)，亨廷頓舞蹈癥關(guān)鍵分子是不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，其編碼基因序列見(jiàn)(GenBank accession numberL12392)。
本發(fā)明的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型可應(yīng)用于研究蛋白構(gòu)象病，如阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈癥、鐮刀形紅細(xì)胞性貧血病、瘋牛病、羊瘙癢病、傳染性瘋貂癥、人類的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、新型變種CJD(vCJD)、格斯特曼綜合癥(GSS)、致死性家族嗜睡癥(FFI)、庫(kù)魯病(Kulu)、抑絲酶(serpins)異常相關(guān)疾病(如神經(jīng)抑絲酶包含體家族性腦病(FENIB))等病癥的致病機(jī)理。
本發(fā)明的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型也可用于篩選防治蛋白構(gòu)象病藥物，如篩選蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子的聚集抑制劑、可溶性突變體、生物活性多肽和小分子化合物等，特別是阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白分子Aβ42聚集仰制劑、阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白分子Aβ42的可溶性突變體、亨廷頓舞蹈癥關(guān)鍵分子不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n聚集仰制劑、Poly(Q)n的可溶性突變體、抑制Aβ42聚集的生物活性多肽和小分子化合物和抑制Poly(Q)n聚集的生物活性多肽和小分子化合物。
蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型的原理如圖1所示在CAT或Lac-Z的α-小片段的N-端融合一段外源蛋白，如果融合蛋白保持可溶狀態(tài)，不會(huì)影響CAT或Lac-Z的α-小片段的活性即氯霉素抗性或α互補(bǔ)，而一種新生肽鏈的正確折疊，其N-端具有至關(guān)重要的作用。在目的蛋白-CAT或目的蛋白-Lac-Z的α-小片段融合蛋白中，如果N-端目的蛋白能正確折疊，勢(shì)必會(huì)帶動(dòng)CAT或Lac-Z的α-小片段正確折疊表現(xiàn)為氯霉素抗性或α互補(bǔ)，反之，如果N-端不能正確折疊而是形成包含體則表現(xiàn)為氯霉素敏感或不能進(jìn)行α互補(bǔ)。這樣，根據(jù)氯霉素抗性或α互補(bǔ)的出現(xiàn)與否，即可對(duì)目的蛋白折疊狀態(tài)進(jìn)行指示，并據(jù)此對(duì)目的蛋白的折疊規(guī)律進(jìn)行研究。
如果目的蛋白是不同蛋白構(gòu)象病的關(guān)鍵蛋白分子如Aβ42或Poly(Q)n及其衍生物等，利用不同形式Aβ42-CAT或Poly(Q)n-CAT或Aβ42-α-小片段融合蛋白或Poly(Q)n-α-小片段融合蛋白中Aβ42或Poly(Q)n的折疊狀態(tài)與報(bào)告基因功能之間的相關(guān)性，即可建立AD、HD蛋白構(gòu)象病的細(xì)胞模型，并可利用上述模型進(jìn)行AD、HD等致病機(jī)理的研究和防治藥物的高通量篩選。
本發(fā)明利用蛋白折疊(可溶性)的遺傳篩選模型(趙志虎，劉萱，張經(jīng)余等，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2001，25264)，通過(guò)不同蛋白構(gòu)象病的關(guān)鍵蛋白分子與雙報(bào)導(dǎo)基因的融合表達(dá)及其可溶性與報(bào)導(dǎo)基因功能相關(guān)性的分析，建立了一種蛋白構(gòu)象病的細(xì)胞模型。利用該模型，可以對(duì)蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子的折疊規(guī)律及影響因素如氨基酸、分子伴侶與折疊輔助物(Partner)、pH、溫度等單獨(dú)或同時(shí)在胞內(nèi)進(jìn)行研究，可以進(jìn)行阻止相關(guān)蛋白分子聚集沉淀的胞內(nèi)特異性結(jié)合蛋白、生物活性多肽(Aptamer)、小分子藥物的高通量篩選，具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值。此外，整個(gè)過(guò)程無(wú)需復(fù)雜儀器、昂貴試劑，對(duì)目的蛋白的結(jié)構(gòu)也無(wú)須詳盡了解，具有更加簡(jiǎn)便快捷、高效通用、可定性定量分析的特點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型的原理2A為報(bào)告質(zhì)粒pCAR圖譜圖2B為報(bào)告質(zhì)粒pCAR的多克隆位點(diǎn)表達(dá)區(qū)域示意3為報(bào)告質(zhì)粒pCAR的酶切、PCR鑒定電泳4為報(bào)告質(zhì)粒pCAR的序列測(cè)定圖譜圖5為pWn-CAR的酶切鑒定電泳6為pMn-CAR的酶切鑒定電泳7為pQn-CAR的酶切鑒定電泳8為pQ16-CAR的序列測(cè)定9為含有不同質(zhì)粒pWn-CAR的大腸桿菌JM109表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE10為含有不同質(zhì)粒pMn-CAR的大腸桿菌JM109表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE11為含有不同質(zhì)粒pQn-CAR的大腸桿菌JM109表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE12為含有不同質(zhì)粒大腸桿菌JM109的α-互補(bǔ)試驗(yàn)具體實(shí)施方式
在下面的實(shí)施例中，所涉及的材料與方法如下pET-22b(+)購(gòu)自Invitro公司，pMal-p2X購(gòu)自New England Biolab公司；克隆有APP基因的質(zhì)粒pGEM-2(Koo EH，Sisodia SS，Cork LC et al.Differential expression of amyloidprecursor protein mRNAs in cases of Alzheimer’s disease and in aged nonhuman primates，Neuron.1990，4(1)97-104)，含有不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n的質(zhì)粒pQ103、pQ46(Krobitsch S，Lindquist，S.Aggregation of huntingtin in yeast varies with the lengthof the polyglutamine expansion and the expression of chaperone proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，971589-1594)。工具酶、常用生化試劑等為Biolab、Promega等公司及國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，1992)。
實(shí)施例1、報(bào)告質(zhì)粒pCAR以及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pCAT的構(gòu)建1、報(bào)告質(zhì)粒pCAR的構(gòu)建(1)含有CAT報(bào)告基因的序列盒的PCR擴(kuò)增與克隆以含有CAT基因的質(zhì)粒pGVtac99(Robben J，Massie G，Bosmans E et al，An Escherichiacoli plasmid vector system that facilitates high level expression and purificationof heterologous peptides by fusion to active chloramphenicol acetyltransferase.Gene，1993，126109-113)為模板，通過(guò)引物P1和P2(序列如下)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，得到預(yù)期大小的特異性擴(kuò)增條帶。Kpn I和Hind III消化PCR產(chǎn)物，純化回收目的條帶。
以上述回收片段為模板，以P3和P2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有CAT報(bào)告基因的完整序列盒的DNA片段。
P15’-AAGGTACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACATGGAGAAA-3’(SEQ ID№1)P25’-CCAAGCTTGCCTGCAGGTCGACTCATTACGCCCCGCCCTGCCA-3’(SEQ ID №2)P35’-GGCATATGGTGTAACTGAGTAGGTACCGGTAGCGC-3’(SEQ ID №3)P45’-GGGAATTCATATGGAGAAAAAAATCACTGG-3’(SEQ ID №4)。
(2)報(bào)告質(zhì)粒pCAR的構(gòu)建步驟(1)中獲得的CAT報(bào)告基因的完整序列盒的DNA片段經(jīng)Nde I和Hind III酶切、回收，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理并回收的pMal-p2X連接、轉(zhuǎn)化；然后經(jīng)KpnI和HindIII酶切鑒定、序列測(cè)定，結(jié)果如圖3和圖4所示， (請(qǐng)確認(rèn)圖4)表明得到與預(yù)期結(jié)果完全一致的報(bào)告質(zhì)粒pCAR。圖3中，1表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；2表示pCAR經(jīng)KpnI和HindIII酶切；3表示pCAT經(jīng)KpnI和HindIII酶切；4表示pCAR的FCR；5表示pCAT的PCR。
2、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pCAT的構(gòu)建以P4和P2為引物，以質(zhì)粒pUC-CAT為模板，PCR擴(kuò)增獲得含有起始密碼前沒(méi)有終止密碼和柔性Linker的單一CAT的DNA片斷，Nde I、Hind III酶切、回收，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理并回收的pMal-p2X連接、轉(zhuǎn)化；經(jīng)酶切鑒定、序列測(cè)定，得到與預(yù)期結(jié)果完全一致的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pCAT(如圖3)。此質(zhì)粒用于單一CAT的表達(dá)，確定最高氯霉素的抗性和氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，作為陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)施例2、一種蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型是含有報(bào)告質(zhì)粒pCAR的E coli DH5α。
以質(zhì)粒pMal-p2X為框架，通過(guò)在Nde I、Hind III位點(diǎn)之間插入含有終止密碼、柔性Linker和CAT的序列盒，構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pCAR。如圖2A和2B所示，Nde I、Kpn I位點(diǎn)用于目的基因，如不同形式的Aβ42基因的插入；Nde I、Kpn I之間的三個(gè)不同閱讀框架的終止密碼可防止空白報(bào)告質(zhì)粒發(fā)生CAT或β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片段的表達(dá)導(dǎo)致背景“噪聲”的出現(xiàn)；KpnI、第一個(gè)Sal I之間為一段13個(gè)氨基酸的柔性Linker，可以防止目的蛋白與報(bào)告基因CAT、β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片段之間出現(xiàn)空間位阻現(xiàn)象以致報(bào)告基因失效；CAT上下游的各一個(gè)Sal I位點(diǎn)，便于CAT基因的酶切去除，以利第二個(gè)報(bào)告基因β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片段發(fā)揮作用。
實(shí)施例3、蛋白構(gòu)象病AD、HD細(xì)胞模型的建立1、各種重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)含有不同拷貝的野生型Aβ42的質(zhì)粒pWn-CAR的構(gòu)建以含有淀粉樣蛋白前體蛋白APP695序列的質(zhì)粒pGEM-2(Koo EH，Sisodia SS，Cork LC etal.Differential expression of amyloid precursor protein mRNAs in cases of Alzheimer’sdisease and in aged nonhuman primates，Neuron.1990，497-104)為模板，以P5、P6為引物(序列如下)，PCR擴(kuò)增得到約130bp的DNA條帶。目的條帶經(jīng)Nde I、Kpn I酶切回收后，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理的pCAR的連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)NdeI和HindIII酶切鑒定、序列測(cè)定的結(jié)果如圖5中泳道1-4所示，表明得到含有一個(gè)拷貝的野生型Aβ42的正確克隆pW-CAR。圖5中，1表示pW-CAR；2表示pW-CAR/NdeI+HindIII；3表示pW-CAR/NdeI+KpnI；4，8，9，13表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；5表示pW2-CAR；6表示pW2-CAR/NdeI+HindIII；7表示pW2-CAR/NdeI+KpnI；10表示pW3-CAR/NdeI+KpnI；11表示pW3-CAR/NdeI+HindIII；12表示pW3-CAR；14表示pW4-CAR/NdeI+KpnI；15表示pW4-CAR/NdeI+HindIII；16表示pW4-CAR。
以P7、P8為引物，以pW-CAR為模板，PCR擴(kuò)增得到目的片段，目的片段經(jīng)Nde I、EcoRI酶切，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理過(guò)的質(zhì)粒pW-CAR連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)NdeI和HindIII酶切鑒定、序列測(cè)定的結(jié)果如圖5中泳道5-8所示，表明得到前后串聯(lián)含有兩個(gè)拷貝Aβ42的質(zhì)粒pW2-CAR。
以P5、P6為引物，以pW2-CAR為模板，PCR擴(kuò)增。由于模板pW2-CAR中存在兩個(gè)拷貝的Aβ42，發(fā)生126bp的移位后一條DNA鏈的第二個(gè)拷貝序列與另一條鏈的第一個(gè)拷貝序列仍能完全互補(bǔ)，因此擴(kuò)增中可以產(chǎn)生串聯(lián)三次、四次甚至更多次的多拷貝Aβ42的片斷。
PCR反應(yīng)后，回收350bp和500bp左右的目的條帶。目的條帶經(jīng)Nde I、Kpn I酶切回收后，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理的pCAR的連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)NdeI和HindIII酶切鑒定、序列測(cè)定的結(jié)果如圖5中泳道9-16所示，表明得到含有三個(gè)、四個(gè)拷貝的野生型Aβ42的正確克隆pW3-CAR(圖5，泳道9-12)、pW4-CAR(圖5，泳道13-16)。
引物P5-P8的序列如下，在引物P7中，通過(guò)同義突變，去除了EcoR I位點(diǎn)。
P55’-GGCATATGGATGCAGAATTCCGACATGAC-3’(SEQ ID №5)P65’-AAGGTACCCGCTATGACAACACCGCCCAC-3’(SEQ ID №6)
P75’-GGCATATGGATGCAGAGTTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTC-3’(SEQ ID №7)P85’-CCGAATTCTGCATCCGCTATGACAACACCGCCCATG-3’(SEQ ID №8)。
(2)含有不同拷貝的突變型mAβ42(F19P)的質(zhì)粒pMn-CAR的構(gòu)建Aβ42第19位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)楦彼?Pro)，可以破壞β-折疊的形成，使Aβ42可溶性大大提高(Wood SJ，Wetzel R， Martin JD et al，Prolines and amyloidogenicityin fragments of the Alzheimer’s peptide Aβ42.Biochemistry，1995，34724-730)。因此，可用來(lái)作為該驗(yàn)證細(xì)胞模型是否有效的陽(yáng)性參照。
以pW-CAR為模板，以P9、P10為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥漳康钠瑪?，經(jīng)EcoR I、Kpn I酶切后，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理的pW-CAR連接、轉(zhuǎn)化，酶切鑒定、序列測(cè)定的結(jié)果如圖6中泳道1-3所示，表明得到含有突變mAβ42(F19P)的質(zhì)粒pM-CAR。圖6中，1表示pM-CAR/NdeI+HindIII；2表示pM-CAR/NdeI+KpnI；3，6，9表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；4表示pM2-CAR/NdeI+HindIII；5表示pM2-CAR/NdeI+KpnI；7表示pM2-CAR；8表示pABPW-CAR；10表示pABPW-CAR/NdeI+KpnI；11表示pABPW-CAR/NdeI+KpnI。
以pM-CAR為模板，以P5-P8為引物，采取與步驟1中完全相同的策略進(jìn)行pM2-CAR的制備，并擴(kuò)增、回收目的片斷，經(jīng)EcoR I、Kpn I酶切后，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理的pM2-CAR連接、轉(zhuǎn)化，酶切鑒定、序列測(cè)定的結(jié)果如圖6中泳道4-7所示，表明得到含有2個(gè)不同拷貝串聯(lián)重復(fù)突變mAβ42(F19P)的質(zhì)粒pM2-CAR。
引物P9、P10序列如下，其中在引物P9中將Phe的密碼子(TTC)轉(zhuǎn)換為Pro的密碼子(CCG)，引入三個(gè)堿基的突變。
P95’-CCGAATTCCGACATGACTCAGGATACGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGCCGTTTGCAGAAGATGTGGGTTC-3’(SEQ ID №9)P105’-AAGGTACCCGCTATGACAACACGCCCCAC-3’(SEQ ID №10)。
(3)含有Aβ42結(jié)合肽ABP的質(zhì)粒pABPW-CAR的構(gòu)建Aβ42的異常折疊及其聚集導(dǎo)致淀粉樣蛋白沉淀斑、老年斑的出現(xiàn)，在整個(gè)AD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此，有人推測(cè)，如果引入一個(gè)短肽，使之能與Aβ42中影響折疊的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸相結(jié)合，貝可以阻止Aβ42的異常折疊，提供AD預(yù)防與治療的一種新途徑(Soto C，Sigurdsson EM，Morelli L，et al.β-sheet breaker peptides inhibit fibrillogenesisin a rat brain model of amyloidosisImplications for Alzheimer’s therapy.NatureMed.1998，4822-826)。Aβ42 N端第17-20位氨基酸對(duì)于整個(gè)多肽形成β-折疊以及最終是否能產(chǎn)生淀粉樣纖絲非常關(guān)鍵的。因此，可以將該區(qū)域的氨基酸序列通過(guò)與同源短肽結(jié)合加以封閉，從而阻止其折疊?；谝陨犀F(xiàn)象，以這段關(guān)鍵性的氨基酸序列(LVFF)(Wood SJ，Wetzel R，Martin JD et al.Prolines and amyloidogenicity in fragments of theAlzheimer’s peptide Aβ42，Biochemistry，1995，34724-730)為模板，并將其中的纈氨酸用脯氨酸(P)來(lái)取代，以增強(qiáng)其破壞β-折疊的能力，同時(shí)在短肽的末端添加一個(gè)帶電荷的天冬氨酸(D)，以減少結(jié)合物的疏水相互作用，增強(qiáng)可溶性，設(shè)計(jì)序列為L(zhǎng)PFFD短肽，命名為ABP。為考察Aβ42結(jié)合肽ABP對(duì)Aβ42的助溶效果，通過(guò)PCR將ABP克隆到Aβ42的上游。
以P11、P6為引物，以pW-CAR為模板，PCR擴(kuò)增得到目的條帶。回收目的片斷，經(jīng)Nde I、Kpn I有限酶切后，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理的pCAR連接、轉(zhuǎn)化，酶切鑒定、序列測(cè)定的結(jié)果如圖6中泳道8-11所示，表明得到含有Aβ42結(jié)合肽ABP的質(zhì)粒pABPW-CAR。P11的序列如下P115’-GGCATATGCTGCCGTTCTTCGATGCAGAATTCCGATGAC-3’(SEQ ID №11)。
(4)含有不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n的質(zhì)粒pQn-CAR的構(gòu)建谷氨酰胺的異常重復(fù)可以影響亨廷頓舞蹈癥等多種相關(guān)疾病，而典型的CAG(編碼谷氨酰胺)重復(fù)疾病的拷貝數(shù)一般來(lái)說(shuō)大于40，所以以40為分界線構(gòu)建了不同長(zhǎng)度的克隆。
以質(zhì)粒pQ103、pQ46((Krobitsch S，Lindquist，S.Agregation of huntingtin in yeastvaries with the length of the polyglutamine expansion and the expression of chaperoneproteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，971589-1594)為模板，以P12、P13為引物，PCR擴(kuò)增，分別回收大小約300、130bp片斷，經(jīng)NdeI、KpnI酶切回收后，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理的pCAR連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶切鑒定、序列測(cè)定的結(jié)果如圖7中泳道2-7所示，表明得到含有97個(gè)谷氨酰胺的克隆pQ97-CAR(圖7，泳道2-4)、pQ46-CAR(圖7，泳道5-7)。圖7中，1，8，11表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；2表示pQ97-CAR/NdeI+HindIII；3表示pQ97-NdeI+KpnI；4表示pQ97-CAR；5表示pQ46-CAR；6表示pQ46-CAR/NdeI+KpnI；7表示pQ46-CAR/NdeI+HindIII；9表示pQ37-CAR/NdeI+HindIII；10表示pQ37-CAR/NdeI+KpnI。
由于pQ103是以CAACAGCAGCAACAGCAA為單位的多個(gè)重復(fù)組成，如果上游引物固定(P12)，下游引物(P14)只包含上述一個(gè)重復(fù)單位和KpnI酶切位點(diǎn)，以pQ103為模板，以P12、P14為引物，在PCR過(guò)程中，下游引物P14就有可能隨機(jī)與模板在不同位置進(jìn)行配對(duì)，最終形成不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物，稱為Q-pool或Q-smear，回收Q-pool，酶切、連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)酶切、序列測(cè)定的結(jié)果如圖7中泳道9-10和圖8所示，表明分別得到含有37、16個(gè)谷氨酰胺的質(zhì)粒pQ37-CAR(圖7，泳道9-10)和pQ16-CAR(圖8)。引物P12-P14序列如下P125’-GGCATATGTCCCTCAAAAGCTTCCAACAG-3’ (SEQ ID №12)P135’-AAGGTACCGCTAGCGCTGAATTCAGGTGGTGGCGGTTGTTGCTG-3’(SEQ ID №13)P145’-AAGGTACCTTGTTGCTGTTGCTGCTG-3’(SEQ ID №14)。
2、不同克隆的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白在胞內(nèi)的存在形式將步驟1中各重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM 109，挑取單菌落，活化，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)后，離心收集菌體，超聲破菌后離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9和圖10所示，表明正如預(yù)期一樣，不同拷貝的野生型Aβ42在生理狀態(tài)下，會(huì)聚集沉淀，而pW1-4-CAR的表達(dá)產(chǎn)物也主要存在于包含體中；可溶性突變體mAβ42(F19P)應(yīng)不會(huì)聚集沉淀，而pM1-2-CAR的表達(dá)產(chǎn)物也在上清中占優(yōu)勢(shì)；根據(jù)設(shè)計(jì)，ABP應(yīng)阻止Aβ42的聚集沉淀，同樣pABPW-CAR表達(dá)量很高，并且出現(xiàn)在上清中，以上結(jié)果表明不同形式Aβ42與報(bào)導(dǎo)基因融合，在大腸桿菌中的折疊狀態(tài)(可溶與否)與其生理?xiàng)l件下在體內(nèi)的存在形式完全一致。圖9中，1表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2表示pW1-CAR超聲破碎沉淀；3表示pW1-CAR超聲破碎上清；4表示pW2-CAR超聲破碎上清；5表示pW2-CAR超聲破碎沉淀；6表示pW3-CAR超聲破碎上清；7表示pW3-CAR超聲破碎沉淀；8表示pW4-CAR超聲破碎沉淀；9表示pW4-CAR超聲破碎上清；箭頭所指為目的條帶。圖10中，1表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2表示pM1-CAR超聲破碎沉淀；3表示pM1-CAR超聲破碎上清；4表示pM2-CAR超聲破碎上清；5表示pM2-CAR超聲破碎沉淀；6表示pABPW-CAR超聲破碎上清；7表示pABPW-CAR超聲破碎沉淀；箭頭所指為目的條帶。
同樣，對(duì)于不同長(zhǎng)度的多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，結(jié)果如圖11所示，表明小于40個(gè)多聚谷氨酰胺在適當(dāng)?shù)木惺且钥扇艿男问酱嬖?，而大?0個(gè)的在適當(dāng)?shù)乃拗髦姓且圆蝗艿陌w形式出現(xiàn)的，這與生理?xiàng)l件下，含不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺的亨廷頓蛋白Ht在胞內(nèi)的存在狀態(tài)完全一致。圖11中，1，4，10表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2表示pQ16-CAR超聲破碎上清；3表示pQ16-CAR超聲破碎沉淀；5表示pQ37-CAR超聲破碎沉淀；6表示pQ37-CAR超聲破碎上清；7表示pQ46-CAR全菌；8表示pQ46-CAR超聲破碎上清；9表示pQ46-CAR超聲破碎沉淀；11表示pQ97-CAR全菌；12表示pQ97-CAR超聲破碎上清。
3、不同克隆的氯霉素抗性測(cè)定將步驟1中各重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，挑取單克隆菌落，接入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)，過(guò)夜活化。次日，按1.5％接入同樣抗性培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)左右，當(dāng)OD600達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(200mg/L)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)約1小時(shí)，以誘導(dǎo)CAT融合蛋白表達(dá)，然后涂固體平板培養(yǎng)基，按0.1％在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素、IPTG及不同濃度的氯霉素，過(guò)夜培養(yǎng)16小時(shí)，觀察不同重組菌在不同的氯霉素濃度中的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如表1，表明不同拷貝野生型(Aβ42)n(n＝1，2，3，4)在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，只有微弱的氯霉素抗性(100，50，50，＜50μg/ml)，相反可溶性突變體(mAβ42)1-2以及含有結(jié)合肽的Aβ42則表現(xiàn)明顯的氯霉素抗性(350、＞750、＞750μg/ml)，以上結(jié)果與步驟2中不同形式Aβ42在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的分布情況(上清或沉淀)對(duì)照發(fā)現(xiàn)可正確折疊(可溶)的突變體Aβ42，與報(bào)告基因氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶CAT融合后，仍能正確折疊，并呈明較高的氯霉素抗性；相反，不能正確折疊的Aβ42，與CAT融合后，仍然沉淀聚集，對(duì)應(yīng)的氯霉素抗性也低。同樣，對(duì)于不同長(zhǎng)度的多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。
以上結(jié)果表明報(bào)告基因CAT的活性指標(biāo)之一氯霉素抗性的確可以反映不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的折疊狀態(tài)(可溶與否)，可以用于定性分析。
4、不同克隆的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT的活性測(cè)定為對(duì)不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在胞內(nèi)的存在形式進(jìn)行定量分析，參考文獻(xiàn)(顏?zhàn)臃f，王海林，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，1998，508-509)，采用有機(jī)溶劑抽提法對(duì)含有不同質(zhì)粒的細(xì)菌在IPTG誘導(dǎo)后的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT的活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表1所示，表1中組別5-9表明不同形式的Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，凡是預(yù)期可溶的，則具有較高的CAT活性；表1中組別1-4，10，11表明預(yù)期不溶的，則只有微弱的CAT活性。證實(shí)利用報(bào)導(dǎo)基因CAT的活性可以對(duì)不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的折疊狀態(tài)(可溶與否)進(jìn)行定量分析。
步驟2、3和4的結(jié)果初步表明以CAT作為報(bào)導(dǎo)基因，通過(guò)目的蛋白與其框內(nèi)融合，CAT的活性以真實(shí)反映不同蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在生理?xiàng)l件下的存在形式，并可利用CAT的活性進(jìn)行定性(氯霉素抗性高低)、定量分析(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性大小)，說(shuō)明建立了蛋白構(gòu)象病AD、HD的細(xì)胞模型，并可利用上述模型有效模擬蛋白構(gòu)象病的關(guān)鍵病理特征。
5、α互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證該細(xì)胞模型對(duì)于體內(nèi)淀粉樣蛋白多肽存在形式的模擬，利用載體攜帶的β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行了α互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。
所構(gòu)建的pCAR系列載體，可以編碼的Lac-Z的α小片段，雖然單獨(dú)表達(dá)無(wú)酶活性，但在適當(dāng)?shù)乃拗魅鏙M109、DH5α等中，可以與宿主編碼的片段實(shí)現(xiàn)α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生LacZ+細(xì)菌易于識(shí)別。它們?cè)谏孜颴-gal存在下形成藍(lán)斑。由此推出，如果目的片段可溶，則形成藍(lán)色菌落；若目的片段形成包含體，則α-片段無(wú)可溶性，形成白色菌斑。
用Sal I限制性內(nèi)切酶消化步驟1中構(gòu)建的各重組質(zhì)粒，將CAT基因切掉，以避免它影響后面的α-片段的表達(dá)。然后，加入T4連接酶，連接過(guò)夜。涂板轉(zhuǎn)化到宿主菌E coli DH 5α，培養(yǎng)后挑取轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆作α-互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果如圖12所示，表明含有質(zhì)粒pABPW/M1/M2-CAR的細(xì)胞顯示藍(lán)色，可以進(jìn)行α互補(bǔ)；相反，含有質(zhì)粒pWn-CAR的菌落則顯示白色，無(wú)法進(jìn)行有效的α互補(bǔ)。與步驟2、3對(duì)照，說(shuō)明以Lac-Z的α小片段為報(bào)導(dǎo)基因，利用α互補(bǔ)現(xiàn)象，也可以對(duì)不同蛋白構(gòu)象病的關(guān)鍵蛋白分子如不同形式Aβ42的折疊狀態(tài)進(jìn)行定性分析，并真實(shí)模擬這些關(guān)鍵蛋白分子在生理?xiàng)l件下的存在形式。
6、β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)參考文獻(xiàn)(顏?zhàn)臃f，王海林，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，1998，508-509)，對(duì)含有不同質(zhì)粒的細(xì)菌在IPTG誘導(dǎo)后的β-半乳糖苷酶的活性進(jìn)行測(cè)定，以定量分析誘導(dǎo)表達(dá)后不同蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子如Aβ42等在胞內(nèi)的折疊狀態(tài)。結(jié)果如表1所示，表明不同形式的Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，凡是預(yù)期可溶的，則具有較高的β-半乳糖苷酶活性(表表1、含有不同形式Aβ42表達(dá)質(zhì)粒的氯霉素Cm抗性、CAT活性、β-半乳糖苷酶活性測(cè)定

注*表示三次試驗(yàn)的結(jié)果1，組別5-9)；預(yù)期不溶的，則只有微弱的β-半乳糖苷酶活性(表1，組別1-4，10，11)。證實(shí)利用報(bào)導(dǎo)基因β-半乳糖苷酶的活性可以對(duì)不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的折疊狀態(tài)(可溶與否)進(jìn)行定量分析。
步驟2、5、6的結(jié)果初步表明以β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片斷作為報(bào)導(dǎo)基因，通過(guò)目的蛋白與其框內(nèi)融合，CAT的活性可以真實(shí)反映不同蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在生理?xiàng)l件下的存在形式，并可利用Lac-Z的活性進(jìn)行定性(α互補(bǔ))、定量分析(Lac-Z活性大小)。
序列表<160>14<210>1<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aaggtaccgg tagcgcgggc agtgctgcgg gttctggcgg tgtcgacatg gagaaa56<210>2<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ccaagcttgc ctgcaggtcg actcattacg ccccgccctg cca 43<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ggcatatggt gtaactgagt aggtaccggt agcgc35<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gggaattcat atggagaaaa aaatcactgg 30<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ggcatatgga tgcagaattc cgacatgac 29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6aaggtacccg ctatgacaac accgcccac 29<210>7<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7ggcatatgga tgcagagttc cgacatgact caggatatga agttc45<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8ccgaattctg catccgctat gacaacaccg cccaccatg 39<210>9<211>73<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9ccgaattccg acatgactca ggatacgaag ttcatcatca aaaattggtg ccgttgcag60aagatgtggg ttc 73<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10aaggtacccg ctatgacaac accgcccac 29<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11ggcatatgct gccgttcttc gacgatgcag aattccgaca tgac44<210>12<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12ggcatatgtc cctcaaaagc ttccaacag 29<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13aaggtaccgc tagcgctgaa ttcaggtggt ggcggttgtt gctg 44<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14aaggtacctt gttgctgttg ctgctg 2權(quán)利要求
1.一種蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型，是含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的大腸桿菌，所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT和β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-片段雙報(bào)導(dǎo)基因，且所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因或β-半乳糖苷酶Lac-Z基因的α-片段的上游框內(nèi)融合有不同蛋白構(gòu)象病相關(guān)靶蛋白分子及其衍生物的編碼基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌DH5α、DH5αMCR、JM109、JM109(DE3)或HB101。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型，其特征在于所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因或β-半乳糖苷酶Lac-Z的基因的α-片段上游框內(nèi)融合有阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白分子Aβ42或其衍生物的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型，其特征在于所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因或β-半乳糖苷酶Lac-Z的基因的α-片段上游框內(nèi)融合有亨廷頓舞蹈癥關(guān)鍵分子不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n的編碼基因。
5.權(quán)利要求1所述的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型在蛋白構(gòu)象病的致病機(jī)理和蛋白構(gòu)象病防治藥物篩選中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型在篩選蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子的聚集抑制劑、可溶性突變體、生物活性多肽或小分子化合物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型在阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈癥、鐮刀形紅細(xì)胞性貧血病、瘋牛病、羊瘙癢病、傳染性瘋貂癥、人類的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、新型變種CJD(vCJD)、格斯特曼綜合癥(GSS)、致死性家族嗜睡癥(FFI)、庫(kù)魯病(Kulu)或抑絲酶(serpins)異常相關(guān)疾病的致病機(jī)理和防治藥物篩選中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型在篩選阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白分子Aβ42聚集抑制劑、阿爾茨海默癥關(guān)鍵蛋白分子Aβ42的可溶性突變體、亨廷頓舞蹈癥關(guān)鍵分子不同長(zhǎng)度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n聚集抑制劑、Poly(Q)n的可溶性突變體中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述Aβ42聚集抑制劑和Poly(Q)n聚集抑制劑分別為抑制Aβ42聚集的生物活性多肽和小分子化合物和抑制Poly(Q)n聚集的生物活性多肽和小分子化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型及其應(yīng)用。其目的是提供一種建立在大腸桿菌中的研究蛋白構(gòu)象病關(guān)鍵蛋白分子折疊規(guī)律以及適合防治藥物高通量篩選的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型。本發(fā)明所提供的蛋白構(gòu)象病細(xì)胞模型是含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的大腸桿菌，所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT和β－半乳糖苷酶Lac－Z的α－片段雙報(bào)導(dǎo)基因，且所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因或β－半乳糖苷酶Lac－Z基因的α－片段上游框內(nèi)融合有不同蛋白構(gòu)象病相關(guān)靶蛋白分子及其衍生物的編碼基因。本發(fā)明將在蛋白構(gòu)象病的致病機(jī)理研究、防治藥物的高通量篩選等方面得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1594552SQ03156600
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2003年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日
發(fā)明者趙志虎, 朱晨燕, 張經(jīng)余, 馬清鈞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所