專利名稱：一種基于胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程化軟骨及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程化軟骨及其制造方法，屬于組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷修復(fù)目前仍是臨床醫(yī)學(xué)的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的治療方案包括軟骨組織或骨-軟骨組織移植和人工關(guān)節(jié)。自體軟骨是最好的移植材料，但因工體有限，而且通常需要在第二個(gè)部位手術(shù)以獲取足夠的用于移植的軟骨組織，因此就應(yīng)用而言并不理想。而人工關(guān)節(jié)替代性修復(fù)迄今為止尚難以達(dá)到功能性修復(fù)效果，并且常會(huì)伴有各種并發(fā)癥的產(chǎn)生。盡管人們?cè)谶@一領(lǐng)域進(jìn)行了多年不懈的努力，但仍需尋找一種關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的有效治療方法，提供適當(dāng)?shù)纳硇孕迯?fù)，從而避免再?gòu)幕颊呱砩鲜占罅孔泽w軟骨組織，以一種創(chuàng)傷修復(fù)另外一種創(chuàng)傷。
組織工程技術(shù)的興起為軟骨組織的生理性修復(fù)帶來(lái)了希望。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)相繼報(bào)道有采用該技術(shù)構(gòu)建軟骨，在裸鼠和具有免疫力的小鼠、大鼠、兔、豬等動(dòng)物體內(nèi)取得成功的例子。但這些研究所采用的細(xì)胞是自體或異體軟骨細(xì)胞。而軟骨細(xì)胞本身來(lái)源少、取材困難、體外擴(kuò)增時(shí)容易丟失表型。為克服軟骨細(xì)胞作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的不足，近年來(lái)人們普遍把注意力投注到間充質(zhì)干細(xì)胞一類的成體組織干細(xì)胞上，其中骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞因其取材相對(duì)容易、體外擴(kuò)增過(guò)程中能維持表型，保持多向分化能力而得到廣泛研究，并且也在具有免疫力的大鼠、犬、羊、豬等動(dòng)物模型中取得了成功，顯示出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有潛在的臨床應(yīng)用前景。然而，從骨髓中獲取間充質(zhì)干細(xì)胞仍然存在明顯的不足。1)抽取患者骨髓需要造成手術(shù)創(chuàng)傷，不容易被患者接受；2)每次抽取骨髓量很少，僅5-10ml，而骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量又極低，僅為有核細(xì)胞的1/100000，因此細(xì)胞收獲量極??；3)間充質(zhì)干細(xì)胞雖然可以進(jìn)行體外連續(xù)傳代擴(kuò)增，但目前大規(guī)模擴(kuò)增技術(shù)尚不成熟，而且耗時(shí)費(fèi)力、成本高昂，從取材到應(yīng)用患者需要等待較長(zhǎng)時(shí)間；4)由于骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫原性，因此異體之間資源無(wú)法共享。以上因素表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并非軟骨組織工程種子細(xì)胞的理想來(lái)源。
最新研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織中具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似的貼壁細(xì)胞。國(guó)外Jaroscak等(2000年)報(bào)道從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出異質(zhì)性貼壁細(xì)胞。國(guó)內(nèi)張毅等報(bào)道采用酶消化法從胎盤組織中獲得貼壁細(xì)胞作為造血干細(xì)胞的支持細(xì)胞。因此，胎盤組織有望成為間充質(zhì)干細(xì)胞的潛在的豐富的來(lái)源。目前國(guó)內(nèi)外僅有零星文獻(xiàn)涉及胎盤來(lái)源貼壁細(xì)胞的小量分離，主要用于造血支持研究，而對(duì)胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)?；蛛x、純化和擴(kuò)增方法則缺乏的詳細(xì)的技術(shù)資料。發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)研究實(shí)踐摸索出胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，并證實(shí)該類細(xì)胞具有與骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，可在適當(dāng)?shù)臈l件下分化為包括軟骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型。由于胎盤組織為廢棄組織，來(lái)源豐富、細(xì)胞收獲量大，因此胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述軟骨組織工程研究中的不足，提供一種以胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程化軟骨及其制造方法。其方法如下1)胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增a.對(duì)新鮮娩出胎盤立即進(jìn)行放血、灌注，以去除血細(xì)胞和組織碎片；b.持續(xù)灌注，或?qū)⑻ケP小葉剪碎，用膠原酶消化，收集細(xì)胞成分；c.采用免疫磁珠吸附法或Percoll密度梯度離心法收集單個(gè)核細(xì)胞；d.測(cè)定細(xì)胞倍增時(shí)間和生長(zhǎng)曲線；e.對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存；e.采用生物反應(yīng)器對(duì)所獲得的細(xì)胞，包括低溫保存后復(fù)蘇的細(xì)胞進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò)增。
2)組織工程化軟骨的構(gòu)建a.支架材料預(yù)處理支架材料可以是可降解多孔生物陶瓷材料，如α-或β-磷酸三鈣；也可以是膠原、聚合物類。本發(fā)明中優(yōu)選β-磷酸三鈣多孔生物陶瓷。材料預(yù)制成各種規(guī)格的圓片狀，或根據(jù)需要預(yù)制成特定形狀，60gray60Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分鐘～1小時(shí)消毒。用前用95％酒精浸泡以提高親水性，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS緩沖液將酒精置換出來(lái)，滅菌干紗布吸干液體。已經(jīng)滅菌的膠原材料可以直接應(yīng)用。
b.組織工程化軟骨的構(gòu)建將新鮮分離或經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、或經(jīng)過(guò)冷凍保存的胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制成1～2×107/ml的細(xì)胞懸液，輕輕滴加在支架材料上，并輕輕翻轉(zhuǎn)材料，使細(xì)胞分布盡量均勻。將細(xì)胞-多孔支架材料復(fù)合體放入孵箱中，37℃，5％CO2，飽和濕度下靜置6～10小時(shí)，使細(xì)胞貼附在材料的孔洞內(nèi)和表面。然后轉(zhuǎn)移入旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行三維立體培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)速度15~50rpm。
c.組織工程化軟骨的保存構(gòu)建好的組織工程化軟骨可以采用低溫冷凍保存技術(shù)進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸。冷凍保存方法可以是以二甲基亞砜(DMSO)為冷凍保護(hù)劑的常規(guī)保存技術(shù)，也可以是以VS55為保護(hù)劑的玻璃化無(wú)冰晶保存技術(shù)。
有益效果本發(fā)明組織工程化軟骨是以胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，細(xì)胞取自廢棄的胎盤組織，來(lái)源豐富、收獲量大、無(wú)免疫排斥反應(yīng)。由于該細(xì)胞可以冷凍保存，并在人群之間共享，因此可以實(shí)現(xiàn)隨用隨取，無(wú)需等待，從而方便臨床應(yīng)用。另一方面，使用的可降解多孔生物陶瓷支架材料生物相容性好，機(jī)械強(qiáng)度高，微結(jié)構(gòu)合理，適于軟骨細(xì)胞的長(zhǎng)入和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，其降解速率可以也軟骨組織的新生速度相協(xié)調(diào)，最終在體內(nèi)形成正常的有功能的軟骨組織，實(shí)現(xiàn)功能性軟骨的再生，再生的軟骨組織可以與周圍組織自然整合，且具有更大的最終強(qiáng)度和穩(wěn)定性，對(duì)損傷或缺損實(shí)現(xiàn)生理性修復(fù)。由于可降解多孔生物陶瓷加工工藝成熟，可批量生產(chǎn)，胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞取材容易、不會(huì)有免疫排斥，因此本發(fā)明制造的組織工程化軟骨具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得胎盤娩出后立即置于無(wú)菌托盤或容器中，經(jīng)臍動(dòng)脈注入含有抗凝劑和抗生素的平衡鹽溶液，放血，并開(kāi)始灌注?？鼓齽┛梢允?~100u/mL的肝素，抗生素可以是青鏈霉素。收集灌注液，離心獲得細(xì)胞成分；或初步灌注后無(wú)菌剪取胎盤小葉，用胰蛋白酶或膠原酶消化胎盤組織，獲得細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液過(guò)細(xì)胞篩，除去組織碎片和血細(xì)胞，獲得的細(xì)胞重新懸浮，用密度為1.073g/mL的percoll，以500g離心力離心30分鐘，收獲界面細(xì)胞層，PBS洗滌后接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR標(biāo)記的免疫磁珠來(lái)分離帶有某種特殊標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的表型，如CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR等。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞周期，確定處于G0-G1期細(xì)胞的比例。
實(shí)施例2一種基于胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程化軟骨的制造方法將新鮮分離或凍存復(fù)蘇的人胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制備成1.5～2×107/ml的細(xì)胞懸液，接種到圓柱狀β-TCP支架上，盡量使細(xì)胞分布均勻。β-TCP多孔生物陶瓷材料可以由上海貝奧路公司專利的方法和工藝生產(chǎn)，材料經(jīng)60gray60Co照射消毒后用于組織工程化關(guān)節(jié)軟骨構(gòu)建，在一個(gè)優(yōu)選的方案中，其微結(jié)構(gòu)為孔徑-100～300μm，孔隙率-52％，孔間連接徑-30～100μm。靜置6小時(shí)后，將復(fù)合物移入RCCS(旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器，Synthecom公司)，在含10％FCS的DMEM中培養(yǎng)48小時(shí)，轉(zhuǎn)速為30rpm。培養(yǎng)后的復(fù)合物可以直接用于臨床修復(fù)患者關(guān)節(jié)軟骨缺損，也可低溫保存，作為組織工程化軟骨組織庫(kù)。
權(quán)利要求
1.一種基于胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程化軟骨及其制造方法。以從胎盤組織中分離提取獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，與可降解多孔生物支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程化軟骨。
2.權(quán)利要求1中所述的胎盤是健康產(chǎn)婦正常分娩或剖腹產(chǎn)胎兒娩出后遺留的胎盤。胎盤與母體以及胎兒分離后立即予以放血，并進(jìn)行灌注。灌注液為無(wú)菌平衡鹽溶液，其中含有抗凝劑和抗生素。
3.權(quán)利要求2中所述的胎盤放血后可以體外保存2-24小時(shí)。保存溫度可以是室溫，也可以是4℃。
4.權(quán)利要求1中所述的胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離可以采用灌注法，即持續(xù)灌注并離心收集細(xì)胞成分，濃縮后重懸，用1.073g/ml的percoll進(jìn)行密度梯度離心收集界面細(xì)胞層；也可以采用消化法，將胎盤組織剪碎后用膠原酶或胰酶進(jìn)行消化，得到的細(xì)胞懸液用1.073g/ml的percoll進(jìn)行密度梯度離心收集界面細(xì)胞層。
5.權(quán)利要求3中所述的界面細(xì)胞層可以接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，或與微載體復(fù)合，置于生物反應(yīng)器內(nèi)擴(kuò)增；也可以應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)，分離某種特定的細(xì)胞亞型，如應(yīng)用偶聯(lián)有NGFR抗體、或D7-FIB抗體、或Stro-1抗體、或CD105抗體的磁珠，分離具有相應(yīng)表型的細(xì)胞群。
6.權(quán)利要求1中所述的可降解多孔生物支架材料可以是聚合物類材料，如天然的膠原，也可以是化學(xué)合成的聚合物。本發(fā)明中優(yōu)選的材料是多孔生物陶瓷支架材料。
7.權(quán)利要求6中所述的多孔生物陶瓷支架材料，其特征是可以是α-磷酸三鈣(α-TCP)，也可以是β-磷酸三鈣(β-TCP)。其組成成分磷酸三鈣與機(jī)體骨骼的無(wú)機(jī)成分相同，因而具有良好的生物相容性和機(jī)械力學(xué)特性，可以為組織新生提供適宜的環(huán)境和有力的支撐。其特征是具有可控的特殊微結(jié)構(gòu)，孔型規(guī)則，孔隙率高，孔與孔之間有管狀連接。該特殊微結(jié)構(gòu)的特征是孔徑可以在100～300μm之間，孔隙率可以在45％～52％之間，孔間連接徑可以在30～100μm之間。該結(jié)構(gòu)不僅可提高組織和細(xì)胞的長(zhǎng)入性，還可以借此調(diào)節(jié)在體內(nèi)的降解速率，以使其與軟骨組織的新生速度相協(xié)調(diào)。
8.權(quán)利要求1中所述的復(fù)合可以是將胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞制成高濃度的細(xì)胞懸液，接種到支架材料上，形成細(xì)胞/材料復(fù)合體。復(fù)合體體外培育一定時(shí)間，使細(xì)胞與材料緊密貼附。
9.權(quán)利要求8中所述的體外培育可以是在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中靜止培養(yǎng)16-48小時(shí)直接用于修復(fù)，也可以在靜止培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。
10.權(quán)利要求1所述的組織工程化軟骨，其特征是可以用于創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等原因造成的各種關(guān)節(jié)軟骨損傷的生理性修復(fù)，也可以用于美容、整形外科等需要軟骨組織提供組織替代或制成的治療。
全文摘要
本發(fā)明是一種基于胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程化軟骨及其制造方法，屬組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，與可降解的多孔生物材料復(fù)合構(gòu)建組織工程化軟骨。采用該方法構(gòu)建的軟骨由于不受細(xì)胞來(lái)源限制，因而不需要對(duì)患者造成二次創(chuàng)傷，也無(wú)需經(jīng)歷較長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，并且更容易控制質(zhì)量，減小批次間或個(gè)體間效果差異，臨床應(yīng)用更為方便。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨損傷的功能性修復(fù)，具有明顯的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1746295SQ20041000953
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月9日
發(fā)明者郭希民, 王常勇, 周曉東, 段翠密, 江紅, 董靈芝, 李晶 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所