專利名稱：一個新的食管癌標志基因rpl14及其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種食管癌診斷標志基因RPL14(如GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示或者如SEQ ID NO1所示)用于檢測食管癌的用途。具體的，基因RPL14的缺失可以作為食管癌早期診斷標志；作為食管癌預警的標志；作為食管癌預后判斷的標志以及作為食管癌治療監(jiān)測的標志，其中測試樣品中含有該基因缺失的細胞數(shù)量的減少指示良好的治療效果。
背景技術(shù)：
利用分子生物學技術(shù)，能夠有效地進行分子水平檢測和/或診斷疾病，進而為早期治療這些疾病提供便利。
食管癌是最常見的消化道腫瘤之一，其死亡率位于我國十大惡性腫瘤的第四位。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是涉及癌基因激活與抑癌基因失活的多步驟過程。在乳腺癌(Chen et al.，1994)、子宮和卵巢癌(Ehlen et al.，1990)、睪丸腫瘤(Lothe et al.，1989)、腎癌(Morita et al.，1991)、口腔癌(Wu et al.，1994)、肺癌(Shriver et al.，1998)、女性生殖道腫瘤(Jones et al.，1992)、頭頸鱗癌(Califano et al.，1999)和食管鱗癌(Huet al.，2000；Ko et al.，2001)等許多種腫瘤中，3號染色體短臂經(jīng)常發(fā)生缺失，提示該區(qū)域可能存在一個或多個腫瘤相關(guān)的抑癌基因。
將3號染色體、3p以及3p21區(qū)域的一個2Mb或者80kb的染色體片段分別導入人肺腺癌(Satoh et al.，1993)、腎癌和口腔癌細胞系(Shimizu et al.，1990；Uzawa et al.，1995)以及鼠的纖維肉瘤細胞系(Todd et al.，1996)，均顯示具有抑制腫瘤形成的能力。
人核糖體蛋白基因RPL14(ribosomal protein L14)定位于3p21.3。該基因由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，其蛋白產(chǎn)物是60S核糖體大亞基的一個組成成分，屬于核糖體蛋白的L14E家族。RPL14基因含有一個高度多態(tài)的CTG三核苷酸重復序列，位于RPL14基因的第6外顯子中，編碼一個多聚丙氨酸結(jié)構(gòu)域。這種CTG重復序列存在于一些發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的基因中，而且與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)(Han et al.，1993)。有研究者在肺癌和頭頸鱗癌觀察到RPL14的基因內(nèi)多態(tài)性標志出現(xiàn)較高的雜合性丟失頻率(Shriver et al.，1998)。然而，尚未見報道RPL14的變化與食管癌之間的關(guān)系。
本發(fā)明人運用RPL14基因內(nèi)多態(tài)性標志在基因組DNA水平和轉(zhuǎn)錄水平對我國食管鱗癌進行了研究，出人意料的發(fā)現(xiàn)，所述基因在基因組DNA水平有很高的雜合性丟失率，即一個等位基因缺失。在轉(zhuǎn)錄水平有更高頻率的一個等位基因表達下調(diào)。特別重要的是，在食管原位癌和不典型增生的食管組織也發(fā)現(xiàn)RPL14的雜合性丟失。因此，該基因的缺失可以作為一個很好的食管癌診斷標志。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面涉及新的食管癌診斷標志，RPL14，基因或其片段用于檢測食管癌的用途。具體的，基因RPL14的缺失可以作為食管癌早期診斷標志。另一方面，基因RPL14的缺失還可以作為食管癌預警的標志。食管上皮不典型增生被公認為食管癌前病變。然而不典型增生是一種可逆狀態(tài)，一部分患者在數(shù)月至數(shù)年后又恢復正常，而另一部分患者數(shù)月至數(shù)年后發(fā)展為癌。在不典型增生食管上皮檢測發(fā)現(xiàn)該基因的缺失時，指示將可能發(fā)生食管癌，有利于受試者采取適當?shù)念A防措施。再一方面，基因RPL14的缺失還可以作為食管癌預后判斷的標志該基因的缺失指示某種特定臨床表型。此外，基因RPL14的缺失可以作為食管癌治療監(jiān)測的標志，其中測試樣品中含有該基因缺失的細胞數(shù)量的減少指示良好的治療效果。
本發(fā)明所述食管癌診斷標志RPL14，包括所述基因的全長DNA序列(GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示)和cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)及其片段，和與所述基因或其片段有高度序列相似性的功能性類似物。
在本發(fā)明中，所述基因序列的片段長度選自GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示序列和SEQ ID NO1所示序列的至少20個連續(xù)堿基，優(yōu)選至少30個堿基，更優(yōu)選為50個堿基。
在本發(fā)明中，所述具有高度序列相似性的功能性類似物是指與GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列或者SEQ IDNO1所述序列具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少85％，特別優(yōu)選至少90％，甚至最優(yōu)選至少95％，甚至最特別優(yōu)選至少98％序列相似性的那些類似物。
利用所述RPL14基因或其片段或其類似物可以用于鑒定相應于全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆或具有完整基因，包括調(diào)節(jié)和啟動子區(qū)域、外顯子及內(nèi)含子的基因組克隆，用于篩選受試者待測樣品，以確定其中是否存在能夠與之雜交的成分，從而作為檢測與RPL14相關(guān)的食管癌疾病或?qū)κ彻馨┑囊赘行缘呐卸酥尽?br> 本發(fā)明也涉及用于檢測各種組織中RPL14基因的mRNA的診斷方法。在本發(fā)明所述方法中，測定樣品中RPL14基因在DNA和/或mRNA水平的變化可用選自PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Southern印跡、Northern印跡、點雜交以及DNA或RNA原位雜交等方法進行檢測。這些方法對于本領域的技術(shù)人員也為常規(guī)操作。
本發(fā)明另一方面涉及利用所述食管癌診斷標志RPL14或其片段檢測食管癌的方法。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，采用PCR方法檢測待測樣品中是否存在RPL14基因缺失，包括如下步驟；1)常規(guī)方法提取患者外周血和待查組織DNA；2)利用根據(jù)RPL14基因序列設計的引物進行PCR擴增；3)取2微升PCR產(chǎn)物進行7％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；4)分析電泳結(jié)果如果某個體外周血RPL14基因內(nèi)多態(tài)性標志的一對等位片段的PCR產(chǎn)物長度不同，在變性聚丙烯酰胺凝膠上呈現(xiàn)兩條帶，該個體即為信息個體。當待測組織的一個等位條帶減弱50％或50％以上，表明此組織發(fā)生了一個RPL14等位基因的缺失。


圖1.RPL14在食管癌患者外周血(N)及腫瘤組織(T)分析的部分電泳結(jié)果本發(fā)明將在下面的實施例中進一步描述。但是本發(fā)明并不局限于這些實施例。
實施例一檢測RPL14基因缺失的方法1)常規(guī)方法提取受試者外周血和待查組織DNA[分子克隆實驗指南(第二版)，J.薩姆布魯克，等人，冷泉港實驗室出版社，1989]；2)采用引物R1和R2按以下條件進行PCR擴增R15’AAG CAC CTG GTA CTA AGG GTA 3’ (SEQ ID NO2)R25’TCG CGG CGG TGA TCT TTT TTG 3’ (SEQ ID NO3)PCR反應體系基因組DNA1.0μl(40ng)10×PCR緩沖液[100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl] 2.0μl25mM MgCl21.2μl2.5mM dNTP 1.0μl上游引物(10μM) 1.0μl下游引物(10μM) 1.0μl去離子甲酰胺 0.5μlTaq酶(10u/μl) 0.2μl雙蒸水 12.1μl總反應體積 20.0μl
PCR反應程序步驟1 94℃5分鐘步驟2 94℃30秒步驟3 52℃30秒步驟4 72℃30秒步驟5 72℃5分鐘步驟6 4℃其中從步驟2至步驟4持續(xù)35個循環(huán)。
3)取2微升PCR產(chǎn)物進行7％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；4)對電泳結(jié)果進行分析如果某個體外周血RPL14基因內(nèi)多態(tài)性標志的一對等位片段的PCR產(chǎn)物長度不同，在變性聚丙烯酰胺凝膠上呈現(xiàn)兩條帶，該個體即為信息個體。當待測組織的一個等位條帶減弱50％或50％以上，表明此組織發(fā)生了一個RPL14等位基因的缺失。
上述實驗結(jié)果顯示，獲自患有食管癌患者的外周血與腫瘤組織中的樣品經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳證實，腫瘤組織中存在一個明顯減弱甚至完全丟失的RPL14基因條帶(參見圖1)。
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本工作受國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃基金(2001AA221151)、國家科技攻關(guān)計劃基金(2002BA711A06)、國家杰出青年科學基金(30125026)和國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃基金(G1998051205)資助。
序列表<110> 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<120> 一個新的食管癌標志基因RPL14及其用途<130> IDC030073<160> 3<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 823<212> DNA<213> cDNA<400> 1gggcgggtct tcttccttct cgcctaacgc cgccaacatg gtgttcaggc gcttcgtgga 60ggttggccgg gtggcctatg tctcctttgg acctcatgcc ggaaaattgg tcgcgattgt120agatgttatt gatcagaaca gggctttggt cgatggacct tgcactcaag tgaggagaca180ggccatgcct ttcaagtgca tgcagctcac tgatttcatc ctcaagtttc cgcacagtgc240ccaccagaag tatgtccgac aagcctggca gaaggcagac atcaatacaa aatgggcagc300cacacgatgg gccaagaaga ttgaagccag agaaaggaaa gccaagatga cagattttga360tcgttttaaa gttatgaagg caaagaaaat gaggaacaga ataatcaaga atgaagttaa420gaagcttcaa aaggcagctc tcctgaaagc ttctcccaaa aaagcacctg gtactaaggg480tactgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctaaa gttccagcaa aaaagatcac540cgccgcgagt aaaaaggctc cagcccagaa ggttcctgcc cagaaagcca caggccagaa600agcagcgcct gctccaaaag ctcagaaggg tcaaaaagct ccagcccaga aagcacctgc660tccaaaggca tctggcaaga aagcataagt ggcaatcata aaaagtaata aaggttcttt720ttgacctgtt gacaaatgta tttaagcctt tggatttaaa gcctgttgag gctagagtta780ggaggcagat tgatagtagg attataataa acattaaata atc 823<210> 2<211> 21<212> DNA<213> primer
<400> 2aagcacctgg tactaagggt a 21<210> 3<211> 21<212> DNA<213> primer<400> 3tcgcggcggt gatctttttt g 2權(quán)利要求
1.食管癌診斷標志基因RPL14或其片段或與之具有高度序列相似性的功能類似物用于診斷食管癌的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述RPL14基因的片段是指長度選自GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp所示序列和SEQ ID NO1所示序列的至少20個連續(xù)堿基，優(yōu)選至少30個堿基，更優(yōu)選為50個堿基的序列片段；所述高度序列相似性的功能類似物是指與GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp所示序列和SEQ ID NO1所述序列具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少85％，特別優(yōu)選至少90％，甚至最優(yōu)選至少95％，甚至最特別優(yōu)選至少98％序列相似性的那些類似物。
3.權(quán)利要求1所述的用途，其中基因RPL14的缺失可以作為食管癌早期診斷標志，食管癌預警的標志，食管癌預后判斷的標志以及食管癌治療監(jiān)測的標志。
4.一種測定待測樣品中RPL14基因在DNA和/或mRNA水平的變化的方法，包括如下步驟；1)提取受試者正常組織如外周血和待查樣品的DNA或mRNA；2)根據(jù)選自PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Southern印跡、Northern印跡、點雜交以及DNA或RNA原位雜交的方法設計引物；3)采用2)所述方法檢測待測樣品；4)當與正常組織相比，判定待測樣品中RPL14等位基因的變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食管癌診斷標志基因RPL14(如GenBank中NT_037565.3第2,442,386～2,442,814bp序列所示或者如SEQ ID NO1所示)用于檢測食管癌的用途。具體的，基因RPL14的缺失可以作為食管癌早期診斷標志；作為食管癌預警的標志；作為食管癌預后判斷的標志以及作為食管癌治療監(jiān)測的標志，其中測試樣品中含有該基因缺失的細胞數(shù)量的減少指示良好的治療效果。
文檔編號C12Q1/68GK1618985SQ20031011536
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者王明榮, 徐昕, 蔡巖, 黃曉平, 趙春霞, 韓亞玲, 吳旻 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所