專利名稱：甲醇利用型植酸酶高效表達(dá)酵母工程菌的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種甲醇利用型植酸酶高效表達(dá)酵母工程菌的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
植酸酶(phytases，myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases，EC3.1.3.8 and3.1.3.26)是近年來出現(xiàn)的一種新型綠色添加劑，它可催化植酸及植酸鹽水解成肌醇和無機(jī)磷酸鹽，目前主要用于飼料工業(yè)和食品工業(yè)，以消除植物性飼料(或食品)中植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高機(jī)體對蛋白質(zhì)及多種微量元素的利用率，促進(jìn)生長發(fā)育，提高動物生產(chǎn)性能，減少糞便中磷的排放量，降低磷對環(huán)境的污染。作為單胃動物飼料添加劑，它的應(yīng)用價值已在豬、雞、鴨等單胃動物中得到充分體現(xiàn)。它能夠提高磷的利用率，有利于鈣的吸收，解除植酸對鋅的強(qiáng)烈螯合，大幅度提高鐵的利用率。植酸酶的添加可以使植物性飼料中磷利用率提高60％，糞便中磷排出量減少40％-75％以上，顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率和動物日增重，對發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)和環(huán)境保護(hù)都有重要意義。同時由植酸酶降解植酸鹽生成的肌醇磷酸對治療心臟病療效顯著，并且在抑制腎結(jié)石、結(jié)腸癌、糖尿病等并發(fā)癥的產(chǎn)生和抗炎癥方面都有重要作用。
植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微生物產(chǎn)生的植酸酶具有良好的開發(fā)前景，但微生物天然菌株產(chǎn)酶量較低，難以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。通過植酸酶產(chǎn)生菌的篩選和基因克隆，并利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基因，以提高植酸酶產(chǎn)量或改變植酸酶酶學(xué)性質(zhì)，從而降低生產(chǎn)成本，提高其使用有效性，已成為世界性的研究熱點(diǎn)之一。國外在這方面作了大量工作，并取得了巨大成功。1991年，荷蘭AIKO公司和美國PANLBS公司合作，成功地利用DNA重組技術(shù)獲得了第一株產(chǎn)酸性植酸酶的基因工程菌，隨后美國科學(xué)家于1995和1998年又獲得兩株酸性植酸酶高產(chǎn)基因工程菌，并獲得美國專利，為植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新的途徑。目前，美國、芬蘭、丹麥、荷蘭和德國等國的多家公司已推出了多種植酸酶制劑。
近年來，國內(nèi)對植酸酶的開發(fā)應(yīng)用研究十分重視，相關(guān)部門對此專門立項，并取得了一定進(jìn)展。姚斌等人在這方面作了大量工作，構(gòu)建了我國第一株植酸酶基因工程菌，并已用于生產(chǎn)。就植酸酶研究和開發(fā)的總體水平而言，我國植酸酶的研究開發(fā)仍處于起步階段，植酸酶生產(chǎn)仍處在工業(yè)化的初級階段。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、能進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾、容易大規(guī)模生產(chǎn)、生產(chǎn)成本低、外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定性較好等特點(diǎn)，目前國內(nèi)外已有數(shù)百種外源蛋白基因在畢赤酵母中獲得表達(dá)，利用畢赤酵母表達(dá)微生物植酸酶也越來越受到人們的重視。Yanming等將植酸酶基因連接到pPICZaA載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母后獲得了高效表達(dá)。貝錦龍等將人工合成的黑曲霉NRRL3135植酸酶基因與pPICZaA載體連接，在畢赤酵母X-33菌株中獲得高效表達(dá)，其高產(chǎn)菌株SPAN-III經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)72h后，上清液酶活高達(dá)165000U/mL，是野生型黑曲霉NRRL3135植酸酶產(chǎn)量的275倍。姚斌等將改造后的來源于黑曲霉963的植酸酶基因與pPIC9載體連接，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后獲得了高效表達(dá)，表達(dá)量約為15000U/mL發(fā)酵液。但以上研究所采用的載體難以獲得高拷貝數(shù)的插入片斷。王紅寧等將黑曲霉N25植酸酶基因與pPIC9K載體連接，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后，雖然獲得了含高拷貝數(shù)外源基因的重組酵母菌，植酸酶表達(dá)量最高達(dá)到35646.7U/mL發(fā)酵液，但對表達(dá)載體的線性化方式與姚斌等報道相同，都是采用Bgl II線性化處理，表達(dá)載體整合在染色體的AOX1座位，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子表型為His+Mut-(不利用甲醇)。
到目前為止，在植酸酶工程菌研究方面，大多數(shù)工程菌表達(dá)量低，而且都是采用BglII線性化處理，所獲得的轉(zhuǎn)化子表型為His+Mut-，即不利用甲醇。尚未見有關(guān)甲醇利用型植酸酶高效表達(dá)酵母工程菌的構(gòu)建方法報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于對以自行篩選并經(jīng)誘變選育所獲得的植酸酶高產(chǎn)突變菌株黑曲霉N14為出發(fā)菌株，構(gòu)建重組表達(dá)載體，采用新的線性化方式轉(zhuǎn)化畢赤酵母，以獲得新型(甲醇利用型)植酸酶高表達(dá)工程菌，從而為簡化植酸酶產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明依次通過以下步驟實現(xiàn)(1)利用發(fā)明人獲得的黑曲霉N14植酸酶phyA基因，從植酸酶phyA基因信號肽下游開始設(shè)計一對引物上游引物為5’gaattcctggcagtccccgcctcgag 3’，下游引物為gcggccgcctaagcaaaacactcc 3’，以擴(kuò)增去除信號肽和內(nèi)含子序列的全長phyA結(jié)構(gòu)基因，同時將上游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物引入NotI酶切位點(diǎn)，用Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增phyA結(jié)構(gòu)基因，將其與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI/NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，確認(rèn)該目的基因已得到成功克隆；(2)質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提陽性克隆菌株質(zhì)粒DNA，用EcoRI和NotI雙酶切，DNA回收試劑盒回收純化與PCR產(chǎn)物大小一致的片斷，采用DNA連接試劑盒與用EcoRI和NotI雙酶切后的pPIC9K質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI和NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建pPIC9K-phyA重組表達(dá)載體；或者根據(jù)黑曲霉N14植酸酶phyA基因全序列，人工合成植酸酶phyA結(jié)構(gòu)基因，并在其兩側(cè)加入EcoRI和NotI雙酶切位點(diǎn)，采用DNA連接試劑盒與用EcoRI和NotI雙酶切后的pPIC9K質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI和NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建pPIC9K-phyA重組表達(dá)載體；(3)重組表達(dá)載體經(jīng)XbaI線性化處理，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，經(jīng)MD平板和G418抗性篩選，得到重組轉(zhuǎn)化子。
上述方法中黑曲霉N14為本發(fā)明人自行選育的植酸酶產(chǎn)生菌突變株，發(fā)明人獲得的黑曲霉N14植酸酶phyA基因已登錄，GenBank注冊號為AY426977，可以很容易查到其全序列。Pyrobest DNA聚合酶、EcoRI、NotI、XbaI、pMD18-T Vector購自TaKaRa公司，DNA回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司，植酸鈉(P3168)、lyticase購自Sigma公司，畢赤酵母GS115(His-Mut+)、質(zhì)粒pPIC9K為Invitrogen公司產(chǎn)品，質(zhì)粒DNA抽提試劑盒購自上海申友生物工程公司。
采用菌落裂解法提取酵母基因組DNA，用表達(dá)載體pPIC9K通用引物(上游引物5′AOX1 Primer5’gactggttccaattgacaagc 3’，下游引物3′AOX1 Primer5’ggcaaatggcattctgacatcct 3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約1.8kb(含目的基因1347bp和載體序列492bp)和一條約2.2kb(本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)化子為甲醇利用型，2.2kb為AOX1-酒精氧化酶1基因)的電泳帶，證明重組表達(dá)載體已成功整合入酵母基因組DNA中。
本發(fā)明方法所獲得的重組酵母表達(dá)的植酸酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究表明，重組酵母能有效分泌表達(dá)植酸酶，表達(dá)產(chǎn)物分子量介于70kD～97kD之間，且?guī)屋^寬。重組植酸酶在pH值2.5～3.0和5.0～5.5時酶活性最高，且在pH4.5～6.5之間均有相當(dāng)高的酶活性，最適作用溫度為55℃。耐熱性試驗表明，重組植酸酶經(jīng)70℃、80℃、90℃處理10min后，與37℃處理組相比，其相對酶活分別58.25％、56.01％和54.15％；處理15min后，其相對酶活分別為49.98％、46.61％和45.92％；而出發(fā)菌株植酸酶經(jīng)70℃處理10min后，其酶活僅為原始酶活的10.77％，結(jié)果說明工程菌植酸酶具有較好的熱穩(wěn)定性，其耐熱性比出發(fā)菌株植酸酶有了較大幅度的提高。
重組酵母經(jīng)連續(xù)10次培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，在生長密度及植酸酶的活性方面基本保持穩(wěn)定。PCR檢測結(jié)果也證明，經(jīng)過10輪的連續(xù)培養(yǎng)，外源基因仍然整合在酵母基因組中，證明轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
下表為發(fā)明所得的工程菌與其它工程菌的主要區(qū)別(第一行為本發(fā)明數(shù)據(jù))基因來源 表達(dá)載體 線性化方式 整合位點(diǎn)表型最高表達(dá)量N14pPIC9K Xba I His4 His+Mut+148908.3U/mLN25pPIC9K Bgl IIAOX1 His+Mut-35646.7U/mLA.niger963 pPIC9 Bgl IIAOX1 His+Mut-15000U/mL(密碼子優(yōu)化)NRRL3135 pPICZaASac I AOX1 His+Mut-165000U/mL(密碼子優(yōu)化)(人工合成)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將黑曲霉N14植酸酶基因表達(dá)片斷與多拷貝表達(dá)載體pPIC9K連接，采用XbaI線性化處理的pPIC9K-phyA重組載體整合在畢赤酵母GS115菌株染色體的His4位置，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子表型為His+Mut+(能利用甲醇)，在密碼子未經(jīng)優(yōu)化的條件下，植酸酶基因表達(dá)水平較高，且得到的轉(zhuǎn)化子為甲醇利用型，有利于發(fā)酵工藝的簡化。
具體實施例方式
實施例1利用發(fā)明人獲得的黑曲霉N14植酸酶phyA基因，從植酸酶phyA基因信號肽下游開始設(shè)計一對引物上游引物為5’gaattcctggcagtccccgcctcgag 3’，下游引物為gcggccgcctaagcaaaacactcc 3’，以擴(kuò)增去除信號肽和內(nèi)含子序列的全長phyA結(jié)構(gòu)基因，同時將上游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物引入NotI酶切位點(diǎn)，用Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增phyA結(jié)構(gòu)基因，將其與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI/NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，確認(rèn)該目的基因已得到成功克?。毁|(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提陽性克隆菌株質(zhì)粒DNA，用EcoRI和NotI雙酶切，DNA回收試劑盒回收純化與PCR產(chǎn)物大小一致的片斷，采用DNA連接試劑盒與用EcoRI和NotI雙酶切后的pPIC9K質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI和NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建pPIC9K-phyA重組表達(dá)載體；重組表達(dá)載體經(jīng)XbaI線性化處理，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，經(jīng)MD平板和G418抗性篩選，得到重組轉(zhuǎn)化子。通過誘導(dǎo)培養(yǎng)和酶活性測定(37℃、pH5.5條件下反應(yīng)1h)，篩選到產(chǎn)酶活性為148908.3U/mL發(fā)酵液(PP-N14-22)的高產(chǎn)工程菌株，其酶活性是出發(fā)菌株酶活性(422U/mL)的352.86倍實施例2根據(jù)黑曲霉N14植酸酶phyA基因全序列，人工合成植酸酶phyA結(jié)構(gòu)基因，并在其兩側(cè)加入EcoRI和NotI雙酶切位點(diǎn)，采用DNA連接試劑盒與用EcoRI和NotI雙酶切后的pPIC9K質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI和NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建pPIC9K-phyA重組表達(dá)載體；重組表達(dá)載體經(jīng)XbaI線性化處理，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，經(jīng)MD平板和G418抗性篩選，得到重組轉(zhuǎn)化子。通過誘導(dǎo)培養(yǎng)和酶活性測定(37℃、pH5.5條件下反應(yīng)1h)，篩選到產(chǎn)酶活性為145908.8U/mL發(fā)酵液(PP-N14-44)的高產(chǎn)工程菌株，其酶活性是出發(fā)菌株酶活性(422U/mL)345.76倍。
權(quán)利要求
1.一種甲醇利用型植酸酶高效表達(dá)酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于依次通過以下步驟實現(xiàn)(1)利用發(fā)明人獲得的黑曲霉N14植酸酶phyA基因，從植酸酶phyA基因信號肽下游開始設(shè)計一對引物上游引物為5’gaattcctggcagtccccgcctcgag 3’，下游引物為gcggccgcctaagcaaaacactcc 3’，以擴(kuò)增去除信號肽和內(nèi)含子序列的全長phyA結(jié)構(gòu)基因，同時將上游引物引入EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物引入Not I酶切位點(diǎn)，用Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增phyA結(jié)構(gòu)基因，將其與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI/NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，確認(rèn)該目的基因已得到成功克??；(2)質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提陽性克隆菌株質(zhì)粒DNA，用EcoRI和NotI雙酶切，DNA回收試劑盒回收純化與PCR產(chǎn)物大小一致的片斷，采用DNA連接試劑盒與用EcoRI和NotI雙酶切后的pPIC9K質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI和NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建pPIC9K-phyA重組表達(dá)載體；或者根據(jù)黑曲霉N14植酸酶phyA基因全序列，人工合成植酸酶phyA結(jié)構(gòu)基因，并在其兩側(cè)加入EcoRI和NotI雙酶切位點(diǎn)，采用DNA連接試劑盒與用EcoRI和NotI雙酶切后的pPIC9K質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽提、EcoRI和NotI雙酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建pPIC9K-phyA重組表達(dá)載體；(3)重組表達(dá)載體經(jīng)XbaI線性化處理，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，經(jīng)MD平板和G418抗性篩選，得到重組轉(zhuǎn)化子。
全文摘要
一種甲醇利用型植酸酶高效表達(dá)酵母工程菌的構(gòu)建方法，以發(fā)明人自行篩選并經(jīng)誘變選育所獲得的植酸酶高產(chǎn)突變菌株黑曲霉N14為出發(fā)菌株，構(gòu)建重組表達(dá)載體，采用XbaI線性化處理轉(zhuǎn)化畢赤酵母，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子表型為His
文檔編號C12N1/19GK1624106SQ20041000977
公開日2005年6月8日 申請日期2004年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
發(fā)明者彭遠(yuǎn)義 申請人:西南農(nóng)業(yè)大學(xué)