來(lái)源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種來(lái)源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。所述的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，通過(guò)構(gòu)建包含還基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，經(jīng)試驗(yàn)表明，該基因能夠在梭菌中穩(wěn)定高效表達(dá)，有效提高了梭菌對(duì)丁醇的耐受性。同時(shí)，利用厭氧發(fā)酵，還表明該基因能夠大幅度提高梭菌產(chǎn)丁醇能力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】來(lái)源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種來(lái)源于極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、包含該基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，以及它們?cè)谔岣咚缶〈寄褪苄裕偈顾缶岣弋a(chǎn)高含量丁醇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物丁醇是是一種極具潛力的第二代新型生物燃料，與乙醇相比，丁醇作為生物燃料具有以下眾多優(yōu)勢(shì):1)能量含量高，與乙醇相比可多走30%的路程；2)丁醇的揮發(fā)性只有乙醇的1/6倍，汽油的1/13.5，與汽油混合對(duì)水的寬容度大，對(duì)潮濕和低水蒸氣壓力有更好的適應(yīng)能力；3)丁醇可在現(xiàn)有燃料供應(yīng)和分銷(xiāo)系統(tǒng)中使用，而乙醇則需要通過(guò)鐵路、船舶或貨車(chē)運(yùn)輸；4)與其他生物燃料相比，腐蝕性較小，比乙醇、汽油安全；5)與現(xiàn)有的生物燃料相比，生物丁醇與汽油的混合比更高，無(wú)需對(duì)車(chē)輛進(jìn)行改造，就可以使用幾乎100%濃度的丁醇，而且混合燃料的經(jīng)濟(jì)性更高；6) 丁醇可以通過(guò)不消耗糧食、不占用耕地、不增加環(huán)境壓力為前提進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。如果丁醇占生物燃料市場(chǎng)的20%，全球市場(chǎng)將超過(guò)200億美
J Li ο
[0003]由于丁醇具有毒性，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和原料轉(zhuǎn)化。目前生產(chǎn)中，丁醇的終濃度維持在13-14g/L，當(dāng)超過(guò)這個(gè)濃度時(shí)，由于丁醇的毒性，細(xì)胞代謝就終止了(Zheng2009J IndMicrobiol Biotechnol )。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)丁醇的毒性主要是破壞細(xì)胞膜的磷脂成分，從而進(jìn)一步影響糖和氨基酸的吸收。目前普遍認(rèn)為若細(xì)胞對(duì)丁醇的抗性得以提高，丁醇的產(chǎn)量也將相應(yīng)提聞。
[0004]泛應(yīng)激蛋白(Universal stress protein, Usp)是一類(lèi)在細(xì)胞質(zhì)中普遍存在的小分子蛋白，通常由111-167個(gè)氨基酸殘基組成。Usp最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)受多種脅迫影響(NyStroml993，J Bacterio)。此后，USP蛋白在多種古生菌、細(xì)菌、植物中均被發(fā)現(xiàn)。USPA蛋白在埃希氏菌屬大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)受到限制，DNA被損壞時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)；該蛋白在化學(xué)毒素，滲透脅迫，UV照射條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；被認(rèn)為外界壓力的生物傳感器。研究表明該類(lèi)蛋白在碳、氮、磷、硫酸鹽、氨基酸等缺乏時(shí)，以及在高溫、氧化、紫外線(xiàn)、環(huán)絲氨酸、抗生素等刺激下能積累表達(dá)(Liu2007, Micro Pathog)。Freestone等(1997, JMol Biol)的研究結(jié)果顯示，UspA作用于絲氨酸、蘇氨酸的蛋白磷酸化，對(duì)細(xì)胞穩(wěn)定期的生長(zhǎng)有重要作用。在埃希氏菌屬大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，USPA與細(xì)胞分裂蛋白有協(xié)同作用，同時(shí)可激活RecA的表達(dá)，RecA蛋白是細(xì)菌中參與DNA同源重組修復(fù)的重要蛋白，增強(qiáng)細(xì)胞抗性。RecA蛋白和Rad51蛋白分別是細(xì)菌和真核生物參與DNA同源重組修復(fù)的重要蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種來(lái)源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。[0006]本發(fā)明按照梭菌的偏愛(ài)密碼合成源于端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白 FaUSPA 基因(Genbank ZP_05570298.1)，設(shè)計(jì)引物，采用 PTDS 方法(Xiong2004，Nucleic Acids Res)人工合成并克隆該基因,對(duì)犾得的陽(yáng)性克隆進(jìn)彳丁序列測(cè)定,其喊基序列如SEQ IDNOl所示，即為本發(fā)明的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因，命名為FaUSPAI。
[0007]進(jìn)一步，本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建包含上述合成的泛應(yīng)急蛋白FaUSPAI基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，使其能夠在梭菌中高效表達(dá)。
[0008]所述的表達(dá)載體是以pS0S94載體為基礎(chǔ)載體，將氯霉素抗性基因表達(dá)單元，梭菌CAC3645基因啟動(dòng)子、上述合成的FaUSPAI基因的閱讀框單元和枯草桿菌pyruvate kinase基因終止子定向連接后替換PS0S94載體中的CtfAB及abc表達(dá)單元構(gòu)建而成的。
[0009]其中，從PXYP251載體中擴(kuò)增氯霉素表達(dá)單元。弓丨物為cml:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5’ -TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’ ；擴(kuò)增條件為 940C 30s, 600C 30s, 72°C 60s ;25 循環(huán)。
[0010]從梭菌C.acetobutylicum ATCC824 中擴(kuò)增 CAC3645 基因啟動(dòng)子，引物為 c3645z: 5，-TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3，，c3645f: 5，-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3，。擴(kuò)增條件為94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25循環(huán)。所得的梭菌CAC3645基因啟動(dòng)子的堿基序列如SEQ ID N02所示。
[0011]從枯草桿菌Bacillus subtilisl68中擴(kuò)增PYK基因終止子，引物為pykl: 5’_GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3，，pyk2:5，-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCG CCG-3’ ；擴(kuò)增條件為 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循環(huán)。
[0012]利用電擊法將上述含 有FaUSPAI基因表達(dá)單元的梭菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體導(dǎo)入梭菌中，通過(guò)紅霉素篩選轉(zhuǎn)化子。試驗(yàn)表明，該FaUSPAI基因可以在梭菌中高效表達(dá)，有效提高了梭菌對(duì)丁醇的耐受性。并在厭氧發(fā)酵中，大幅度提高了梭菌產(chǎn)丁醇能力，較原始菌株824提聞了 18%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明的含有FaUSPAI基因表達(dá)單元的梭菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜。
[0014]圖2至圖5為FaUSPAI梭菌轉(zhuǎn)化子和原始菌種在不同濃度對(duì)丁醇的耐受性。
[0015]圖6至圖7為FaUSPAI轉(zhuǎn)化子和原始菌種發(fā)酵后產(chǎn)物和生長(zhǎng)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1來(lái)源于極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因的合成
[0017]在不改變氨基酸序列的前提下，根據(jù)梭菌特有的密碼子特點(diǎn)，合成源極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus 的泛應(yīng)急蛋白 FaUSPA 基因(Genbank ZP_05570298.1),設(shè)計(jì)引物，并人工合成。引物序列如下，引物長(zhǎng)度為60bp左右。
[0018]1.NI10=FAUSPA1-1:Tm=54, 60mer
[0019]GGA, TCC, ATG, AAG, GTC, CTC, GTC, TCC, TAT, GAT, GGT, TCT, GAA, GGT, GCT, AGA, GAA, GCT, CTC, AAG
【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)源于極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因,其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.包含權(quán)利要求1所述的來(lái)源于來(lái)極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體是以pS0S94載體為基礎(chǔ)載體，將氯霉素抗性基因表達(dá)單元，梭菌CAC3645基因啟動(dòng)子、權(quán)利要求I所述的FaUSPA基因的閱讀框表達(dá)單元和枯草桿菌pyruvate kinase基因終止子定向連接后替換PS0S94載體中的ctfAB及abc表達(dá)單元構(gòu)建而成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，其特征在于，從PXYP251載體中擴(kuò)增氯霉素表達(dá)單元，引物為 cml:5’ -AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5，-TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3，；擴(kuò)增條件為 94 °C 30s, 60 °C 30s,72°C 60s ；25 循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，其特征在于，從梭菌C.acetobutylicum ATCC824 中擴(kuò)增 CAC3645 基因啟動(dòng)子，引物為 c3645z:5’ -TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3，，c3645f: 5，-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3 ’。擴(kuò)增條件為940C 30s, 600C 30s,72°C 30s ;25 循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求 3或5所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體，其特征在于，所述梭菌CAC3645基因啟動(dòng)子的堿基序列如SEQ ID N02所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達(dá)載體,其特征在于,從枯草桿菌Bacillus subtilisl68 中擴(kuò)增 PYK 基因終止子，引物為 pykl: 5’ -GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’，pyk2:5’ _CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCGCCG_3’ ；擴(kuò)增條件為 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循環(huán)。
8.權(quán)利要求1所述的來(lái)源于來(lái)極端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇耐受性中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的來(lái)源于來(lái)極端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇產(chǎn)量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103898126SQ201210585227
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】彭日荷, 姚泉洪, 田永生, 趙偉, 付曉燕, 朱波, 許晶, 高建杰, 韓紅娟, 王波, 王麗娟, 韓靜, 薛永 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院