專利名稱：靶核酸的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請基于2009年10月29日提交的日本專利申請?zhí)仡?009-249122要求優(yōu)先權(quán),其全部內(nèi)容通過引用納入本申 請。本發(fā)明涉及靶核酸的檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
一直以來，作為用于生物個體的基因分析或研究生物樣本中的病毒或細(xì)菌等感染的方法，提出了全面地檢測或者定量核酸序列的方法。例如，作為樣本中所含的作為檢測對象的核酸序列(靶核酸)的表達(dá)量的檢測方法，使用微陣列(下文簡稱為“陣列”)(例如，非專利文獻(xiàn)1-4)。陣列是預(yù)先將堿基序列已知的多個核酸片段(檢測用探針)分別獨(dú)立地固定于載體上得到的。如圖8所示，在現(xiàn)有的陣列方法中，為了識別作為檢測對象的靶序列，使用以包含靶序列的方式設(shè)計的正向引物(F引物)和反向引物(R引物)，擴(kuò)增含有靶序列的DNA片段(靶核酸)。然后將擴(kuò)增的靶核酸分離為單鏈。接著，陣列上固定的檢測用探針具有與靶核酸的特征性部分序列(靶序列)互補(bǔ)的序列的部分和靶序列形成雜合體(雜交)，從而使靶核酸結(jié)合于載體上。通過以任意方法檢測形成該雜合體的靶核酸，可以研究樣本中核酸的有無。另外，開發(fā)了專門檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)的陣列(例如專利文獻(xiàn)1、2)。在所述方法中，使用DNA計算機(jī)技術(shù)，可以檢測出樣本的靶核酸的SNP的類型?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :特開2006-211982號公報專利文獻(xiàn)2 :特開2006-101844號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :廣M才実験T失敗U々IM検出i定量W,実験醫(yī)學(xué)別冊羊土社第3章_10 74夕口7>4解析W，非專利文獻(xiàn)2 =Bioview, No. 45，ppl4_18，2004 夕力 9 八 4 才非專利文獻(xiàn)3 : 才f夕)口 -7'> 'J 一文' DNA千，7。応用技術(shù) '> 一工A —社第5章実際i子Q応用非專利文獻(xiàn)4 :厚生労働科學(xué)研究費(fèi)補(bǔ)助金食品CO安心 安全確保推進(jìn)事業(yè)P ^吵石健康食品O有効性O(shè)評価t二関+ 3研究(平成18年度総括 分擔(dān)研究報告)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題在上述非專利文獻(xiàn)1-4記載的方法中，陣列上固定的檢測用探針與靶序列雜交，但是該雜交反應(yīng)需要很長時間。而且，檢測用探針有可能非特異性地結(jié)合與靶序列有相似性(同源性)的其他核酸序列。即,在檢測樣本中含有多種靶核酸時,有可能不能正確地檢測靶核酸的有無。對于非特異性結(jié)合的問題，在非專利文獻(xiàn)2中記載了通過縮短檢測用探針從而可以最小化同源性，但如果縮短檢測用探針，則檢測時的標(biāo)識信號降低。另外，在非專利文獻(xiàn)4中記載了通過升高雜交時的溫度可以減少非特異性結(jié)合，但是在通過這種方法也不能解決問題時，需要再設(shè)計檢測用探針的序列并再制作陣列。因此，陣列的使用者需要研究同源性的影響。獲得針對合適靶核酸的合適檢測體系的加工步驟工作量極大。另一方面，專利文獻(xiàn)1，2記載的方法是專門檢測SNP的方法，其可以更精確地檢測SNP，但是有檢測一種SNP需要七種探針、且操作繁雜的問題。而且，由于有在雜交至陣列前連接靶核酸的擴(kuò)增副產(chǎn)物的操作，因此給使用者帶來了探針設(shè)計的麻煩。如上所述，通過現(xiàn)有方法構(gòu)建所針對的靶核酸的檢測體系需要付出很大努力。另夕卜，在短時間內(nèi)更精確地檢測靶核酸也很困難。因此，本說明書的公開內(nèi)容的目的是提供一種能夠有效地構(gòu)建靶核酸的檢測體系的靶核酸檢測方法。解決問題的方法為了有效地構(gòu)建檢測體系，本發(fā)明人對在載體上固定的檢測用探針和靶核酸在保持選擇性的同時有效地雜交的方法進(jìn)行了各種研究。其結(jié)果是得出以下結(jié)論在通過固相載體上的雜交反應(yīng)的基于靶核酸的序列特異性的檢測體系中，檢測體系的有效構(gòu)建非常困難。并且發(fā)現(xiàn)，通過使用以能特異性雜交的方式預(yù)先設(shè)計的多組檢測用探針和標(biāo)簽序列，使標(biāo)簽序列結(jié)合于靶核酸，可以省略對雜交條件的研究，而且可以排除非特異性結(jié)合并且可以實(shí)現(xiàn)高選擇性。而且還發(fā)現(xiàn)，不用使用靶序列特異的探針連接所述嵌合靶核酸，而使用與同源性低的部分序列即靶序列的特征性序列能特異性雜交的引物擴(kuò)增標(biāo)識的靶核酸，藉此可以減少標(biāo)識的靶核酸與檢測用探針的非特異性結(jié)合。基于所述發(fā)現(xiàn)提供以下手段。本說明書的公開內(nèi)容涉及樣本中的靶核酸的檢測方法。本檢測方法可以包括以下步驟制備包含檢測用探針的固相體的步驟，所述檢測用探針各自具有不同的給定堿基序列；對所述樣本進(jìn)行PCR，從而獲得具有預(yù)先與所述靶核酸關(guān)聯(lián)的與所述檢測用探針互補(bǔ)的標(biāo)簽序列和標(biāo)識的嵌合DNA的步驟；使所述嵌合DNA和所述檢測用探針以能通過所述標(biāo)簽序列雜交的方式接觸的步驟；基于所述固相體上的所述標(biāo)識獲得信號強(qiáng)度信息的步驟；和基于所述信號強(qiáng)度信息檢測所述靶核酸的步驟。本檢測的所述PCR步驟可以包括制備第I引物和第2引物，使用所述第I引物和所述第2引物對所述樣本進(jìn)行PCR，合成具有所述靶序列、所述標(biāo)簽序列和所述標(biāo)識的嵌合DNA，其中所述第I引物具有與前述靶核酸中的靶序列互補(bǔ)的識別用序列和與所述標(biāo)簽序列互補(bǔ)的標(biāo)簽添加用序列，所述第2引物具有與同所述靶序列鄰接的部分序列一致的部分序列和標(biāo)識。另外，在所述PCR步驟中，對于兩個以上的所述靶核酸，可以使用2個以上的所述第I引物和兩個以上的所述靶核酸共通的I個所述第2引物。另外，在所述PCR步驟中，可以通過非對稱PCR擴(kuò)增所述嵌合DNA。使用包含能與預(yù)先與所述靶核酸關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽序列雜交的檢測用探針的陣列，可以檢測靶核酸。


圖I :本發(fā)明的檢測方法的一個實(shí)例的概要的示意圖。圖2 :示出本發(fā)明中的固相載體和固相載體上的檢測用探針和嵌合DNA的關(guān)系的圖。圖3 :示出本發(fā)明中的經(jīng)標(biāo)識靶核酸的擴(kuò)增步驟的圖。圖4 :示出陣列制作和靶制備的流程的圖。圖5 出用于檢測用探針的喊基序列的表。圖6 :示出本發(fā)明的實(shí)施例獲得的檢測結(jié)果的圖。圖7 :示出現(xiàn)有方法的實(shí)施例獲得的檢測結(jié)果的圖。圖8 :示出現(xiàn)有的靶核酸檢測方法的一個實(shí)例的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及用于檢測作為檢測對象的靶核酸中的靶序列的陣列。根據(jù)本發(fā)明的靶核酸的檢測方法，由于制備了包含各自具有不同的固有堿基序列的多個檢測用探針的固相載體，所以回避了為了構(gòu)建針對每個靶核酸設(shè)計并固定檢測用探針的檢測體系而進(jìn)行的操作。另外，通過對所述樣本進(jìn)行PCR，以獲得具有預(yù)先與所述靶核酸關(guān)聯(lián)的與所述檢測用探針互補(bǔ)的檢測用序列和標(biāo)識的嵌合DNA，從而可在制備雜交用DNA的PCR中，獲得靶核酸特異的且被標(biāo)識的嵌合DNA，所述嵌合DNA識別靶核酸，并且具有已與檢測用探針關(guān)聯(lián)的檢測用序列。另外，通過使用檢測用序列使嵌合DNA和檢測用探針雜交，基于預(yù)先關(guān)聯(lián)的檢測用探針和檢測用序列，嵌合DNA與檢測用探針雜交，因此有效地減少或回避了雜交時的非特異性結(jié)合。另外，根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，在進(jìn)行PCR時，通過使用第I引物和第2引物，減少或回避了探針或引物設(shè)計時的繁雜，其中所述第I引物具有與靶核酸中的靶序列互補(bǔ)的識別用序列和標(biāo)簽添加用序列，所述第2引物具有同靶序列鄰接的部分序列和標(biāo)識。另外，通過使用所述引物系列，可以簡單地制備直接識別靶序列且靶核酸特異的用于與檢測用探針雜交的嵌合DNA。所述方法除了確實(shí)可以檢測靶核酸有多個時的各靶核酸外，還可以用于檢測核酸中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或基因改變的核酸中的改變位點(diǎn)，以及檢測RNA等表達(dá)基因。即，對于靶核酸中的多態(tài)性或突變，通過以與作為檢測對象的突變相同的概念獲得嵌合DNA，可以檢測靶核酸中的SNP、改變位點(diǎn)、表達(dá)基因、多態(tài)性或突變等。圖4概括地示出了用于檢測靶核酸的陣列制作和靶制備的方案。圖4的方案一并示出了本說明書公開的方法以及現(xiàn)有的檢測方法的流程圖。以實(shí)線表示的步驟是本說明書公開的方法和現(xiàn)有方法共通的步驟，以虛線表示的步驟是僅現(xiàn)有方法必需的步驟。在現(xiàn)有方法中，為了制作各靶核酸的陣列，要進(jìn)行多個步驟。首先，獲得作為檢測對象的靶核酸的序列信息，并參照所述序列信息設(shè)計檢測用探針。基于設(shè)計合成檢測用探針，制備陣列用的斑點(diǎn)溶液并固定陣列。另一方面，從樣本中提取、純化作為檢測對象的靶核酸(RNA或DNA等靶)。接著，設(shè)計用于擴(kuò)增靶核酸的引物，添加標(biāo)識并合成所述引物。之后，使用合成的引物擴(kuò)增靶核酸。接著，使擴(kuò)增的靶核酸和制作的陣列上的檢測用探針進(jìn)行雜交(hybridization)。再通過檢測陣列上的標(biāo)識信號，檢查雜交的進(jìn)行，并將所得的標(biāo)識信號數(shù)值化。在本文中，在所得結(jié)果是異常的或者沒有獲得熒光信號自身等非預(yù)期結(jié)果時，如圖4的實(shí)線和虛線所示，必須要再次設(shè)計陣列或者重新制備樣本。例如，在非專利文獻(xiàn)1-4公開的現(xiàn)有方法中，需要對雜交條件、引物以及陣列上的檢測用探針序列等進(jìn)行諸多反復(fù)研究。特別是在作為檢測用探針的寡聚DNA或查詢探針序列的再設(shè)計和合成上會花費(fèi)很多時間。在本發(fā)明的方法中，檢測用探針或查詢探針僅選自100種序列即可(參照序列表)。另外，在專利文獻(xiàn)5-6中記載的方法中，對一種靶序列的檢測需要七種引物和探針，然而在本發(fā)明中，對一種靶序列的檢測有兩種引物即可。另一方面，在本說明書中公開的方法中，僅需制備包含多個預(yù)先確定的各自具有固有的檢測用序列的檢測用探針的陣列就足矣，無需考慮靶核酸。由于無需考慮作為檢測對象的靶核酸即可應(yīng)用所述陣列，因此如現(xiàn)有方法那樣對各靶核酸的探針的設(shè)計、合成、固定化、雜交條件的研究均被回避。另外，在本說明書中公開的方法中，僅主要研究制備靶制備時的引物設(shè)計，即可構(gòu)建檢測體系。而且，通過本說明書公開的方法，可以制備雜交條件最適化的檢測用探針，因此可 以在短時間內(nèi)更精確地檢測靶核酸。另外，本說明書中的“核酸”包括包含cDNA、基因組DNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA和合成RNA在內(nèi)的全部DNA和RNA、以及肽核酸、嗎啉核酸、甲基磷酸核酸和S-寡聚核酸等人工合成核酸。此外，可以是單鏈或者雙鏈。另外，本說明書中的“靶核酸”是具有任意序列的任意核酸。典型地，可以列舉可能具有對體質(zhì)、遺傳病、癌等特定疾患的發(fā)病、疾患診斷、治療預(yù)后、藥劑或治療的選擇等成為人或非人動物中的遺傳指標(biāo)的堿基序列的核酸。作為指標(biāo)，可以列舉SNP等多態(tài)性或者先天或后天突變。另外，靶核酸也包括病原菌或病毒等微生物來源的核酸。對于靶核酸，可以直接使用后述樣本或者其核酸級分，但優(yōu)選使用全部多個靶核酸經(jīng)擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選地，通過借由PCR的擴(kuò)增反應(yīng)，更優(yōu)選地，通過借由多重PCR的擴(kuò)增反應(yīng)。本說明書中的“樣本”是指可能含有靶核酸的樣本。作為樣本，可以使用包括細(xì)胞、組織、血液、尿、唾液等在內(nèi)的含有核酸的任意樣本。本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)參照現(xiàn)有技術(shù)即可獲得含有來自所述各種樣本的核酸的級分。本說明書中的“靶序列”是指作為檢測對象的靶核酸的特征性的由I個或者2個以上堿基組成的序列。例如，可以是靶核酸之間同源性低的部分序列，也可以是與可能包含在樣本中的其他核酸的互補(bǔ)性或者同一性低的序列。靶序列也可以是靶核酸的特征序列。所述靶序列也可以是人為地改變序列所得的序列。下文參照附圖對本說明書公開的代表性且非限定性的具體實(shí)例進(jìn)行詳細(xì)說明。所述詳細(xì)說明僅意在向本領(lǐng)域技術(shù)人員示出實(shí)施本說明書的公開內(nèi)容的優(yōu)選實(shí)例的細(xì)節(jié)，無意于限定本說明書的公開內(nèi)容的范圍。另外，為了提供進(jìn)一步改善的靶核酸的檢測方法等，下文公開的附加特征以及公開內(nèi)容可以與其他特征或發(fā)明分別地或者共同地使用。另外，下文的具體實(shí)施方式
中公開的特征或步驟的組合不是在最廣義情況下實(shí)施本說明書的公開內(nèi)容時必需的，而是僅記載用于特別說明本說明書的公開內(nèi)容的代表性具體實(shí)例。另外，對于上述和下述的代表性具體例的各特征、以及獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中記載的技術(shù)方案的各特征，在提供本說明書的公開內(nèi)容的附加且有用的實(shí)施方案時，不是必須按照在此記載的具體例或所列舉的順序進(jìn)行組合。對于本說明書和/或權(quán)利要求記載的全部特征，與實(shí)施例和/或權(quán)利要求記載的特征的構(gòu)成不同，其作為對提交申請時的公開內(nèi)容和權(quán)利要求書的特定事項的限定，意在分別地且各自地獨(dú)立公開。并且，對于全部的數(shù)值范圍以及類或集合的記載，其作為對提交申請時的公開內(nèi)容以及權(quán)利要求的特定事項的限定，旨在公開其中間構(gòu)成。圖I為本發(fā)明的檢測方法的原理的示意圖。圖2示出本發(fā)明中使用的固相體100的一個實(shí)例，圖3示出圖I的擴(kuò)增步驟的細(xì)節(jié)。另外，圖I和圖3是用于檢測樣本中包含的一種靶核酸的檢測方法和引物的一個實(shí)例。另外，在以下的說明中，在對某堿基序列添加編號并進(jìn)行說明時，對所述編號添加(_)并進(jìn)行記載是指與所述堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。[靶核酸中的靶序列的檢測方法]本說明書中公開的檢測方法包括以下步驟制備包含多個檢測用探針的固相體的步驟，所述多個檢測用探針各自具有不同的固有堿基序列；對所述樣本進(jìn)行PCR，從而獲得具有預(yù)先與所述靶核酸關(guān)聯(lián)的與所述檢測用探針的檢測用序列互補(bǔ)的標(biāo)簽序列和標(biāo)識的嵌合DNA的步驟；使用所述檢測用序列和所述標(biāo)簽序列使所述嵌合DNA和所述檢測用探針雜交的步驟；基于所述載體上的所述標(biāo)識獲得信號強(qiáng)度信息的步驟；和基于所述信號強(qiáng)度信息檢測所述靶核酸的步驟。在本說明書公開的檢測方法中，以I種或者2種以上的靶核酸作為適用對象，更詳細(xì)地，以與所述靶核酸中的特征序列有關(guān)的靶序列作為檢測對象。下文主要對一種靶核酸的一系列步驟進(jìn)行說明，但是以下步驟也適用于同時檢測多個或者多種靶核酸的情況。(固相載體的制備步驟)如圖I所示，本說明書中公開的檢測方法(以下簡稱為本檢測方法)可以具有制備固相體100的步驟。所述固相體100可以在實(shí)施檢測方法前預(yù)先制備，也可以商購，或者在每次實(shí)施檢測方法時制備。如圖I所示，固相體100可以在載體102上包含多個檢測用探針104，所述檢測用探針104各自具有不同的固有堿基序列，即檢測用序列106。通過制備所述固相體100，可以回避對探針設(shè)計、合成、陣列制作、雜交條件的研究。圖2不出固相體100的一例。檢測用探針104各自具有用于探測的固有喊基序列，即檢測用序列106。所述檢測用序列106可以與靶核酸10的特征序列即靶序列12無關(guān)地設(shè)定。通過與靶序列12無關(guān)地設(shè)定，可以以下述方式設(shè)定檢測用探針104的檢測用序列106 :即可減少或回避多個檢測用探針104之間的非特異性結(jié)合，并且考慮適合雜交的溫度和時間等雜交條件。另外，無需考慮靶核酸10的種類，總是可以使用相同的檢測用探針104。 作為所述檢測用探針104的檢測用序列106，可以使用例如序列號I-序列號100中記載的堿基序列或與所述堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。所述堿基序列全都為相同堿基長度，解鏈溫度(Tm)為40°C以上80°C以下，優(yōu)選50°C以上70°C以下，在相同條件的雜交中可以得到均質(zhì)的雜交結(jié)果。檢測用探針104的檢測用序列106可以從所述候選堿基序列中適當(dāng)選擇并使用。所使用的2種以上的檢測用探針104的解鏈溫度優(yōu)選盡可能接近。在希望同時地、全面地檢測多個靶核酸10時，優(yōu)選地進(jìn)行組合，從而使針對多個靶核酸10分別使用的多個檢測用探針104的解鏈溫度相互最接近。例如，在按解鏈溫度的順序?qū)z測用探針104進(jìn)行排列時，例如，與希望區(qū)別開的2種以上靶核酸10分別對應(yīng)的2種以上檢測用探針104可以從在解鏈溫度的排列中相鄰的2種堿基序列中選擇。另外，用于與其他靶核酸10對應(yīng)的檢測用探針104的檢測用序列106可從與已選擇的堿基序列緊鄰的堿基序列選擇，也可以從隔開的一系列堿基序列選擇。優(yōu)選地，使用與希望同時檢測的多個靶核酸10對應(yīng)的全部檢測用探針的解鏈溫度為解鏈溫度排列的一系列堿基序列。另外，解鏈溫度可采用通過GC %法、Wallace法、基于Current Protocols inMolecular Biology的方法(秀潤社刊生物實(shí)驗說明3,可真實(shí)擴(kuò)增的PCR,第25頁記載)等算出的值，但優(yōu)選地，在本發(fā)明中，通過引入解鏈溫度的范圍和堿基序列濃度的影響的Nearest-Neighbor法算出。采用Nearest-Neighbor法的解鏈溫度可以容易地通過例如Visual OMP (卜U '7'夕；Ws' ^才口夕一株式會社制)的軟件或日本基因研究所(http://www. ngrl. co. jp/)提供的軟件(OligoCalculator ；http://www. ngrl. co. jp/tool/ngrl_tool. html)獲得。另外,序列號I-序列號100按照以VisualOMP算出的解鏈溫度(0. IM探針濃度、50mM Na+離子和I. 5mM Mg+離子)的降序排列。對于所述檢測用探針104中的檢測用序列106 (也稱為標(biāo)準(zhǔn)正交化序列)，可通過計算例如相對于從隨機(jī)數(shù)目獲得的給定堿基長度的DNA序列的連續(xù)一致長度、通過 Nearest-Neighbor法的解鏈溫度預(yù)測、Hamming距離、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測而進(jìn)行設(shè)計。標(biāo)準(zhǔn)正交化序列為核酸的堿基序列，其指解鏈溫度均一、即以解鏈溫度聚集在一定范圍內(nèi)的方式設(shè)計的序列，核酸自身在分子內(nèi)(intramolecular)構(gòu)造、不妨礙與互補(bǔ)序列形成雜交的序列，以及不與其互補(bǔ)堿基序列以外的序列形成穩(wěn)定雜交的堿基序列。包含在一個標(biāo)準(zhǔn)正交化序列群中的序列在所希望的組合之外的序列之間以及自身序列內(nèi)難以發(fā)生反應(yīng)，或者不發(fā)生反應(yīng)。另外，在PCR中擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)正交化序列時，不會受到例如上述交叉雜交之類的問題的影響，與具有該標(biāo)準(zhǔn)正交化序列的核酸初始量相應(yīng)的量的核酸具有被定量擴(kuò)增的性質(zhì)。如上所述的標(biāo)準(zhǔn)正交化序列在 H. Yshida and A. Suyama,“Solution to 3-SAT by breadthfirst search”，DIMACS VI. 54，9-20 (2000)和日本專利申請 2003-108126 中有詳細(xì)記載。可以使用所述文獻(xiàn)中記載的方法設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)正交化序列。將檢測用探針104固定于載體102。作為所述載體102，可以使用固相載體。例如，載體102可以是塑料，也可以是玻璃，對材質(zhì)沒有特別限定。另外，載體102的形狀可以是如圖I所示的平板狀，也可以是珠狀，對其形狀沒有特別限定。優(yōu)選地，固相體100為載體102為固相平板狀、多個檢測用探針104以一定的序列固定的陣列(特別是微陣列)。陣列可以固定有多個檢測用探針104，并適合同時地、全面地檢測各種靶核酸10。另外，固相體100可以具有在載體102上劃分開的多個陣列區(qū)域。在所述多個陣列區(qū)域中，可以分別固定由同一組合形成的檢測用探針104的系列，也可以分別固定由不同的組合形成的檢測用探針104的系列。如果多個陣列區(qū)域中固定不同組合的檢測用探針104的系列，則可以分派各個陣列區(qū)域，目的是檢測不同基因中的靶核酸10。另外，優(yōu)選的固相體100可以具有將兩種以上的檢測用探針104以基于其解鏈溫度的順序排列的排列形式。例如，使用所述固相體100，按照檢測用探針104的順序，分派與2種以上的靶核酸10對應(yīng)的2種以上的檢測用探針104，藉此可以抑制由檢測用探針104的檢測用序列106的解鏈溫度之差或檢測用探針104的固定化位置所致的雜交差異，并更精確地檢測樣本中的靶核酸10，其中所述2種以上的靶核酸10與可能存在于某基因的某位點(diǎn)的2種以上的靶序列12對應(yīng)。對檢測用探針104的固定化形式?jīng)]有特別限制。可以是共價結(jié)合，也可以是非共價結(jié)合?？梢酝ㄟ^現(xiàn)有公知的各種方法將檢測用探針104固定于載體102的表面。另外，也可以具有適合載體102表面的連接序列。優(yōu)選地，連接序列為在檢測用探針104之間具有相同堿基長度的相同序列。(嵌合DNA獲得步驟PCR步驟)如圖I所示，PCR步驟可以是對樣本進(jìn)行PCR的步驟，從而獲得下述嵌合DNA :所述嵌合DNA具有標(biāo)識42和預(yù)先與靶核酸10關(guān)聯(lián)的能與特定檢測用探針104的檢測用序列106雜交的標(biāo)簽序列66。通過獲得所述嵌合DNA60，無需考慮靶核酸10的靶序列12的堿基序列，即可利用具有預(yù)先確定與靶序列12無關(guān)的固有檢測用序列106的檢測用探針104。優(yōu)選地，標(biāo)簽序列66與檢測用探針104的固有檢測用序列106以能特異性雜交的程度互補(bǔ)，更優(yōu)選地，與檢測用序列106完全互補(bǔ)。下文對標(biāo)識進(jìn)行了描述。對于PCR步驟，只要能獲得所述嵌合DNA60即可，對所使用的引物形式無特別限定。下面參照圖I對本檢測方法中優(yōu)選的PCR步驟的一個實(shí)例進(jìn)行說明。在圖I的右上側(cè)示出了使用第I引物30和第2引物40對樣本中的靶核酸10及其互補(bǔ)鏈20進(jìn)行PCR，獲得作為其擴(kuò)增產(chǎn)物的嵌合DNA60的步驟。(第I引物)如圖I所示，第I引物30具有識別用序列32和標(biāo)簽添加用序列36。制備第I引物30，其數(shù)目同靶核酸10的種類。如果推測在某種生物的基因組DNA的給定部分有兩種突變，例如有野生型為A、突變型為T的單堿基置換突變時，對于所述部分，靶核酸10有兩種。因此，對于該部分，一種靶核酸10具有含有野生型堿基的靶序列12，另一種靶核酸10具有含有突變型堿基的靶序列12。因此，在基因的某位點(diǎn)存在2種靶核酸10時，制備各自具有與各靶核酸10所具有的靶序列12互補(bǔ)的識別用序列32的兩種第I引物30。(識別用序列)識別用序列32可以與作為靶核酸10中的特征序列的靶序列12特異性雜交、識別樣本中的靶核酸10。識別用序列32以能與靶核酸10的靶序列12以高選擇性雜交的程度互補(bǔ)地設(shè)定。優(yōu)選地，完全互補(bǔ)地(特異地)設(shè)定。另外，作為識別用序列32，優(yōu)選的長度因突變的形式而異，因此對其沒有特別限定，但優(yōu)選例如15個堿基以上。通過使識別用序列32的長度為15個堿基以上，可以高選擇性與靶序列12雜交。另外，如果識別用序列32在60個堿基以下，則可以減少非特異性雜交，因此是優(yōu)選的。(標(biāo)簽添加用序列)第I引物30可以具有用于向擴(kuò)增產(chǎn)物即嵌合DNA60添加標(biāo)簽序列66的標(biāo)簽添加用序列36，目的是使嵌合DNA60能夠與檢測用探針104的檢測用序列106雜交。嵌合DNA60中的標(biāo)簽序列66是檢測靶核酸10的序列，因此以能與各靶核酸10的檢測用探針104的檢測用序列106雜交的方式設(shè)定。因此，與一種靶核酸10對應(yīng)的一種嵌合DNA60與一種檢測用探針104對應(yīng)。另外，優(yōu)選地，標(biāo)簽序列66與檢測用探針104的固有檢測用序列106完全互補(bǔ)。因此，優(yōu)選地，標(biāo)簽添加用序列36為與檢測用探針104中用于檢測的固有檢測用序列106相同的堿基序列。如上所述，制備第I引物30，使其與靶核酸10的靶序列12特異地結(jié)合，并且其數(shù)目與靶核酸10的種類一樣多，藉此形成能特異性地擴(kuò)增并檢測靶核酸10。另外，對于第I引物30，以使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即嵌合DNA60能特異地結(jié)合于與靶核酸10預(yù)先關(guān)聯(lián)的特定檢測、用探針104的方式形成。
(第2引物)如圖I所示，第2引物40可以具有標(biāo)識42和與同靶核酸10的靶序列12鄰接的堿基序列相同的部分序列44。標(biāo)識42可在其5’偵U。(標(biāo)識)標(biāo)識42用于檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即嵌合DNA60。作為標(biāo)識42，可以適當(dāng)選擇并使用現(xiàn)有公知的標(biāo)識。所述標(biāo)識可以是自身被激發(fā)時發(fā)出熒光信號的熒光物質(zhì)等各種色素，還可以是通過酶反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)與第2成分組合發(fā)出各種信號的物質(zhì)。典型地，可以使用Cy3、AleXa555、Cy5、AleXa647等熒光標(biāo)識物質(zhì)。另外，也可以使用結(jié)合生物素和鏈霉親和素HPR并用底物處理等導(dǎo)致的顯色來檢測。(部分序列)部分序列44由與同靶核酸10的靶序列12鄰接的部分序列14相同的堿基序列組成。在此，同靶序列12鄰接的部分序列14不是指相對于靶序列12沒有間隔一個堿基(核苷酸)地緊鄰5’側(cè)，間隔適當(dāng)個數(shù)的堿基(核苷酸)也可以。第2引物40中的部分序列44是用于使第2引物40與靶核酸10的互補(bǔ)鏈20退火的序列。在檢測DNA上的某個突變時，將野生型和突變型兩者分別作為靶核酸10設(shè)計第I引物30和第2引物40，此時，第2引物40的部分序列44可以為這些靶核酸10所共通。即，可以將部分序列44作為同所述靶核酸10的靶序列12鄰接的共通的部分序列。共通的部分序列為與突變無關(guān)的共通的堿基序列。因此，可以平均化靶核酸10的擴(kuò)增效率，并且可以減少所使用的第I引物40。所述部分序列44可以說是具有與構(gòu)成某個突變的多個靶序列12對應(yīng)的多個靶核酸10有同源性的序列。如上所述，第2引物40具有標(biāo)識42和部分序列44，其基于所述部分序列44以能合成作為擴(kuò)增產(chǎn)物的含有靶序列12的嵌合DNA60的方式形成。另外，在本方法以具有構(gòu)成突變的多個靶序列12的多個靶核酸10作為對象時，第2引物40可以具有在相同條件下能擴(kuò)增具有構(gòu)成突變的多個靶序列12的多個靶核酸10的共通的部分序列44。其次，參照圖I和圖3對使用所述第I引物30和第2引物40獲得嵌合DNA60的步驟進(jìn)行說明。另外，在以下的說明中，僅對能獲得目的嵌合DNA60的PCR反應(yīng)進(jìn)行了說明。如圖3所示，介由第I引物30的識別用序列32將第I引物30退火至靶核酸10的靶序列12。其結(jié)果是，以靶核酸10為模板，以第I引物30為基點(diǎn)，新的DNA鏈得以延伸，從而合成了包含新合成的部分序列14 (-)的DNA鏈50。所得DNA鏈50具有標(biāo)簽添加用序列36、識別用序列32和部分序列14㈠。接下來，介由其部分序列44，第2引物40退火至由此獲得的DNA鏈50的部分序列14㈠。其結(jié)果是，以DNA鏈50為模板，以第2引物40為基點(diǎn)，新的DNA鏈得以延伸，從而合成了包含與識別用序列32互補(bǔ)的堿基序列和與標(biāo)簽添加用序列36互補(bǔ)的堿基序列的DNA鏈60。由于識別用序列32為與靶序列12 (-)相同的堿基序列，因此，與識別用序列32互補(bǔ)的堿基序列與靶序列12 —致。與標(biāo)簽添加用序列36互補(bǔ)是指與檢測用探針104的固有檢測用序列106相同，因此與之互補(bǔ)的堿基序列是與檢測用探針104的固有檢測用序列106互補(bǔ)的標(biāo)簽序列66。因此，由此獲得的DNA鏈60為將標(biāo)識42預(yù)先與靶序列12和檢測用探針104關(guān)聯(lián)的嵌合DNA60。以所述嵌合DNA60為模板進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增反應(yīng)。
另外，優(yōu)選地，將獲得所述嵌合DNA60的PCR步驟以非對稱PCR步驟實(shí)施。例如，通過改變第I引物和第2引物的濃度，可進(jìn)行非對稱PCR。由于所獲得的嵌合DNA60為雙鏈DNA狀態(tài)，因此通過將其解離為單鏈，可供雜交步驟。另外，在本文中提及的解離可通過采用包括諸如化學(xué)變性和熱變性等的變性處理實(shí)現(xiàn)。例如，在通過化學(xué)變性解離連接的寡核苷酸時，可以進(jìn)行堿變性等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的處理。在通過熱變性解離連接的寡核苷酸時，可以在生理條件下在85°C以上、優(yōu)選在90°C以上的溫度進(jìn)行，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)慕怆x方法。若通過所述PCR步驟，則通過對可能含有靶核酸10的樣本進(jìn)行PCR，可以一舉獲得通過預(yù)先與靶核酸10關(guān)聯(lián)的檢測用探針104能特異性檢測的嵌合DNA60。另外，無需從PCR反應(yīng)物回收嵌合DNA60，可以直接進(jìn)行隨后的步驟 。原因在于僅嵌合DNA60結(jié)合于檢測用探針104并通過標(biāo)識42檢測。另外，也可以通過公知的方法回收嵌合DNA60。例如，可以在單鏈化后，通過諸如使用適當(dāng)?shù)墓滔噍d體等的公知方法分離回收嵌合DNA50。(雜交步驟)雜交步驟為如下所述的步驟，即在將具有與嵌合DNA60中的標(biāo)簽序列66互補(bǔ)的檢測用序列106的檢測用探針104固定于載體102的固相體100上，使所述檢測用探針104和嵌合DNA60接觸從而使其能雜交。如圖I和圖2(c)所示，在嵌合DNA60與檢測用探針104中的檢測用序列106在一定條件下以能特異性地雜交的程度互補(bǔ)時，通過所述步驟，它們在雜交的載體102上的給定檢測用探針104形成雙鏈。在雜交步驟后，還可以包含適當(dāng)?shù)南礈觳襟E。在雜交步驟中，提供在樣本中存在靶核酸10時僅以PCR步驟合成的、并且僅與預(yù)先關(guān)聯(lián)的檢測用探針104雜交的嵌合DNA60。檢測用探針104的檢測用序列106和嵌合DNA60的標(biāo)簽序列66以高選擇性設(shè)計，能高度抑制錯誤雜交，因此在雜交步驟中嵌合DNA60對檢測用探針104的非特異性雜交被高度抑制。(信號強(qiáng)度信息獲得步驟)信號強(qiáng)度信息獲得步驟是基于雜交后的載體102上的標(biāo)識42獲得靶核酸10的信號強(qiáng)度信息的步驟。根據(jù)本發(fā)明的信號強(qiáng)度信息獲得步驟，通過嵌合DNA60與檢測用探針104雜交，可以獲得基于標(biāo)識42的信號強(qiáng)度信息。如圖I所示，在信號強(qiáng)度信息獲得步驟中，可以檢測與固相體100的檢測用探針104關(guān)聯(lián)、來自標(biāo)識42的標(biāo)識信號48。由于預(yù)先獲知關(guān)聯(lián)的檢測用探針104在固相體100上的位置，因此可以在后續(xù)的檢測步驟中通過檢測標(biāo)識信號48確定靶核酸10的有無或比例。對于信號強(qiáng)度信息獲得步驟，可根據(jù)所用的載體102的形態(tài)或標(biāo)識42的種類，適當(dāng)選擇并采用現(xiàn)有公知的方法。典型地，在通過洗滌操作等從載體102除去沒有雜交的寡核苷酸等后，可以對添加的標(biāo)識物質(zhì)的熒光信號通過陣列掃描等進(jìn)行檢測，或者對標(biāo)識物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在載體使用珠的情況下，可列舉借助流式細(xì)胞儀的檢測方法。(檢測步驟)檢測步驟為基于針對檢測用探針104所得的標(biāo)識42的信號強(qiáng)度信息，檢測樣本中的靶核酸10的有無或比例等的步驟。根據(jù)本方法，即便在同時檢測多個靶核酸10時，也可確實(shí)地檢測作為檢測對象的靶序列。通過本方法，雜交步驟中對檢測用探針104的非特異性結(jié)合被高度抑制，因此可以更精確地并以高的檢測靈敏度檢測靶核酸10，并且可以獲得其有無或者比例等。(引物系列)本發(fā)明的引物系列包括前述第I引物和第2引物。所述引物系列與固定有檢測用探針104的固相體組合，為適合獲得前述嵌合DNA的引物系列。例如，第I引物具有檢測與相同基因等相關(guān)的存在于個體內(nèi)的突變、或者種或?qū)僦写嬖诘牟町惖奶囟ò泻怂崽禺惖淖R別用序列32、和預(yù)先與檢測用序列106關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽添加用序列36，第2引物具有標(biāo)識。引物系列也可以用于檢測兩種以上的靶核酸。此時，可以含有對各靶核酸特異的第I引物和2種以上靶核酸共通的單一第2引物。本發(fā)明的引物系列也可以與固定有前述檢測用探針的陣列等的載體制成試劑盒。實(shí)施例I下面通過列舉實(shí)施例對本發(fā)明具體說明，但以下實(shí)施例不是對本發(fā)明的限定。實(shí)施例2在以下實(shí)施例中，用本發(fā)明的檢測方法按照以下順序進(jìn)行靶核酸的檢測。下面按照所述順序進(jìn)行說明。(I) DNA微陣列的制作(2)靶核酸和引物的制備和擴(kuò)增(3)雜交(4)使用掃描儀的檢測(5)數(shù)據(jù)分析(I) DNA微陣列的制作在塑料板上，以溶解有3’末端由氨基修飾的合成寡聚DNA(株式會社日本基因研究所制)的水溶液作為檢測用探針，使用日本力' ^ 株式會社的GENESH0T (注冊商標(biāo))斑點(diǎn)儀(SPOTTER)制作斑點(diǎn)。如表I所示，所使用的合成寡聚DNA序列是文獻(xiàn)(AnalyticalBiochemistry 364 (2007) 78-85)的 Supplementary Tablel 記載的 D1001 至 D1100 的 100種(參照圖5)。制作斑點(diǎn)后，在80°C進(jìn)行I小時的烘焙。另外，所述探針按照其Tm為通過VisualOMP算出的解鏈溫度(0. IM探針濃度、50mM Na+離子和I. 5mM Mg+離子)的降序排列。接著按照下述順序進(jìn)行合成寡聚DNA的固定化。即，用2XSSC/0. 2% SDS洗滌15分鐘，之后用95°C的2XSSC/0. 2% SDS洗滌5分鐘，之后重復(fù)三次用滅菌水洗滌(上下振蕩10次)。之后通過離心(IOOOrpmX3分)脫水。(2)靶核酸和引物的制備和擴(kuò)增 作為檢測對象的樣本基因使用口腔內(nèi)微生物種中的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)(樣本 I)和不解乳假枝桿菌(Pseudorambibacter alactolyticus)(樣本 2)2種。各樣本的長度為作為微生物的特征序列的周圍序列的150bp左右，將由所述堿基序列形成的人工基因作為靶核酸。將用于擴(kuò)增所述靶核酸的引物按照以下所述人工地合成。第2引物即正向引物(F引物)為Y -AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG-3'(序列號101)，并且5/側(cè)以Cy3標(biāo)識。第I引物即反向引物(R引物)按照樣本的靶序列制成。樣本I的反向引物為 5' -GCAGATTCATTGGTCAGAGAACATATCTCTAGAGTGGT-3'(序列號 102)。樣本 2 的反向引物為 5' -CATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCATATCTCTATTGCGCT-3'(序列號 103)。接下來如下所述擴(kuò)增所述樣本。另外，作為樣本擴(kuò)增用試劑，使用QIAGEN公司的多重PCR試劑盒。作為熱循環(huán)儀，使用Applied Biosystems公司的GeneAmp PCRSystem9700o首先，對各樣本制備如下所示的試劑。另外，分別將F引物和R引物調(diào)整為IOpmol/u I使用。(試劑制備)
dH20 15. Ou I多重PCR試劑盒25. OiUF 引物 3. 75 illR 引物 3. 75 ill樣本2.5ul總計50. Ou I接下來，將制備試劑裝入熱循環(huán)儀的板子上，進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)(95°C 15分后；94°C 30秒、62°C 30秒、72°C 30分，50個循環(huán)；72°C 10分，之后降低至4°C )。而且，對擴(kuò)增的標(biāo)識樣本用QIAGEN公司的MinElutePCR純化試劑盒純化，之后確定以所需長度進(jìn)行了擴(kuò)+
>曰o(3)雜交為了使⑵所得的擴(kuò)增樣本與固定于微陣列上的檢測用探針雜交，制備以下的雜交對照和雜交溶液，并由此制備雜交用試劑。另外，對于雜交對照中使用的Alexa555標(biāo)識寡聚DNA序列，使用圖5中記載的探針中與Dl_100的序列互補(bǔ)的序列的5 ’末端以Alexa555標(biāo)識的 Alexa555-rDl_100。(雜交對照)Alexa555-rDl_100 10 U ITE (pH8. 0) 390 U I總計400 ill(雜交溶液)20 X SSC 2. Oml10% SDS 0.8ml100% 甲酰胺 12. OmlIOOmM EDTA 0. 8mlmi I IiQ 24. 4mI總計40. Oml(雜交用試劑)雜交對照I. 5 ill雜交溶液9. Oiil小計10. 5 U I標(biāo)識樣本7. 5 ii I
總計18·0μ1使用Applied Biosystems 公司的 GeneAmp PCR system 9700 于 90°C將制備的標(biāo)識樣本溶液加熱I分鐘，之后使用熱封閉液(TAITEC^iDTU-N)于80°C加熱I分鐘。將上述樣本溶液各9 μ I加至微陣列的斑點(diǎn)區(qū)域,為防止干燥使用Comfort/plus用ThermoblockSlide (Eppendorf公司)，于37°C靜置30分鐘，由此進(jìn)行雜交反應(yīng)。(洗滌)雜交后，將雜交反應(yīng)結(jié)束后的微陣列基板漫潰于裝有以下組成的洗滌液的玻璃染色缸中，上下振蕩5分鐘，將玻璃基板移入裝有滅菌水的染色缸中，上下振蕩I分鐘，以2000rpm離心干燥I分鐘，除去殘留于微陣列基板表面的水分。(洗滌液的組成)
mi I IiQ 188. Oml20 X SSC 10. Oml10% SDS 2. Oml總計200. Oml(4)使用掃描儀的檢測使用Appleied Precision公司的ArrayWoRx適當(dāng)調(diào)節(jié)曝光時間，獲得突光照片。再使用GenePix Pro，對所得照片的熒光信號進(jìn)行數(shù)值化。(5)數(shù)據(jù)分析使用GenePix Pro作為照片的數(shù)值化軟件，對所得照片的熒光信號進(jìn)行數(shù)值化。圖6示出了對樣本I和樣本2各自是否與檢測用探針發(fā)生非特異性結(jié)合進(jìn)行驗證的結(jié)果。如圖6(a)所示，在混合樣本I和樣本2進(jìn)行反應(yīng)時，與兩者均反應(yīng)產(chǎn)生了熒光信號，可以檢測樣本。另外，由圖6(b)和(c)所示可知，在不混合樣本而是僅以樣本I或僅以樣本2進(jìn)行反應(yīng)時，可以顯著減少與不希望的探針的非特異性結(jié)合反應(yīng)。還可知，各樣本均特異性結(jié)合于以能識別的方式各自設(shè)計的檢測用探針。接下來，作為比較例，驗證了現(xiàn)有的靶核酸的檢測方法(非專利文獻(xiàn)4的方法)。在以下比較例中，用現(xiàn)有檢測方法按照以下順序檢測靶核酸。下面按照所述順序進(jìn)行說明。在塑料板上，將溶解有3 ’末端以氨基修飾的合成寡聚DNA (株式會社日本基因研究所制)的水溶液作為檢測用探針，使用日本力' ^ 株式會社的GENESH0T (注冊商標(biāo))斑點(diǎn)儀制作斑點(diǎn)。所使用的合成寡聚DNA序列，5' -ACCACTCTAGAGATA-3'(序列號104)用于樣本1，5^ -AGCGCAATAGAGATA-Si (序列號105)用于樣本2。在塑料板上制作斑點(diǎn)后，于80°C進(jìn)行I小時的烘焙，按照Tm的降序排列。作為檢測對象的樣本基因，使用與實(shí)施例一樣的樣本I、樣本2。用于擴(kuò)增所述靶核酸的共通引物如下所示地人工合成。F引物為Y -AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG-3'(序列號 106)，5’ 側(cè)以 Cy3 標(biāo)識。R 引物為 5' -ATGGTGTGACGGGCGGTGTGT-3'(序列號 107)。接下來同上述(3)-(5)那樣通過熱循環(huán)反應(yīng)擴(kuò)增樣本I和樣本2，在與在實(shí)施例6制作的檢測用探針雜交后、洗滌、進(jìn)行信號檢測。圖7示出了對樣本I和樣本2各自是否與檢測用探針發(fā)生非特異性結(jié)合進(jìn)行驗證的結(jié)果。如圖7(a)_(c)所示，甚至在樣本中不含樣本I時，檢測到樣本I的檢測用探針的弱的信號，另一方面，甚至在樣本中不含樣本2時，也檢測到樣本2的檢測用探針的弱的信號。即，觀察到樣本的非特異性結(jié)合。另外，以現(xiàn)有方法雜交所需的時間為2小時左右。另外，觀察到對檢測用探針的非特異性反應(yīng)(熒光強(qiáng)度為10%左右)。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的雜交所必需的時間可以縮短至30分鐘左右，對樣本的DNA微陣列上的不想要的檢測用探針的非特異性反應(yīng)能夠大幅減少(熒光強(qiáng)度不足1%)。因此，通過本發(fā)明，可以以雜交溫度恒定(37°C左右)且以時間為30分鐘左右(現(xiàn)有的1/4)進(jìn)行。可以得到與現(xiàn)有技術(shù)相比更高的信號結(jié)果，可以進(jìn)行與現(xiàn)有技術(shù)相比更正確的特定核酸中的喊基檢測和序列的確定。另外，在現(xiàn)有方法中，在得到所希望的結(jié)果之前，有時需要雜交條件的最適化、探針序列的再設(shè)計或者陣列的再制作。與之相對，在本發(fā)明中，不必進(jìn)行探針序列的再設(shè)計，陣列的再制作，可以通常相同規(guī)格的陣列進(jìn)行評價。序列用自由正文序列號1-100 :探針；序列號101-103 :引物；序列號104-105 :探針；序列號106-107 :引物權(quán)利要求
1.樣本中的靶核酸的檢測方法，包括以下步驟 制備包含檢測用探針的固相體的步驟，所述檢測用探針各自具有不同的給定堿基序列； 對所述樣本進(jìn)行PCR，從而獲得具有預(yù)先與所述靶核酸關(guān)聯(lián)的與所述檢測用探針互補(bǔ)的標(biāo)簽序列和標(biāo)識的嵌合DNA的步驟； 使所述嵌合DNA和所述檢測用探針以能通過所述標(biāo)簽序列雜交的方式接觸的步驟； 基于所述固相體上的所述標(biāo)識獲得信號強(qiáng)度信息的步驟；和 基于所述信號強(qiáng)度信息檢測所述靶核酸的步驟。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中在所述PCR步驟中， 制備第I引物和第2引物，所述第I引物具有與所述靶核酸中的靶序列互補(bǔ)的識別用序列和與所述標(biāo)簽序列互補(bǔ)的標(biāo)簽添加用序列，所述第2引物具有與同所述靶序列鄰接的部分序列一致的部分序列和標(biāo)識， 使用所述第I引物和所述第2引物對所述樣本進(jìn)行PCR，從而合成具有所述靶序列、所述標(biāo)簽序列和所述標(biāo)識的嵌合DNA。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中對于2個以上的所述靶核酸，所述PCR步驟是使用2個以上的所述第I引物和2個以上的所述靶核酸共通的I個所述第2引物的步驟。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述PCR步驟是采用非對稱PCR擴(kuò)增所述嵌合DNA的步驟。
5.用于檢測權(quán)利要求1-4中記載的靶核酸的陣列，其包含能與預(yù)先與所述靶核酸關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽序列雜交的檢測用探針。
全文摘要
本說明書的公開內(nèi)容的目的是提供可有效構(gòu)建靶核酸的檢測體系的靶核酸的檢測方法。為此目的，本說明書的公開內(nèi)容制備了第1引物(30)和第2引物(40)，所述第1引物(30)具有與靶核酸中的靶序列(12)互補(bǔ)的識別用序列(32)和標(biāo)簽添加用序列(36)，所述第2引物具有標(biāo)識(42)。針對樣本中的靶核酸(10)，使用第1引物(30)和第2引物(40)，擴(kuò)增具有標(biāo)簽序列(66)和標(biāo)識(42)的嵌合DNA(60)。使嵌合DNA(60)與固相體(100)的檢測用探針(104)雜交，獲得基于標(biāo)識(42)的信號強(qiáng)度信息，并基于信號強(qiáng)度信息檢測靶核酸(10)。
文檔編號C12Q1/68GK102639714SQ20108004928
公開日2012年8月15日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者丹羽孝介, 川瀨三雄, 廣田壽一 申請人:日本礙子株式會社