專利名稱：誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和組織工程學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
軟骨組織作為一種結(jié)締組織主要起支撐、保護(hù)、分散應(yīng)力等作用。組織學(xué)上可分為透明軟骨(關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨、鼻軟骨、氣管軟骨)、彈性軟骨(會厭軟骨、耳軟骨)、纖維軟骨(半月板)三類。它們在組織學(xué)上都是只含有軟骨細(xì)胞的單一組織，內(nèi)部無血管，營養(yǎng)主要依靠組織液的滲透。
從結(jié)構(gòu)上看，軟骨細(xì)胞被包裹在軟骨陷窩內(nèi)，其周圍厚厚的軟骨囊作為一道天然屏障，將軟骨細(xì)胞與周圍組織分離開來。因此，軟骨組織具有抗原性弱，不易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別和攻擊而具有較輕免疫排斥反應(yīng)的特點。早期的研究結(jié)果表明，同種異體軟骨細(xì)胞可以在受體體內(nèi)存活并保持分泌基質(zhì)的功能。
軟骨病損是臨床常見疾病之一，如由創(chuàng)傷、感染、自身免疫、腫瘤等因素引起的各種關(guān)節(jié)表面疾患；耳廓軟骨、鼻、喉軟骨支架的缺損、畸形；以及兒童骨骺生長板的創(chuàng)傷、早閉、壞死等。由于軟骨組織幾乎沒有自我修復(fù)能力，所以必須利用軟骨或其它替代材料進(jìn)行修復(fù)。
自體和異體軟骨移植是目前的常用方法。自體軟骨組織移植療效可靠，但必須以犧牲人體正常組織為代價，且患者要多遭受一次手術(shù)的痛苦。此外，自體組織來源有限，小塊移植物還有易變形的問題。異體和異種移植物又具有免疫原性。
目前，雖然有一些人工合成的軟骨組織代用品，還存在著組織相容性、材料機(jī)械特性等方面的缺陷，尚不能滿足臨床上的各項要求。人工合成替代材料只具備充填、支持及維持美觀的作用，無生物學(xué)功能，尚不能達(dá)到真正意義上的結(jié)構(gòu)與功能重建。
組織工程學(xué)為軟骨組織缺損的治療開辟了新的途徑。組織工程用少量細(xì)胞在體外擴(kuò)增，然后接種到生物可降解材料上，構(gòu)建成細(xì)胞-材料復(fù)合物，用于移植，修復(fù)缺損。
構(gòu)建組織工程化軟骨組織的重要條件之一是必須獲得大量的有功能和活力的軟骨細(xì)胞。在高等大型哺乳動物甚至人體內(nèi)也可以利用組織工程技術(shù)再生軟骨組織，但這些研究所應(yīng)用的種子細(xì)胞均為軟骨細(xì)胞，且只能用原代或早期傳代的軟骨細(xì)胞，并且體外大量擴(kuò)增后的軟骨細(xì)胞易發(fā)生老化及去分化，難以在體內(nèi)形成軟骨組織。自體軟骨細(xì)胞來源極為有限，同種異體及異種軟骨細(xì)胞又無法杜絕免疫排斥反應(yīng)，生長因子雖可大量擴(kuò)增軟骨細(xì)胞，但其費用昂貴，所形成組織在體內(nèi)的長期效果尚不肯定，這些都使軟骨組織工程難以在臨床推廣應(yīng)用。
軟骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)具備來源廣泛、取材方便并對機(jī)體創(chuàng)傷小、體外增殖能力強(qiáng)不易老化等特點。而目前主要取自自體軟骨組織的軟骨種子細(xì)胞來源非常有限，終末分化的軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中極易去分化，擴(kuò)增數(shù)量不能滿足組織構(gòu)建的需要(VonderMark K，Gauss V，Vonder Mark H，et al.Relationship between cell shape and type of collagen synthesized aschondrocytes lose their cartilage phenotype in culture.Nature，1997，26753-532)。結(jié)合發(fā)育生物學(xué)研究，體內(nèi)分布廣泛的真皮成纖維細(xì)胞與軟骨細(xì)胞都來源于中胚層間質(zhì)細(xì)胞(Mesenchymal cells)，與軟骨細(xì)胞不同的是成纖維細(xì)胞保留了中胚層間質(zhì)細(xì)胞增殖能力強(qiáng)的生物學(xué)特性，多次傳代仍保持較好的增殖能力。研究表明，成纖維細(xì)胞在特定的體外環(huán)境中可表達(dá)特異的骨基質(zhì)(Inaba K，Matsunaga S，Ishidou Y，et al.Effect oftransforming growth factor-beta on fibroblasts in ossification of theposterior longitudinal ligament.In Vivo.1996 10445-449.)。然而到目前為止，尚沒有以成纖維細(xì)胞系為種子細(xì)胞制得軟骨細(xì)胞的報道。
綜上所述，種子細(xì)胞來源不足是限制軟骨組織工程臨床推廣應(yīng)用的主要困難，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的制備軟骨的種子細(xì)胞，以及用其制備的軟骨細(xì)胞和軟骨移植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種來源廣泛的軟骨移植物的種子細(xì)胞，以及用該種子細(xì)胞制備軟骨細(xì)胞和移植物的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備軟骨細(xì)胞的方法，包括步驟(a)在適合生長的條件下，將成纖維細(xì)胞在含10-1000納克/毫升軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白(尤其是CDMP-1)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-30天，從而使成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出軟骨細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的生長條件是37±2℃，CO25±3％。
在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)液是含0-20％(更佳地3-15％)胎牛血清的F-12，DMEM或1640培養(yǎng)液。
在另一優(yōu)選例中，所述的成纖維細(xì)胞是人的成纖維細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中所述的成纖維細(xì)胞的密度為0.5×104-5×105個/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的成纖維細(xì)胞是原代的或傳代的成纖維細(xì)胞。
在本發(fā)明的第二方面，提供了用本發(fā)明所述的方法制備的軟骨細(xì)胞。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種組織工程化軟骨移植物，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)用本發(fā)明所述方法制備的軟骨細(xì)胞，其含量為1×105-5×107個細(xì)胞/毫升，或1×105-5×107個細(xì)胞/cm3。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物，Pluronics、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其混合物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種成纖維細(xì)胞的用途，它用于制備軟骨細(xì)胞。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備組織工程化軟骨移植物的方法，它包括步驟將本發(fā)明所述方法制備的軟骨細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，形成組織工程化軟骨移植物。


圖1顯示了成纖維細(xì)胞形態(tài)相差顯微鏡觀察結(jié)果。
A)未誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)為長梭形(×100)；B)誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)由長梭形向成軟骨細(xì)胞樣多角形轉(zhuǎn)變(箭頭所示)；方框內(nèi)細(xì)胞為體外培養(yǎng)人第二代正常軟骨細(xì)胞(×100)。
圖2顯示了體外單層培養(yǎng)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)組(A-C)與非誘導(dǎo)組(D-F)的I、II、III型膠原的免疫熒光檢測結(jié)果?？贵w為FITC標(biāo)記(綠色熒光)，細(xì)胞核為PI襯染(紅色熒光)。
A)CDMP-1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞可見明顯II型膠原表達(dá)，框內(nèi)細(xì)胞為低倍所見(×100)；B)和C)誘導(dǎo)細(xì)胞仍表達(dá)I、III型膠原(×100)；D)體外培養(yǎng)正常成纖維細(xì)胞II型膠原免疫熒光陰性；E，F(xiàn))正常成纖維細(xì)胞I、III型膠原表達(dá)陽性。
圖3顯示了對離心管培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)塊的檢測結(jié)果。
A)Alicain Blue染色，細(xì)胞團(tuán)塊天青色染，表明GAG分泌(×100)。
B)Masson′s Trichrome染色，膠原基質(zhì)藍(lán)染(×200)圖4顯示了對離心管法培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)塊II型膠原免疫組化染色(ABC法)檢測結(jié)果。
A)細(xì)胞與基質(zhì)內(nèi)可見大量II型膠原沉積(×100)。
B)局部放大后可見細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒(×200))圖5顯示了對誘導(dǎo)細(xì)胞的RT-PCR檢測結(jié)果。
A)誘導(dǎo)組細(xì)胞RT-PCR檢測Aggrecan、II型膠原mRNA表達(dá)條帶，未誘導(dǎo)組結(jié)果為陰性。
B)，C)誘導(dǎo)細(xì)胞RT-PCR檢測表達(dá)I、III型膠原。
圖6顯示了Western印跡法檢測II型膠原表達(dá)的結(jié)果。實驗組成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)后II型膠原蛋白表達(dá)為陽性，與正常軟骨細(xì)胞出現(xiàn)同樣條帶；對照組成纖維細(xì)胞的未見II型膠原蛋白表達(dá)條帶。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白(cartilage-derived morphorgentic protein，CDMP)特別適合作為誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)因子，可以有效地誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞在體外形成軟骨細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
術(shù)語術(shù)語“純化的或分離的”指純化的或分離的物質(zhì)基本上不含有其他細(xì)胞、蛋白質(zhì)或多肽，例如純化的細(xì)胞因子，或分離的軟骨細(xì)胞。
術(shù)語“異種移植”指將所需生物活體材料(如成纖維細(xì)胞)從某一物種中取出并再施用于另一物種對象的方法。
術(shù)語“自體移植”指將所需生物活體材料(如成纖維細(xì)胞)從某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
術(shù)語“異體移植”指將所需生物活體材料(如軟骨細(xì)胞)從某個體中取出并再施用于同物種另一不同個體的方法。
成纖維細(xì)胞本發(fā)明中成纖維細(xì)胞的來源沒有特別限制，一種優(yōu)選的來源是來自自體的真皮。通常，本發(fā)明的成纖維細(xì)胞是來自自體或同種異體。成纖維細(xì)胞可以是原代的或傳代的成纖維細(xì)胞。
分離和培養(yǎng)獲得成纖維細(xì)胞的方法都是本領(lǐng)域中已知的。一種優(yōu)選的方法是取皮膚真皮組織，剪碎移入離心管中，加入約10倍于組織體積的0.1％的I型膠原酶消化，37℃，2小時，100目細(xì)胞濾器過濾后離心，1000轉(zhuǎn)5分鐘，棄去上清，加入含10％FBS DMEM培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，以2×104/cm2接種于100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80％-90％時，進(jìn)行傳代，傳代密度為1×104/cm2。優(yōu)選第2～18代細(xì)胞用于制備人工軟骨。
一類優(yōu)選的成纖維細(xì)胞是體外培養(yǎng)的第二代～第六代的成纖維細(xì)胞。此時的成纖維細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖能力和向軟骨細(xì)胞分化的潛能。
誘導(dǎo)因子如本文所用，“誘導(dǎo)因子”指軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白(Cartilage-DerivedMorphogenetic Proteins，CDMPs)。這是BMP家族中一類特異生長因子，它在軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其中軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白-1(CDMP1)和軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白-2(CDMP2)是優(yōu)選的。更佳地是CDMP1。
如本文所用，“細(xì)胞誘導(dǎo)液”指含有10-1000納克/毫升(較佳地20-500ng/ml，更佳地50-200ng/ml)軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液。
除了CDMP之外，在本發(fā)明的方法中還可聯(lián)用其他因子，例如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)1、2、3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphorgenetic protein，BMP)2、6、7。聯(lián)用其他誘導(dǎo)因素如低氧環(huán)境培養(yǎng)、在特定的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分中培養(yǎng)、應(yīng)用阻滯或激活特定的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路、與軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)等誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)步驟是本發(fā)明方法的關(guān)鍵。通常，在適合生長的條件下，將成纖維細(xì)胞在添加了10-1000納克/毫升(較佳地20-500ng/ml，更佳地50-200ng/ml)軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-30天(較佳地5-15天)，就可使成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞。
一種優(yōu)選的方法是單層培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)，在含約10％FBS和約10-1000ng/ml的CDMP成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(如F-12培養(yǎng)基)中進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)，每三天換一次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)3-30天。
另一種優(yōu)選方法是離心管培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)。將成纖維細(xì)胞在約1500轉(zhuǎn)離心，棄上清后加入細(xì)胞誘導(dǎo)液，將細(xì)胞團(tuán)塊搖起，懸浮于培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)3-30天。
經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可以通過Masson’s Trichrome，Alcian Blue與免疫組化染色，RT-PCR，Western印跡分析等進(jìn)行定性和半定量鑒定，然后從培養(yǎng)物中分離出軟骨細(xì)胞。
生物可降解材料可用于本發(fā)明的組織工程化軟骨的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細(xì)胞基質(zhì)；(c)可注射性材料，如Pluronic(一種市售的聚環(huán)氧乙丙烯商品)、藻酸鈣凝膠等；(d)上述材料的混合物或復(fù)合材料或共聚物，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。共聚物聚羥基乙酸-聚乳酸共聚物(lactic-co-glycolic acid，PLGA)優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是可注射性的材料，例如藻酸鈣凝膠、Pluronic凝膠等。
本發(fā)明組織工程化軟骨中的軟骨細(xì)胞的細(xì)胞濃度通常約為2×107/ml至5×107/ml或更高。當(dāng)材料為可注射性材料時，以該液體材料調(diào)整軟骨細(xì)胞濃度；當(dāng)材料為固體性材料時，以培養(yǎng)液調(diào)整軟骨細(xì)胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時培養(yǎng)液與固體性材料的比例沒有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養(yǎng)液的最大量為準(zhǔn)。
在本發(fā)明的組織工程化軟骨移植物中，還可添加或復(fù)合其他各種細(xì)胞因子、生長因子、各種轉(zhuǎn)基因成分，從而保持軟骨細(xì)胞表型、促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長或基質(zhì)合成能力等。
組織工程化軟骨移植物用本發(fā)明方法制備的軟骨細(xì)胞可用于構(gòu)建組織工程化軟骨移植物，即將一定數(shù)量的所述軟骨細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合即可。
用本發(fā)明方法形成的組織工程化軟骨移植物，分為兩類，一類是軟骨細(xì)胞與可注射性生物材料構(gòu)成的復(fù)合物，該復(fù)合物可直接注射到皮下、軟骨缺損處等體內(nèi)各部位。另一類是軟骨細(xì)胞與非可注射性生物材料構(gòu)成的復(fù)合物，該復(fù)合物可直接植入體內(nèi)皮下、軟骨缺損處等體內(nèi)各部位。
在一優(yōu)選例中生物可降解材料為固態(tài)。此時，可用上述細(xì)胞與培養(yǎng)液制成濃度為約5×107/ml的細(xì)胞懸液，然后與生物材料聚羥基乙酸/聚乳酸支架(PGA/PLA)形成復(fù)合物，該復(fù)合物大小、形狀依照軟骨缺損的大小及形狀確定。體外培養(yǎng)一周至三周，每二至三天換液一次，以保證細(xì)胞營養(yǎng)，當(dāng)體外組織工程化軟骨初步形成時植入體內(nèi)皮下、軟骨缺損處等體內(nèi)各部位。
在另一優(yōu)選例中，生物可降解材料是可注射性材料(Pluronic凝膠、藻酸鈣凝膠等)。以該液體材料調(diào)整細(xì)胞濃度為約5×107/ml，直接用于皮下注射或體內(nèi)缺損的修復(fù)。
應(yīng)用方法當(dāng)生物可降解材料是可注射性材料時，細(xì)胞與生物材料復(fù)合物可直接植入皮下或體內(nèi)軟骨缺損處。當(dāng)生物可降解材料為固態(tài)時，細(xì)胞與生物材料在體外復(fù)合，在生物反應(yīng)器內(nèi)形成適合各種軟骨缺損大小和形狀的組織工程化軟骨后，再植入體內(nèi)軟骨缺損處。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)應(yīng)用自體細(xì)胞，且一次取材既可獲得足夠的細(xì)胞量；(2)成纖維細(xì)胞的采集操作簡單，對病人損傷極小，無需住院，且可以重復(fù)取材；(3)體外培養(yǎng)方法簡單易學(xué)，便于推廣應(yīng)用。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1成纖維細(xì)胞培養(yǎng)與傳代無菌條件下取包皮環(huán)切術(shù)中切除的皮膚真皮組織，剪碎移入離心管中，加入約10倍于組織體積的0.1％的I型膠原酶(WORTHINGTON公司)消化，37℃，2小時，100目細(xì)胞濾器過濾后離心，1000轉(zhuǎn)5分鐘，棄去上清，加入含10％FBS DMEM培養(yǎng)液(GIBCO)混勻細(xì)胞，以2×104/cm2接種于100mm培養(yǎng)皿(FALCON，F(xiàn)ranklinLakes NJ)中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80％-90％時，進(jìn)行傳代，傳代密度為1×104/cm2。體外擴(kuò)增到第二代后，進(jìn)行實驗分組。
實施例2
單層培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)法誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞在本實施例中，用單層培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)法誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞。方法如下用0.1％BSA稀釋CDMP1生長因子(Research Diagnostics)至100μg/ml，加入含10％FBS的F-12(Gibco公司)培養(yǎng)液使其終濃度為100ng/ml，配制成細(xì)胞誘導(dǎo)液。取第二代成纖維細(xì)胞接種6-12小時，細(xì)胞誘導(dǎo)，每三天換一次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)7天(在37℃，5％CO2，飽和濕度)，分離獲得軟骨細(xì)胞。
實施例3離心管培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)在本實施例中，用單層培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)法誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞。方法如下誘導(dǎo)液配制同實施例2。收取傳代至第6代的成纖維細(xì)胞1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清后加入細(xì)胞誘導(dǎo)液，將細(xì)胞團(tuán)塊搖起，誘導(dǎo)7天，獲得軟骨細(xì)胞團(tuán)。
石蠟包埋后切片，供Masson′s Trichrome，Alcian Blue與免疫組化染色等鑒定使用。
實施例4誘導(dǎo)效果的檢測一、檢測方法(a)細(xì)胞激光共聚焦檢測將實施例2中對照組和實驗組細(xì)胞分別在培養(yǎng)和誘導(dǎo)7天后，95％丙酮固定10分鐘，PBS漂洗，10％羊血清封閉30分鐘，兔抗I、II、III型膠原抗體(1∶100，Chemicon公司)分別孵育1小時，PBS漂洗，F(xiàn)ITC山羊抗兔IgG(1∶1000稀釋，Oncogene公司)孵育40分鐘，PBS漂洗，PI(Propidium iodide碘化丙啶)(1∶1000稀釋，Sigma公司)室溫孵育10分鐘，PBS漂洗后封片。將標(biāo)記后的標(biāo)本置于雙光子激光共聚焦顯微鏡(購自Zeiss公司，型號LSN510)，激光激發(fā)波長488nm，鏡下觀察。所得圖像通過鏡載攝像系統(tǒng)輸入電腦保存，自動拍照。
(b)細(xì)胞團(tuán)塊II型膠原免疫組織化學(xué)檢測將實施例3中制備的切片脫蠟入水后，PBS漂洗，3％H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加0.4％胃蛋白酶37℃孵育30min，加入兔抗人II型膠原單克隆抗體(1∶100，Chemicon公司)，置濕盒4℃過夜，滴加山羊抗兔二抗(1∶100，DAKO)，37℃孵育30min，PBS漂洗后，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。以不加一抗樣本作為空白對照。
(c)細(xì)胞膠原表達(dá)RT-PCR檢測分別收集對照組和實驗組在培養(yǎng)和誘導(dǎo)7天后細(xì)胞，檢測II型膠原與聚集蛋白聚糖(Aggrecan)表達(dá)。Trizol(Invitrogen公司)提取總mRNA，檢測I、II型膠原和聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)。根據(jù)RT-PCR試劑盒(Takara)操作說明，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)。相應(yīng)引物(由上海申能博彩生物科技有限公司合成)序列見表1。反應(yīng)條件94℃變性，55℃退火，35個循環(huán)。
表1.引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小

(d)細(xì)胞II型膠原分泌Western印跡檢測分別收集對照組和實驗組在培養(yǎng)和誘導(dǎo)7天后細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)為均1×106個，加入三去污裂解液1ml，裂解細(xì)胞后移入1.5ml Eppendorftube內(nèi)，10000rpm，4℃離心5分鐘。取上清，加入等體積2×SDS Loading buffer，β-巰基乙醇2μl/100μl。100℃沸水變性10分鐘，瞬離心2秒鐘，待冷至室溫即上樣。聚丙烯酰胺凝膠電泳10mA電泳3-4小時。電泳結(jié)束后，90v，4℃轉(zhuǎn)膜2小時，封閉緩沖液(PIERCE公司)4℃封閉過夜。37℃依次加入II型膠原鼠抗一抗(1∶500，Sigma公司)、生物素化二抗(1∶500，Vector Lab公司)、鏈親和素-AP(1∶3400，Pierce公司)進(jìn)行雜交，逐級雜交放大后，滴加1-Step NBT/BCIP(Pierce公司)顯色液，顯色后進(jìn)行結(jié)果分析。
二、結(jié)果細(xì)胞形態(tài)變化應(yīng)用CDMP1誘導(dǎo)3天后，成纖維細(xì)胞形態(tài)未見無明顯改變；誘導(dǎo)7天后時，可見長梭形的成纖維細(xì)胞開始向多角形、多邊形轉(zhuǎn)變，與軟骨細(xì)胞形態(tài)非常相似。對照組細(xì)胞未見明顯形態(tài)改變(圖1)。
細(xì)胞膠原表達(dá)觀察激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，單層培養(yǎng)的正常成纖維細(xì)胞(未誘導(dǎo)組)僅I、III型膠原熒光表達(dá)，未見II型膠原熒光陽性細(xì)胞。應(yīng)用CDMP誘導(dǎo)后，II型膠原熒光陽性細(xì)胞明顯增多，同時可觀察細(xì)胞仍表達(dá)I、III型膠原熒光陽性，熒光強(qiáng)度略有減弱(圖2)。
細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)后基質(zhì)合成檢測應(yīng)用離心管法培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊，應(yīng)用CDMP1誘導(dǎo)7天后，Masson′s Trichrome染色可見基質(zhì)呈彌漫性亮綠色，表明膠原合成旺盛(圖3A)。Alcian Blue染色可見基質(zhì)呈均一性天青色藍(lán)染，表明GAG大量沉積(圖3B)。細(xì)胞團(tuán)塊II型膠原免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，棕黃色的顆粒分布于細(xì)胞內(nèi)與胞外基質(zhì)中；II型膠原表達(dá)在細(xì)胞密度較高、基質(zhì)合成致密的區(qū)域染色較強(qiáng)(圖4)。對照組檢測為陰性。
II型膠原和Aggrecan表達(dá)RT-PCR檢測單層培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞CDMP1誘導(dǎo)后7天，RT-PCR檢測到大小為510bp的II型膠原和Aggrecan擴(kuò)增產(chǎn)物，與陽性對照軟骨細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果相符。為誘導(dǎo)組未見擴(kuò)增陽性條帶(圖5A)。誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞仍可檢測到I、III型膠原mRNA表達(dá)(圖5B，C)。
II型膠原表達(dá)Western印跡分析檢測單層培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞CDMP1誘導(dǎo)后7天，可檢測到II型膠原蛋白表達(dá)，與陽性對照組軟骨細(xì)胞表達(dá)條帶相同。未誘導(dǎo)對照組成纖維細(xì)胞未見II型膠原蛋白(圖6)。
實施例5組織工程軟骨移植物的制備將實施例2或3中制備的軟骨細(xì)胞，分別以5×107個細(xì)胞/ml的終濃度與30％Pluronic F-127(一種市售的聚環(huán)氧乙丙烯商品)/DMEM混合，從而制得組織工程軟骨移植物。
討論作為TGF-β超家族中的一類生長因子，人CDMP首先由關(guān)節(jié)軟骨中克隆分離出，主要包括CDMP1與CDMP2兩個亞型，分別對應(yīng)BMP家族中BMP14與BMP13；同時對應(yīng)鼠BMP家族中生長分化因子(Growth and Differentiation Factor，GDF)。
在目前所發(fā)現(xiàn)的BMP全部家族成員中，CDMP是最為特異的與軟骨形態(tài)發(fā)生與發(fā)育相關(guān)的一類生長因子，在四肢骨的圖式形成(patterning)、軟骨發(fā)生與長骨生長過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
研究發(fā)現(xiàn)，CDMP1特異性表達(dá)于胚胎發(fā)育過程中關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨形成部位(Tsumaki N，Tanaka K，Arikawa-Hirasawa E，et al.Role of CDMP-1 inskeletal morphogenesisPromotion of mesenchymal cell recruitment andchondrocyte differentiation.J.Cell Biol.，1999.144161-173)；體內(nèi)發(fā)育模型(Storm EE and Kingsley DM.GDF5 coordinates bone and jointformation during digit development.Dev.Bio.1999，20911-27)及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灳C實，CDMP1主要通過促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的聚集(consendation)，提高局部軟骨前體細(xì)胞的數(shù)量，加速關(guān)節(jié)軟骨形成、軟骨細(xì)胞的分化并調(diào)節(jié)骨骼組織的發(fā)育。出生后及成年關(guān)節(jié)軟骨組織中均可檢測到CDMP的表達(dá)，提示CDMP在出生后可繼續(xù)維持正常軟骨組織的生長；體外器官培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，損傷的關(guān)節(jié)軟骨中有大量CDMP表達(dá)，在外源性CDMP因子作用下，軟骨基質(zhì)合成明顯增加，提示CDMP可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)過程(Ludwig E，Chee KNG，Robert U，et al.Presence of cartelage-derived morphogenetic proteins in articularcartelage and enhancement of matrix replacement in vitro.Arthriti.Rheumat.1998，41263-273)。上述研究表明，CDMP主要通過調(diào)節(jié)間質(zhì)前體細(xì)胞的分化，參與了軟骨組織發(fā)生、生長與損傷修復(fù)的幾乎全部生物學(xué)過程，是重要的調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化的生長因子。
一般認(rèn)為，真皮成纖維細(xì)胞是分化完全的終末體細(xì)胞，雖然取材與培養(yǎng)簡單、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，但不再具備干細(xì)胞樣的向其他類型細(xì)胞分化的能力，只作為真皮組織工程種子細(xì)胞來源。然而，本發(fā)明中應(yīng)用CDMP 1生長因子，作用于體外培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞，卻發(fā)現(xiàn)7天后細(xì)胞可表達(dá)特異性軟骨細(xì)胞基質(zhì)II型膠原與聚集蛋白聚糖，同時伴有細(xì)胞形態(tài)的軟骨細(xì)胞樣改變，這證實了終末分化的二倍體成纖維細(xì)胞仍然具有作為構(gòu)建其他組織的種子細(xì)胞來源的潛力。
軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由II型膠原纖維(COLII)與蛋白聚糖組成，其中蛋白聚糖的主要成分為聚集蛋白聚糖。膠原纖維形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有很高的抗張強(qiáng)度，存在于網(wǎng)絡(luò)中的聚集蛋白聚糖分子的毛刷樣結(jié)構(gòu)能使其更好地對抗壓力與I I型膠原一起共同支持軟骨組織的結(jié)構(gòu)，維持著軟骨組織的生物學(xué)特征，因此COLII與聚集蛋白聚糖的表達(dá)目前是軟骨細(xì)胞最特異的標(biāo)記(Micky D.Tortorella，Michael A.，et al.The Interglobular Domain of CartilageAggrecan Is Cleaved by Hemorrhagic Metalloproteinase HT-d(AtrolysinC)at the Matrix Metalloproteinase and Aggrecanase Sites.J.Bio.Chem.1998，2735846-5850)。真皮成纖維細(xì)胞本身不表達(dá)COLII與聚集蛋白聚糖，在本發(fā)明的培養(yǎng)體系作用下，單層培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞經(jīng)CDMP誘導(dǎo)7天后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了由梭形向軟骨細(xì)胞樣多角形形態(tài)的轉(zhuǎn)變，免疫熒光、Western-Blot與RT-PCR均證實了II膠原的表達(dá)；RT-PCR結(jié)果也觀察到成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)后表達(dá)聚集蛋白聚糖。離心管培養(yǎng)是模擬軟骨形態(tài)發(fā)生過程中間充質(zhì)前體細(xì)胞聚集、分化過程，研究干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的體外培養(yǎng)方法。為了進(jìn)一步證實上述研究結(jié)果，本發(fā)明人采用離心管培養(yǎng)技術(shù)研究成纖維細(xì)胞在聚集狀態(tài)下的誘導(dǎo)分化過程。研究發(fā)現(xiàn)，在CDMP1作用下，誘導(dǎo)7天的細(xì)胞團(tuán)經(jīng)阿麗新蘭染色證實有大量酸性粘多糖沉積，Masson’s染色也觀察到膠原與粘多糖的合成。免疫組化、Western-Blot與RT-PCR均檢測到離心管誘導(dǎo)培養(yǎng)后COLII與聚集蛋白聚糖的表達(dá)。上述研究結(jié)果與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的報道相符(Johnstone B，Hering TM，Caplan AI，et al.In vitro chondrogenesisof bone marrow derived mesenchymal progenitor cells.Exp cell res，1998，238265-272.)。
本研究中發(fā)現(xiàn)，在CDMP1作用下成纖維細(xì)胞雖然表達(dá)COLII與聚集蛋白聚糖，但I(xiàn)、III型膠原的表達(dá)并未消失，表明經(jīng)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞與自然的軟骨細(xì)胞還有一定的差距。Lennon(Lennon D，Haynesworth SE，Arm DM，et al.Dilution of human mesenchymal stem cells with dermal fibroblasts andthe effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis.Dev.Dyn.2000，21950-62)等將人真皮成纖維細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以25-50％的比例混合，離心管培養(yǎng)誘導(dǎo)后仍可見軟骨組織形成，顯著降低了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的用量。本發(fā)明人認(rèn)為，通過CDMP的誘導(dǎo)，在軟骨組織構(gòu)建過程中有可能進(jìn)一步降低骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的比例。同時由于軟骨形成常為軟骨內(nèi)化骨過程中的早期階段，因此本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明中成纖維細(xì)胞表達(dá)特異性軟骨基質(zhì)，不能排除是成纖維細(xì)胞向成骨表型分化的一個階段。在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究中發(fā)現(xiàn)(Gruber R，Mayer C，Schulz W，et al.Stimulatory effects ofcartilage-derived morphogenetic proteins 1 and 2 on osteogenicdifferentiation of bone marrow stromal cells.Cytokine.2000，121630-1638)，CDMP1、2均可促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型分化，但其成骨作用明顯低于BMP-6與OP-1；雖然有IIA型前膠原表達(dá)，但未檢測到作為成熟軟骨細(xì)胞基質(zhì)的IIB型前膠原與聚集蛋白聚糖分泌，該研究中生長因子作用時間僅為4天。在另一項研究中，當(dāng)CDMP誘導(dǎo)時間延長至7天時，骨膜源性細(xì)胞表現(xiàn)了成骨與成軟骨的多向分化，可見明顯II型膠原與聚集蛋白聚糖表達(dá)，成軟骨作用明顯強(qiáng)于成骨作用。因此，CDMP在不同作用時間下、針對不同細(xì)胞表現(xiàn)出成骨與成軟骨的雙能作用，有必要在同一作用條件下繼續(xù)觀察其成骨或成軟骨的功能。
本發(fā)明的實驗證明了，真皮成纖維細(xì)胞通過CDMP-1誘導(dǎo)，在單層培養(yǎng)與離心管培養(yǎng)的條件下，均出現(xiàn)了向軟骨細(xì)胞表型分化的現(xiàn)象，成纖維細(xì)胞可合成特異性軟骨細(xì)胞基質(zhì)II型前膠原與聚集蛋白聚糖。這一研究結(jié)果目前尚未見文獻(xiàn)報道，提示通過CDMP的誘導(dǎo)作用，成纖維細(xì)胞具有作為軟骨組織工程新的種子細(xì)胞來源的可能。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種制備軟骨細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟(a)在適合生長的條件下，將成纖維細(xì)胞在含10-1000納克/毫升軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-30天，從而使成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出軟骨細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生長條件是37±2℃，CO25±3％。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液是含0-20％胎牛血清的F-12，DMEM或1640培養(yǎng)液。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的成纖維細(xì)胞是人的成纖維細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的成纖維細(xì)胞的密度為0.5×104-5×105個/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的成纖維細(xì)胞是原代的或傳代的成纖維細(xì)胞。
7.一種軟骨細(xì)胞，其特征在于，它是用權(quán)利要求1所述的方法制備的。
8.一種組織工程化軟骨移植物，其特征在于，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)權(quán)利要求1所述方法制備的軟骨細(xì)胞，其含量為1×105-5×107個細(xì)胞/毫升，或1×105-5×107個細(xì)胞/cm3。
9.如權(quán)利要求8所述的移植物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物，Pluronics、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其混合物。
10.一種成纖維細(xì)胞的用途，其特征在于，用于制備軟骨細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備軟骨細(xì)胞的方法，包括步驟(a)在適合生長的條件下，將成纖維細(xì)胞在含軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3－30天，從而使成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出軟骨細(xì)胞。實驗研究證明成纖維細(xì)胞在CDMP1生長因子誘導(dǎo)下能向成軟骨細(xì)胞表型分化，并能分泌軟骨細(xì)胞特異性基質(zhì)，因而可成為軟骨組織工程的種子細(xì)胞來源。
文檔編號C12N5/06GK1661010SQ20041001651
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者崔磊, 曹誼林, 劉偉, 尹爍 申請人:上海組織工程研究與開發(fā)中心