專利名稱：烯酮還原酶基因和左旋二酮的微生物生產(chǎn)的制作方法
本申請涉及編碼烯酮還原酶的DNA，包含該DNA的表達載體，導入了該DNA的微生物，和利用該微生物從2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮(以下稱為酮基異佛爾酮(ketoisophorone)生產(chǎn)(6R)-2，2，6-三甲基-1，4-環(huán)己烷二酮(以下稱為左旋二酮(levodione)的方法。
左旋二酮是一種在合成例如玉米黃質(zhì)的旋光活性類胡蘿卜素方面有用的中間物。從酮基異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的微生物生產(chǎn)過程是已知的(US4,156,100)。分離自乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、作用于酮基異佛爾酮以生產(chǎn)左旋二酮的烯酮還原酶在2002年2月22日提交的歐洲專利申請No.02003967.3中有描述。這個酶的特點在于下列理化性質(zhì)(a)分子量61,300±5,000Da(利用凝膠過濾測定。由一個亞基組成。)(b)輔助因子NADPH和NADH(c)底物特異性作用于α，β-不飽和酮(d)最適宜的溫度55-60℃，pH7.4(e)最適pH值pH4.5-8.5此處使用的術語“烯酮還原酶(enone reductase)”包括按照生物化學和分子生物學國際協(xié)會命名委員會(NC-IUBMB)提供的酶命名法定義的催化羰基活化的雙鍵的酶還原的蛋白質(zhì)。還涉及具有烯酮還原酶的上述活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)優(yōu)選催化酮基異佛爾酮轉(zhuǎn)化成左旋二酮。涉及左旋二酮生物合成的烯酮還原酶的基因?qū)τ诟纳谱笮奈⑸锷a(chǎn)產(chǎn)量非常有用。
本發(fā)明提供編碼烯酮還原酶的分離的DNA序列。
該分離的DNA序列可被更確切地表征為(a)它編碼具有SEQ ID NO2描述的氨基酸序列的酶，或(b)它編碼酶的變體，選自(i)等位變體，和(ii)具有一個或多個氨基酸的添加、插入、刪除和/或替換并具有申明的酶活性的酶。
更特別地，本發(fā)明提供來源于乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母(Candidamacedoniensis))IFO 0960的基因的DNA序列，選自(i)SEQ ID NO1所示的序列，(ii)SEQ ID NO1所示DNA序列的等同編碼變體(isocoding variant)或等位基因變體(allelic variant)，(iii)SEQ ID NO1所示DNA序列的衍生物，具有一個或多個核苷酸的添加、插入、刪除和/或替換并編碼具有所述酶活性的多肽，(iv)在嚴緊雜交條件下與(i)或(ii)的核苷酸序列的互補序列雜交、并編碼具有所述酶活性的多肽的DNA序列，和(v)與(i)的核苷酸序列具有至少80％的同一性并編碼具有所述酶活性的多肽的DNA序列。
乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960菌株可以從大阪發(fā)酵研究所(IFO)，17-85Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，大阪，532-8686，日本，公開地獲得。
通過雜交鑒別DNA序列的操作指南對于本領域的技術人員是公知的。雜交可在嚴緊條件下發(fā)生，在該條件下僅當雜交物中探針和目標序列，例如用該探針處理的多核苷酸具有至少70％的同一性時，雜交物才會形成。已知的是雜交的嚴緊度、包括洗滌步驟，受緩沖液成分、溫度和鹽濃度變化的影響，或由它們決定。雜交反應優(yōu)選在與洗滌步驟相比相對低的嚴緊度下進行。
例如，5×SSC緩沖液、大約50-68℃的溫度，可用于雜交反應。此時探針也可以和那些與該探針的序列具有小于70％同一性的多核苷酸雜交。這種雜交物不太穩(wěn)定，在嚴緊條件下洗滌時會被除去。這可以通過，例如在大約50-68℃的溫度下將鹽濃度降低到2×SSC、隨后到0.5×SSC來實現(xiàn)。也可以選擇性地將鹽濃度降低到0.1×SSC。多核苷酸片段，例如，與使用的探針的序列具有至少70％或至少80％、或至少90％到95％的同一性的多核苷酸片段，可以通過以約1-2℃為一級逐步地升高雜交溫度來分離。
在本發(fā)明的上下文中“嚴緊條件”是指在緩沖液中，例如，在由5×SSC、0.1％(w/v)N-十二烷基肌氨酸、0.02％(w/v)SDS、1％封閉試劑(RocheDiagnostics，Cat.No.1096 176)組成的緩沖液中50℃過夜雜交，在雜交的洗滌步驟中在室溫下用2×SSC、0.1％(w/v)SDS洗滌5分鐘，洗兩次，隨后在68℃用0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS洗滌15分鐘，洗兩次。
DNA序列可以從乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960菌株，或另一個或有關的生物體例如，可以是該DNA序列的烯酮還原酶編碼區(qū)的等位變體或種系變體中克隆出來。同樣包括在本發(fā)明的范圍中的還有DNA序列的衍生物，其具有不同核苷酸的添加、插入、刪除和/或替換從而產(chǎn)生編碼同樣的或功能上等同的左旋二酮還原酶的多肽。該編碼的蛋白質(zhì)也可包含產(chǎn)生沉默變化并產(chǎn)生功能上等同的烯酮還原酶的氨基酸殘基的添加、刪除和/或替換。
本發(fā)明的DNA還指包含與目的基因的表達有關的調(diào)控序列例如啟動子和終止子的基因組DNA，以及僅包含5′和3′非翻譯區(qū)中短片段側(cè)翼之間的開放閱讀框的cDNA。
在本發(fā)明中使用的烯酮還原酶基因、重組體表達載體、和重組生物體可通過以下步驟獲得-從可以提供本發(fā)明的烯酮還原酶的微生物分離染色體DNA并用該染色體DNA構(gòu)建基因文庫。
-通過菌落或噬菌斑雜交、PCR克隆、Southern印跡雜交等從染色體DNA中克隆烯酮還原酶基因。
-通過通常的方法確定如上獲得的烯酮還原酶基因的核苷酸序列并構(gòu)建包含并有效地表達該烯酮還原酶基因的重組表達載體。
-通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導，轉(zhuǎn)接合或電穿孔構(gòu)建攜帶重組表達載體上或染色體上的烯酮還原酶基因的重組生物體。
用于分離或克隆編碼本發(fā)明烯酮還原酶的DNA的技術是本領域已知的，包括從基因組DNA中分離。可利用簡并的聚合酶鏈式反應(以下稱為PCR)從這樣的基因組DNA中克隆本發(fā)明的DNA序列。
根據(jù)部分氨基酸序列的信息，可合成作為PCR引物的寡聚核苷酸。用于通過PCR克隆烯酮還原酶基因的引物可以以純化的烯酮還原酶的肽片段的氨基酸序列為依據(jù)，烯酮還原酶是來自包括，但不限于，假絲酵母屬(Candida)和接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，在最優(yōu)選的實施方式中，來自乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960。烯酮還原酶的DNA片段(部分DNA序列)利用所述引物和例如C.kefyr染色體DNA的模板通過PCR擴增產(chǎn)生。擴增的DNA片段可以用作探針來克隆編碼整個烯酮還原酶的基因組片段。包含其編碼區(qū)以及調(diào)控區(qū)例如啟動子或終止子的完整基因可以從染色體中克隆，例如，在測序之后，利用依據(jù)獲得的DNA片段的部分序列的引物，通過反向PCR法克隆，或通過利用上述PCR法獲得的DNA片段作為探針，在進行標記后，篩選在適當宿主中構(gòu)建的噬菌體載體或質(zhì)粒載體的基因文庫來克隆。
通常，作為宿主菌株的大腸桿菌和大腸桿菌載體、噬菌體載體例如λ噬菌體載體、質(zhì)粒載體或酵母載體常被用于文庫的構(gòu)建，隨后進行基因操作例如測序、限制性消化、連接等。在分離了包含其編碼區(qū)以及調(diào)控區(qū)的完整基因的全部必需部分之后，獲得的片段被亞克隆入適當?shù)馁|(zhì)粒載體，其可被方便地用于測序和構(gòu)建烯酮還原酶的完整基因。在本發(fā)明中，插入片段被亞克隆入pUC18載體。核苷酸序列可以通過公知的方法例如雙脫氧鏈終止法來確定。
本發(fā)明的分離的DNA序列可按照本領域公知的方法，用來鑒別和克隆來自其他不同的屬或種的編碼具有烯酮還原酶活性的多肽的DNA。
本發(fā)明還涉及重組DNA，優(yōu)選的是包含編碼烯酮還原酶的序列的載體和/或質(zhì)粒。所述重組DNA載體和/或質(zhì)?？砂{(diào)控區(qū)例如啟動子和終止子以及烯酮還原酶基因的開放閱讀框?？捎帽绢I域普通技術人員公知的方法構(gòu)建表達載體，其包含編碼烯酮還原酶的核苷酸序列和適當?shù)霓D(zhuǎn)錄的和翻譯的調(diào)控元件，包括對所述核苷酸序列的編碼序列的表達是必需的或是有利的所有組件。也可使用特殊的起始和終止信號為編碼烯酮還原酶的序列實現(xiàn)更有效的翻譯。編碼烯酮還原酶的分離的DNA序列可以用各種方法進行操作以準備所述多肽的表達。取決于表達載體，在插入載體之前對編碼烯酮還原酶的核苷酸序列進行的操作是可取的或必需的。利用克隆方法修改核苷酸序列的技術是本領域公知的?？梢岳酶鞣N表達載體/宿主系統(tǒng)來包含和表達編碼烯酮還原酶的序列。
本發(fā)明還提供該重組DNA轉(zhuǎn)化宿主生物的用途。重組DNA的適宜的形式可以是載體。用重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主生物在生產(chǎn)烯酮還原酶的多肽以及改善左旋二酮的生產(chǎn)過程方面是有用的。因而，本發(fā)明還提供這樣的轉(zhuǎn)化的宿主細胞(重組微生物)和該重組DNA編碼的多肽。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)該重組DNA編碼的多肽的方法，包括在適合于酶表達的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細胞，和從細胞培養(yǎng)物中回收所述多肽。重組微生物的培養(yǎng)可以是有氧的或厭氧的、pH值從4.0到9.0、溫度在從10到60℃的范圍內(nèi)、培養(yǎng)15分鐘到72小時，優(yōu)選的，pH值從5.0到8.0、溫度在20到40℃的范圍內(nèi)，培養(yǎng)30分鐘到48小時。取決于序列和/或使用的載體，所述重組細胞生產(chǎn)的烯酮還原酶可以是分泌的或包含在細胞內(nèi)部的。然后可以通過傳統(tǒng)步驟從培養(yǎng)基或重組細胞中分離所述烯酮還原酶。
本發(fā)明進一步提供左旋二酮的生產(chǎn)過程，包括用所述烯酮還原酶多肽接觸酮基異佛爾酮。
本發(fā)明的烯酮還原酶在輔助因子NADH或NADPH的存在下，按照以下公式催化酮基異佛爾酮還原成左旋二酮
該反應可以在例如Tris-HCl緩沖液和磷酸鹽緩沖液的溶劑中進行。
優(yōu)選的反應條件是pH值從4.5到8.5，更優(yōu)選的從5.0到8.0，溫度范圍從10到60℃，更優(yōu)選的從20到60℃，反應時間5分鐘到72小時，更優(yōu)選的15分鐘到48小時。
本發(fā)明還提供左旋二酮的生物生產(chǎn)方法，包括在適合于左旋二酮的生產(chǎn)的條件下用如上所述的重組微生物接觸酮基異佛爾酮，其中包括在作為底物的酮基異佛爾酮存在下培養(yǎng)所述重組微生物，并從反應混合物中分離生成的左旋二酮。
重組微生物的生長的細胞或靜止細胞培養(yǎng)物，或固定化細胞，或無細胞抽提物等，都可用于左旋二酮的生產(chǎn)。
生長的細胞培養(yǎng)物可以通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組微生物來獲得，培養(yǎng)基包含糖類，例如葡萄糖或蔗糖，醇類，例如乙醇或甘油，脂肪酸，例如油酸和硬脂酸或它們的酯，或油類，例如菜籽油或豆油，作為碳源；硫酸銨，硝酸鈉，蛋白胨，氨基酸，玉米漿，麥麩，酵母抽提物等，作為氮源；硫酸鎂，氯化鈉，碳酸鈣，磷酸氫鉀，磷酸二氫鉀等，作為無機鹽來源；和麥芽提取物，肉膏等，作為其他的營養(yǎng)物來源。重組微生物的培養(yǎng)可以是有氧的或厭氧的、pH值從4.0到9.0、溫度在從10到60℃的范圍內(nèi)、培養(yǎng)15分鐘到72小時，優(yōu)選的，pH值從5.0到8.0、溫度在20到40℃的范圍內(nèi)，培養(yǎng)30分鐘到48小時。在培養(yǎng)期間對培養(yǎng)物適當?shù)臄嚢鑼⒂兄诩毎L或反應的進行。
利用如此獲得的生長的細胞培養(yǎng)物，可通過任何本領域公知的方法來制備靜止細胞培養(yǎng)物或固定化細胞或無細胞抽提物。
生產(chǎn)左旋二酮的優(yōu)選的條件是pH值從4.0到9.0，溫度范圍從10到60℃，反應15分鐘到72小時。
生產(chǎn)左旋二酮的更加優(yōu)選的條件是pH值從5.0到8.0，溫度范圍從20到60℃，反應30分鐘到48小時。
取決于其他的反應條件，反應混合物中酮基異佛爾酮的濃度可以變化，但通常在0.1g/l到300g/l之間，優(yōu)選的在1g/l到30g/l之間。
在如上所述反應混合物中酶生產(chǎn)的或生物生產(chǎn)的左旋二酮可以通過有機溶劑例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯或正丁烷來提取。提取物可以通過已知的方法分析，如氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析法或紙層析法等。在氣相色譜法中，作為例子可以使用以下條件柱ULBON HR 20M(Shinwa，Japan)0.25mm×30m；柱溫度160℃(恒定)；注入器溫度250℃；運載氣體He(大約1ml/min)。
在反應之后，反應混合物中的左旋二酮可以，例如，通過用容易使左旋二酮溶解的、不與水混合的有機溶劑例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯、或乙酸正丁酯進行提取來回收。左旋二酮的進一步提純可以通過濃縮提取物直接結(jié)晶左旋二酮或通過各種層析法的組合，例如薄層層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、或高效液相色譜法來進行。
以下的實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例1乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960的烯酮還原酶的部分氨基酸序列C.kefyr的凍干純化的烯酮還原酶(在2002年2月22日提交的歐洲專利申請No.02003967.3中描述)用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生的消化物用Smart系統(tǒng)分離，例如，將1nmol純化的酶溶于包含8M尿素的25μl 50mMTris-HCl緩沖液(pH8.6)中，在37℃孵育1小時。此后，添加25μl 50mMTris-HCl緩沖液(pH8.6)使尿素濃度變?yōu)?M。然后，添加0.5μl 12nmol/ml賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(Wako，Japan，0.006nmol，E/S＝1/167)，在30℃孵育6小時。產(chǎn)生的肽用以下條件通過Smart系統(tǒng)分離柱μRPC C2/C18 SC2.1/10(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，英國)；流速100μl/min；液體A0.1％TFA；液體B0.1％TFA+80％CH3CN；梯度100％A(0-15分鐘)；100％A→100％B(15-75分鐘)；柱溫度室溫；檢測214nm，280nm。
肽(K-15，K-25.1，K6.1，K6.2，K30，K13.2，K-1.1，K-1.2，K-33，K-25.2，K-20，K-17，K-22，K-4.1，K-13.1，和K-9)被分離出來，用蛋白質(zhì)測序儀分析這些多肽的氨基酸序列，例如，通過用491HT脈沖液體蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California)自動進行Edman降解，得到肽K-15SEQ ID NO3；肽K-25.1SEQ ID NO4；肽K-6.1SEQ ID NO5；肽K-6.2SEQ ID NO6；肽K-30SEQ ID NO7；肽K-13.2SEQ ID NO8；肽K-1.1SEQ ID NO9；肽K-1.2SEQ ID NO10；肽K-33SEQ IDNO11；肽K-25.2SEQ ID NO12；肽K-20SEQ ID NO13；肽K-17SEQ ID NO14；肽K-22SEQ ID NO15；肽K-4.1SEQ ID NO16；肽K-13.1SEQ ID NO17；肽K-9SEQ ID NO18。
將獲得的部分氨基酸序列與保存在SWISS PROT(版本37.0+/06-14，99年6月)、PIR(版本60.0，99年5月)和PRF(版本99-05，99年5月)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進行對比。利用Blast(J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)和Fasta(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448，1988)程序進行序列對比。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與已知的老黃酶(Old Yellow Enzymes)有高同源性。
實施例2乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960的染色體DNA的制備乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960的細胞在200ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過離心收集細胞并懸浮在10ml TES緩沖液中。向細胞懸液中添加3ml0.5M EDTA、0.5ml消解酶溶液和0.5ml蛋白酶K溶液。在37℃輕輕地攪拌孵育0.5小時后，添加2ml10％SDS并攪拌。在加H2O使體積到達20ml之后，添加10ml TE飽和的苯酚和10ml氯仿并攪拌。離心后收集上層液，添加同樣體積的苯酚/氯仿并混合。離心后，收集上層液并添加0.1倍體積的3M醋酸鈉和2.5倍體積的乙醇。利用纏繞玻璃棒收集DNA沉淀，用70％、80％和90％乙醇沖洗，干燥并懸浮于5ml包含10μl 5mg/ml RNase A的TE緩沖液中。通過在4℃下輕輕地攪拌過夜完全溶解DNA。再添加10μl 5mg/mlRNase A，DNA溶液在37℃孵育2小時。在用苯酚/氯仿處理后，回收水層，DNA用乙醇沉淀，然后離心。團狀物重懸浮于50ml TE緩沖液中。如此獲得的基因組DNA的濃度是88ng/μl。
實施例3乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960的部分烯酮還原酶基因的克隆利用制備的基因組DNA作為模板，通過利用熱循環(huán)儀(Perkin-ElmerCetus Instruments，USA)進行簡并的PCR擴增獲得烯酮還原酶基因的部分序列。簡并的PCR引物根據(jù)實施例1中獲得的部分氨基酸序列(K-15，K-13.1和K-9)設計，如下
有義引物1(SEQ ID NO19) 反義引物2(SEQ ID NO20) PCR反應(50μl)利用176ng染色體DNA(獲得自實施例2)作為模板，150pmol每種簡并的引物，2.5nmol每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.5單位的Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo，Kyoto，Japan)，和5μl EX Taq緩沖液(Takara Shuzo)進行。最初的模板變性步驟為94℃4分鐘。94℃1分鐘、50℃1分鐘和72℃1.5分鐘的擴增循環(huán)重復35次。在附加的72℃反應10分鐘之后，擴增出包含部分烯酮還原酶基因的DNA片段(約1kb)。將該片段克隆到測序載體上，通過雙脫氧鏈鏈終止法確定DNA序列。Taq著色引物測序試劑盒與自動測序儀(DNA測序儀373A，Applied Biosystems)一同使用。如此獲得的烯酮還原酶的部分DNA序列和推測的氨基酸序列分別如SEQ IDNO21和SEQ ID NO22所示。
實施例4乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960的完整烯酮還原酶基因的克隆用反向PCR克隆實施例3中獲得的部分烯酮還原酶DNA序列側(cè)翼的上游和下游序列。
1μg乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960的基因組DNA(獲得自實施例2)用10單位Nco I(Takara Shuzo，Kyoto，Japan)在包含0.01％BSA的50μlK緩沖液中消化。在37℃反應過夜后，用苯酚/氯仿處理反應混合物，回收水層，DNA用乙醇沉淀，然后離心。DNA團狀物重懸浮于1ml包含700單位T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)的T4 DNA連接酶緩沖液中。在15℃反應過夜后，用苯酚/氯仿處理反應混合物，回收水層，DNA用乙醇沉淀，然后離心。DNA團狀物重懸浮于TE緩沖液中用作PCR的模板。PCR引物根據(jù)實施例3中獲得的部分烯酮還原酶基因序列設計，如下IA1(用于上游區(qū)的反義引物)＝SEQ ID NO23和IS1(用于下游區(qū)的有義引物)＝SEQ ID NO24。
PCR反應(50μl)利用250ng模板DNA，5pmol每種引物，2.5nmol每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP，2.5單位的Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)和5μlEX Taq緩沖液(Takara Shuzo)進行。最初的模板變性步驟為94℃4分鐘。94℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃4分鐘的擴增循環(huán)重復30次。在附加的72℃反應10分鐘后，擴增出包含烯酮還原酶基因的上游和下游序列的DNA片段(約4kb)。將該片段克隆到測序載體上，確定DNA序列。
通過將如此獲得的序列與實施例3獲得的部分烯酮還原酶DNA序列組合，獲得了包含其編碼區(qū)以及調(diào)控區(qū)例如啟動子或終止子的預計的完整基因序列。如此獲得的烯酮還原酶的預計的完整序列如SEQ ID NO25所示，它包含編碼區(qū)以及其側(cè)翼的上游和下游區(qū)(預計的ORF是148-1359)。
然后，通過如下的PCR，獲得了包含其編碼區(qū)以及側(cè)翼的上游和下游區(qū)的烯酮還原酶的實際的完整序列。
使用乳酒假絲酵母(馬其頓假絲酵母)IFO 0960的基因組DNA(獲得自實施例2)作為模板。根據(jù)上面獲得的預計的烯酮還原酶基因序列(SEQ IDNO25)設計PCR引物，在SEQ ID NO26(有義)和SEQ ID NO27(反義)中說明。
PCR反應(50μl)利用900ng模板DNA，10pmol每種引物，2.5nmol每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP，100nmol MgCl2，1.5單位的LA Taq聚合酶(TakaraShuzo)和5μl LA Taq緩沖液(Takara Shuzo)進行。最初的模板變性步驟為94℃2分鐘。94℃1分鐘、60℃1分鐘和74℃1.5分鐘的擴增循環(huán)重復23次。在附加的74℃反應7分鐘后，擴增出包含烯酮還原酶基因的完整序列的DNA片段(約1.3kb)。將該片段克隆到測序載體上，確定DNA序列。
如此獲得的包含其編碼區(qū)以及側(cè)翼的上游和下游區(qū)的烯酮還原酶的完整DNA序列如SEQ ID NO28所示(ORF為55-1266)。
實施例5烯酮還原酶基因的表達和利用具有C.kefyr的烯酮還原酶基因的大腸桿菌進行左旋二酮生產(chǎn)通過PCR擴增獲得一個僅包含烯酮還原酶基因的ORF(1212bp)的DNA片段。使用引物ExS(SEQ ID NO29)和ExA(SEQ ID NO30)進行PCR。
攜帶烯酮還原酶基因的完整序列(獲得自實施例4)的載體被用作模板。PCR反應(50μl)利用250ng模板DNA，10pmol每種引物，2.5nmol每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.5單位的Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)和5μlPyrobest緩沖液(Takara Shuzo)進行。最初的模板變性步驟為94℃1分鐘。94℃0.5分鐘、60℃1分鐘和75℃1.5分鐘的擴增循環(huán)重復15次。在附加的75℃反應5分鐘后，擴增出僅包含烯酮還原酶基因的ORF的DNA片段(約1.2kb)。
使用pET Directional TOPOS表達試劑盒(Invitrogen Corporation，USA)按照廠家提供的使用手冊，將該擴增的烯酮還原酶基因片段克隆到載體pET101/D-TOPO上。將如此獲得的攜帶烯酮還原酶基因的載體(pET101/D-TOPO-ER)導入大腸桿菌BL21(DE3)，選出幾個克隆利用自動測序分析儀(DNA測序儀373A，Applied Biosystems)進行序列分析。將其中一個顯示了與C.kefyr的烯酮還原酶序列完全相同的序列的克隆，大腸桿菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]選出，用于進一步實驗。還制備出大腸桿菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO]菌株作為對照。
將大腸桿菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]和大腸桿菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO]菌株接種到包含0.05mg/ml氨芐青霉素和2％(W/V)酪蛋白氨基酸(Difco laboratories，USA)的M9基本培養(yǎng)基(每試管5ml)中，在37℃下培養(yǎng)。當610nm處的光密度到達0.4時，向培養(yǎng)基添加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其濃度達到0.01mM，繼續(xù)培養(yǎng)8-10小時。然后通過離心收集細胞，一部分細胞用于SDS-PAGE分析。結(jié)果，僅當使用重組菌株大腸桿菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]時，才觀察到預計為45kDa的IPTG誘導的蛋白帶。
其余收集的細胞重懸浮于2ml 100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。該混懸液用于證實從酮基異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的活性。將該混懸液分成兩部分(各1ml)，添加33mM(最終濃度，以下縮寫為f.c.)酮基異佛爾酮和280mM(f.c.)D-葡萄糖、有或者沒有0.37mM(f.c.)NAD+、15單位/ml(f.c.)葡糖脫氫酶，開始反應。在30℃下反應過夜。反應混合物用乙酸乙酯提取以回收乙酸乙酯層中的左旋二酮。通過氣相色譜法分析提取物。結(jié)果，僅當使用重組菌株大腸桿菌BL21(DE3)[pET101/D-TOPO-ER]時，才檢測到左旋二酮。
序列表<110>羅奇維生素股份公司(Roche Vitamins AG)<120>烯酮還原酶基因和左旋二酮的微生物生產(chǎn)<130>NDR5231<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1212<212>DNA<213>乳酒假絲酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(1212)<400>1atg tcg tac atg aac ttt gac cct aag cca ttg gga gac acc aat atc 48Met Ser Tyr Met Asn Phe Asp Pro Lys Pro Leu Gly Asp Thr Asn Ile1 5 10 15ttc aag cca atc aag atc ggt aac aat gag cta aaa cac aga gta gtc 96Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Lys His Arg Val Val20 25 30atg cca gca ttg act aga atg aga gcc att gca cca gga aac atc cca 144Met Pro Ala Leu Thr Arg Met Arg Ala Ile Ala Pro Gly Asn Ile Pro35 40 45aac act gaa tgg gcc gag gaa tac tac aga caa cgt tct caa tac cct 192Asn Thr Glu Trp Ala Glu Glu Tyr Tyr Arg Gln Arg Ser Gln Tyr Pro50 55 60ggt acc ctt att atc acg gaa ggt act ttc cct tct gcg caa tca ggt 240Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser Ala Gln Ser Gly65 70 75 80ggt tac cca aat gtg cca ggt atc tgg tcc aaa gag caa ttg gct gaa 288Gly Tyr Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Ser Lys Glu Gln Leu Ala Glu85 90 95tgg aaa aag atc ttc aat gca atc cat gag aac aaa tcg ttc gtg tgg 336Trp Lys Lys Ile Phe Asn Ala lle His Glu Asn Lys Ser Phe Val Trp100 105 110gtg caa ttg tgg gtt cta ggt aga caa gca tgg cca gaa gtg ttg aag 384Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Ala Trp Pro Glu Val Leu Lys115 120 125aag gaa ggt ttg cgt tac gat agt gct acc gat gac ttg tac atg ggt 432Lys Glu Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asp Leu Tyr Met Gly130 135 140gaa gaa gaa aaa gag cgt gcc tta aag gct aac aac cca cag cac ggt 480Glu Glu Glu Lys Glu Arg Ala Leu Lys Ala Asn Asn Pro Gln His Gly145 150 155 160atc acc aag gaa gaa atc aag cag tac atc aag gag tac gtg gat gct 528Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Glu Tyr Val Asp Ala165 170 175gcc aag aaa gcc atc gat gca ggt gca gac ggt gtg caa atc cat tct 576Ala Lys Lys Ala Ile Asp Ala Gly Ala Asp Gly Val Gln Ile His Ser180 185 190gcc aac ggt tac ttg ttg aac cag ttt ttg gac cct att tct aac aac 624Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro Ile Ser Asn Asn195 200 205aga acc gac gag tac ggt gga tcg atc gag aac cgt gcg aga ttc act 672Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe Thr
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Gly Tyr Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Ser Lys Glu Gln Leu Ala Glu85 90 95Trp Lys Lys Ile Phe Asn Ala Ile His Glu Asn Lys Ser Phe Val Trp100 105 110Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Ala Trp Pro Glu Val Leu Lys115 120 125Lys Glu Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Thr Asp Asp Leu Tyr Met Gly130 135 140Glu Glu Glu Lys Glu Arg Ala Leu Lys Ala Asn Asn Pro Gln His Gly145 150 155 160Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Glu Tyr Val Asp Ala165 170 175Ala Lys Lys Ala Ile Asp Ala Gly Ala Asp Gly Val Gln Ile His Ser180 185 190Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro Ile Ser Asn Asn195 200 205Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe Thr210 215 220Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Val Gly Ala Glu Arg Thr225 230 235 240Ser Ile Arg Phe Ser Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Thr Met Ser Gly Gly245 250 255Glu Asn Pro Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Ile Gly Glu Leu260 265 270Glu Lys Arg Ala Arg Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Ile Asp Leu Val275 280 285Glu Pro Arg Val Thr Asp Pro Phe Leu Pro Glu Phe Glu Lys Trp Phe290 295 300Lys Glu Gly Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro Val305 310 315 320Leu Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Pro Asp Gln Ala Thr Leu Asp325 330 335Ser Lys Lys Pro Asn Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Ser Phe Ile Ala340 345 350Asn Pro Asp Leu Val Tyr Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn Lys355 360 365Tyr Asp Arg Asn Thr Phe Tyr Thr Phe Thr Lys Glu Gly Tyr Thr Asp370 375 380
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<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)
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<221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>Xaa是未知的<220>
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<223>reverse sequence of a partial amino acid sequence of enonereductase<400>20Gly Glu Lys Thr Phe Thr Tyr Phe Thr1 5<210>21<211>1058<212>DNA<213>乳酒假絲酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(1056)<400>21cac aga gta gtc atg cca gca ttg act aga atg aga gcc att gca cca 48His Arg Val Val Met Pro Ala Leu Thr Arg Met Arg Ala Ile Ala Pro1 5 10 15gga aac atc cca aac act gaa tgg gcc gag gaa tac tac aga caa cgt 96Gly Asn Ile Pro Asn Thr Glu Trp Ala Glu Glu Tyr Tyr Arg Gln Arg20 25 30tct caa tac cct ggt acc ctt att atc acg gaa ggt act ttc cct tct144Ser Gln Tyr Pro Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser35 40 45gcg caa tca ggt ggt tac cca aat gtg cca ggt atc tgg tcc aaa gag192Ala Gln Ser Gly Gly Tyr Pro Asn Val Pro Gly Ile Trp Ser Lys Glu50 55 60caa ttg gct gaa tgg aaa aag atc ttc aat gca atc cat gag aac aaa240
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權(quán)利要求
1.一種分離的DNA，包括編碼具有烯酮還原酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述酶的特征在于以下理化特性(a)分子量61,300±5,000Da(利用凝膠過濾測定，由一個亞基組成)；(b)輔助因子NADPH和NADH；(c)底物特異性作用于α，β-不飽和酮；(d)最適宜的溫度55-60℃，pH 7.4；和(e)最適pH值pH 4.5-8.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的DNA，其中所述核苷酸序列選自如下構(gòu)成的組(a)編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽的等位變體的核苷酸序列；和(c)編碼在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸的添加、插入、刪除和/或替換但具有烯酮還原酶活性的多肽的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的DNA，其中所述核苷酸序列選自如下構(gòu)成的組(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)編碼烯酮還原酶的核苷酸序列，該烯酮還原酶具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(c)在嚴緊雜交條件下與(a)或(b)的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列；和(d)與(a)的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
4.包含權(quán)利要求1的DNA的載體或質(zhì)粒。
5.用權(quán)利要求1的DNA或權(quán)利要求4的載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
6.權(quán)利要求1的DNA編碼的多肽。
7.左旋二酮的生產(chǎn)方法，包括在適合于左旋二酮的生產(chǎn)的條件下用權(quán)利要求6的多肽接觸酮基異佛爾酮，例如，pH值從4.5到8.5、溫度范圍從10到60℃接觸5分鐘到72小時的條件，或pH值從5.0到8.0、溫度范圍從20到60℃接觸15分鐘到48小時的條件。
8.左旋二酮的生產(chǎn)方法，包括在適合于左旋二酮的生產(chǎn)的條件下用權(quán)利要求5的宿主細胞或其無細胞抽提物接觸酮基異佛爾酮，例如，pH值從4.0到9.0、溫度范圍從10到60℃接觸15分鐘到72小時的條件，或pH值從5.0到8.0、溫度范圍從20到60℃接觸30分鐘到48小時的條件。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離的DNA，包含編碼具有烯酮還原酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述酶的特征在于以下理化性質(zhì)(a)分子量61,300±5,000Da(利用凝膠過濾估測，由一個亞基組成)；(b)輔助因子NADPH和NADH；(c)底物特異性對α，β－不飽和酮有活性；(d)最適溫度55－60℃，pH7.4；和(e)最適pH值pH4.5－8.5。
文檔編號C12P7/26GK1751123SQ03822613
公開日2006年3月22日 申請日期2003年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月23日
發(fā)明者片岡道彥, 清水昌 申請人:Dsm Ip資產(chǎn)公司