專利名稱：一種雅致放射毛霉用于生產神經酰胺的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種雅致放射毛霉的新用途，特別是涉及生產神經酰胺的用途，本發(fā)明還提供了神經酰胺的制備方法，屬生物技術領域。
背景技術：
菌號為AS3.2778的菌株是雅致放射毛霉Actinomucor elegans的典型株，由中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏。它是從發(fā)酵豆腐乳中分離得到，主要用于發(fā)酵食品的制造，尤其是豆腐乳的生產。該菌種是釀造豆腐乳的一株優(yōu)良菌種，但是該菌種的其它用途目前尚未相關報道。
神經酰胺具有傳遞神經指令，促進細胞增殖分化，保護機體免受外界物理(如紫外線)、化學(毒害氣體)、生物等因素的傷害，防止包括水分等體內成分損失，維護機體屏障功能，其中最突出的是具有抗腫瘤作用，是防治皮膚癌的重要活性成分。神經酰胺具有抑制黑色素生成的功能，因而能消除皮膚黑褐斑，保持皮膚美白。臨床證明，經常補充神經酰胺，能改善全身皮膚水合性，增加皮膚保水量，提高皮膚彈性，減少皺紋和褐黑斑生成。國外已將其作為重要生理活性成分及醫(yī)藥原料，在藥品、高檔護膚化妝品和食品中使用。
因神經酰胺具有多種生物活性及良好的安全性，大量用于化妝品和功能性食品，需求量大，人工化學合成產品中的副產物可能會給消費者帶來不可預測的負面影響，存在局限性。從天然生物原料中提取神經酰胺目前有兩類原料，一是動物源神經酰胺；二是植物源神經酰胺。動物源神經酰胺因近年來豬牛感染瘋牛病、口蹄疫等人畜共患病，其產品中殘留該類病毒而引起消費者普遍憂慮，因瘋牛病等的潛在危害性，使動物源神經酰胺的研究開發(fā)與應用逐步萎縮，國外是以動物源為主生產。植物源神經酰胺中一方面神經酰胺含量很低，提取無工業(yè)價值，另一方面神經酰胺為結合態(tài)，用常規(guī)的化學方法很難將神經酰胺從植物中提取出來，目前國外還未見以植物源生產神經酰胺的產業(yè)化的報導。孫慶杰的“天然神經酰胺的研究與開發(fā)”(孫慶杰、天然神經酰胺的研究與開發(fā)，中國油脂.2003，28(2).60-61)報道了神經酰胺的工藝路線，即用米糠經有機溶劑萃取或超臨界方法得米糠萃取物，經色譜分離，得神經酰胺類化合物，經純化即得神經酰胺單體，其缺陷在于米糠中的神經酰胺60％以神經鞘磷脂和神經糖(主要為半乳糖)苷脂的結合態(tài)存在，采用常規(guī)提取方法，不能提取分離神經酰胺單體，提取率低。雖然已有報道米糠可以生產神經酰胺，但這種可直接分離的神經酰胺在米糠中只占約0.024％，以常規(guī)分離、純化技術，一噸產品要耗用1萬噸以上的米糠，沒有可利用價值。
目前隨著集約化養(yǎng)殖畜牧業(yè)的發(fā)展，在飼料生產中越來越普遍的添加抗菌藥、抗寄生蟲藥和各種生長促進劑。這些藥物或其代謝產物可能殘留于動物器官、組織中，通過食物鏈進入人體危害人類健康。另外，非法使用違禁藥物，造成養(yǎng)殖產品中違禁藥物殘留嚴重超標，不僅對人民群眾的身體健康、乃至生命安全構成嚴重威脅，而且對人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害，同時嚴重影響我國飼料和養(yǎng)殖產品的出口創(chuàng)匯，如歐盟、東歐、日本和香港等國家和地區(qū)多次退回我國出口的畜產品，歐盟還以中國飼料中用藥過濫、殘留超標等原因于1996年8月停止進口中國禽肉及其相關產品，給國家造成嚴重經濟損失，也損害了國家形象。目前在飼料中使用違禁藥物主要有激素、鎮(zhèn)靜劑和國家已明令禁止的其它藥物或化學藥品3大類數10個品種。
酶型飼料添加劑是利用現代發(fā)酵工程技術生產的高效能生物活性物質，它可以作為飼料的添加劑，如蛋白酶、脂肪酶、植物酶，多糖酶等，它具有安全高、無毒副作用等特點，除能較好地促進動物生長，提高飼料利用率，提高生產效益之外，還可有效地避免在動物飼料中使用各種不良添加劑帶來的負面影響。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術方案是提供了一種雅致放射毛霉的新用途，具體地，是涉及生產神經酰胺的用途，本發(fā)明還提供了神經酰胺的制備方法，它是以米糠為原料通過發(fā)酵、提取分離、純化而成，本發(fā)明的另一技術方案是提供了神經酰胺制備方法的副產物—一種酶型飼料添加劑。
本發(fā)明提供了一種雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生產神經酰胺的用途。
本發(fā)明還提供了雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生產酶型飼料添加劑的用途。
本發(fā)明提供神經酰胺的制備方法，它是以含有神經酰胺的植物性原料通過生物發(fā)酵技術提取制備的方法，它包括下列步驟a、選擇菌種選用中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏的菌號為AS3.2778的雅致放射毛霉Actinomucor elegans作為發(fā)酵菌種；b、菌種發(fā)酵用a步驟選擇的菌種對含有神經酰胺的植物性原料進行固體發(fā)酵，得到含神經酰胺的發(fā)酵產物；c、將b步驟的發(fā)酵產物經分離、純化得神經酰胺和剩余產物。
其中步驟b所述的含有神經酰胺的植物性原料是米糠。所述固體發(fā)酵的培養(yǎng)基中含有米糠重量比97.6～99.08％，其余為微生物發(fā)酵所需的氮源，微量元素；進一步地，固體發(fā)酵的培養(yǎng)基為米糠97.6～99.08％，酵母膏0.4～0.8％，KH2PO40.05～0.2％，K2HPO40.05～0.2％，MgSO40.05～0.1％，CaCl20.05～0.2％，ZnSO40.02～0.1％，菜籽油0.3～0.8％；以米糠為主要培養(yǎng)基物質，加入不同的無機鹽、微量元素，pH值調節(jié)劑，可對培養(yǎng)基的物料有不同選擇；其中培養(yǎng)溫度15℃～35℃；培養(yǎng)時間24～84h；培養(yǎng)基pH值7.0～8.0；培養(yǎng)基含水量40％～70％；培養(yǎng)基接種量4％～12％。
進一步地，步驟b所述的菌種固體發(fā)酵條件為培養(yǎng)基采用變溫培養(yǎng)，培養(yǎng)時間72h，前24h培養(yǎng)溫度30℃，后48h培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)基pH值7.0～8.0，培養(yǎng)基含水量65％，接種量8～10％的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。
其中步驟c所述的分離、純化方法為CO2超臨界流體萃取分離，得神經酰胺粗品，再將神經酰胺粗品經大孔吸附樹脂純化。除了上述分離、純化方法外，還可選用微生物工程中可接受的分離、純化方法達到相同或相似的效果。
進一步地，CO2超臨界流體萃取為CO2在超臨界流體狀態(tài)下萃取發(fā)酵產物，采用分級萃取，其步驟為①將CO2經液化、低溫、高壓、加熱轉變成超臨界流態(tài)；②將發(fā)酵產物置于萃取器中，通入超臨界流態(tài)CO2，得萃取物和萃取分離所得的剩余產物；其中萃取器可選用單個的萃取器，也可選多個萃取器并聯，有利于提高萃取效率。
③將萃取物經減壓加熱通入分離器，得神經酰胺粗品，除了神經酰胺粗品外，還有剩余萃取物；該分離器是一整套儀器中的一個部分，來自大連光明化工院。所述的萃取器和分離器是整套儀器中的一個部分，整套儀器的型號是GM32-200×3型超臨界CO2萃取工業(yè)裝置。
另外，可將③步驟所述的剩余萃取物再次減壓加熱通入另一分離器，得水、精油和氣態(tài)CO2，該分離器的目的是為了進一步純化產品，回收CO2溶劑，達到物料的物料的循環(huán)利用。
其中各步驟的萃取壓力為20Mpa～32Mpa；萃取溫度為32℃～45℃；萃取流量30公斤CO2/公斤發(fā)酵料；步驟③分離壓力為7Mpa～8Mpa，分離溫度為35℃～38℃；將③步驟所述的剩余萃取物再次減壓加熱通入另一分離器的分離壓力為4Mpa～5Mpa，分離溫度為20～25℃；萃取時間2小時。
進一步地，所述各步驟的條件是萃取壓力為30Mpa；萃取溫度為32℃～35℃；萃取流量30公斤CO2/公斤發(fā)酵料；步驟③分離壓力為7Mpa～7.5Mpa，分離溫度為35℃～38℃；將③步驟所述的剩余萃取物再次減壓加熱通入另一分離器的分離壓力為4Mpa～5Mpa，分離溫度為20～25℃；萃取時間2小時。
其中步驟c中神經酰胺粗品，經大孔吸附樹脂純化條件為大孔樹脂型號D140、D141、D180、LD605(中國藍星集團晨光化工研究院)，洗脫液為乙醇∶乙酸＝7∶1～9∶1，洗脫速度6～10L/h，收集洗脫液、濃縮、結晶，即得神經酰胺。
進一步地，大孔樹脂為D140，洗脫液為乙醇∶乙酸＝8∶1，洗脫速度8L/h。
本發(fā)明還提供了一種酶型飼料添加劑，它是用神經酰胺的制備方法中步驟c將發(fā)酵產物分離所得的剩余產物制備而成，即由CO2超臨界流體萃取步驟②中所述的萃取分離所得的剩余產物。該酶型飼料添加劑含高活性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、植酸酶、β-葡聚糖苷酶、纖維素酶等系列生物酶。其中加入了生物穩(wěn)定劑，該酶型飼料添加劑的的重量配比為萃取分離所得的剩余產物98.2～99.6％，乳酸鈣0.2～0.8％，山梨醇0.2～1.0％；進一步地，該酶型飼料添加劑的重量配比為萃取分離所得的剩余產物98.9％，乳酸鈣0.5％、山梨醇0.6％。
本發(fā)明還提供了該酶型飼料添加劑的各重量配比的原料用于飼料添加劑中的用途。
其中本發(fā)明酶型飼料添加劑的用量是飼料總重量的0.5％～2％。
所述的酶型飼料添加劑用于飼養(yǎng)豬、奶牛、羊、兔、鵝、雞、鯉魚、鯽魚等動物。
酶型飼料添加劑是利用現代發(fā)酵工程技術生產的高效能生物活性物質。通過動物功效學實驗，證明本發(fā)明酶型飼料添加劑作為生物催化劑，它具有安全、無毒、無副作用等特點。酶型飼料添加劑能將動物難以消化吸收的蛋白質、脂肪、碳水化合物等分解為葡萄糖、氨基酸、游離脂肪酸等易吸收的成分，并降解或排除飼料中抗營養(yǎng)因子，降低其在腸道中產生的黏度而提高飼料效益。此外，酶型飼料添加劑能有效地防治動物結腸炎和腹瀉等消化性疾病，并能與抗生素協同作用而有利于動物健康。作為全蛋白質的飼料酶能隨同飼料中的營養(yǎng)物質一起被消化吸收，而不會殘留在畜產品中，也不會造成環(huán)境污染。使用該酶型飼料添加劑可降低料肉比，降低飼養(yǎng)成本，提高生產效益。
通過分析化學試驗檢測證明米糠中的神經酰胺(Ceramide)，其中40％以游離狀態(tài)存在。另有60％以神經鞘磷脂和神經糖(主要為半乳糖)苷脂的結合態(tài)存在于谷胚和細胞膜中。(神經鞘磷脂和神經糖苷脂的結構與酶解位點如圖1所示)除了米糠中的神經酰胺含量較高外，其它植物，比如魔芋、小麥，微生物如酵母細胞等同樣含有較高的神經酰胺，也適用于本發(fā)明神經酰胺的制備方法。
提取試驗證明，呈結合狀態(tài)的神經酰胺不易被抽提浸取，嚴重影響神經酰胺的收率和產量。本發(fā)明神經酰胺的制備方法選用的菌種能合成并分泌大量的神經酰胺酶(Ceramidase)，能定向地作用于神經鞘磷脂的磷脂鍵和神經酰胺糖苷脂的糖苷鍵，使米糠在發(fā)酵過程中，呈結合狀態(tài)的神經酰胺水解率達到94％，發(fā)酵產物中，神經酰胺的得率，提高1.91倍，經濟效益提高54％?；诒景l(fā)明神經酰胺制備方法的原理，選用能合成并分泌大量的神經酰胺酶是本發(fā)明神經酰胺制備方法的關鍵，這種菌種的選擇包括與本發(fā)明菌種雅致放射毛霉Actinomucorelegans AS3.2778同屬的其它菌種。
本發(fā)明神經酰胺制備方法的原料米糠來源豐富，經過生物技術生產神經酰胺，成本低，安全性好，生產的神經酰胺生理活性和應用價值高，含量高(95％以上)、純度高(可達99.2％～101.8％)，產量高且本方法生產神經酰胺污染小，對環(huán)境有益，并且實現了廢渣的充分利用。
本發(fā)明制備的酶型飼料添加劑，是由米糠經菌種發(fā)酵并分離神經酰胺后的米糠殘渣，經測定含蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、植酸酶、β-葡聚糖苷酶、纖維素酶等多種生物酶，在萃取殘渣中加入適量的穩(wěn)定劑，可使酶活性保存90～95％，延長產品的貨架期(即產品從生產出來到農戶購買之間的間隔時間)和儲存期，且用量小，能顯著提高動物對飼料的吸收利用率，降低料肉比，降低飼養(yǎng)成本，提高生產效益。
顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現的技術均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1神經鞘磷脂和神經糖苷脂化學結構與酶切位點圖2本發(fā)明神經酰胺的工藝流程3本發(fā)明神經酰胺的HPLC色譜圖c為神經酰胺特征峰
具體實施例方式
實施例1 神經酰胺的制備本發(fā)明提供神經酰胺的制備方法，它是由米糠為原料通過生物發(fā)酵技術提取制備的方法，它包括下列步驟a、選擇菌種選用中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心的菌號AS3.2778的雅致放射毛霉Actinomucor elegans；菌種用量為4～12g；b、菌種發(fā)酵將選擇的菌種進行固體發(fā)酵，固體發(fā)酵條件為固體培養(yǎng)基米糠98.43％，酵母膏0.7％，KH2PO40.1％，K2HPO40.1％，MgSO40.05％，CaCl20.05％，ZnSO40.02％，菜籽油0.55％；培養(yǎng)溫度15℃～35℃；培養(yǎng)時間24～84h；培養(yǎng)基pH值7.0～8.0；培養(yǎng)基含水量40％～70％；培養(yǎng)基接種量4％～12％。
其中培養(yǎng)基采用變溫培養(yǎng)，培養(yǎng)時間72h，前24h培養(yǎng)溫度30℃，后48h培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)基pH值7.0～8.0，培養(yǎng)基含水量40％～70％，接種量4％～12％的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。
c、將b步驟的發(fā)酵產物經CO2超臨界流體萃取，得神經酰胺粗品，經大孔吸附樹脂純化，即得神經酰胺。
其中步驟c所述的CO2超臨界流體萃取為CO2在超臨界流體狀態(tài)下萃取發(fā)酵產物，采用分級萃取，其步驟為①將CO2經液化、低溫、高壓、加熱轉變成超臨界流態(tài)(超臨界流體兼有氣、液兩態(tài)特點，密度接近于液體，粘度和擴散系數接近于氣體，它不僅具有與液體溶劑相當的溶解能力，而且具有優(yōu)良的傳質性能。超臨界流體萃取技術就是利用上述超臨界流體的特殊性質，在高壓條件下與待分離的固體或液體混合物接觸，調節(jié)系統的操作壓力和溫度，萃取出所需要的物質，隨后通過減壓或升溫的方法，降低超臨界流體的密度，使萃取物得到分離)。
②將發(fā)酵產物置于萃取器中，通入超臨界流態(tài)CO2，得萃取物和剩余產物；③將萃取物經減壓加熱通入分離器A(該分離器是一整套儀器中的一個部分，設計來自大連光明化工院)，得神經酰胺粗品和剩余萃取物；其中一級分離壓力為7Mpa～8Mpa，分離溫度為35℃～38℃；④、將③步驟所述的剩余萃取物再次減壓加熱通入分離器B，得水、精油和氣態(tài)CO2，二級分離壓力為4Mpa～5Mpa，分離溫度為20～25℃；其中各步驟的萃取壓力為20Mpa～32Mpa；萃取溫度為32℃～45℃；萃取流量30公斤CO2/公斤發(fā)酵料；萃取時間2小時。
在此基礎上各步驟的條件可以選擇萃取壓力為30Mpa；萃取溫度為32℃～35℃；萃取流量30公斤CO2/公斤發(fā)酵料；步驟③一級分離壓力為7Mpa～7.5Mpa，分離溫度為35℃～38℃；步驟④二級分離壓力為4Mpa～5Mpa，分離溫度為20～25℃；萃取時間2小時。
其中步驟c中神經酰胺粗品，經大孔吸附樹脂純化條件為大孔樹脂型號D140洗脫液為乙醇∶乙酸＝8∶1，洗脫速度6～10L/h，收集洗脫液、濃縮、結晶，即得神經酰胺。
選擇上述不同條件，都可生產出純度較高的神經酰胺。(見圖2)實施例2 產物神經酰胺的定性定量分析1、本發(fā)明方法制備的神經酰胺經四川省疾病預防控制中心檢測，檢驗依據GB/T5009.11-1996和GB4789-94，衛(wèi)生指標如下產品重金屬殘量見表1表1.本發(fā)明方法制備的產品神經酰胺重金屬殘量項目 單位測定結果鉛(以Pb計) mg/kg 0.22砷(以As計) mg/kg ＜0.21汞(以Hg計) mg/kg 0.026水分 ％ 0.96產品微生物指標見表2
表2.本發(fā)明方法制備的產品神經酰胺微生物指標項目 單位 測定結果菌落總數cfu/g ＜10霉菌計數cfu/g ＜10酵母計數cfu/g ＜10大腸菌群MPN/100g＜10沙門氏菌 未檢出志賀氏菌 未檢出金黃色葡萄球菌 未檢出溶血性鏈球菌 未檢出2、本發(fā)明方法制備的神經酰胺(ceramide)經中國科學院成都分院分析測試中心用Waters液相色譜儀檢測，其中神經酰胺對照品為Sigma公司產品，通過與該對照品比較，神經酰胺含量為101.8％，純度及HPLC波譜與美國Sigma公司標準品基本一致。(見圖2)本發(fā)明方法制備的產品神經酰胺經成都市藥檢所檢測，檢測依據JISK0124-83液相色譜分析方法通則；主要儀器Waters液相色譜儀。結果純度為99.2％，與中國科學院成都分院分析測試中心檢測結果基本一致。
3、本發(fā)明方法制備的產品神經酰胺與美國部分公司產品質量對照A.美國Questamide H公司的神經酰胺產品標準見表3表3.Questamide H公司神經酰胺產品標準Appearance(外觀) waxy powder(暗白色粉末)Odor(氣味) Characetristics(無味)Color(顏色)Off white(暗白色)Purity(％)(純度) ＞98.0％Melting point(熔點)73.0-81.00CBacteria(細菌) 300opg max.(最大300opg)Fungi/Yeast(真菌) 100opg max.(最大100opg)No pathogens(無病原體)B.美國Biopharm Solutions，Inc.公司的神經酰胺產品標準見表4
表4.Biopharm Solutions，Inc.公司神經酰胺產品標準Appearance(外觀) waxy powder(暗白色粉末)Odor(氣味) Bland，Characetristics(無味)Color(顏色) Pale/off white(暗白色)Purity(％)(純度) ＞95.0％Moisture(濕度) ＜1.0％Melting point(熔點) 90.0-100.00CMicrobial Content(微生物含量)500opg max.(最大500opg)No pathogens(無病原體)C.本發(fā)明方法制備的產品質量標準(企業(yè)標準)見表5表5.本發(fā)明方法制備的產品神經酰胺質量標準外觀(Appearance) 微黃色粉末(light yellow powder)氣味(Odor) 無味(Bland)顏色(Color) 微黃色(light yellow)純度(Purity)(％) ＞99.0％熔點(Melting point) 78.0-87.00C菌落總數(Bacteria Content) ＜10cfu/g病原體(Pathogens)未檢出(No)從以上質量指標可見，本發(fā)明方法制備的產品神經酰胺純度略高于Questamide H公司和Biopharm Solutions，Inc.公司產品，其余指標與其相近，產品質量達到美國同類產品水平。
實施例3 本發(fā)明方法副產物酶型飼料添加劑制備將實施例1分離所得的剩余產物98.2～99.6％加入如下穩(wěn)定劑乳酸鈣、山梨醇作酶型飼料添加劑穩(wěn)定劑，乳酸鈣的用量范圍0.2～0.8％，最佳用量0.5％；山梨醇的用量范圍0.2～1.0％，最佳用量0.6％。
制備方法取發(fā)酵前固體發(fā)酵原料的投入量98.9公斤，計算出乳酸鈣和山梨醇的分別加入量，按乳酸鈣0.5公斤和山梨醇0.6公斤總量計，加入10倍量沸水，將其溶解后，噴灑在提取神經酰胺后的殘渣中，拌和均勻后，30℃～50℃條件下鼓風干燥，粉碎、包裝、檢測，即為成品。
以下通過具體功效學試驗說明本發(fā)明制備方法制備的副產物酶型飼料添加劑作為飼料添加劑的有益效果。
實驗例1 斷奶仔豬實驗通過添加本發(fā)明酶型飼料添加劑，彌補斷奶仔豬消化的不足，促進飼料消化吸收，提高經濟效益。
1、材料和方法1.1酶型飼料添加劑 本發(fā)明實施例3制備的酶型飼料添加劑。
1.2日糧組成及營養(yǎng)水平試驗日糧配方及營養(yǎng)水平見表6。
表6 日糧組成及營養(yǎng)水平日糧％ 試驗組對照組玉米 60.2 60.7豆粕 2828次粉 6.3 6.3預混料 5 5本發(fā)明酶型飼料添加劑 0.5 -合計 100 100試驗組添加5‰的本發(fā)明酶型飼料添加劑，對照組不加。
1.3試驗條件和方法1.3.1試驗時間共20天。
1.3.2試驗組的選擇及分組從10窩PIC斷奶仔豬中選擇60頭，體重相近，按窩別、性別隨機分成兩組，每組30頭，分為兩圈，每圈15頭。試驗組平均始重8.85kg，對照組平均始重9.03kg。
1.3.3飼養(yǎng)管理投喂量以投料后半小時吃完為原則，自由飲水。
1.3.4測定指標記錄兩組初始重，每天記錄各組飼料用量，20天后早晨空腹稱重，記錄末重，計算飼料用量，平均日增重，飼料轉化率。
2試驗結果2.1試驗期增重結果見表7。
表7 試驗期增重結果試驗頭試驗天 平均增重指標 初始重(kg) 末重(kg) 比較數數 (kg)試驗組 3020265 525 0.433 111對照組 3020270 270 0.390 1002.2采食量和飼料轉化見表8。
表8 采食量和飼料轉化表采食量(元 增重耗(元/kg料肉比 比較/kg)體重)試驗組504 260 1.94 93.7對照組495 239 2.07 100從表8可以看出，因其添加本發(fā)明酶型飼料添加劑，試驗組采食量稍大，飼料轉化率提高6.3％。
2.3飼料成本分析表9 飼料成本增重一公斤(耗料元料價(元/kg) 比較/g體重)試驗組1.763.41 947對照組1.743.60 100從表9可以看出，每公斤增重所需的飼料成本，試驗組比對照組下降了5.3％。
3、分析仔豬消化機能不健全，消化酶分泌不足，斷奶使消化酶的分泌減少，通過添加本發(fā)明酶型飼料添加劑，彌補仔豬消化酶的不足，提高消化功能，促進營養(yǎng)物質吸收。
4、結論試驗選用60頭29-30日齡PIC斷奶仔豬，分為兩組，試驗組添加千分之五的本發(fā)明酶型飼料添加劑，以觀察本發(fā)明酶型飼料添加劑的飼養(yǎng)效果。試驗表明試驗組日增重較對照組提高11％，飼料轉化率改善6.3％，飼養(yǎng)成本降低5.4％。說明該本發(fā)明酶型飼料添加劑可在畜牧生產中推廣運用。
實驗例2 本發(fā)明對生長豬的實驗1、材料和方法1.1酶型飼料添加劑 本發(fā)明實施例3制備的酶型飼料添加劑。
1.2試豬的選擇和分組供試豬為PIC生長豬(PIC是優(yōu)秀的配套系豬種)，體重、月齡相近，公母各半，全部去勢，隨機分成試驗組、對照組各20頭，每組分2欄飼養(yǎng)。試驗組平均始重25.33kg，對照組平均始重25.53kg。
1.3試驗時間共30天。
1.4飼料配方表10 飼料配方本發(fā)明酶玉米次粉麥麩豆粕預混料型飼料添加劑試驗組43.520 18 18 4 0.5對照組44.020 18 18 4飼料配方見表10，試驗組添加5‰本發(fā)明酶型飼料添加劑，對照組以玉米代替。次數、麥麩總用量為38％。
1.5飼養(yǎng)管理試驗前進行常規(guī)驅蟲、免疫。供試豬分別在同一棟豬舍相對四圈內，由同一飼養(yǎng)員管理，粉料濕飼，每日二次，每次以半小時內吃完為原則，自由飲水。
1.6測定指標在試驗期內觀察豬的采食及健康狀況，記錄每天每組飼料用量。二十天后早晨空腹稱豬重，計算飼料總量，平均日增重，飼料轉化率和飼料成本。
2試驗結果
2.1試驗豬增重情況表11 試驗豬增重結果試驗試驗平均始重 平均末重 平均日增比較頭數天數 (kg) (kg) 重(g)試驗組20 30 25.33 47.92 753 107對照組20 30 25.53 46.65 704 100供試豬增重結果見表11，由表可以看出，試驗組平均日增重較對照組提高7％。
2.2飼料采食量和轉化率供試豬飼料采食量和轉化率見表12。試驗組采食量稍大，但飼料轉化率提高4.9％，料肉比下降。
表12 飼料采食量和轉化率總耗料日采食量日增重料肉比 比較(kg)試驗組1026 1.63753 2.17 95.1對照組960 1.60704 2.28 1002.3飼料成本分析飼料成本分析見表13。
表13 飼料成本分析飼料成本 飼料成本比較(元/kg) (元/kg增重)試驗組1.64 3.5696.5對照組1.62 3.69100從表四可以看出，試驗組每增重一公斤活重，降低飼料成本0.13元，飼料成本下降3.5％。
2.4試驗組皮毛光亮，食欲旺盛，采食速度快。
麥麩、次粉的主要抗營養(yǎng)物質是非淀粉多糖，在小腸內增加內容物粘性，延長食糜在小腸內停留時間，減少消化酶同底物的接觸。飼料中添加本發(fā)明酶型飼料添加劑，如木聚糖酶，β-葡聚糖酶在腸道中分解非淀粉多糖，降低其粘性，消除其抗營養(yǎng)作用。同時添加本發(fā)明酶型飼料添加劑，幫助消化，提高飼料利用率。其次，添加酶制劑，營養(yǎng)成分吸收更完全，減少了消化道內有害微生物的過度繁殖，減少畜的免疫應答反應，從而提高生產性能。
結論本試驗表明，麥麩、次粉是小麥的副產物之一，因其蛋白含量較高，廣泛用于飼養(yǎng)業(yè)，但其非淀粉多糖，有抗營養(yǎng)作用。添加本發(fā)明酶型飼料添加劑，生長豬日增重提高7％，飼料利用率改善4.9％，降低飼料成本3.5％，經濟效益明顯，能提高利用率添加本發(fā)明酶型飼料添加劑。
實驗例3 奶牛實驗1.材料與方法1.1試牛選擇本場的健康泌乳母牛，按照年齡、胎次、泌乳月份、泌乳量基本一致的原則，選出20頭，隨機均分成試驗組和對照組。
1.2材料1.2.1日糧混合精料成份(％)玉米面46，麥麩19，豆餅28.5，磷酸三鈣2，鹽1，貝殼粉1，糠粕轉化高活性酶2.5。粗飼料為當地收購的飼草秸桿，自由采食。其它成份按常規(guī)飼喂。
1.2.2試樣本發(fā)明實施例3制備的酶型飼料添加劑，只在試驗組日糧中，按精料喂給量的2.3％加入，對照組不加，按常規(guī)飼喂。
1.3方法采取對比試驗法。兩組先分別預試30天，再正試30天。兩組均采用手工擠奶，每日擠奶3次。擠出鮮奶，分期、分組、分頭按日稱重記錄數據，最后統計分析。
日糧喂給量，兩組均按日投入量稱重記錄數據，最后分別統計分析。
1.4時間30天。
2.結果2.1參試奶牛產乳量及產值對比表14參試奶牛產乳量及產值對比

注表中，每公斤鮮牛奶單價按1.6元計算。
從表14可知，在奶牛日糧中添加23％的糠粕轉化酶型飼料添加劑(平均每頭奶牛日糧采食量8.5kg，約采食高活性酶添加劑100克)，試驗組奶牛比對照組平均日增產牛奶3.15kg/頭，產奶率提高12.79％，日平均產值增加5.04元/頭。料奶比下降12.8％。除去高活性酶添加劑成本(每頭奶牛日添加100克，增加日糧成本0.8元，每公斤售價8元)，每頭奶牛日增利潤4.24元。
2.2飼喂本發(fā)明酶型飼料添加劑對奶牛乳脂與乳蛋白質的影響表15飼喂添加劑對牛奶乳脂和乳蛋白質的影響試驗分奶牛 平均乳脂率(％) 乳蛋白質(％)組 頭數 試驗前 試驗期間 試驗前 試驗期間對照組10 3.79±0.37 3.18±0.453.34±0.35 3.35±0.32試驗組10 3.81±0.41 3.97±0.463.87±0.43 3.93±0.45從表15可見，在日糧中添加糠粕轉化高活性酶試驗期間，平均乳脂率試驗組比對照組提高4.2％。乳蛋白質試驗期間試驗組比對照組平均提高17.3％。
2.3在日糧中添加本發(fā)明酶型飼料添加劑對牛奶乳糖與乳干物質含量的影響表16 飼喂添加劑對牛奶乳糖與乳干物質的影響試驗分奶牛 平均乳糖(％)平均乳干物質(％)組 頭數 試驗前 試驗期間 試驗前 試驗期間對照組 104.81±0.24 4.84±0.2212.80±0.61 12.85±0.73試驗組 104.29±0.21 4.94±0.1913.10±0.49 13.07±0.71從表16可見，在奶牛日糧中加入本發(fā)明酶型飼料添加劑后，試驗期間試驗組牛奶中平均乳糖量比對照組增加2.1％，平均乳干物質含量增加1.7％。
在奶牛日糧中添加糠粕轉化酶型飼料添加劑，不僅可增加牛奶產量，也使牛奶中乳脂、乳蛋白質、乳糖、乳干物質等營養(yǎng)素含量有所提高。
經檢驗，本發(fā)明酶型飼料添加劑不含抗生素和動物激素。產品重金屬殘量及微生物指標經檢測均符合飼料添加劑標準，急性毒性實驗結果小鼠染毒后未見各劑量組動物出現中毒癥狀及死亡。觀察1周后稱體重處死，大體解剖亦未見異常病理改變。結論糠粕轉化酶型飼料添加劑對雌雄小鼠LD50值均大于10.0g/kg，參照化學物質毒性分級標準評價屬實際無毒級。
通過上述的動物功效學試驗說明，通過添加本發(fā)明酶型飼料添加劑，對仔豬消化機能不健全，消化酶分泌不足，斷奶使消化酶的分泌減少，彌補仔豬消化酶的不足，提高消化功能，促進營養(yǎng)物質吸收。能使生長豬日增重明顯提高，且用量小，能提高飼料利用率，降低飼料成本，增加奶牛牛奶產量，使牛奶中乳脂、乳蛋白質、乳糖、乳干物質等營養(yǎng)素含量提高，以上實驗充分說明本發(fā)明酶型飼料添加劑優(yōu)質安全，適應工業(yè)大生產使用，為畜牧業(yè)提供一種新的飼料添加劑選擇。
權利要求
1.一種雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生產神經酰胺的用途。
2.權利要求1所述的雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生產酶型飼料添加劑中的用途。
3.神經酰胺的制備方法，其特征在于它是以含有神經酰胺的植物性原料通過生物發(fā)酵技術提取制備的方法，它包括下列步驟a、選擇菌種選用中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏的菌號為AS3.2778的雅致放射毛霉Actinomucor elegans作為發(fā)酵菌種；b、菌種發(fā)酵用a步驟選擇的菌種對含有神經酰胺的植物性原料進行固體發(fā)酵，得到含神經酰胺的發(fā)酵產物；c、將b步驟的發(fā)酵產物經分離、純化得神經酰胺和剩余產物。
4.根據權利要求3所述的神經酰胺的制備方法，其特征在于步驟b所述的含有神經酰胺的植物性原料是米糠。
5.根據權利要求4所述的神經酰胺的制備方法，其特征在于所述固體發(fā)酵的培養(yǎng)基中含有米糠重量比97.6～99.08％。
6.根據權利要求3所述的神經酰胺的制備方法，其特征在于步驟c所述的分離、純化方法為CO2超臨界流體萃取分離，得神經酰胺粗品，再將神經酰胺粗品經大孔吸附樹脂純化。
7.根據權利要求6所述的神經酰胺的制備方法，其特征在于所述的CO2超臨界流體萃取為CO2在超臨界流體狀態(tài)下萃取發(fā)酵產物，采用分級萃取，其步驟為①、將CO2經液化、低溫、高壓、加熱轉變成超臨界流態(tài)；②、將發(fā)酵產物置于萃取器中，通入超臨界流態(tài)CO2，得萃取物和萃取分離所得的剩余產物；③、將萃取物經減壓加熱通入分離器，得神經酰胺粗品。
8.根據權利要求7所述的神經酰胺的制備方法，其特征在于步驟c所述的CO2超臨界流體萃取中步驟②萃取壓力為20Mpa～32Mpa；萃取溫度為32℃～45℃；萃取流量30公斤CO2/公斤發(fā)酵料；步驟③中分離壓力為7Mpa～8Mpa，分離溫度為35℃～38℃。
9.根據權利要求6所述的神經酰胺的制備方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂純化條件為大孔樹脂型號D140、D141、D180、LD605中的一種，洗脫液為乙醇∶乙酸＝7∶1～9∶1，洗脫速度6～10L/h，收集洗脫液、濃縮、結晶，即得神經酰胺。
10.根據權利要求9所述的神經酰胺的制備方法，其特征在于大孔樹脂為D140，洗脫液為乙醇∶乙酸＝8∶1，洗脫速度8L/h。
11.權利要求2所述的酶型飼料添加劑，它是用權利要求3步驟c所述的經分離所得的剩余產物制備而成。
12.根據權利要求11所述的酶型飼料添加劑，其特征在于酶型飼料添加劑的重量配比為分離所得的剩余產物98.2～99.6％，乳酸鈣0.2～0.8％，山梨醇0.2～1.0％。
13.根據權利要求12所述的酶型飼料添加劑，其特征在于酶型飼料添加劑的重量配比為分離所得的剩余產物98.9％，乳酸鈣0.5％、山梨醇0.6％。
14.根據權利要求11所述的酶型飼料添加劑，其特征在酶型飼料添加劑的用量占飼料總重量的0.5％～2％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雅致放射毛霉的新用途，特別是涉及雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生產神經酰胺的用途，本發(fā)明還提供了神經酰胺的制備方法，它是以米糠為原料通過發(fā)酵、提取分離、純化而成，本發(fā)明的另一技術方案是提供了神經酰胺制備方法的副產物——一種酶型飼料添加劑。本發(fā)明神經酰胺制備方法的原料米糠來源豐富，經過生物技術生產神經酰胺，成本低，安全性好，神經酰胺純度高，對污染小，并且實現了廢渣的充分利用，本發(fā)明制備的酶型飼料添加劑，用量小，能顯著提高動物對飼料的吸收利用率，降低料肉比，降低飼養(yǎng)成本，提高生產效益。
文檔編號C12P13/00GK1563398SQ20041002222
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月5日 優(yōu)先權日2004年4月5日
發(fā)明者劉克武, 李佳, 劉鑫 申請人:四川省時代生物技術有限責任公司