專利名稱：抗日本血吸蟲(chóng)病天然分子亞單位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)未成熟卵可溶性抗原分子分離、純化、優(yōu)化組合、其抗病效果的檢測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用條件(包括免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫途徑等)的優(yōu)化篩選。
背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病是一種分布廣，危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)病的流行嚴(yán)重影響了人們?nèi)罕姷纳眢w健康并阻礙了疫區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展?，F(xiàn)階段血吸蟲(chóng)病防治研究主要集中在滅螺、化療和疫苗研究三個(gè)方面。藥物滅螺是目前阻斷血吸蟲(chóng)傳播最常用的措施，但大面積湖洲外灘滅螺由于受到生態(tài)和防洪等因素的限制而難以奏效，且財(cái)力消耗巨大而難以承擔(dān)?；熾m可短期內(nèi)緩解病情、疫情，但防治效果不能鞏固；此外由于血吸蟲(chóng)病是人獸共患病，存在多種家畜和野生動(dòng)物保蟲(chóng)宿主，因此，人畜同步化療難度更大；頻繁的化療已經(jīng)導(dǎo)致血吸蟲(chóng)對(duì)首選藥物吡喹酮產(chǎn)生了抗藥性，此藥的長(zhǎng)期應(yīng)用已面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，歷史經(jīng)驗(yàn)證明疫苗的研制并成功應(yīng)用是控制和消滅一些重要傳染性疾病的最為經(jīng)濟(jì)和有效的途徑之一。因此，血吸蟲(chóng)病疫苗研究是當(dāng)今血吸蟲(chóng)病防治研究的熱點(diǎn)之一由于現(xiàn)代免疫學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，血吸蟲(chóng)病疫苗研制已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，在發(fā)達(dá)國(guó)家，對(duì)疫苗的研究主要集中于曼氏血吸蟲(chóng)病，現(xiàn)已篩選出數(shù)種有希望的曼氏血吸蟲(chóng)疫苗侯選分子(見(jiàn)圖一)，此外巴西科學(xué)家在研究中采用了自己開(kāi)發(fā)的繪制基因圖譜技術(shù)，集中繪制了含有蛋白質(zhì)配方的基因中間片段，并對(duì)血吸蟲(chóng)六個(gè)生命階段表達(dá)的活躍基因都進(jìn)行了分析，現(xiàn)已繪制出了其中92％的活躍基因，為研究和開(kāi)發(fā)新的防治血吸蟲(chóng)病的疫苗和藥品邁出了重要一步。
表1 WHO推薦的6種曼氏血吸蟲(chóng)疫苗

在我國(guó)，現(xiàn)階段對(duì)疫苗的研究主要集中于以天然或重組成分為主的亞單位多肽疫苗，這類疫苗成分單一，無(wú)致病力，但只能提供部分保護(hù)力，免疫保護(hù)效果一般不超過(guò)50％，而本發(fā)明提供了一種“雞尾酒”式多價(jià)混合疫苗，大大提高了疫苗的動(dòng)物免疫保護(hù)力。1999-2000年，衛(wèi)生部專家組織進(jìn)行了全國(guó)血吸蟲(chóng)抗原疫苗免疫保護(hù)統(tǒng)一檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，采用單盲法、異地重復(fù)(上海、南京)對(duì)全國(guó)16種日本血吸蟲(chóng)疫苗進(jìn)行統(tǒng)一檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)來(lái)源于未成熟蟲(chóng)卵天然的亞單位分子疫苗(1號(hào)疫苗)獲得最佳的動(dòng)物保護(hù)效果減卵率高達(dá)89.3％，減雌雄蟲(chóng)合抱率達(dá)53.9％。且免疫動(dòng)物肝臟呈正常紅色，僅少許蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)，損害明顯減輕。(見(jiàn)表2，只列舉了其中四種部分有效的疫苗，其他無(wú)效12種未列入)表2 血吸蟲(chóng)疫苗會(huì)戰(zhàn)結(jié)果比較

發(fā)明內(nèi)容為了克服由于人畜化療導(dǎo)致血吸蟲(chóng)對(duì)首選藥物吡喹酮產(chǎn)生抗藥性及藥物滅螺對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，本發(fā)明提供一種針對(duì)我國(guó)血吸蟲(chóng)病傳染源(抗卵免疫)的新型天然分子疫苗，該疫苗由日本血吸蟲(chóng)未成熟蟲(chóng)卵可溶性抗原26kDa、28kDa等亞單位分子組成，SIEA雙向電泳圖譜26、28kDa抗原組群中66、71、73號(hào)蛋白點(diǎn)分別與HGPRT、SDISP、GST匹配，進(jìn)一步結(jié)合同源性分析證明，HGPRT是與細(xì)胞核苷酸代謝有關(guān)的酶，在血吸蟲(chóng)體內(nèi)有很高的活性，與血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，SDISP是細(xì)胞三羧酸循環(huán)限速酶琥珀酸脫氫酶的亞單位成分，主要與血吸蟲(chóng)的能量代謝有關(guān)，26kDaGST則是催化谷胱甘肽(GSH)巰基與其他化合物的親電基團(tuán)作用，生成谷胱甘肽衍生物，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，影響血吸蟲(chóng)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。
該發(fā)明的應(yīng)用可以使感染動(dòng)物的產(chǎn)卵量顯著降低并增加死卵率，從而使感染者病情減輕，同時(shí)由于動(dòng)物糞便中成熟蟲(chóng)卵排出量的減少、毛蚴孵化率下降可以產(chǎn)生阻斷血吸蟲(chóng)病傳播的效果，這將有利于傳染源的控制，通過(guò)阻斷傳播而降低湖州感染性、降低疫情以達(dá)到最終控制血吸蟲(chóng)病流行的目的。此外，這種阻斷血吸蟲(chóng)病傳播的亞單位SIEA26-28kDa分子疫苗介入血吸蟲(chóng)病防治工作，可望通過(guò)控制傳染源而給家畜的血吸蟲(chóng)病防治帶來(lái)突破性進(jìn)展，從而大大改善湖州生態(tài)的可利用性環(huán)境。
疫苗的推廣可結(jié)合目前我國(guó)血吸蟲(chóng)病流行區(qū)正在實(shí)施的退田還湖、移民建鎮(zhèn)國(guó)家重點(diǎn)工程。堤垸退田還湖后，廢堤外的釘螺將向廢棄垸內(nèi)擴(kuò)散，這些廢棄垸將重新成為有螺湖州，洞庭湖的釘螺面積將急劇增加。而移民建鎮(zhèn)工程的新鎮(zhèn)大多建在防洪大堤上，居民家畜大量集中將加劇新鎮(zhèn)外洲污染，使其水體感染性增加。血吸蟲(chóng)病感染率可能再度上升。以控制傳染源為主要目標(biāo)的抗卵疫苗的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，將對(duì)廣大退田還湖、移民建鎮(zhèn)地區(qū)預(yù)防血吸蟲(chóng)病提供重要的參考價(jià)值。


圖1SIEA超凝膠柱層析圖2層析純化SIEA26-28kDa SDS-PAGE(Amaker，BSIE26-28kDa)圖3技術(shù)路線圖
具體實(shí)施例方式
一、抗日本血吸蟲(chóng)病天然分子疫苗動(dòng)物保護(hù)效果的檢測(cè)1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡BALB/c雄性小鼠，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，用作日本血吸蟲(chóng)大陸株的感染宿主。
1.2日本血吸蟲(chóng)大陸株安徽品系尾蚴陽(yáng)性釘螺由江蘇血吸蟲(chóng)病防治研究所提供。
2方法2.1BALB/c小鼠免疫實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)小鼠分成2組，每組15只，以亞單位SIEA26-28kDa等分子疫苗加入等量福氏完全佐劑進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，免疫部位為頸背部皮下，以后改加福氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每?jī)芍苓M(jìn)行一次，連續(xù)三次，對(duì)照組注射生理鹽水-佐劑，所用佐劑等均經(jīng)高壓滅菌，無(wú)菌分裝備用。分子疫苗及SEA經(jīng)0.22um微孔濾膜除菌。
2.2對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行攻擊感染每次加強(qiáng)免疫后一周從免疫動(dòng)物耳緣靜脈取血，用聚苯乙烯微板做ELISA測(cè)定血清抗體滴度，其中一抗為32天感染兔血清，待滴度達(dá)1∶12800以上即進(jìn)行攻擊感染，采用常規(guī)腹部鋪片法，三組小鼠每只感染40條尾蚴。
2.3蟲(chóng)荷測(cè)定于攻擊感染后46天剖殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠)，以摘眼球法取血剖開(kāi)胸腹腔，以心臟灌注法收集成蟲(chóng)，并仔細(xì)檢查肝外門脈，腸系膜靜脈，搜索殘留成蟲(chóng)并記數(shù)。用以下公式計(jì)算減蟲(chóng)率減蟲(chóng)率＝(1-免疫組平均蟲(chóng)荷數(shù)/對(duì)照組平均蟲(chóng)荷數(shù))×100％
2.4肝組織蟲(chóng)卵定量解剖后取鼠肝1g，加入生理鹽水5ml，剪碎后用高速組織分散器處理40秒，連續(xù)3次，取1ml肝懸液在顯微鏡下記數(shù).按以下公式計(jì)算減蟲(chóng)率(減卵率＝(1-免疫組EPG/對(duì)照組EPG)×100％；EPG為平均每克肝臟組織中所荷蟲(chóng)卵數(shù))。
2.5糞卵減少率計(jì)算采用定量加藤氏法進(jìn)行糞卵定量計(jì)數(shù)，糞卵減少率＝(1-免疫組糞卵EPG/對(duì)照組糞卵EPG)×100％3結(jié)果3.1疫苗免疫組小鼠體內(nèi)成蟲(chóng)數(shù)量顯著減少(53.9％)，與對(duì)照組比較，成蟲(chóng)獲檢數(shù)在各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.2疫苗組小鼠肝組織內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)量顯著下降，成熟蟲(chóng)卵數(shù)下降更加明顯(89.3％)，與對(duì)照組比較肝組織蟲(chóng)卵數(shù)在(EPG值)各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
二、抗日本血吸蟲(chóng)病天然分子疫苗的研制程序1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康新西蘭兔平均體重2kg，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，用作日本血吸蟲(chóng)大陸株的感染宿主。
1.2日本血吸蟲(chóng)大陸株安徽品系尾蚴陽(yáng)性釘螺由江蘇血吸蟲(chóng)病防治研究所提供。
2方法2.1原液制備2.1.1未成熟蟲(chóng)卵收集采用腹部鋪片法，每只2kg健康家兔感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴4000尾，在潔凈通風(fēng)條件下喂養(yǎng)，并保證有充足的食物和飲水，在感染后第32天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行剖殺，收集感染兔血并分離血清備用。取兔肝臟去除結(jié)締組織后在搗碎機(jī)內(nèi)充分搗碎，過(guò)不同目尼龍絹篩，280目絹篩收集到的即為未成熟蟲(chóng)卵粗品，將蟲(chóng)卵粗品反復(fù)離心去上層肝臟碎片，鏡檢蟲(chóng)卵純度達(dá)95％以上，量取壓積凍存于-20度冰箱內(nèi)備用。
2.1.2未成熟蟲(chóng)卵可溶性抗原(SIEA)制備取壓積日本血吸蟲(chóng)未成熟蟲(chóng)卵加入等體積0.2M檸檬酸緩沖液冰浴研磨，鏡檢無(wú)完整蟲(chóng)卵止，冰浴超聲處理(處理5s，間隔時(shí)間為8s，共40次，功率為550W)，12000rpm高速冷凍離心處理30min，分離上清液，采用752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度，凍存于-20℃冰箱內(nèi)備用。
2.1.3抗原活性成分分離純化采用26×500mm普通層析柱，凝膠色譜系統(tǒng)還包括HD-21-88核酸蛋白檢測(cè)儀，XWT-S小型臺(tái)式記錄儀，HL-2恒流泵，BSZ-100自動(dòng)部分收集器，層系柱填料為ACA超凝膠，每次上樣4ml，以0.2M檸檬酸緩沖液洗脫，調(diào)節(jié)恒流泵至流速為20ml/h，紫外檢測(cè)儀以280nm示蹤，靈敏度選擇1.0A，開(kāi)啟自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，以每管2ml分部收集，同時(shí)開(kāi)啟臺(tái)式記錄儀，速度為3cm/min，開(kāi)始記錄洗脫峰，待記錄儀指示筆回到基線后再洗脫數(shù)小時(shí)，停止收集，將收集到的洗脫液用Tris堿調(diào)pH值至中性，從管中取100ul包聚乙烯微板作ELISA，一抗選用32天感染兔血清，顯色后用酶標(biāo)儀測(cè)定，選取活性管在4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行透析，透析完成后將蛋白液轉(zhuǎn)移至潔凈青霉素瓶?jī)?nèi)，膜封口后在膜上扎針孔，置于-70℃冰箱內(nèi)凍結(jié)4小時(shí)以上，取出后在凍干機(jī)內(nèi)凍干，當(dāng)瓶?jī)?nèi)液體約剩1ml時(shí)停止凍干。
2.2疫苗制備在獲得大量單分子抗原的基礎(chǔ)上按照本室確定的配方進(jìn)行配制并稀釋至所需的濃度，用G6過(guò)濾除菌，即為半成品，按照生物制品規(guī)程進(jìn)行分裝、凍干，包即得成品。
2.3疫苗檢定2.3.1生物學(xué)活性測(cè)定以亞單位SIEA26-28kDa等分子疫苗加入等量福氏完全佐劑對(duì)新西蘭兔進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，免疫部位為頸背部皮下，以后改加福氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每?jī)芍苓M(jìn)行一次，連續(xù)三次，每次加強(qiáng)免疫后一周從兔耳緣靜脈取血，用聚苯乙烯微板作ELISA測(cè)定血清抗體滴度，達(dá)1∶12800。
2.3.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定雙縮脲法試劑配制取硫酸銅(CuSO4·5H2O)3.0g，酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化鉀5.0g，氫氧化鈉24g，加水使溶解成1000ml，搖勻即得。精密量取適量的蛋白質(zhì)對(duì)照品及供試品溶液，分別加水制成50mg/ml的溶液。
分別精密量取供試品溶液、蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液各0.05ml于玻璃試管中，各加4.0ml雙縮脲試劑，混勻，37℃水浴30分鐘，照紫外-可見(jiàn)分光光度法在540nm的波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。另精密量取50ul水，同法操作，作為空白對(duì)照。
按下式計(jì)算供試品中蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量(mg/ml)＝(A1/A2)×C×n式中A1為供試品的吸光度；A2為蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液的吸光度；C為蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液的濃度(mg/ml)；n為供試品稀釋倍數(shù)。
2.3.3純度測(cè)定高效液相色譜法用RP-HPLC法色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以A相(三氟醋酸-水溶液取1.0ml三氟醋酸加入超純水999ml，充分混勻)、B相(三氟醋酸-乙腈溶液取1.0ml三氟醋酸加入色譜純乙腈999ml，充分混勻)為流動(dòng)相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫(0～70％B相)。上樣量10ug，用波長(zhǎng)280nm檢測(cè)，按面積歸一化法計(jì)算。主峰面積不低于總面積的95.0％。
2.3.4分子量測(cè)定用還原型SDS-聚丙烯酰胺電泳法，分離膠膠濃度為10％，加樣量應(yīng)不低于1.0mg，測(cè)定制品的分子量。
2.3.5異常毒性檢查豚鼠試驗(yàn)法徹底清注射器及針頭洗、滅菌、保證無(wú)菌、無(wú)熱原。注射前稱取每只豚鼠體重，為250～350g。每批供試品用2只豚鼠，每只豚鼠腹腔注射供試品5.0ml，觀察7天。在觀察期內(nèi)，豚鼠全部健存，且無(wú)異常反應(yīng)，且每只豚鼠體重增加，供試品判為合格。
權(quán)利要求
1.一種抗日本血吸蟲(chóng)病的天然分子亞單位疫苗，具體涉及到日本血吸蟲(chóng)未成熟蟲(chóng)卵可溶性蛋白質(zhì)抗原，即SIEA26kDa、28kDa分子。
2.一種如權(quán)利要求1所闡明的抗日本血吸蟲(chóng)病天然分子亞單位疫苗的作用機(jī)制SIEA雙向電泳圖譜抗原位于66、71、73號(hào)蛋白點(diǎn)，SIEA26kDa、28kDa分子抗原熒光定位于蟲(chóng)卵胚胎和雌蟲(chóng)卵黃腺及腸道細(xì)胞。SIEA26kDa、28kDa分子與血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和能量代謝相關(guān)，并參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響血吸蟲(chóng)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，免疫后可產(chǎn)生抗蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育、抗雌蟲(chóng)生殖產(chǎn)卵和促進(jìn)蟲(chóng)卵死亡的效果。
3.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)SIEA26kDa、28kDa天然分子的超凝膠AcA54柱層析的分離、SDS-PAGE電泳鑒定及電滲洗脫的方法。
4.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)SIEA26kDa、28kDa天然分子的編碼基因及核甘酸序列，以及在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其中原核表達(dá)的宿主菌為BL21，原核表達(dá)質(zhì)粒為pGEX-4T-1；真核表達(dá)的宿主菌為DH5α，真核表達(dá)的質(zhì)粒為pcDNA3。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)未成熟蟲(chóng)卵可溶性抗原SIEA26kDa、28kDa天然分子亞單位疫苗的分離鑒定、抗日本血吸蟲(chóng)病作用機(jī)制及SIEA26kDa、28kDa天然分子編碼基因的篩選、鑒定、克隆表達(dá)與應(yīng)用。其發(fā)明基于我們對(duì)SIEA6kDa、28kDa天然分子亞單位抗血吸蟲(chóng)病機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)本疫苗具有抗日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)生殖產(chǎn)卵及抗蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育的雙重功效其減卵率高達(dá)89.3％，減蟲(chóng)合抱率達(dá)53.9％，糞卵減少率達(dá)90％。
文檔編號(hào)C12N15/30GK1714865SQ200410023359
公開(kāi)日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2004年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月28日
發(fā)明者汪世平, 李少波, 李宏實(shí), 文繼舫, 毛金武, 周汨波, 劉立鵬, 徐紹銳, 呂志躍, 何卓, 彭先楚, 周松華 申請(qǐng)人:汪世平, 長(zhǎng)沙博康生物醫(yī)藥研究所