在感染的治療和預(yù)防中的神經(jīng)酰胺水平的制作方法
【專利說明】在感染的治療和預(yù)防中的神經(jīng)醜胺水平
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年6月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/654, 519的權(quán)益， 該申請(qǐng)W引用的方式整體并入本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及使具有囊性纖維化、慢性阻塞性肺?。ɑ痳onic化structive Lung Disease, COPD)和/或開放性傷口的受試者體內(nèi)的神經(jīng)酷胺水平正常化W預(yù)防和/或治療 病原體感染。
[000引發(fā)明背景
[0004] 囊性纖維化（切Stic Fibrosis, "CF")是歐洲和美國(guó)最常見的常染色體隱性病 癥，在西方國(guó)家中每2500個(gè)新生兒就有一人患病。它是一種由CF跨膜傳導(dǎo)調(diào)控蛋白（CF transmembrane conductance regulator protein，"CFTR")的突變引起的疾病。盡管該一 基因突變導(dǎo)致了若干呼吸道、生殖道和胃腸道并發(fā)癥，但在該些受試者中發(fā)病和死亡的主 要原因是綠脈桿菌（Pseudomonas aeruginosa) ("P. aeruginosa")的長(zhǎng)期肺定殖的破壞性 作用。醫(yī)療記錄指示，有約80%的患有CF的受試者到25歲時(shí)將成為綠脈桿菌的宿主。參 見 Cystic Fibrosis Foundation Subject Registry:Annual Data Report (2010)。除對(duì)于 綠脈桿菌的易感性增加外，CF肺還W慢性炎癥和進(jìn)行性纖維化為特征。目前，介導(dǎo)CF疾病 標(biāo)志（即，感染易感性、炎癥及纖維化）的分子機(jī)制有待確定。
[0005] 上皮細(xì)胞的綠脈桿菌感染是由病原體與細(xì)胞表面接觸來起始。已經(jīng)鑒別出綠 脈桿菌的若干結(jié)合分子，包括CFTR、纖連蛋白、asei-整合素及糖脂（包括神經(jīng)節(jié)巧 脂-GM1)。參見 Pier 等，"Role Of Mutant CFTR In Hypersusc 巧 tibility Of 切 Stic Fibrosis Subjects To Lung Infections, " Science. 271, 64-67 (1996) ；Schroeder 等,"CFTR Is A Pattern Recognition Molecule That Extracts Pseudomonas aeruginosa LPS From The Outer Membrane Into Epithelial Cells And Activates NF-kappa B Translocation, "Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A. 99,第 6907-6912 頁 (2002) ；deBentzmann 等,"Asialo GMlIs A Receptor For Pseudomonas aeruginosa Adherence To Regenerating Respiratory Epithelial Cells, "Infect. Immun. 64巧）， 第 1582-1588 頁（1996) ;deBentzmann 等，"Pseudomonas aeruginosa A化erence To Remodeling Respiratory Epithelium, "Eur. Respir. J. 9,第 2145-2150 頁（1996) ;Roger 等，"Fibronectin And 口 5 P 1-integrin Mediate Binding Of Pseudomonas aeruginosa To Repairing Airway Epithelium, "Eur. Respir. J. 13,第 1301-1309 頁（1999) ；Saiman 等，"Pseudomonas aeruginosa Pili Bind To AsialoGMlWhich Is Increased On The Surface Of 切Stic Fibrosis Epithelial Cells, "J. Clin.Invest. 92,第 1875-1880 頁 (1993);從及 Davies 等，"Reduction In The Adherence Of Pseudomonas aeruginosa To Native Cystic Fibrosis Epithelium With Anti-AsialoGMlAntibody And Neuraminidase Inhibition,，，化r. Respir. J ; 13,第 565-570 頁（1999)。
[0006] 因此，鑒別在CF中特異性改變并且設(shè)及該些受試者對(duì)綠脈桿菌的高感染易感性 的綠脈桿菌上皮細(xì)胞受體是開發(fā)針對(duì)CF-和伴隨的病原體感染的新預(yù)防和治療策略的一 個(gè)重要考慮因素。該些分子將是防止病原體與CF受試者中的支氣管上皮細(xì)胞的初始接觸 并由此極早預(yù)防感染的理想祀標(biāo)。
[0007] 當(dāng)前治療和預(yù)防罹患某種疾病或病狀的受試者的疾病發(fā)病的方法會(huì)引起毒性和 功效問題。
[000引本發(fā)明是針對(duì)例如通過用一種獨(dú)特的膜脂質(zhì)介導(dǎo)的機(jī)制校正體內(nèi)細(xì)菌病原體與 支氣管上皮細(xì)胞的主要結(jié)合分子的異常表達(dá)來克服本領(lǐng)域中的該些不足。 發(fā)明概要
[0009] 本發(fā)明一方面針對(duì)一種用于治療或預(yù)防具有囊性纖維化、慢性阻塞性肺病（COPD) 和/或開放性傷口的受試者的病原體感染的方法。所述方法設(shè)及選擇具有囊性纖維化、 coro和/或開放性傷口的受試者，并且在有效減少神經(jīng)酷胺并治療或預(yù)防所選受試者的病 原體感染的條件下，向所選受試者施用神經(jīng)酷胺酶。
[0010] 本發(fā)明另一方面設(shè)及向所述受試者施用神經(jīng)酷胺酶與用W減少神經(jīng)酷胺或減少 感染的其它藥劑的組合。該些藥劑可W包括但不限于抗生素、用于降低粘液粘度的試劑、用 于增強(qiáng)囊性纖維化跨膜蛋白（CFTR)的功能的伴侶劑（chaperone agent),或酸性銷磯脂酶 抑制劑。
[0011] 本發(fā)明另一方面設(shè)及基于受試者的細(xì)胞、組織或流體中神經(jīng)酷胺的水平，和/或 內(nèi)源性神經(jīng)酷胺酶的水平來選擇所述受試者。
[0012] 附圖簡(jiǎn)述
[0013] 圖1A和1B示出了石蠟包埋的小鼠肺切片。圖1A是用切3-抗神經(jīng)酷胺抗體染色 并且然后通過共聚焦顯微術(shù)分析的野生型小鼠、CerS2缺陷型小鼠及囊性纖維化小鼠肺的 代表性切片。圖1B是在小鼠單次吸入酸性神經(jīng)酷胺酶（acid ceramidase/'AC")之后2小 時(shí)，用相同抗體染色的野生型小鼠、CerS2缺陷型小鼠及囊性纖維化小鼠肺的代表性切片。 結(jié)果是每組至少6只小鼠的代表性結(jié)果。
[0014] 圖2證實(shí)，重組酸性神經(jīng)酷胺酶防止積累神經(jīng)酷胺的小鼠肺中的綠脈桿菌感染。 使用了兩個(gè)小鼠模型。一個(gè)（CerS2-/-)是敲除了產(chǎn)生神經(jīng)酷胺的酶，即神經(jīng)酷胺合成酶2 的基因。另一個(gè)（Cftr-/-)在囊性纖維化跨膜蛋白基因中具有突變并且是囊性纖維化的模 型。野生型小鼠、CerS2-/-小鼠或Cftr-/-小鼠單次吸入生理鹽水（淺灰色）或酸性神經(jīng) 酷胺酶（深灰色），然后用綠脈桿菌進(jìn)行感染。兩小時(shí)之后，將其處死并且測(cè)定小鼠肺中殘 留的綠脈桿菌的滴度。
[0015] 圖3示出了在用IX 108個(gè)菌落形成單位（CFU)的綠脈桿菌菌株762或ATCC 27853 進(jìn)行鼻內(nèi)感染之前30至45分鐘吸入含100 y g AC的0. 8血0. 9 %化C1的小鼠的結(jié)果。在 感染后4小時(shí)取出肺，將其均質(zhì)化，在5mg/mL皂素中溶解10分鐘，并洗漆。將等分試樣接種 于LB板上并使其生長(zhǎng)過夜。對(duì)LB板上的C即進(jìn)行計(jì)數(shù)W確定肺中綠脈桿菌細(xì)菌的數(shù)量。 示出了四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，使用了分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、微生 物學(xué)及重組DNA中的許多常規(guī)技術(shù)。該些技術(shù)是眾所周知的并且分別解釋于例如W下文獻(xiàn) 中；Current Protocols in Molecular Biology,第 I-III 卷，Ausubel 編（1997) ；Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二片反（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha