專利名稱：一株嗜酸異養(yǎng)菌dx-x及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一株嗜酸異養(yǎng)菌DX-X及其應(yīng)用，主要涉及一株嗜酸異養(yǎng)菌(Acidiphiliumspp.DX-X)及在提高生物冶金浸出率方面的應(yīng)用，屬于生物冶金技術(shù)范疇。

背景技術(shù)：
由于人們對(duì)金屬礦物原料的需求不斷增長(zhǎng)，地球金屬礦產(chǎn)資源日益貧乏。同時(shí)，常規(guī)的金屬礦物冶煉方法為環(huán)境帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題。迫使人們開始采用成本低，工藝簡(jiǎn)單，作用廣泛，環(huán)境污染小的微生物濕法冶金技術(shù)。如今，世界各國(guó)通過運(yùn)用微生物濕法冶金的方法從低品位原料(如廢礦石)中回收貴重金屬已經(jīng)達(dá)到了前所未有的規(guī)模。
1947年，美國(guó)colmer和hinkle從礦山酸性廢水坑中分離鑒定出氧化亞鐵硫桿菌，并證實(shí)了微生物在浸礦中的生物化學(xué)作用[1]。經(jīng)過多年來的實(shí)驗(yàn)研究以及工作實(shí)踐，目前已被報(bào)告可用于浸礦的微生物已有20多種[2-4]。嗜酸菌屬細(xì)菌(Acidiphilium spp)是一類嗜酸、兼性異養(yǎng)的G-桿狀細(xì)菌，能夠利用有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，同時(shí)在自養(yǎng)環(huán)境中，還可以利用鐵礬、無定形氫氧化鐵、單質(zhì)硫和含鐵、亞鐵或三價(jià)鐵礦物獲得能量進(jìn)行生長(zhǎng)，是微生物浸礦群落的重要組成部分[5-7]，將該屬細(xì)菌應(yīng)用在微生物濕法冶金工業(yè)上，可以大大提高浸出率[8-13]。
本發(fā)明提供的一株嗜酸異養(yǎng)菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)，是一株性能獨(dú)特、可大大提高生物冶金浸出率的嗜酸異養(yǎng)菌。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株可在低pH值下生長(zhǎng)的嗜酸異養(yǎng)菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)，它與氧化亞鐵硫桿菌混合，對(duì)金川貧鎳礦進(jìn)行微生物浸出，大大提高了浸出率，顯示出其良好的促浸作用。
該菌株可培養(yǎng)在BSYG液體培養(yǎng)基以及固體培養(yǎng)基中，在25～40℃的溫度范圍內(nèi)，DX-X菌都可良好生長(zhǎng)，DX-X菌的最適溫度為3035℃。該菌株為革蘭氏陰性菌，短桿狀，能運(yùn)動(dòng)，單生。在pH2.5～4.5的范圍內(nèi)，該菌株都可良好生長(zhǎng)，最適pH值為3.0～3.5，屬于嗜酸微生物，可在3％的鹽濃度下生長(zhǎng)。該菌株不能利用硫粉以及硫代硫酸鈉，也不能以Fe2+作為能源?？梢岳闷咸烟恰⒏事短谴家约案视妥鳛橛袡C(jī)能源。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)對(duì)氧化亞鐵硫桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性。所測(cè)得的16SrRNA寡核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示與嗜酸菌屬細(xì)菌(Acidiphilium spp.)同源性>98％。將該菌株與氧化亞鐵硫桿菌一同對(duì)金川鎳礦進(jìn)行混合浸出，其浸出率優(yōu)于氧化亞鐵硫桿菌單獨(dú)浸礦的浸出率，具有應(yīng)用于生物濕法冶金工業(yè)的巨大潛力。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株的特征 1.將DX-X接種于BSYG液體培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)適合時(shí)間后染色鏡檢，進(jìn)行革蘭氏染色。染色結(jié)果該細(xì)菌為短桿狀，G-性，能運(yùn)動(dòng)，單生。
2.嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株的溫度適應(yīng)性 將1ml的等量的菌株接種于50ml BSYG液體培養(yǎng)基中，分別放入20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃恒溫?fù)u床中，120rpm下振蕩48h后，觀察其生長(zhǎng)狀況。
從上表可以看出，在25～40℃的溫度范圍內(nèi)，DX-X菌都可良好生長(zhǎng)，DX-X菌的最適溫度為30-35℃。
3.嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株的滲透壓適應(yīng)性 分別制備含0％，1.5％，3％，3.5％，5％NaCl的BSYG液體培養(yǎng)基，將1ml等量的菌種接入30ml上述液體培養(yǎng)基中，并設(shè)空白對(duì)照，120rpm，30℃下振蕩培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀況。
顯示嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株可在3％的鹽濃度下生長(zhǎng)。
4.嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株的pH適應(yīng)性 制備pH2，2.5，3，3.5，4，4.5的BSYG液體培養(yǎng)基，接種方法同上，120rpm，30℃下振蕩培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀況。
從上表可以看出，在pH2.5～4.5的范圍內(nèi)，嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株都可良好生長(zhǎng)，其最適pH為3.5。
5.嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株對(duì)能源的特性 (1)嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株對(duì)硫粉和硫代硫酸鈉的利用 分別制備含硫粉的Wasksman((NH4)2SO4 0.2g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 O.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，硫粉10g，蒸餾水1000ml，pH3.0)液體培養(yǎng)基和含硫代硫酸鈉的Wasksman((NH4)2SO4 0.2g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.2g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01g，Na2S2O3 10g，蒸餾水1000ml，pH3.0)液體培養(yǎng)基，將5ml的嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株接入30ml的上述液體培養(yǎng)基中，并設(shè)兩個(gè)空白對(duì)照，120rpm，30℃下振蕩培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株不能利用硫粉和硫代硫酸鈉進(jìn)行生長(zhǎng)。
(2)嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株對(duì)Fe2+的利用 制備含有4％FeSO4的9K(3.0g(NH4)2SO4，0.1g KCl，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.01g Ca(NO3)2，44.7g FeSO4·7H2O，蒸餾水1000ml，pH2.5)液體培養(yǎng)基，將5ml的嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株接入30ml的上述液體培養(yǎng)基中，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照(防止Fe2+自身氧化的干擾)，120rpm，30℃下振蕩培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株不能利用Fe2+進(jìn)行生長(zhǎng)。
(3)嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株對(duì)有機(jī)能源的利用 分別制備含有0.1％有機(jī)物的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，將5ml的DX-3接入30ml的上述液體培養(yǎng)基中，并設(shè)空白對(duì)照，120rpm，30℃下振蕩培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況。
“+”表示有生長(zhǎng)，“-”表示沒有生長(zhǎng)。結(jié)果顯示嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株只可利用葡萄糖、甘露糖醇和甘油。
6.嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株的生化反應(yīng) (1)氧化酶 在干凈的濾紙上滴二甲基對(duì)苯撐二胺的1％水溶液，用玻棒蘸取3-5天的菌苔，涂抹在潤(rùn)濕的濾紙上，在10秒內(nèi)涂抹的菌苔呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，10-60秒現(xiàn)紅色者為延遲反應(yīng)，60秒以上現(xiàn)紅色者不計(jì)，按陰性處理，結(jié)果顯示DX-3為陰性。
(2)接觸酶 將3-5天的菌苔以接種環(huán)取一小環(huán)涂抹于已滴有3％過氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，無氣泡為陰性，結(jié)果顯示DX-3為陽(yáng)性。
7.嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株16SrRNA寡核苷酸序列分析 用CEQXL2000，BECKENMAN-COUNL TERDNA測(cè)序儀對(duì)DX-3的16SrRNA寡核苷酸序列進(jìn)行分析，測(cè)序引物為1492r5’-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3’ 27f5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株16SrRNA寡核苷酸序列如下 tggttggctg cctcccttgc gggttagcgc accaacttaa ggtcaaacca aatcccatgg 60 tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120 ttactagcga ttccaccttc atgcactcga gttgcagagt gcaatccgaa ctgagacggc 180 tttttgagat cagctcggtg tcaccacctg gcttcccact gtcaccgcca ttgtagcacg 240 tgtgtagccc aggacataag ggccatgagg acttgacgtc atccccacct tcctccggct 300 tgtcaccggc agttccttca gagtgcccac ccaaacatgc tggcaactga aggcgagggt 360 tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag 420 cacctgtgcg ggagcccctt gcgggaaagt ccatctctgg accggtactcc ccatgtcaa 480 atcctggtaa ggttctgcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540 gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtgtgctta 600 ccgcgttagc tacgacactg aagtgctaag caccccaaca tccagcacac atcgtttaca 660 gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca 720 gtaatggacc aggttgccgc cttcgccacc ggtgttcttt ccaatatcta cgaatttcac 780 ctctacactg gaaattccac aaccctcttc catactcaag acaacacgtc tcagacgcag 840 tccccaggtt gagcccagga atttcacgcc tgactgtgcc gtccgcctac gcgcccttta 900 cgcccagtca ttccgagcaa cgctagcccc cttcgtatta ccgcggctgc tggcacgaag 960 ttagccggag cttattctgc gggtaccgtc atcatcgtcc ccgccaaaag gactttacat 1020 tccgaaagac cttc 1034 將此序列在網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/上用BLAST軟件和已登陸的部分菌株的16SrRNA寡核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明與嗜酸菌屬細(xì)菌(Acidiphilium spp.)的同源性>98％。
實(shí)施例2嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株對(duì)氧化亞鐵硫桿菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用 配置FeTSBo(1.26g(NH4)2SO4，0.5gMgSO4·7H2O，0.25g蛋白胨，6.95gFeSO4.7H2O，12g瓊脂，蒸餾水1000ml，pH3.0)雙層固體培養(yǎng)基。將50ul DX-3菌液涂布于FeTSBo雙層培養(yǎng)基的底層，培養(yǎng)基的上層涂布20ul氧化亞鐵硫桿菌菌液，30℃倒置培養(yǎng)，一周后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。
“+”表示有生長(zhǎng)，“-”表示沒有生長(zhǎng)。
實(shí)施例3嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株對(duì)氧化亞鐵硫桿菌鎳礦浸出率的促進(jìn)作用 將采自金川鎳礦的礦石處理成粒度為165μm的顆粒，并用10％的硫酸溶液酸化，用蒸餾水沖洗干凈并烘干。礦石的鎳含量為0.29％。
配置9K培養(yǎng)基(3.0g(NH4)2SO4，0.1g KCl，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.01gCa(NO3)2，44.7g FeSO4·7H2O，蒸餾水1000ml，pH2.5)以及9KYE培養(yǎng)基(3.0g(NH4)2SO4，0.1g KCl，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.01g Ca(NO3)2，44.7g FeSO4·7H2O，1g葡萄糖，0.1g酵母提取物，蒸餾水1000ml，pH2.5)。在兩種培養(yǎng)基中分別加入3g已酸化好的礦粉。
接種在9K培養(yǎng)基里接入10％的氧化亞鐵硫桿菌，在9KYE培養(yǎng)基中按10％的接種量同時(shí)接入氧化亞鐵硫桿菌以及DX-3，比例為11。30℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔24取樣并通過TAS-986原子吸收分光光度計(jì)測(cè)得鎳的含量。

由上表可見，9KYE培養(yǎng)基中氧化亞鐵和DX-3混合培養(yǎng)物的浸出率明顯高于9K培養(yǎng)基中氧化亞鐵硫桿菌的浸出率。這提示我們，在鎳礦浸出工業(yè)方面，我們可以采用氧化亞鐵硫桿菌和嗜酸異養(yǎng)菌DX-3混合浸礦。
權(quán)利要求
權(quán)利要求1本發(fā)明為一株嗜酸異養(yǎng)菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)及其應(yīng)用，其特征在于該菌株屬于嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)，能在微生物冶金混合浸出方面應(yīng)用。
權(quán)利要求2根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸異養(yǎng)菌DX-X，其特征在于
(1)、形態(tài)特征該細(xì)菌為短桿狀，G-性，能運(yùn)動(dòng)，單生。
(2)、培養(yǎng)特征
該菌株可培養(yǎng)在BSYG液體培養(yǎng)基以及固體培養(yǎng)基中，在25～40℃的溫度范圍內(nèi)，DX-X菌都可良好生長(zhǎng)，DX-X菌的最適溫度為30～35℃。在pH2.5～4.5的范圍內(nèi)，該菌株都可良好生長(zhǎng)，最適pH值為3.0～3.5。該菌株可在3％的鹽濃度下生長(zhǎng)。
(3)、菌株的生理生化特征
該菌株不能利用硫粉以及硫代硫酸鈉，也不能以Fe2+作為能源?？梢岳闷咸烟?、甘露糖醇以及甘油作為有機(jī)能源。氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性。
(4)、該菌株的16S rRNA基因序列為
tggttggctg cctcccttgc gggttagcgc accaacttaa ggtcaaacca aatcccatgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccaccttc atgcactcga gttgcagagt gcaatccgaa ctgagacggc 180
tttttgagat cagctcggtg tcaccacctg gcttcccact gtcaccgcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggacataag ggccatgagg acttgacgtc atccccacct tcctccggct 300
tgtcaccggc agttccttca gagtgcccac ccaaacatgc tggcaactga aggcgagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag 420
cacctgtgcg ggagcccctt gcgggaaagt ccatctctgg accggtactc cccatgtcaa 480
atcctggtaa ggttctgcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtgtgctta 600
ccgcgttagc tacgacactg aagtgctaag caccccaaca tccagcacac atcgtttaca 660
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca720
gtaatggacc aggttgccgc cttcgccacc ggtgttcttt ccaatatcta cgaatttcac780
ctctacactg gaaattccac aaccctcttc catactcaag acaacacgtc tcagacgcag840
tccccaggtt gagcccagga atttcacgcc tgactgtgcc gtccgcctac gcgcccttta900
cgcccagtca ttccgagcaa cgctagcccc cttcgtatta ccgcggctgc tggcacgaag960
ttagccggag cttattctgc gggtaccgtc atcatcgtcc ccgccaaaag gactttacat1020
tccgaaagac cttc 103權(quán)利要求3根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的嗜酸異養(yǎng)菌DX-X，其特征在于嗜酸異養(yǎng)菌DX-X菌株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)對(duì)氧化亞鐵硫桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。將該菌株與氧化亞鐵硫桿菌一同對(duì)硫化礦進(jìn)行混合浸出，其浸出率優(yōu)于氧化亞鐵硫桿菌單獨(dú)浸礦的浸出率，可應(yīng)用于生物濕法冶金工業(yè)。
權(quán)利要求4根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的嗜酸異養(yǎng)菌DX-X，其特征在于該菌株可以不但可應(yīng)用于微生物冶金，也可廣泛工業(yè)酸性廢氣污染脫硫治理、煤炭脫硫、礦物藥處理等方面，這是一般技術(shù)人員可以理解的。
全文摘要
本發(fā)明為一株嗜酸異養(yǎng)菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)及其應(yīng)用，該菌株可培養(yǎng)在BSYG液體培養(yǎng)基以及固體培養(yǎng)基中，在25～40℃的溫度范圍內(nèi)，pH2.5～4.5的范圍內(nèi)，都可良好生長(zhǎng)。該菌株為革蘭氏陰性菌，短桿狀，能運(yùn)動(dòng)，單生，屬于嗜酸微生物，可在3％的鹽濃度下生長(zhǎng)。該菌株不能利用硫粉以及硫代硫酸鈉，也不能以Fe2+作為能源?？梢岳闷咸烟恰⒏事短谴家约案视妥鳛橛袡C(jī)能源，氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性。該菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)對(duì)氧化亞鐵硫桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且在與氧化亞鐵硫桿菌一同對(duì)金川鎳礦進(jìn)行混合浸出時(shí)，浸出率優(yōu)于氧化亞鐵硫桿菌單獨(dú)浸礦的浸出率，具有應(yīng)用于生物濕法冶金工業(yè)的巨大潛力。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101481667SQ20081030524
公開日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2008年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日
發(fā)明者李紅玉, 張曉雪, 鮑婧婷 申請(qǐng)人:李紅玉, 蘭州大學(xué)