專利名稱：抗醛糖還原酶相似蛋白單克隆抗體的制備與鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種單克隆抗體的制備方法，屬于生物工程開發(fā)新型肝癌診斷試劑的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，死亡率高，五年生存率停留在2.2-2.3％之間，嚴(yán)重威脅著我國人民的健康。
肝癌有一相對長的自然發(fā)展過程，其自然病程至少為24個(gè)月出現(xiàn)低濃度AFP到亞臨床肝癌診斷確立為早期階段，一般為10個(gè)月；從亞臨床期到出現(xiàn)臨床癥狀為中期階段一般為8個(gè)月時(shí)間；自有臨床癥狀到出現(xiàn)黃疸、腹水、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或惡液質(zhì)稱作晚期階段，時(shí)間大約4個(gè)月；自晚期到死亡，一般為個(gè)2月時(shí)間。
由于肝癌自然病程相對較長，因此要想改善預(yù)后、提高肝癌的生存率早期診斷非常重要。對于肝癌早期診斷而言，血清標(biāo)志物是非常有前景的。近幾年出現(xiàn)的一些肝癌標(biāo)志物包括甲種胎兒球蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、γ-GT同工酶、甲胎蛋白異質(zhì)體、異常凝血酶原、血清巖藻糖苷酶、同工鐵蛋白、醛縮酶同工酶、α1-抗胰蛋白酶分子異質(zhì)體、丙酮酸激酶同工酶。這些肝癌標(biāo)志物對肝癌的早期診斷有重要意義，但其中最有價(jià)值的是AFP。AFP是當(dāng)前診斷肝癌最特異的標(biāo)志物，其陽性率僅70-80％。它是胎兒時(shí)期肝臟合成的一種胚胎蛋白，當(dāng)成人肝細(xì)胞惡變后又可重新獲得這一功能。但是，在孕婦、新生兒及生殖腺(睪丸、卵巢)胚胎瘤AFP也可出現(xiàn)，這說明AFP對肝癌只有相對的特異性；采用高靈敏度的檢測方法在部分肝炎、肝硬化及少數(shù)消化道腫瘤(胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌)可測得低濃度的AFP，因此對AFP的檢測結(jié)果必須聯(lián)系臨床才有診斷意義；近年來發(fā)現(xiàn)AFP陰性的肝癌有上升趨勢，所以開發(fā)更新、更特異、更敏感的肝癌標(biāo)志物成為當(dāng)前緊迫的課題。
醛糖還原酶相似蛋白(Aldose Reductase like protein，ARL-1)與醛糖還原酶(Aldose Reductase，AR)相似，以NADPH為輔酶，能還原各種醛類和糖類化合物。ARL-1 cDNA序列全長約1.35kb，編碼316個(gè)氨基酸，分子量為34.8KD。ARL-1為醛酮還原酶大家族的成員，該家族包括AR、醛還原酶(AldehydeReductase，ADR)、碳酰還原酶(Carbonyl Reductase)、成纖維生長因子調(diào)節(jié)蛋白(FR-1)、小鼠輸精管蛋白(MVDP)、變易蛋白(斑塊17，spot17)。就氨基酸序列而言，ARL-1分別與AR、MVDP、FR-1、中國倉鼠卵巢還原酶、spot17有70.6％、81％、82％、83％、94％的同源性。與ARL-1氨基酸序列同源性高達(dá)94％的spot17是Zeindl Eberhart等在1994年用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)的，研究證實(shí)spot17與大鼠肝癌的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系。
ARL-1與肝癌的關(guān)系如何呢？Northern blotting顯示，ARL-1在54％的原發(fā)性肝癌組織中呈高水平表達(dá)，而在正常肝組織中檢測不到該基因的表達(dá)。高表達(dá)ARL-1基因的肝癌細(xì)胞株HepG2，對道諾霉素(一種抗腫瘤藥)的抗藥性明顯增強(qiáng)，而且這種效應(yīng)能被AR抑制劑逆轉(zhuǎn)。
為了分析ARL-1在肝癌細(xì)胞中的翻譯水平及組織特異性，我們制備了抗ARL-1多克隆抗體，應(yīng)用Western blotting分析發(fā)現(xiàn)(1)ARL-1在94.4％(17/18)的肝癌組織中被檢測到，在相應(yīng)的癌旁組織中有82.4％(14/17)被檢測到。而在正常肝組織中100％(5/5)沒有檢測到ARL-1蛋白產(chǎn)物。所有被檢測的肝癌組織與其相應(yīng)的癌旁組織相比，肝癌組織中ARL-1全部上調(diào)；(2)在小腸、結(jié)腸、膽囊有微量ARL-1蛋白的表達(dá)；而在正常肝臟、食道、胃、直腸、腹膜、卵巢、子宮、腎、扁桃體、睪丸ARL-1蛋白卻不表達(dá)；(3)在多種肝癌細(xì)胞株HepG-2、BEL-7402、QGY-7701、SMMC-7721和人胚肝細(xì)胞系L-02檢測到ARL-1蛋白，在一種肝細(xì)胞株P(guān)H5CH、一種肝癌癌旁細(xì)胞系QSG-7701以及鱗狀上皮細(xì)胞系Hacat中均沒有檢測到該蛋白。這些結(jié)果表明，ARL-1在肝癌中特異性高表達(dá)。
我們在研究中，應(yīng)用抗ARL-1多單克隆抗體利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測外周血中ARL-1抗原，初步的研究結(jié)果表明ARL-1可能是一個(gè)新的、有價(jià)值的肝癌血清標(biāo)志物，將有助于肝癌的早期診斷。但多克隆抗體由于特異性差，存在交叉反應(yīng)，因此有必要制備抗ARL-1單克隆抗體來檢測患者外周血中ARL-1抗原用于肝癌的早期診斷。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種抗醛糖還原酶相似蛋白單克隆抗體的制備與鑒定方法，該單克隆抗體可以作為一種新的肝癌早期診斷試劑，將有助于提高肝癌的早期診斷水平，從而為肝癌的早期治療創(chuàng)造條件。
技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案為醛糖還原酶相似基因是一種肝癌相關(guān)基因，采用基因重組的方法表達(dá)醛糖還原酶相似蛋白—谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(aldosereductase like protein-glutathione S-transferase，ARL-GST)重組蛋白并將其純化。將ARL-GST免疫小鼠制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)作用下與處于對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過雜交瘤抗體檢測與數(shù)次克隆，得到穩(wěn)定分泌抗ARL-1單克隆抗體的一株細(xì)胞，命名為F9。經(jīng)測定F9分泌的抗ARL-1單克隆抗體屬IgG2b亞型，輕鏈為κ型，其腹水效價(jià)為1∶4×10-5。經(jīng)鑒定F9分泌的單克隆抗體只對ARL-1蛋白反應(yīng)，而對與ARL-1蛋白具有較高同源性的AR都不起作用，說明上述單克隆抗體是特異性抗ARL-1蛋白的。
制備的工藝為
a)ARL-1重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)“GenBankTMHARLU37100”(基因銀行中ARL-1基因的序列號)已知序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ARL-1基因，以合適的酶切位點(diǎn)(要求與所用質(zhì)粒相匹配)將ARL-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物插入質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序等手段證明插入子正確；b)ARL-GST的表達(dá)、純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，當(dāng)細(xì)菌長到對數(shù)生長期時(shí)，異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)ARL-GST，收集細(xì)菌，采用超聲波破碎，經(jīng)離心收集上清，此為粗蛋白，粗蛋白采用親和層析純化，純化產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepoly-acrylamide gel electrophoresis，SDS PAGE)鑒定；c)將ARL-GST免疫小鼠制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇(PEG)作用下與處于對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過雜交瘤抗體檢測與數(shù)次克隆，得到穩(wěn)定分泌抗ARL-1單克隆抗體的一株細(xì)胞，命名為F9。F9分泌的抗ARL-1單克隆抗體屬IgG2b亞型，輕鏈為κ型，其腹水效價(jià)為1∶4×10-5。F9分泌的單克隆抗體只對ARL-1蛋白反應(yīng)，而對與ARL-1蛋白具有較高同源性的醛糖還原酶(aldose reductase，AR)不起作用，說明上述單克隆抗體是特異性抗ARL-1蛋白的。
有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是制造了一種肝癌特異性蛋白的單克隆抗體，可用作肝癌的早期診斷。這種抗ARL-1單克隆抗體可以消除抗ARL-1多克隆抗體由于特異性差，存在交叉反應(yīng)的問題。因此，以該抗體，檢測患者外周血中ARL-1抗原，將有助于肝癌的早期診斷。
本發(fā)明所述抗ARL-1單克隆抗體，可用作肝癌的早期診斷。
具體實(shí)施例方式
下面是
具體實(shí)施例方式醛糖還原酶相似基因(ARL-1)是一種肝癌相關(guān)基因，采用基因重組的方法表達(dá)、純化ARL-GST重組蛋白。將ARL-GST免疫小鼠制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇(PEG)作用下與處于對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過雜交瘤抗體檢測與數(shù)次克隆，得到穩(wěn)定分泌抗ARL-1單克隆抗體的一株細(xì)胞，命名為F9。經(jīng)測定F9分泌的抗ARL-1單克隆抗體屬IgG2b亞型，輕鏈為κ型，其腹水效價(jià)為1∶4×10-5。經(jīng)鑒定F9分泌的單克隆抗體只對ARL-1蛋白反應(yīng)，而對與ARL-1蛋白具有較高同源性的AR都不起作用，說明上述單克隆抗體是特異性抗ARL-1蛋白的。
抗ARL-1單克隆抗體制備，具體如下
a)ARL-1重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)GenBankTMHARLU37100已知序列，設(shè)計(jì)引物。5′引物cg gaa ttc atggcc acg ttt gtg gag c(含有EcoRI酶切位點(diǎn))。3′引物cg ctc gag tca atattc tgc atc gaa ggg(含有XhoI酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增ARL-1基因，以EcoRI、XhoI酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增產(chǎn)物插入質(zhì)粒pGEX-4T-1(His)6C，經(jīng)酶切、測序等手段證明插入子正確。
b)ARL-GST的表達(dá)純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ARL-1重組蛋白。具體說來，當(dāng)細(xì)菌長到A600＝0.4時(shí)，加入終濃度為0.05mM的IPTG在30℃過夜，收集細(xì)菌，采用超聲波破碎，經(jīng)離心(12,000×g，4℃)收集上清，此為粗蛋白。粗蛋白分別采用Pharmacia Biotech公司的Glutathione sepharose 4B純化ARL-GST(參照說明)，15％SDS PAGE顯示純化后的產(chǎn)物只有一條帶(ARL-GST為60.8KD)。
c)采用淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備抗ARL-1單克隆抗體初次免疫小鼠1～50μg重組蛋白ARL-GST加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射↓3周后第二次免疫ARL-GST劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下多點(diǎn)注射↓3周后第三次免疫ARL-GST劑量同上，不加佐劑，皮下多點(diǎn)注射↓2～3周后加強(qiáng)免疫，ARL-GST劑量50～500μg，皮下多點(diǎn)注射↓3天后取脾融合，選擇雜交瘤↓抗體檢測(ELISA、Western blotting)↓雜交瘤克隆化(有限稀釋法)、雜交瘤細(xì)胞凍存↓單克隆抗體的大量生產(chǎn)(采取小鼠體內(nèi)繁殖法)↓腹水的純化(親和層析法)d)抗ARL-1單克隆抗體的鑒定，包括①抗體特異性的鑒定用ELISA、Western blotting法，選擇ARL-GST、AR、GST以及表達(dá)菌株Ecoli的蛋白進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)鑒定F9分泌的單克隆抗體只對ARL-1蛋白反應(yīng)，而對與ARL-1蛋白具有較高同源性的AR都不起作用，說明上述單克隆抗體是特異性抗ARL-1蛋白的。
②McAb的Ig類與亞類的鑒定采用小鼠Ig亞型測定試劑盒(Mouse MabIsotyping test kit，購自Boehringer Mannheim公司)。經(jīng)測定F9分泌的抗ARL-1單克隆抗體屬IgG2b亞型，輕鏈為κ型。
③單抗效價(jià)的測定將單抗腹水用PBS(0.01mol/l)按1∶400開始做連續(xù)倍比稀釋，用間接ELISA法測定OD450，能與靶抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的單抗最大稀釋度即為其效價(jià)。經(jīng)測定其腹水效價(jià)為1∶4×10-5。
權(quán)利要求
1.一種抗醛糖還原酶相似蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于采用基因重組的方法表達(dá)醛糖還原酶相似蛋白-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(ARL-GST)重組蛋白并將其純化；將醛糖還原酶相似蛋白-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(ARL-GST)免疫小鼠制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇(PEG)作用下與處于對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過雜交瘤抗體檢測與數(shù)次克隆，得到穩(wěn)定分泌抗ARL-1單克隆抗體的一株細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗醛糖還原酶相似蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于制備的工藝為a)ARL-1重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)“GenBankTMHARLU37100”已知序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ARL-1基因，以合適的酶切位點(diǎn)將ARL-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物插入質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序等手段證明插入子正確；b)ARL-GST的表達(dá)、純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，當(dāng)細(xì)菌長到對數(shù)生長期時(shí)，異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)ARL-GST，收集細(xì)菌，采用超聲波破碎，經(jīng)離心收集上清，此為粗蛋白，粗蛋白采用親和層析純化，純化產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)鑒定；c)將ARL-GST免疫小鼠制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇(PEG)作用下與處于對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過雜交瘤抗體檢測與數(shù)次克隆，得到穩(wěn)定分泌抗ARL-1單克隆抗體的一株細(xì)胞。
3.一種如權(quán)利要求1所述的抗醛糖還原酶相似蛋白單克隆抗體的鑒定方法，其特征在于能穩(wěn)定分泌抗ARL-1單克隆抗體的該株細(xì)胞，命名為“F9”；“F9”分泌的抗ARL-1單克隆抗體屬IgG2b亞型，輕鏈為κ型，其腹水效價(jià)為1∶4×10-5；“F9”分泌的單克隆抗體只對ARL-1蛋白反應(yīng)，而對與ARL-1蛋白具有較高同源性的醛糖還原酶(AR)不起作用，說明上述單克隆抗體是特異性抗ARL-1蛋白的。
全文摘要
抗醛糖還原酶相似蛋白單克隆抗體的制備與鑒定方法，屬于生物工程開發(fā)新型肝癌診斷試劑的技術(shù)領(lǐng)域。其制備的方法是采用基因重組的方法表達(dá)、純化ARL－GST重組蛋白，將ARL－GST免疫小鼠制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇作用下與處于對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過雜交瘤抗體檢測與數(shù)次克隆，得到穩(wěn)定分泌抗ARL－1單克隆抗體的一株細(xì)胞，命名為F9。經(jīng)測定F9分泌的抗ARL－1單克隆抗體屬IgG2b亞型，輕鏈為κ型，其腹水效價(jià)為1∶4×10
文檔編號C12P21/08GK1544636SQ20031010635
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者謝維, 金俊飛, 張建瓊, 單軍, 謝 維 申請人:東南大學(xué)