專利名稱：一種提高微生物法制備耐熱耐堿性過氧化氫酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種提高微生物法制備耐熱耐堿性過氧化氫酶產(chǎn)量的方法，涉及金黃色嗜熱子囊菌發(fā)酵制備過氧化氫酶。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶是一種催化效率非常高的生化酶，在食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè)一直有著廣泛的用途。它可作為消除啤酒、飲料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化劑。與葡萄糖氧化酶并用作氧的去除劑，牛乳殺菌及干酪原料乳的殺菌。在臨床分析中，對研究自由基代謝失衡，抗衰老和腫瘤發(fā)病機(jī)理具有一定價(jià)值，對某些疾病的診斷，鑒別診斷亦具有重要意義。在醫(yī)藥方面，可用于隱形眼鏡消毒過程中殘留過氧化氫的分解。過氧化氫酶還與H2O2同時(shí)使用，用于橡膠成型，塑料及多泡性粘合劑。近年來隨著H2O2在紡織、造紙、制漿等行業(yè)的普遍應(yīng)用，市場對過氧化氫酶的需求呈大幅增長趨勢。其中在織物染整工藝中，采用過氧化氫酶去除漂白廢液中殘余H2O2，不僅能避免給后續(xù)染色工序帶來問題，大幅度提高過氧化氫去除率從而確保染色的良好可再現(xiàn)性，還能使漂染同浴，節(jié)省大量的水、電、汽的消耗并顯著提高生產(chǎn)效率。
動(dòng)物肝臟是過氧化氫酶的一個(gè)很大來源，國內(nèi)外均已實(shí)現(xiàn)這一工藝的工業(yè)化生產(chǎn)。巴西研究者最近開發(fā)了從人胎盤中提取醫(yī)用過氧化氫酶的技術(shù)?，F(xiàn)有紡織用商品過氧化氫酶基本由丹麥諾維信公司壟斷，它來源于經(jīng)基因改性后的黑曲霉。國內(nèi)用微生物生產(chǎn)過氧化氫酶尚停留在研究階段，研究用菌種有溶壁微球菌、黑曲霉、嗜熱鏈霉菌，生產(chǎn)水平較低。
在織物染整工藝中運(yùn)用過氧化氫酶實(shí)現(xiàn)漂染同浴雖然具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保效益，但實(shí)現(xiàn)這一工藝的主要問題是在高溫和強(qiáng)堿性條件下過氧化氫酶的穩(wěn)定性問題。從人或動(dòng)物臟器中提取的過氧化氫酶熱穩(wěn)定性很差，且受來源和季節(jié)等因素影響較大。細(xì)菌過氧化氫酶的熱、堿穩(wěn)定性雖然可隨來源不同而不同，但大都為胞內(nèi)酶，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)和提取均不方便。用工程菌合成的過氧化氫酶，則僅限于性質(zhì)研究，沒有開展生產(chǎn)性的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高微生物法制備耐熱耐堿性過氧化氫酶產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案菌種金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862。購自日本國NITE Biological Resource Center Biotechnology Center National Lnstitute ofTechnology and Evaluation培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基PDA(g/L)馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂16，pH 6.0。
種子培養(yǎng)基(g/L)酵母膏4，玉米淀粉15，K2HPO41，Na2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，pH 6.8。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)糊精10～30，乙醇0.5％～3％(培養(yǎng)基體積比)，蛋白胨5～20，K2HPO45，KH2PO4·3H2O 3，MgSO4·7H2O 2，pH 7.0。
培養(yǎng)方法將成熟的孢子接種到PDA斜面上，45℃下培養(yǎng)6-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，45℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。吸取種子培養(yǎng)液，按5-12％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，45℃搖床培養(yǎng)84h或5L生化反應(yīng)器培養(yǎng)5天。
過氧化氫酶活性測定發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾后的清液直接用于過氧化氫酶活力的分析。
過氧化氫酶活力采用分光光度法在25℃下測定。反應(yīng)總體積為3mL，含0.1ml酶液和2.9ml含有10mmol/L H2O2的50mmol/L的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉緩沖液(pH 7.0)。過氧化氫的分解速率用752型紫外-可見光分光光度計(jì)在240nm下測定。酶活定義為在25℃下，每分鐘分解1μmnol H2O2所需的酶量為一個(gè)酶活單位。
還原糖的測定3，5-二硝基水楊酸比色法。
總糖的測定蒽酮比色法。
提高過氧化氫酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式1.添加混合碳源以10g/L蛋白胨為氮源，采用10g/L～30g/L糊精和0.5％～3％乙醇為混合碳源，實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶水平和菌體量較大幅度的提高。其中酶產(chǎn)量與以乙醇和糊精分別為單一碳源時(shí)相比分別提高了291％和81％，即從408U/mL、882U/mL提高到1594U/mL。與采用乙醇為單一碳源時(shí)相比，混合碳源的菌體生長更好；與以糊精為單一碳源相比，混合碳源對過氧化氫酶合成的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于以糊精為單一碳源時(shí)的情況。
2.初始添加誘導(dǎo)劑在工藝1的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵初始時(shí)加入0.05～0.5％的H2O2，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中的過氧化氫酶活力可達(dá)2762U/mL。
搖瓶培養(yǎng)時(shí)，在工藝1、2的基礎(chǔ)上，將搖床轉(zhuǎn)速在菌體開始生長的4～36小時(shí)后，由100r·min-1提高到200r·min-1，實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶的高表達(dá)，發(fā)酵終了時(shí)培養(yǎng)基中過氧化氫酶水平為3015U/mL。
5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，罐中裝3L培養(yǎng)基，實(shí)罐滅菌，冷卻后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。通氣量為0.5vvm～1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300r·min-1～500r·min-1，接種量為2％～10％。培養(yǎng)基中乙醇的添加方式改為流加，用于流加的乙醇預(yù)先經(jīng)孔徑為0.2μm的無菌濾膜過濾，流加速率為0.1～1.0mL/h。5天后發(fā)酵液中過氧化氫酶水平達(dá)到3567U/mL。
本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明選用的金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus IFO9862)合成的過氧化氫酶為胞外酶，并且是迄今為止已報(bào)道過的熱、堿穩(wěn)定性最好過氧化氫酶，用于高溫和堿性的織物染整工藝具有很大的潛力。搖瓶培養(yǎng)和在5L發(fā)酵罐中的實(shí)驗(yàn)水平均達(dá)國內(nèi)領(lǐng)先水平。通過發(fā)酵工藝優(yōu)化，搖瓶培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵終了時(shí)過氧化氫酶的水平達(dá)3015U/mL。在5L發(fā)酵罐中恒速流加乙醇，5天后過氧化氫酶水平達(dá)到3567U/mL。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以乙醇為單一碳源，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為408U/mL。
實(shí)施例2以糊精為單一碳源，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為882U/mL。
實(shí)施例3采用由糊精和乙醇組成的混合碳源，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為1594U/mL。
實(shí)施例4在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，發(fā)酵初始添加0.05％～0.5％的H2O2，培養(yǎng)基其余組分及培養(yǎng)方法如說明書所述，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中過氧化氫酶的產(chǎn)量為2762U/mL。
實(shí)施例5在實(shí)施例4的基礎(chǔ)上，將搖床轉(zhuǎn)速在菌體開始生長的4～36小時(shí)內(nèi)由100r·min-1迅速提高到200r·min-1，實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶的高表達(dá)，發(fā)酵終了時(shí)培養(yǎng)基中過氧化氫酶水平為3015U/mL。
實(shí)施例65L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，罐中裝3L培養(yǎng)基，實(shí)罐滅菌，冷卻后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。通氣量為0.5vvm～1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300r·min-1～500r·min-1，接種量為2％～10％。培養(yǎng)基中乙醇的添加方式改為流加，用于流加的乙醇預(yù)先經(jīng)孔徑為0.2μm的無菌濾膜過濾，流加速率為0.1～1.0mL/h。5天后發(fā)酵液中過氧化氫酶水平達(dá)到3567U/mL。
權(quán)利要求
1.一種提高微生物法制備耐熱耐堿性過氧化氫酶產(chǎn)量的方法，其特征是A.以金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862為生產(chǎn)菌種；B.發(fā)酵培養(yǎng)基采用混合碳源，以10g/L～30g/L糊精和培養(yǎng)基體積比為0.5％～3％的乙醇為混合碳源；C.發(fā)酵初始添加誘導(dǎo)劑，在發(fā)酵初始時(shí)加入0.05％～0.5％的H2O2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是搖瓶發(fā)酵時(shí)還提高搖床轉(zhuǎn)速，在菌體開始生長的4～36小時(shí)后，轉(zhuǎn)速由100r·min-1提高到200r·min-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是5L發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵罐中裝3L培養(yǎng)基，實(shí)罐滅菌，冷卻后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，通氣量為0.5vvm～1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300r·min-1～500r·min-1，接種量為2％～10％，培養(yǎng)基中乙醇的添加方式改為流加，用于流加的乙醇預(yù)先經(jīng)孔徑為0.2μm的無菌濾膜過濾，流加速率為0.1～1.0mL/h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是培養(yǎng)基組成為斜面培養(yǎng)基PDA(g/L)馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂16，pH 6.0；種子培養(yǎng)基(g/L)酵母膏4，玉米淀粉15，K2HPO41，Na2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，pH 6.8；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)糊精10～30，乙醇0.5％～3％培養(yǎng)基體積比，蛋白胨5～20，K2HPO45，KH2PO4·3H2O 3，MgSO4·7H2O 2，pH 7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是培養(yǎng)方法為將成熟的孢子接種到PDA斜面上，45℃下培養(yǎng)6-8d，待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，45℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，吸取種子培養(yǎng)液，按5-12％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，45℃搖床培養(yǎng)84h或5L生化反應(yīng)器培養(yǎng)5天。
全文摘要
一種提高微生物法制備耐熱耐堿性過氧化氫酶產(chǎn)量的方法，涉及金黃色嗜熱子囊菌發(fā)酵制備過氧化氫酶。本發(fā)明通過采用糊精和乙醇作為培養(yǎng)基的混合碳源，在發(fā)酵初始添加誘導(dǎo)劑H
文檔編號C12N1/14GK1544621SQ20031010637
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月18日
發(fā)明者陳堅(jiān), 李寅, 方芳, 倫世儀, 陳 堅(jiān) 申請人:江南大學(xué)