專利名稱：一種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，特別是涉及一種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用。屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的篩選和培育，得到了本發(fā)明的嗜酸乳桿菌，經(jīng)過本發(fā)明中產(chǎn)品嗜酸乳桿菌制備的一系列產(chǎn)品都具有對(duì)人體十分有益的效果。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是得到一種嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)；本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明產(chǎn)品嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的應(yīng)用。
本發(fā)明嗜酸乳桿菌的保藏號(hào)CGMCC No.1084。保藏日期2004年1月6日。保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏地點(diǎn)中國(guó).北京.中關(guān)村。
本發(fā)明產(chǎn)品的確具有相比于現(xiàn)有技術(shù)更好的和更多的功能。在耐酸耐膽鹽、抑制致病菌等很多方面具有特別的優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下膠囊劑的制備方法膠囊劑是嗜酸乳桿菌制品的一種重要?jiǎng)┬?。膠囊劑有其特點(diǎn)生產(chǎn)工藝較簡(jiǎn)單，運(yùn)輸和攜帶方便，可掩蓋制劑的不良?xì)馕?，可有不同顏色便于區(qū)別，藥物的生物利用率高，因?yàn)橹圃鞎r(shí)不用加粘合劑，也不施壓，因而易于分散，可以用不透明膠囊殼減少嗜酸乳桿菌受光、熱和空氣的影響。其缺點(diǎn)是水劑和吸濕性強(qiáng)的制劑不宜直接制成膠囊。此外，膠囊不適于兒童服用。
膠囊有膠囊殼填裝制劑組成，膠囊殼有許多種，選擇適合的囊殼對(duì)嗜酸乳桿菌制劑非常重要。
(一)空膠囊的選擇膠囊劑分硬膠囊、軟膠囊和腸溶膠囊。硬膠囊劑是將益生軍劑制成粉末或小顆粒填充與空膠囊中，囊殼稱空心膠囊或空膠囊?？漳z囊有明膠、增塑機(jī)、防腐劑、著色劑和遮透劑組成，經(jīng)溶膠、蘸膠、干燥、脫模、截割及套合等工序組成。由于著色劑不同，可制成不同顏色的囊殼，還可用印字機(jī)在囊殼上印字。軟膠囊系指一定量的液態(tài)制劑密封于球形或橢圓形的軟質(zhì)囊材中，囊材由明膠、甘油或其他適宜的藥用材料制成。腸溶膠囊系指囊客不溶于胃液，但能在腸液中崩解釋放出膠囊中的內(nèi)容物，有硬膠囊或軟膠囊劑。腸溶膠囊過去用甲醛與明膠制造，甲醛與明膠起氨縮醛反應(yīng)，使明膠分子互相交聯(lián)，形成甲醛明膠，分子中已無氨基，失去與酸結(jié)合能力，故仍含羧基，故能在堿性腸液中溶解，使內(nèi)容物釋放出來。由于這種囊材具有不穩(wěn)定性。
本發(fā)明產(chǎn)品用PVP作底衣，再CAP、蜂蠟等進(jìn)行外層包衣，可進(jìn)一步改善質(zhì)量。
空膠囊的規(guī)格由大到小可分為000、00、0、1、2、3、4以及5號(hào)等八種規(guī)格，一般常用的是0～5號(hào)，使用時(shí)應(yīng)根據(jù)嗜酸乳桿菌劑的密度、顆粒大小和所占容積來選用相應(yīng)的最小型號(hào)膠囊。
(二)膠囊的填裝一般小量制備時(shí)可以用手工填裝，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)則用自動(dòng)填充機(jī)填裝。目前自動(dòng)填裝機(jī)可分為四種類型，適合于不同物理性狀的制劑填裝。制劑的流動(dòng)性是直接影響填充物的物理性狀，I、II型填充機(jī)因?yàn)橛袡C(jī)械措施適合于填裝流動(dòng)性較好的制劑；III型適合于自由流動(dòng)的粉劑，為改善流動(dòng)性，可添加低于2％的潤(rùn)滑劑如乙二醇酯、聚硅銅、二氧化硅、硬脂酸鹽、硬脂酸、滑石粉、甲基纖維素以及淀粉等，選用原則是不影響嗜酸乳桿菌的存活率及其檢測(cè)；IV型機(jī)適于聚集性強(qiáng)的針狀結(jié)晶和具吸濕性的制劑，可加礦物油、食用油或微晶纖維素等，制成小顆粒再填裝。嗜酸乳桿菌膠囊填裝的全過程要求在無菌條件下進(jìn)行，以減少二次污染，層流室的相對(duì)濕度要求低于40％。
(三)膠囊劑的包裝與儲(chǔ)藏嗜酸乳桿菌膠囊包裝有其特殊要求，特別是像嗜酸乳桿菌等厭氧菌，首要條件是要盡可能避免與空氣接觸減少氧的作用。因此，包裝材料應(yīng)選用不透氣材料，并是用真空或充氮?dú)獍b。在儲(chǔ)藏中也和其他膠囊劑一樣，易受環(huán)境溫度和濕度的影響，應(yīng)在陰涼干燥條件下儲(chǔ)藏。當(dāng)溫度超過室溫，相對(duì)濕度大于45％時(shí)，嗜酸乳桿菌易死亡，膠囊劑變軟發(fā)粘，膨脹，真菌容易滋生，若長(zhǎng)期在高濕度下儲(chǔ)藏，則崩解時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)。
嗜酸乳桿菌菌片劑制備方法目前片劑也是嗜酸乳桿菌制品的一大類，它是用嗜酸乳桿菌劑加適當(dāng)輔料，通過制劑技術(shù)制成的片狀制劑。片劑具有劑量準(zhǔn)確，質(zhì)量穩(wěn)定(與光、空氣、水分等接觸面減小之故)，服用和攜帶方便，便于識(shí)別以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。其缺點(diǎn)是兒童不易吞服，儲(chǔ)藏條件不當(dāng)時(shí)易變質(zhì)。
(一)口服片劑的制備片劑制備即是將菌粉與合適的輔料混合均勻，使其具有良好的流動(dòng)性和可壓性，然后通過壓片機(jī)機(jī)械壓成片。原料的流動(dòng)性是為了使混合物順利而以準(zhǔn)確的劑量流入模孔，使片劑大小一致。對(duì)嗜酸乳桿菌片劑而言，良好的可壓性至關(guān)重要，可壓性越好，壓片時(shí)所需壓力就越小，即可在適度的壓力下壓成硬度符合要求的片劑，因?yàn)橹破瑫r(shí)的壓力直接影響片劑中菌的存活率。
壓片分干法壓片和濕法制粒壓片。干法壓片又分干法直接壓片和干法制粒壓片。干法壓片適合于大多數(shù)嗜酸乳桿菌片劑制備。對(duì)流動(dòng)性和可壓性好的混合物可以直接壓片，而有的則需先行制粒，即加入黏合劑先制成大片再粉碎成顆粒后制片。濕法制粒壓片是將混合物進(jìn)行濕法制粒再壓片。濕法制粒有幾種方法一是將混合料制成軟材，過篩或以其他方式制粒，干燥后壓片；二是流化噴霧制粒，即進(jìn)一步制粒壓片和轉(zhuǎn)動(dòng)制粒壓片等。制粒的目的除改善流動(dòng)性外，還可增大物料的緊密度，逸出空氣，減少片劑的松裂現(xiàn)象，避免因粉末分層而影響片劑中的劑量的準(zhǔn)確性，避免細(xì)粉飛揚(yáng)及黏附于沖頭表面而造成黏沖和拉?，F(xiàn)象。濕法制粒過程中烘干階段對(duì)一些不耐熱和氧氣的菌劑影響較大，宜慎用。多數(shù)嗜酸乳桿菌可采用先將輔料制成恐怖顆粒，再與菌粉混合均勻后壓片的方法制片，以減少制粒過程中菌的死亡。
(二)外用片劑——泡騰片的制備用于治療陰道疾病或改善陰道微生態(tài)平衡的嗜酸乳桿菌制劑，可制成泡騰片。這種片劑放入陰道后，與陰道液體發(fā)生反應(yīng)即產(chǎn)生大量氣泡，泡騰片崩解，使嗜酸乳桿菌均勻的分布到陰道黏膜表面而發(fā)揮作用。
泡騰片是由嗜酸乳桿菌菌粉和泡騰崩解劑組成。泡騰片中的酸堿系統(tǒng)與水相互反應(yīng)，生成二氧化碳?xì)怏w而加速片劑崩解溶解和形成泡沫。崩解劑所用的酸和堿應(yīng)分別制粒，在壓片前與菌粉混合立即壓片。最常用的酸和堿系統(tǒng)是枸櫞酸和酒石酸的混合物，以及碳酸鹽或碳酸氫鉀、甘氨酸碳酸酸、鈉以及倍半碳酸鈉等。
泡騰片要求產(chǎn)生的氣泡細(xì)小而持久，以達(dá)到嗜酸乳桿菌充分分散。泡騰片應(yīng)采用不透氣不透水，而且避光的包裝材料進(jìn)行包裝，以防止吸潮變質(zhì)。嗜酸乳桿菌沖劑制備方法沖劑也是嗜酸乳桿菌制品的一大類。沖劑生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的設(shè)備，攜帶和服用方便。沖劑以菌粉、填充劑、穩(wěn)定劑和調(diào)味劑等組成。沖劑可分為可溶性沖劑和混懸性沖劑，嗜酸乳桿菌沖劑多為后者。嗜酸乳桿菌沖劑主料為干燥菌粉，輔料為奶粉以及淀粉等，根據(jù)產(chǎn)品要求還可加入一些甜味劑、香精等調(diào)味劑，有的還加入一些營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑如維生素等。在嗜酸乳桿菌沖劑中還可以加入低聚糖等雙歧因子。經(jīng)充分混合制成顆?；蚍蹌?，用復(fù)合鋁膜真空包裝，按所含菌數(shù)有不同規(guī)格，每克含菌數(shù)從幾億到百億。
嗜酸乳桿菌沖劑在日本和歐洲早已形成商品，國(guó)內(nèi)也已有類似產(chǎn)品上市。在保存期內(nèi)如何保持產(chǎn)品中的活菌數(shù)是及其重要的問題，因?yàn)榛罹鷶?shù)是這累產(chǎn)品的唯一指標(biāo)。這類產(chǎn)品服用時(shí)不能用開水，只能用低于50℃溫水沖服。
嗜酸乳桿菌口服液類產(chǎn)品制備方法口服液也是嗜酸乳桿菌制品的一大類。20世紀(jì)90年代中出現(xiàn)過許多產(chǎn)品，并有較大的市場(chǎng)份額，但由于種種原因，近年一些產(chǎn)品銷量銳減。盡管如此，我國(guó)嗜酸乳桿菌口服液的興起，對(duì)我過消費(fèi)者認(rèn)識(shí)和了解嗜酸乳桿菌及其保健功能起到了積極作用，促進(jìn)了嗜酸乳桿菌制品的研究和開發(fā)。隨著基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品開發(fā)的深入，實(shí)事求是的宣傳其功效，消除認(rèn)識(shí)和某些理論上的偏差，嗜酸乳桿菌制品包括嗜酸乳桿菌口服液仍將有光明的前景。
嗜酸乳桿菌口服液有多種配方，有含雙歧因子的，有加入食藥兼用的中草藥的，也有含強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)素的，等等。如系保健食品類口服液，其配方原料必須是食物和衛(wèi)生部已批準(zhǔn)公布的食藥兼用的中草藥，不得隨意添加其他藥物。營(yíng)養(yǎng)素也要按規(guī)定的量添加。
嗜酸乳桿菌口服液的生產(chǎn)工藝取決于口服液的類型。上述第一類口服液工藝與一般的液態(tài)發(fā)酵工藝相比，只不過是在發(fā)酵結(jié)束后增加灌裝工藝，灌裝要求在無菌條件下進(jìn)行，因此，發(fā)酵罐通過管道與灌裝設(shè)備密封連接，灌裝車間要求有一定的潔凈度，一避免污染。第二類產(chǎn)品則分兩部分一是嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)和菌劑制備；二是按配方配制口服液基料，然后將二者按要求混合，再行灌裝。
嗜酸乳桿菌發(fā)酵果蔬汁嗜酸乳桿菌發(fā)酵果蔬汁是一類新型制劑，它是利用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的某些精制果蔬汁，經(jīng)合適的嗜酸乳桿菌發(fā)酵而制成的液態(tài)產(chǎn)品，其優(yōu)點(diǎn)是兼有嗜酸乳桿菌和代謝物以及果蔬汁高營(yíng)養(yǎng)的有益作用，可以不添加任何人工成分，達(dá)到全天然的要求。
原料選擇胡蘿卜應(yīng)選擇紅色、肉質(zhì)細(xì)嫩、纖維少、無硬心的優(yōu)質(zhì)品種。
胡蘿卜和番茄等果蔬均可用本發(fā)明的嗜酸乳桿菌發(fā)酵，制成嗜酸乳桿菌發(fā)酵果蔬汁。
嗜酸乳桿菌果蔬汁發(fā)酵是在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行。發(fā)酵過程中需定時(shí)取樣檢測(cè)發(fā)酵液的PH值和菌數(shù)，以及時(shí)了解發(fā)酵情況。發(fā)酵終點(diǎn)的判別標(biāo)準(zhǔn)，一是PH值，一般PH值達(dá)到4.2～4.5；二是活菌數(shù)達(dá)到108CFU/ml以上。根據(jù)嗜酸乳桿菌產(chǎn)品的特定要求，發(fā)酵結(jié)束后應(yīng)立即冷卻到室溫以下，然后在無菌條件下迅速灌裝冷藏。
嗜酸乳桿菌微膠囊制劑嗜酸乳桿菌制品質(zhì)量最重要的標(biāo)志之一是活菌數(shù)，特別是對(duì)那些單純以活菌數(shù)為唯一指標(biāo)的產(chǎn)品來說更為重要。嗜酸乳桿菌中應(yīng)用最多的是嗜酸乳桿菌和乳酸菌等，它們?cè)诋a(chǎn)品保存中極易失活，如何延長(zhǎng)保存期成了這類產(chǎn)品的一大難題。國(guó)內(nèi)外都在試圖通過基因改造或耐酸耐氧菌株的篩選等來提高菌種對(duì)酸和氧的抵抗能力；在工藝技術(shù)上，通過微膠囊使菌與氧和酸等不利因素隔離，以提高菌的存活率。
1.囊心和囊材的制備工藝 嗜酸乳桿菌菌種用液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集和洗滌菌體，然后加入淀粉、奶粉或其他保護(hù)劑混合成懸液或冷凍干燥成菌粉；將合適的囊材配成溶液，經(jīng)滅菌后與囊心混合均勻。固化劑通常采用0.1～0.3mol/L的氯化鈣溶液滅菌后冷卻待用。
2.微膠囊的制備工藝 將心材和囊材的混合物擠壓成細(xì)滴或噴入固化劑溶液中，緩緩攪拌固化，然后收集微膠囊，用緩沖液洗滌三次即得濕的嗜酸乳桿菌微膠囊。
濕的微膠囊可直接用于生產(chǎn)各種制劑及添加到食品飲料中。干燥后的微膠囊除可加入食品飲料外還可制成膠囊、片劑等劑型，其保存期更長(zhǎng)。
濕微膠囊的干燥有兩種方式，一是在濕膠囊中加入一些填充劑如淀粉、碳酸鈣、滑石粉等拌勻，然后在不高于40℃下烘干；二是用噴霧干燥法進(jìn)行干燥。噴霧干燥的優(yōu)點(diǎn)是可以以比較快的速度使樣品干燥，其缺點(diǎn)是嗜酸乳桿菌的死亡率較高。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度為140～160℃，隨排風(fēng)溫度升高，死亡率也升高，70～73℃是菌體對(duì)溫度最敏感的階段，而從72℃到82℃則死亡率變化不大。從存活率的角度考慮最好的溫度是68～70℃，但此時(shí)得到的樣品水分過高，一般選擇80℃左右較為適宜。在這樣的排風(fēng)溫度下，如果囊材配方選擇較好，則可得到較高的存活率。在優(yōu)化條件下，微膠囊噴霧干燥后，乳酸菌的存活率為20％左右。影響微膠囊在噴霧干燥中菌的存活率的主要因素是噴霧是進(jìn)出風(fēng)溫度和囊材的配方。嗜酸乳桿菌由于對(duì)氧敏感，不宜用噴霧干燥法進(jìn)行干燥。干燥微膠囊中菌的存活率與保護(hù)劑、水分含量等有密切關(guān)系。
Selmer-Olsen等(1999)在瑞士乳桿菌微膠囊的研究中，將培養(yǎng)液在低于5℃下離心收集菌體，將菌體分別懸浮在核糖醇、三甲氨乙內(nèi)酯、甘油及脫脂奶粉復(fù)原乳中，與熱處理過的海藻酸鈉溶液混合，滴入緩慢攪拌下的乳酸鈣溶液中，攪拌30min，即得到濕的乳酸菌微膠囊，用滅菌Ringer液漂洗，去除多余的鈣離子和游離細(xì)胞，在2～3℃下保存。濕的微膠囊通過流化床進(jìn)行干燥，流化床進(jìn)風(fēng)溫度為5℃，相對(duì)濕度55％±2.5％，微膠囊的直徑約3mm。在4保護(hù)劑中，核糖醇和脫脂乳保持菌體存活率相對(duì)較高，與起始菌數(shù)比，分別為71％和57％。其儲(chǔ)藏過程中的存活率也最高。存活率隨微膠囊內(nèi)的含水量增高而下降。
嗜酸乳桿菌微膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌微膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)包含三個(gè)方面，即包埋效率、包埋產(chǎn)率及儲(chǔ)藏期間菌的存活率即穩(wěn)定性。包埋效率是指微膠囊內(nèi)外菌存在的數(shù)量，微膠囊內(nèi)部活菌數(shù)越高說明包埋效率越高；包埋產(chǎn)率是指產(chǎn)品中的活菌數(shù)與微膠囊制備時(shí)加入的菌數(shù)之比；而穩(wěn)定性是以在一定儲(chǔ)藏條件下一定時(shí)間后菌體的存活率來表示，菌的存活率越高說明穩(wěn)定性越好。
嗜酸乳桿菌的微膠囊化是解決產(chǎn)品保存性的重要技術(shù)之一，應(yīng)進(jìn)一步把菌種選育、新囊材和保護(hù)劑的選擇以及膠囊加工技術(shù)結(jié)合起來，以提高嗜酸乳桿菌在儲(chǔ)藏期間的存活率，得到更理想的嗜酸乳桿菌制劑。
嗜酸乳桿菌乳粉利用各種乳酸菌經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)酵劑制成的各種酸乳制品，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的醫(yī)療作用。制品中所含的蛋白質(zhì)更容易被人體消化。使用酸乳制品對(duì)人體具有很高的醫(yī)療作用，除能促進(jìn)人的消化作用和加強(qiáng)新陳代謝作用外，對(duì)于腸胃病、赤痢、腹瀉、便秘等消化系統(tǒng)病癥，有特殊的療效。由于乳酸菌的代謝作用能產(chǎn)生乳酸和抗生物質(zhì)，可以抑制大腸內(nèi)腐敗微生物的繁殖和生長(zhǎng)，改善腸道中微生物群。
嬰兒如果長(zhǎng)期喂哺以普通乳粉，則由于缺乏必要的乳酸菌，會(huì)對(duì)嬰兒的消化及發(fā)育引起不良影響；如果哺育以經(jīng)過純培養(yǎng)發(fā)酵劑制成的酸乳制品，則可以治療和改善嬰兒的消化機(jī)能，促進(jìn)消化作用，加強(qiáng)新陳代謝。
酸乳制品由于所使用的乳酸菌不同而有很多種類，嗜酸乳桿菌乳是醫(yī)療價(jià)值最高的一種，所使用的乳酸菌為嗜酸乳桿菌。這種菌在腸內(nèi)較保加利亞乳桿菌具有更高的活力。
使用嗜酸乳桿菌純培養(yǎng)發(fā)酵劑制造嗜酸乳桿菌乳，目前各國(guó)已很普遍。這種嗜酸乳桿菌乳是一種均勻柔膩的乳狀體，唯不便長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸。因此，最近在我國(guó)開始制造含有這種嗜酸乳桿菌的乳粉，這樣，不僅便于貯存和運(yùn)輸，而且原菌的活力可在長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)不致減弱。
用本發(fā)明產(chǎn)品嗜酸乳桿菌，制備得到的嗜酸乳桿菌乳粉不但能保持嗜酸乳桿菌對(duì)人體的作用，而且便于貯存和運(yùn)輸。
還可以用本發(fā)明嗜酸乳桿菌制備一種含有這種嗜酸乳桿菌的純培養(yǎng)發(fā)酵劑片，可以保存更長(zhǎng)的日期原菌的活力不會(huì)減退，攜帶方便、使用簡(jiǎn)單。
無論嗜酸乳桿菌乳粉或嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑片，其制造方法，有下列三種1.將純培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌粉末(可以采用真空冷凍升華干燥法制備)與良質(zhì)乳粉在無菌室內(nèi)成分混合、包裝、進(jìn)行無菌操作。這種方法制造的嗜酸乳桿菌乳粉質(zhì)量很好。
2.采用真空冷凍升華干燥法。即將純培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌的脫脂乳培養(yǎng)液與經(jīng)過殺菌濃縮的牛乳成分混勻，再進(jìn)行真空冷凍升華干燥。這種方法制造的嗜酸乳桿菌乳粉質(zhì)量極高。
3.噴霧法。即將純培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌的脫脂乳培養(yǎng)液與經(jīng)過殺菌濃縮的牛乳成分混勻后噴霧干燥。這種方法制造的嗜酸乳桿菌乳粉中原菌的含量，較前兩種方式為低。但如果控制得當(dāng)，仍能得到很好的制品，而且可使用生產(chǎn)普通乳粉的全套設(shè)備，不須另外增加新設(shè)備，投資較少。
嗜酸乳桿菌乳粉的產(chǎn)品指標(biāo)，一般應(yīng)達(dá)到下列要求。
水分(不超過) 4％溶解度(不低于) 98％雜質(zhì)度(不超過) 2ppm嗜酸乳桿菌含量(不低于) 600萬/克乳粉復(fù)原后在40～42℃保溫凝固時(shí)間(不超過) 10小時(shí)凝塊均勻稠密、無乳清分離、無氣泡產(chǎn)生、味純而酸、無其他異味顯微鏡檢查不發(fā)現(xiàn)其他雜菌嗜酸乳桿菌酸奶工藝流程如下混合料、均質(zhì)、殺菌、冷卻，然后加入香料，小容器灌裝、培養(yǎng)、冷卻，得到凝固型酸牛奶；混合料、均質(zhì)、殺菌、冷卻，然后加入發(fā)酵劑，加入發(fā)酵罐培養(yǎng)、攪拌、冷卻，再加入果料、香料、小容器灌裝，得到攪拌型酸牛奶；嗜酸乳桿菌乳飲料a、液體酸牛乳型嗜酸乳桿菌飲料發(fā)酵混合料是用濃縮脫脂乳或脫脂乳粉強(qiáng)化的脫脂乳，必要時(shí)添加葡萄糖等促進(jìn)乳酸菌發(fā)育的物質(zhì)進(jìn)行配置?；旌狭显?0～95℃溫度下加熱殺菌5～10分鐘，冷卻到37℃；然后在其中添加2～3％的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑，在35～37℃下培養(yǎng)，使乳酸度達(dá)到1.5～2.0％。一般培養(yǎng)時(shí)間以24小時(shí)以內(nèi)為好，這時(shí)菌數(shù)達(dá)到108CFU/ml。培養(yǎng)后若提高菌數(shù)，以稍降培養(yǎng)溫度為宜。培養(yǎng)后的混合料應(yīng)立即冷卻，直到使用時(shí)為止保持溫度在10℃以下。
另外，將作為輔料的砂糖、穩(wěn)定劑、色素等溶解配成糖漿，經(jīng)80～90℃加熱殺菌10～30分鐘后冷卻到10℃以下。穩(wěn)定劑用少量的水溶解，同時(shí)用機(jī)械強(qiáng)力攪拌，充分分散后加熱溶解。
將發(fā)酵乳與糖漿混合，必要時(shí)添加檸檬酸調(diào)節(jié)酸度；添加香料后，用9.8～14.72兆帕的壓力均質(zhì)，制成發(fā)酵原液；加一定量的冷卻水稀釋，最后把3～5℃的制品灌裝于容器中冷藏。
b、果汁型嗜酸乳桿菌飲料按配方量將果汁、蔗糖、果肉醬色素等混合溶解，必要時(shí)添加穩(wěn)定劑，檸檬酸后，經(jīng)80～85℃、10～15分鐘或90～95℃、15秒鐘殺菌后冷卻到3～5℃。添加另外培養(yǎng)的乳酸菌發(fā)酵劑充分混合，灌裝于容器中后冷藏。
發(fā)酵劑的添加量，按菌種、菌數(shù)、活力等各異，通常5％以內(nèi)已足夠。如果發(fā)酵劑的添加量過多，則產(chǎn)生酪蛋白沉淀，降低商品價(jià)值。
嗜酸乳桿菌冰激凌用常規(guī)的方法得到冰激凌，在分裝之前加入本發(fā)明活性嗜酸乳桿菌菌粉或本發(fā)明嗜酸乳桿菌活性發(fā)酵液，攪拌后即得到嗜酸乳桿菌冰激凌。
原料的成分與成分值見下表

圖1是果蔬汁的加工工藝流程(以胡蘿卜為例)；圖2是嗜酸乳桿菌胡蘿卜汁發(fā)酵及包裝工藝；圖3是嗜酸乳桿菌酸奶的制造工藝流程圖；圖4是液體酸牛乳型嗜酸乳桿菌飲料制造工藝流程圖；圖5是嗜酸乳桿菌冰激凌的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)a.實(shí)驗(yàn)方案1.將待測(cè)菌株從斜面上活化1次，37℃培養(yǎng)18hr取出備用；2.用滅菌生理鹽水將菌體從斜面上洗下，使用3.0比濁管進(jìn)行比濁；3.耐酸取0.1ml菌懸液加入到2mlPH3.0的磷酸鹽緩沖液中，37℃厭氧培養(yǎng)3hr；
耐酸耐膽鹽取0.1ml菌懸液加入到2mlPH3.0的磷酸鹽緩沖液中，37℃厭氧培養(yǎng)1hr后，取1ml加入到0.15％的膽鹽溶液中，37℃厭氧培養(yǎng)3hr；4.適當(dāng)稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。
b.實(shí)驗(yàn)結(jié)果耐酸

耐酸耐膽鹽

實(shí)施例2降膽固醇實(shí)驗(yàn)a.實(shí)驗(yàn)方案色譜條件儀器型號(hào)VISTA6000GC檢測(cè)器火焰離子化檢測(cè)器色譜柱2m*I.D.2mm 5％0V-17 on 80/100目GCQ玻璃柱，或其它公司生產(chǎn)的具有相同性能的儀器和色譜柱。
柱溫285℃檢測(cè)器溫度325℃進(jìn)樣器溫度325℃氮?dú)饬魉?0ml/min進(jìn)樣體積2μl(一)培養(yǎng)基上清液中膽固醇含量的測(cè)定方法1.將1.0ml的菌懸液接種到裝有10ml MRS液體培養(yǎng)基的試管中，同時(shí)用1ml滅菌生理鹽水做對(duì)照；2.加入1.0ml膽固醇溶液(1.6)；3.37℃培養(yǎng)10小時(shí)后，4000*g離心10分鐘，收集上清；4.皂化向一具塞試管中加入0.1ml上清，0.3ml 33％KOH，3ml 95％乙醇，混勻后60℃水浴15分鐘，然后迅速降至室溫；5.萃取加入5ml正己烷，3ml蒸餾水，混合震蕩1分鐘。轉(zhuǎn)移1ml正己烷層到容量瓶中待測(cè)。
(二)降低發(fā)酵乳制品中膽固醇含量實(shí)驗(yàn)1.將菌懸液1ml接種到100ml均質(zhì)原料乳中；2.在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)；3.待乳凝固后取出，放入冰箱中冷藏備用；4.樣品處理方法及檢測(cè)方法準(zhǔn)確稱取5g樣品(乳50ml)于皂化瓶中，然后加入25ml 50％KOH溶液和25ml 95％乙醇，連接冷凝管，水浴回流皂化30分鐘。
迅速冷卻皂化液至室溫，然后將皂化液全部移至250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚，振搖2分鐘后萃取，靜止分層；放出水相于另一分液漏斗中，再分別用50ml石油醚，按上述方法萃取水相兩次；合并有機(jī)相，用蒸餾水洗至中性后，再用無水硫酸鈉干燥。
在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將石油醚蒸干，最后用1ml正己烷定容。
將萃取后所得的正己烷部分吸取1ml備用，然后用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)。
b.實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)基中

發(fā)酵乳中

實(shí)施例3吸附實(shí)驗(yàn)a.實(shí)驗(yàn)方案1.將待測(cè)菌株從斜面上活化1次，37℃培養(yǎng)18hr取出備用；2.用滅菌生理鹽水將菌體從斜面上洗下；3.用PBS清洗2次，每次用3000rpm離心10min。最后配成1*108CFU/ml的菌懸液；
4.向帶蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中(已培養(yǎng)好單層HT-29細(xì)胞)加入0.5ml菌懸液，并加入細(xì)胞培養(yǎng)液。37℃培養(yǎng)60min(培養(yǎng)條件為10％CO2、90％空氣或5％CO2、95％空氣)；5.倒去培養(yǎng)液，并用PBS清洗3-4次，自然干燥；6.用甲醇、丙酮或其它試劑固定；7.革蘭氏染色；8.在光學(xué)顯微鏡(1000倍，油鏡)下觀察吸附情況；9.計(jì)數(shù)并照像。
b.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例4抑菌實(shí)驗(yàn)a.實(shí)驗(yàn)方案(一)平板法1.將致病菌用營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基活化2次，分別取0.2ml進(jìn)行平板涂布。
37℃放置30min，使其表面干燥。
2.向每一個(gè)平板中放置4個(gè)牛津杯，分別加入0.1ml的PH3.5乳酸、嗜酸乳桿菌培養(yǎng)上清、嗜酸乳桿菌菌懸液和空白MRS液體培養(yǎng)基。
通過步驟732和756，處理構(gòu)建清單文件中列出的每一文件。為此，在步驟734，找到該文件，并在步驟738確定它是否可執(zhí)行。如果不是，則照原樣將該文件復(fù)制到一臨時(shí)構(gòu)建目錄，否則，該文件需要由令可執(zhí)行代碼能夠在安裝時(shí)重新定位/修補(bǔ)到設(shè)備上(如果尚未被處理，如通過步驟740所測(cè)試的)的工具250(圖2，如名為relmerge.exe)來處理。如果文件需要relmerge處理，如后文參考圖8A和8B所描述的，則在步驟744調(diào)用該工具，并且如果它成功地執(zhí)行，則將文件名添加到設(shè)備清單。
由此，如上文參考圖7A和7B所描述的，在插入到包中以允許可執(zhí)行代碼在安裝時(shí)能夠重新定位/修補(bǔ)到設(shè)備上之前，審閱構(gòu)建清單文件208中列出的包的文件內(nèi)容，并處理任何可執(zhí)行代碼。為將構(gòu)建清單文件轉(zhuǎn)化成最終包文件列表形式，用relmerge工具250處理每一可執(zhí)行文件，該工具壓縮已在文件中的重定位信息，并可任選地(如果提供了.REL文件)提供允許操作系統(tǒng)將代碼和數(shù)據(jù)段分隔成不連續(xù)的存儲(chǔ)器區(qū)域的更詳細(xì)的重定位信息。
relmerge工具操作一般在圖8的流程圖中描述。如步驟802所表示的，作出輸入文件的副本，因?yàn)檩斎胛募⑼ㄟ^運(yùn)行該工具而被修改。由此，relmerge工具250作出該輸入文件的副本，并從該副本工作，當(dāng)程序退出時(shí)，該副本被刪除。
在步驟804，移除簽名，因?yàn)榉駝t簽名將導(dǎo)致處理的稍后部分(空格計(jì)算檢查，后文描述)失敗。注意，由于工具250將輸出完全不同的文件，因此簽名在任何情況下都與輸出文件無關(guān)。注意，在可移植的可執(zhí)行文件中，(.EXE和.DLL文件的文件格式)，簽名儲(chǔ)存在文件中任何分段之外的文件末端，其中，每一分段對(duì)應(yīng)于一單元，數(shù)據(jù)與該單元一起由加載器加載到存儲(chǔ)器中。每一分段具有一頭部，被稱為O32頭部，或用IMAGE_SECTION_HEADER結(jié)構(gòu)來標(biāo)識(shí)。如由步驟806一般表示的，為方便處理該文件，工具250將PE文件的PE文件頭部及其分段解析成合適的內(nèi)部數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。IMAGE_SECTION_HEADER結(jié)構(gòu)表示映象分段頭部格式(關(guān)于IMAGE_SECTION_HEADER的另外細(xì)節(jié)可在msdn.microsoft.com上找到)


實(shí)施例5抑制幽門螺桿菌實(shí)驗(yàn)a.實(shí)驗(yàn)方案(平板法)1.制備幽門螺桿菌菌懸液(109CFU/ml)、濃度109CFU/ml嗜酸乳桿菌菌懸液；MRS液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)液上清；乳酸溶液(自備)；2.制備幽門螺桿菌平板；3.培養(yǎng)基平板上加入0.2ml螺桿菌菌懸液，用三角形玻璃棒涂布均勻。放入培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)30min；4.放入4個(gè)牛津杯，依次加入菌懸液、菌培養(yǎng)液上清、PH3.5乳酸溶液(滅菌)、MRS液體培養(yǎng)基；5.培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48hr；6.測(cè)抑菌環(huán)直徑(使用游標(biāo)卡尺)；7.記錄數(shù)據(jù)。
b.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例6將嗜酸乳桿菌菌種用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集和洗滌菌體，添加保護(hù)劑，干燥制備成活性菌粉；用明膠制成囊材，用PVP作底衣，再用蜂蠟進(jìn)行外層包衣，用0號(hào)膠囊包裝。得到嗜酸乳桿菌膠囊。
實(shí)施例7取胡蘿卜50公斤，經(jīng)過分選、清洗、去皮、切分、漂燙、榨汁打漿、配料、均質(zhì)、滅菌步驟得到無菌果蔬汁。
然后經(jīng)過如下步驟將嗜酸乳桿菌菌種活化、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)、接種到滅菌蔬菜汁、發(fā)酵、取樣檢測(cè)合格、冷卻降溫、無菌灌裝、產(chǎn)品包裝、成品，得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵果蔬汁，其中，所述的取樣檢測(cè)合格的條件一是PH值達(dá)到4.2～4.5；二是活菌數(shù)達(dá)到108CFU/ml以上。
實(shí)施例8將嗜酸乳桿菌菌種用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集和洗滌菌體，添加保護(hù)劑，然后加入淀粉、奶粉混合成懸液或冷凍干燥成菌粉；將現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)囊材配成溶液，經(jīng)滅菌后與菌粉混合均勻；然后將菌粉和囊材的混合物擠壓成細(xì)滴或噴入滅菌的0.3mol/L氯化鈣溶液中，緩緩攪拌固化，然后收集微膠囊，用緩沖液洗滌三次即得濕的嗜酸乳桿菌微膠囊。
實(shí)施例9用濃縮脫脂乳或脫脂乳粉強(qiáng)化的脫脂乳，將混合料在95℃溫度下加熱殺菌60分鐘，冷卻到37℃；然后在其中添加3％的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑，在35℃下培養(yǎng)，使酸度達(dá)到1.5％，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)，這時(shí)菌數(shù)最低達(dá)到108CFU/ml。得到嗜酸乳桿菌乳飲料。
上述實(shí)施例說明本發(fā)明產(chǎn)品的確具有相比于現(xiàn)有技術(shù)更好的和更多的功能。在耐酸耐膽鹽、抑制細(xì)菌等很多方面具有特別的優(yōu)勢(shì)。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基本上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種嗜酸乳桿菌菌株，其特征是由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的保藏號(hào)為CGMCC No.1084。
2.一種嗜酸乳桿菌膠囊的制備方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌菌種用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集和洗滌菌體，加入保護(hù)劑，干燥后裝入選用0～5號(hào)膠囊。
3.如權(quán)利要求2所述的嗜酸乳桿菌膠囊的制備方法，其特征在于膠囊用PVP作底衣，再CAP或蜂蠟進(jìn)行外層包衣，并且選用不透氣材料作為包裝材料，并用真空或充氮?dú)獍b。
4.一種嗜酸乳桿菌片劑的制備方法，其特征在于將嗜酸乳桿菌菌粉與輔料或泡騰崩解劑混和制備成嗜酸乳桿菌片劑。
5.一種嗜酸乳桿菌發(fā)酵果蔬汁的制備方法，其特征在于將蔬菜用常規(guī)方法處理成蔬菜汁，然后經(jīng)過如下步驟將嗜酸乳桿菌菌種活化、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)、接種到滅菌蔬菜汁、發(fā)酵、取樣檢測(cè)合格、冷卻降溫、無菌灌裝、產(chǎn)品包裝、成品，得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵果蔬汁，其中，所述的取樣檢測(cè)合格的條件一是PH值達(dá)到4.2～4.5；二是活菌數(shù)達(dá)到108CFU/ml以上。
6.一種嗜酸乳桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于將嗜酸乳桿菌菌種用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集和洗滌菌體，然后加入淀粉、奶粉或其他保護(hù)劑混合成懸液或冷凍干燥成菌粉；將現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)囊材配成溶液，經(jīng)滅菌后與菌粉混合均勻；然后將菌粉和囊材的混合物擠壓成細(xì)滴或噴入固化劑溶液中，緩緩攪拌固化，然后收集微膠囊，用緩沖液洗滌三次即得濕的嗜酸乳桿菌微膠囊；其中，固化劑采用滅菌后的0.1～0.3mol/L氯化鈣溶液。
7.一種嗜酸乳桿菌乳粉的制備方法，其特征在于將純培養(yǎng)的本發(fā)明嗜酸乳桿菌粉末與良質(zhì)乳粉在無菌室內(nèi)成分混合、包裝、進(jìn)行無菌操作。
8.如權(quán)利要求7所述的嗜酸乳桿菌乳粉的制備方法，其特征在于將純培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌的脫脂乳培養(yǎng)液與經(jīng)過殺菌濃縮的牛乳混和，然后進(jìn)行真空冷凍升華干燥，得到嗜酸乳桿菌乳粉。
9.一種嗜酸乳桿菌酸乳的制備方法，其特征在于用常規(guī)方法制備得到酸乳發(fā)酵劑和用本發(fā)明制備的發(fā)酵劑按一定比例混合后，用常規(guī)工藝生產(chǎn)凝固性和攪拌型酸奶。
10.一種嗜酸乳桿菌乳飲料的制備方法，其特征在于用濃縮脫脂乳或脫脂乳粉強(qiáng)化的脫脂乳，將混合料在90～95℃溫度下加熱殺菌5～10分鐘，冷卻到37℃；然后在其中添加2～3％的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑，在35～37℃下培養(yǎng)，使乳酸度達(dá)到1.5～2.0％，培養(yǎng)時(shí)間低于24小時(shí)，然或用常規(guī)方法制成乳飲料，其中，菌數(shù)最低達(dá)到108CFU/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，特別是涉及一種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用。屬于生物制品領(lǐng)域。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的篩選和培育，得到了本發(fā)明的嗜酸乳桿菌，經(jīng)過本發(fā)明中產(chǎn)品嗜酸乳桿菌制備的一系列產(chǎn)品都具有對(duì)人體十分有益的效果。本發(fā)明嗜酸乳桿菌的保藏號(hào)CGMCC No.1084。保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏地點(diǎn)中國(guó).北京.中關(guān)村。用本發(fā)明產(chǎn)品嗜酸乳桿菌可以制備的產(chǎn)品包括嗜酸乳桿菌膠囊、嗜酸乳桿菌片劑、嗜酸乳桿菌發(fā)酵果蔬汁、嗜酸乳桿菌微膠囊、嗜酸乳桿菌乳粉、嗜酸乳桿菌酸乳、嗜酸乳桿菌乳飲料。本發(fā)明產(chǎn)品的確具有相比于現(xiàn)有技術(shù)更好的和更多的功能。在耐酸耐膽鹽、抑制致病菌等很多方面具有特別的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A23L2/02GK1641014SQ20041000076
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2004年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月18日
發(fā)明者于景華, 呂加平, 王建, 張國(guó)鈺, 李樹芹, 張和平 申請(qǐng)人:北京三元食品股份有限公司