專利名稱：光敏芳香雜環(huán)化合物高效快速降解基因組dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用光敏芳香雜環(huán)化合物切斷劑將大分子核酸非特異性地降解成小片段的方法。
背景技術(shù)：
核酸大分子非特異性地降解或分解成合適的片段在許多領(lǐng)域都是非常重要的。這些領(lǐng)域包括1)DNA序列分析；2)DNA足跡技術(shù)；3)從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)或酶的分離純化過程；4)其他需要將大分子核酸降解的領(lǐng)域。
1)DNA序列分析對(duì)于大分子核酸如基因組的DNA測(cè)序，鑒于每一個(gè)測(cè)序反應(yīng)對(duì)DNA的長(zhǎng)度有限制，一般需要先將大片段的DNA降解成較小的片段。常規(guī)方法是用核酸酶處理，或者超聲波打段核酸片段之后電泳分離。核酸酶價(jià)格昂貴，在測(cè)序之前需要徹底去除；而超聲波法間歇性高頻率打斷核酸大分子的操作過程不易控制，因此合適的降解核酸的方法仍值得探索。
2)DNA足跡技術(shù)DNA足跡技術(shù)主要用于檢測(cè)和鑒定轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA的序列特異性結(jié)合能力，如果同時(shí)進(jìn)行DNA化學(xué)測(cè)序，即可判斷出結(jié)合區(qū)的精確順序。該技術(shù)仍然是目前最常用的研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的最常用方法。通常，未與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA都是用DNaseI來解降，但是核酸酶往往分子尺寸太大而不能獲得高的分辨率(Nature，1988，332(6165)663)，因此研究開發(fā)一類小分子DNA切割劑替代大分子核酸酶將十分有意義(Chinese Science Bulletin，2000，45(2)2017-2028)。
3)蛋白質(zhì)或酶的制備從細(xì)胞中提取酶等蛋白質(zhì)分子過程中，首先要經(jīng)過細(xì)胞破碎。細(xì)胞破壁之后，其胞內(nèi)核酸的存在會(huì)增加體系的粘度從而干擾酶的分離純化，特別是進(jìn)行超濾操作時(shí)該現(xiàn)象更為突出。除了某些生物體自身含有高活性核酸酶，不存在此問題以外，一般情況下核酸必須通過加入沉降劑沉降或加入外源的核酸酶降解。另外，如果純化的目標(biāo)是以包含體的形式存在，因包含體在形成過程中會(huì)結(jié)合核酸，因此其預(yù)處理也是需要除核酸。
目前公開使用的有多種更專一的沉淀劑，即一些帶正電的可以與帶負(fù)電的核酸磷酸殘基形成復(fù)合物的物質(zhì)。按其效率由大到小的順序，這些化合物是聚乙烯亞胺，陽離子表面活性劑溴化十六烷基三甲基銨，硫酸鏈霉素以及硫酸魚精蛋白。同樣地，他們也會(huì)與某些酶形成我們所不希望存在的復(fù)合物。硫酸銨沉淀法可以很有效地除核酸，但同時(shí)也會(huì)將一些蛋白質(zhì)去除，影響目的蛋白質(zhì)的收率。
有一點(diǎn)十分重要的是用于分解核酸的試劑不能損傷蛋白質(zhì)，而且可以很容易將他們從純化步驟中去除。通常人們?cè)诜蛛x純化之前的予處理階段，用核酸降解酶來除核酸，然后在后面的階段檢測(cè)驗(yàn)證這些酶確已被去除。但是，這些酶都非常昂貴。因此，新的降解核酸的方法將十分有前途。
有時(shí)，核酸需通過陰離子交換層析(如DEAE-和Q-等陰離子交換劑)高效去除，以保證蛋白質(zhì)制品特別是用于人體注射目的的蛋白質(zhì)藥物絕對(duì)不含核酸。在這種情況下，細(xì)胞破碎液中的核酸也需要在上柱前先行降解，以降低粘度，避免核酸分子與分離介質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合從而損害分離純化的效率。
綜上所述，無論是從常規(guī)應(yīng)用的角度或是從分離純化角度，安全快速高效的核酸去除方法在蛋白質(zhì)或酶制作過程中是十分重要的。
4)其他在其他需要將大分子核酸降解的領(lǐng)域中，包括便于人體或動(dòng)物吸收的核酸營養(yǎng)品等。
本發(fā)明的目的是提供一種光敏化合物切斷劑高效快速降解大分子核酸生成小片段的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能對(duì)光能量具有強(qiáng)烈吸收的光敏芳香雜環(huán)化合物作為DNA切斷劑，在光照下產(chǎn)生活潑自由基或引發(fā)電子轉(zhuǎn)移，高效快速將生物體動(dòng)、植物或微生物細(xì)胞破碎液、質(zhì)粒DNA或基因組DNA中大分子核酸降解切斷成小片段的新方法。
本方法用來作為DNA切斷劑的光敏芳香雜環(huán)化合物有萘酰亞胺，氧或硫雜蒽，蒽醌，呫噸，羅丹明，菁染料，金屬酞菁，聯(lián)苯，聯(lián)萘，芘，苝，苝酰亞胺或香豆素衍生物。
本方法所用的生物體細(xì)胞有動(dòng)物細(xì)胞是軟體動(dòng)物或脊椎動(dòng)物細(xì)胞；植物細(xì)胞是裸子植物或雙子葉植物細(xì)胞；微生物細(xì)胞是細(xì)菌或病毒。
本方法是將上述光敏芳香雜環(huán)化合物直接加到生物體細(xì)胞破碎液、質(zhì)粒DNA或基因組DNA中，至其終濃度為10μM-1.0M，同時(shí)在UV300-600nm光照下反應(yīng)0.5-10小時(shí)，將大分子核酸切斷降解成小片段。
本方法應(yīng)用于DNA序列分析、DNA足跡技術(shù)，從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)或酶的分離純化過程核酸的降解以及其它需要將大分子核酸降解的領(lǐng)域。
本發(fā)明提供的光敏芳香雜環(huán)化合物降解核酸的方法具有以下特點(diǎn)(1)在工作濃度時(shí)的化合物對(duì)蛋白質(zhì)沒有損傷作用；(2)其在光照條件下能夠產(chǎn)生自由基或引發(fā)電子轉(zhuǎn)移；(3)反應(yīng)不需要引入可能造成污染的金屬離子；(4)該方法靈敏快捷，操作簡(jiǎn)單。


圖1為1％瓊脂糖凝膠電泳分析合成物對(duì)基因組DNA的降解效率欄1-欄9，分別加入合成物N-丁基苯并硫雜蒽-1，3-酰亞胺(R-1)，N-二甲胺基乙基苯并硫雜蒽-1，3-酰亞胺(R-2)，N-哌嗪基乙基苯并硫雜蒽-1，3-酰亞胺(R-3)，N-Z甲胺基丙基苯并硫雜蒽-1，3-酰亞胺(R-4)，N-(間氟對(duì)氯苯酰氧基)硫代萘酰亞胺(C-I)，N-(呋喃酰氧基)硫代萘酰亞胺(C-II)，N-(間二甲氧基苯酰氧基)硫代萘酰亞胺(C-III)，N-(鄰氯間吡啶酰氧基)硫代萘酰亞胺(C-IV)，N-丁基萘酰亞胺并噻二唑(S)后，質(zhì)粒pBR322DNA的降解情況；欄10，pBR322DNA空白對(duì)照。
圖2為合成物存在下大腸桿菌DNA的降解情況欄1，加入合成物N-二甲胺基乙基苯并硫雜蒽-1，3-酰亞胺(R-2)；欄2，基因組NDA空白對(duì)照；欄3，加入合成物N-二甲胺基丙基苯并硫雜蒽-1，3-酰亞胺(R-4)；欄4，加入合成物N-丁基萘酰亞胺并噻二唑(S)。
圖3為合成物N-丁基萘酰亞胺并噻二唑(S)對(duì)植物基因組DNA的損傷作用欄1，大豆基因組不加入合成物，空白對(duì)照；欄2，玉米基因組不加入合成物，空白對(duì)照；欄3，大豆基因組加入合成物；欄4，玉米基因組加入合成物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 大腸桿菌細(xì)胞的破碎及其基因組DNA的提取超凈工作臺(tái)中挑取單菌落，接種于10ml的LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中，30℃， 180rpm下振蕩活化培養(yǎng)過夜(12-14h)。次日接種2％菌體于250ml新鮮培養(yǎng)液中，37℃，180rpm培養(yǎng)，至OD600吸收值為0.6，加入異丙基-β-D-巰基半乳糖至終濃度1mM，繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，離心(6,500rpm，10min)收集菌體。按濕重1∶5(W/V)加入冰冷緩沖液A(20mM Tris-HCl，pH8.0)，懸浮5分種，之后加入5g溶菌酶(Amresco公司)，獲得細(xì)胞破碎液。取1000ml菌液在4500-5000rpm下離心5min。棄上清，保留沉淀。向沉淀中加入溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8.0，10mM乙二胺基四乙酸EDTA)100ml，輕輕震蕩，然后再向其中加入溶液II(0.2M NaOH，1％十二烷基磺酸鈉SDS)20ml，輕輕混勻，這時(shí)溶液中出現(xiàn)絮狀物。向其中加入溶液III(5M乙酸鈉，60.0ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)20ml，凍存20-30min。10000rpm離心20min。取上清，用紗布過濾。濾液與等體積(或0.6倍體積)異丙醇混勻，放置10min。4℃下，10000rpm離心10min。棄上清，然后加入70％乙醇搖動(dòng)，使沉淀重新溶解。4℃下，10000rpm離心10min。沉淀在自然的條件下干燥保存。
實(shí)施例2 合成物對(duì)質(zhì)粒DNA，基因組DNA以及細(xì)胞破碎液中核酸雜質(zhì)的降解1)對(duì)質(zhì)的降解考察溶于緩沖液10mM Tris/HCl，20mM NaCl，pH7.5，終濃度為50μM不同化合物R-1，R2，R3，S，R-4；C-I，C-II，C-III，C-IV，在UV400nm光照下，反應(yīng)體系為10μl，上樣量1μl，1％瓊脂糖電泳跟蹤分析對(duì)于pBR322(500ng/μl)切斷的情況，發(fā)現(xiàn)均表現(xiàn)出極高的DNA切斷活性(圖1)。化合物R-1將I型質(zhì)粒pBR322降解成小片段；化合物R-2將質(zhì)粒pBR322由I型轉(zhuǎn)化為II型，最后轉(zhuǎn)化為III型DNA；化合物R-3將質(zhì)粒pBR322由I型轉(zhuǎn)化為II型，最后降解成小片段；化合物R-4主要將質(zhì)粒pBR322由I型轉(zhuǎn)化為II型，最后轉(zhuǎn)化為III型DNA；化合物S將質(zhì)粒pBR322由I型轉(zhuǎn)化為II型和III型DNA；化合物C-系列均具有將I型質(zhì)粒pBR322降解成小片段的功能。
2)對(duì)大腸桿菌基因組DNA的降解將R系列化合物直接加入到大腸桿菌基因組DNA(5.2×106bp)中至其終濃度為50μM，同時(shí)在UV400nm光照反應(yīng)2hr，觀察降解效果(圖2)。
3)合成物對(duì)植物細(xì)胞破碎液中基因組DNA的降解將合成物R-4直接加入到玉米基因組DNA(1×1011bp)和大豆基因組DNA(1.7×109bp)中至其終濃度為0.0005M，同時(shí)光照2hr，觀察降解效果(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種用有機(jī)化合物降解核酸的方法，其特征在于本方法用來作為核酸切斷劑的有機(jī)合成物為光敏芳香雜環(huán)化合物是萘酰亞胺，氧或硫雜蒽，蒽醌，呫噸，羅丹明，菁染料，金屬酞菁，聯(lián)苯，聯(lián)萘，芘，苝，苝酰亞胺或香豆素衍生物；該方法是將上述光敏芳香雜環(huán)化合物直接加到生物體細(xì)胞破碎液、質(zhì)粒DNA或基因組DNA中，至其終濃度為10μM-1.0M，同時(shí)在UV300-600nm光照下反應(yīng)0.5-10小時(shí)，將大分子核酸切斷降解成小片段。
2.按照權(quán)利要求1所述降解核酸的方法，其特征在于本方法所用的生物體細(xì)胞有動(dòng)物細(xì)胞是軟體動(dòng)物或脊椎動(dòng)物細(xì)胞；植物細(xì)胞是裸子植物或雙子葉植物細(xì)胞；微生物細(xì)胞是細(xì)菌或病毒。
3.按照權(quán)利要求1所述降解核酸方法的用途，其特征是應(yīng)用在除DNA足跡技術(shù)外的DNA序列分析、從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)或酶的分離純化過程核酸的降解以及其它需要將大分子核酸降解的領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用光敏芳香雜環(huán)化合物作為DNA切斷劑，在光照下產(chǎn)生活潑自由基或引發(fā)電子轉(zhuǎn)移，高效快速將生物體動(dòng)、植物或微生物細(xì)胞破碎液、質(zhì)粒DNA或基因組DNA中的大分子核酸降解切割成小片段的新方法。該方法具有在工作濃度的化合物對(duì)蛋白質(zhì)沒有損傷作用；化合物在光照條件下能夠產(chǎn)生自由基或引發(fā)電子轉(zhuǎn)移；反應(yīng)不需引入可能造成污染的金屬離子；該反應(yīng)靈敏快捷，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)；可用于DNA序列分析、DNA足跡技術(shù)、從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)或酶的分離純化過程核酸的降解以及其它需要將大分子核酸降解的領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1491954SQ0315953
公開日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2003年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月17日
發(fā)明者楊青, 錢旭紅, 許建強(qiáng), 楊 青 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)