專利名稱：果葡糖漿制備新方法與耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域與生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及果葡糖漿制備新方法及一系列耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體和這些葡萄糖異構(gòu)酶突變體的制備方法。
背景技術(shù)：
葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose isomerase，簡稱GI；E.C.5.3.1.5)，又稱木糖異構(gòu)酶(Xylose isomerase)是催化轉(zhuǎn)化葡萄糖為果糖，該酶也是將木聚糖轉(zhuǎn)化為乙醇途徑中的關(guān)鍵酶。因此，葡萄糖異構(gòu)酶在工業(yè)上可用于生產(chǎn)果葡糖漿，或生產(chǎn)酒精。
淀粉(玉米淀粉、薯干淀粉等)經(jīng)化學或生物酶制劑轉(zhuǎn)化產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)生果葡糖漿。目前，食品及飲料行業(yè)是果葡糖漿最大的消費者。市場上存在F42(稱第一代果葡糖漿)、F55(稱第二代果葡糖漿)和F90(稱第三代果葡糖漿)三種類型的果葡糖漿。
淀粉經(jīng)淀粉酶等水解后產(chǎn)生葡萄糖液，葡萄糖再經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶作用后產(chǎn)生果糖，葡萄糖與果糖的混合糖漿稱為果葡糖漿。目前，國內(nèi)外工業(yè)界利用葡萄糖異構(gòu)酶只能生產(chǎn)果糖含量為42％的果葡糖漿(或稱F42)，后者經(jīng)用色譜分離技術(shù)將這類產(chǎn)品中的果糖和葡萄糖分離得含果糖90％(或稱F90)以上的果葡糖漿，將F90與F42按一定比例混合，得果糖含量為55％的果葡糖漿(或稱F55)。
由于果葡糖漿的甜度高，因此它一直是作為在食品、飲料領(lǐng)域替代蔗糖的主要淀粉糖種類。據(jù)中國發(fā)酵協(xié)會統(tǒng)計，1992年到2002年，淀粉糖工業(yè)快速發(fā)展。淀粉糖產(chǎn)量從1992年的21萬噸發(fā)展到2002年的200萬噸，十年翻了近10倍，2002年比1992年增長了89.5％。品種4～5個發(fā)展到24個，而且出現(xiàn)了淀粉糖(干基)單價低于蔗糖的新情況。國際淀粉糖生產(chǎn)中果葡糖占主要位置。以美國為例，2000年美國淀粉糖總產(chǎn)量1490.7萬噸，其中果葡糖漿1080.4萬噸，占72.47％。1996-2000年美國果葡糖漿產(chǎn)量從956.3萬噸上升到1080.4萬噸，平均年遞增3.1％。國內(nèi)果葡糖漿目前處于啟動階段。發(fā)展糧食深加工，加快發(fā)展淀粉糖行業(yè)，可以解決農(nóng)民增產(chǎn)不增收的制約瓶頸。
酶法生產(chǎn)果葡糖漿，產(chǎn)品中果糖的含量取決于反應(yīng)的溫度。目前工業(yè)上使用的葡萄糖異構(gòu)酶不僅酶活低而且在高溫(如高于60℃)下極不穩(wěn)定。因此，工業(yè)上通常在60℃制備果葡糖漿，產(chǎn)物中果糖的含量也就較低，通常不超過44％。更高果糖含量的果葡糖漿只能依靠層析分離的方法產(chǎn)生，這一額外步驟增加成本。本發(fā)明從Thermoanaerobacteriumsachcharolyticum B6A菌中(ATCC 49915，USA)分離到葡萄糖異構(gòu)酶(Lee Y.E.etal.，Journal of General Microbiology 1993，1391227-1234)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID NO.1，氨基酸序列為序列表SEQ.ID NO.2。然后，本發(fā)明通過基因與蛋白工程技術(shù)改良了本發(fā)明分離到的葡萄糖異構(gòu)酶，使其催化轉(zhuǎn)化葡萄糖為果糖之活性有了顯著提高，并且葡萄糖異構(gòu)酶突變體之耐高溫穩(wěn)定性及其在大腸桿菌中的表達水平有了顯著提高。這些葡萄糖異構(gòu)酶突變體可用于生產(chǎn)果糖含量高于50％的果葡糖漿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種果葡糖漿制備方法；本發(fā)明的目的之二是提供編碼一系列耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的核苷酸序列；本發(fā)明的目的之三是提供一系列耐高溫葡構(gòu)酶突變體的氨基酸序列；本發(fā)明的目的之四是提供使用本發(fā)明所述的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶在高于70℃反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)化葡萄糖至果糖，直接(即無需色譜分離技術(shù)、或類似技術(shù)輔助)生產(chǎn)果糖含量≥50％的果葡糖漿。本發(fā)明的目的還在于提供這些耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶的工程與制備方法。
本發(fā)明一方面提供一種果葡糖漿制備方法，該方法包括以下步驟1)溶解(來源于玉米、或小麥、或土豆、或紅薯、或水稻淀粉之)葡萄糖；2)加入本發(fā)明提供的一種液相或固相耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體；3)在高于70℃反應(yīng)條件下攪拌反應(yīng)，葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖至果糖，生產(chǎn)果糖含量≥50％的果葡糖漿；4)按常規(guī)方法脫色再收集生成的果葡糖漿。
本發(fā)明另一方面提供編碼一系列耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的核苷酸序列，所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(≥75％的同源性)，所述的突變包括缺失、無義、插入、錯義，所述的突變不包括公知的密碼子簡并性變化。
本發(fā)明進一步提供由序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.IDNO.9的核苷酸序列編碼的相應(yīng)的序列表SEQ.ID NO.4、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.IDNO.6、或SEQ.ID NO.10氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(≥90％的同源性)，該修飾形式功能上相當或與耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
本發(fā)明進一步提供耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的工程方法，該方法包括以下步驟1)根據(jù)基因庫(L09699)基因序列設(shè)計引物TF5′AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAA 3′和TR5′ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATACT 3′，利用引物對TF和TR及常規(guī)PCR技術(shù)從Thermoanaerobacterium saccharolyticum(購自ATCC 49915，USA)中擴增出親本葡萄糖異構(gòu)酶基因(TS-F)；2)分析親本葡萄糖異構(gòu)酶之二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)，選擇位點R81、W139、R182、V186、Q59及T182六位點進行單個位點或/和多位點組合突變；3)通過PCR技術(shù)突變產(chǎn)生突變基因，將產(chǎn)生的突變基因與載體pGEMT-Easy(Promega，USA)連接，得含突變基因的質(zhì)粒；4)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌細胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆；5)從克隆中提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)DNA測序確定引入的點突變無誤。
本發(fā)明進一步提供耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的制備方法，該方法包括以下步驟1)將含葡萄糖異構(gòu)酶突變體基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌細胞HB101，涂在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上，37℃選擇培養(yǎng)36小時，產(chǎn)生具有葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆；2)接種單個克隆于液體LB培養(yǎng)基(含50mg/L氨芐青霉素)中培養(yǎng)；3)離心收集菌體，并懸于磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至終濃度分別為250μM和5mM。然后用超聲波裂解細菌細胞；4)離心并收集上清液；5)上清液經(jīng)80℃熱處理10分鐘后，離心并進一步收集上清液。上清液即為部分純化的葡萄糖異構(gòu)酶。
在本發(fā)明制備耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的方法中，所述的載體可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，包括但不限于原核表達載體pGEMT-Easy，pRSET和pET21。在生產(chǎn)本發(fā)明提供的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶時，可以將耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶基因序列與表達調(diào)控序列相連，進而形成耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶表達載體。表達載體含有復(fù)制起始點和表達調(diào)控序列、啟動子、或/和增強子、或/和必要的加工信息位點、或/和信號肽編碼序列。表達載體還必須含有可供選擇的標記基因，如氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。這些表達載體可以用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)制備，可參考Sambrook，et al.，MolecularcloningA laboratory manual.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
在本發(fā)明制備葡萄糖異構(gòu)酶的方法中，所述的葡萄糖異構(gòu)酶可以在原核細胞(如HB101、BL21、DH5α)或真核細胞(如釀酒酵母、畢赤巴斯德酵母)內(nèi)表達，也可采用本領(lǐng)域已知的任何其它適當方法實現(xiàn)在原核細胞或真核細胞外表達。
本發(fā)明獲得的耐高溫的葡萄糖異構(gòu)酶可用于生產(chǎn)果糖含量高于50％的果葡糖漿，或直接用于生產(chǎn)果糖含量為55％(即F55)的果葡糖漿。
附圖表說明 下列附圖表用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F之二級結(jié)構(gòu)。
圖2親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F之模擬三級結(jié)構(gòu)。
圖3葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖4親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體的比活性。
圖5葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1于80℃下制備果葡糖漿。
圖6親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1在80℃的熱穩(wěn)定。
圖7 pH對親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體MCROGI1的影響。
表1親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體擴增反應(yīng)之引物。
具體實施例方式
下列實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。實施實施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。
實施例1親本基因(TS-F)的擴增及其載體的構(gòu)建根據(jù)基因庫(L09699)基因序列設(shè)計引物TF和TR(見表1)。利用引物對TF和TR從T.saccharolyticum中擴增葡萄糖異構(gòu)酶編碼親本基因(TS-F)。
擴增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM引物TR，1.5UPfu(Promega，USA)DNA聚合酶，用接種環(huán)挑取少許T.saccharolyticum菌體，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。
PCR擴增反應(yīng)程序為95℃ 3分鐘，40圈循環(huán)95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 10分鐘。擴增的基因連接至載體pGEMT-Easy(Promega，USA)上，得質(zhì)粒pGMT-TS-F。利用快速質(zhì)粒制備試劑盒(Marligen Bioscience，USA)提取質(zhì)粒pGMT-TS-F，經(jīng)DNA測序確定TS-F葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列為序列表SEQ.ID NO.1，相應(yīng)的氨基酸序列為序列表SEQ.ID NO.2。
實施例2葡萄糖異構(gòu)酶二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)分析利用PSIPRED軟件獲得親本基因編碼的葡萄糖異構(gòu)酶之二級結(jié)構(gòu)(參見McGufGIn L.J.etal.，Bioinformatics 2000，16404-405)。葡萄糖異構(gòu)酶二級結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖1。利用SWISS-PROT軟件分析獲得親本基因編碼的葡萄糖異構(gòu)酶之模擬三級結(jié)構(gòu)(參見Reutrakul S.etal.，The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2001，86(10)5039-5044)。葡萄糖異構(gòu)酶之模擬三級結(jié)構(gòu)見圖2。利用BLAST軟件(見網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)將親本葡萄糖異構(gòu)酶基因與基因庫中其它葡萄糖異構(gòu)酶基因(特別是來源于耐熱菌的葡萄糖異構(gòu)酶基因，如基因庫號A72225、P45687和P29441的GI基因)進行比較，獲得葡萄糖異構(gòu)酶基因的保守序列信息。再在親本GI二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，選擇位點Q59、R81、W139、R182、V186及T299四位點進行單個位點和多位點組合突變(見實施例3、4和5)。
實施例3葡萄糖異構(gòu)酶之多位點組合突變MACROGI1定點突變技術(shù)參考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)51-59一文之描述。以質(zhì)粒pGEMT-TS-F為模板，設(shè)計引物對81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、186TF和186TR、以及299QF和299QR(見表1)。引物TF和TR見實施例1。用引物對TF和81AR，擴增TFAR片段；引物對81AF和139FR，擴增AFFR片段；引物對139FF和182AR，擴增FFAR片段；引物對182AF和186TR，擴增AFTR片段；引物對186TF和299QR，擴增TFQR片段；引物對299QF和TR，擴增QFTR片段。擴增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM單個引物(來自一對引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，美國)，40ng pGMT-TS-F，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴增反應(yīng)程序為95℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用試劑盒QIAquickDNA(QIAGEN，德國)回收，分別得到TFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFTR片段、TFQR和QFTR片段。然后擴增全長基因。擴增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U PfuDNA聚合酶，40ng TFAR片段，40ng AFFR片段，40ng FFAR片段，40ng AFTR片段，40ng TFQR片段和40ng QFTR片段，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴增反應(yīng)程序為95℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用試劑盒QIAquick DNA回收，得到全長突變基因MACROGI1。將MACROGI1與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-MACROGI1。將質(zhì)粒pGEMT-MACROGI1轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌細胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆。從克隆中提取質(zhì)粒pGEMT-MACROGI1 DNA，經(jīng)DNA測序確定引入的點突變無誤。MACROGI1序列見序列表SEQ.ID NO.3-4。
實施例4葡萄糖異構(gòu)酶之多位點組合突變MACROGI2定點突變技術(shù)參考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)51-59一文之描述。以質(zhì)粒pGEMT-TS-F為模板，設(shè)計引物對59PF和59PR、81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、以及299QF和299QR(見表1)。引物TF和TR見實施例1。用引物對TF和59PR，擴增TFPR片段；用引物對59PF和81AR，擴增PFAR片段；引物對81AF和139FR，擴增AFFR片段；引物對139FF和182AR，擴增FFAR片段；引物對182AF和299QR，擴增AFQR片段；引物對299QF和TR，擴增QFTR片段。諸片段的擴增反應(yīng)條件皆為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM單個引物(來自一對引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ngpGMT-TS-F，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴增反應(yīng)程序為95℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用試劑盒QIAquick DNA回收，分別得到TFPR片段、PFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFQR和QFTR片段。然后擴增全長基因。擴增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mMdNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFPR片段，40ngPFAR片段，40ng AFFR片段，40ng FFAR片段，40ng AFQR片段和40ng QFTR片段，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴增反應(yīng)程序為95℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用QIAquick DNA回收，得到全長突變基因MACROGI2。將MACROGI2與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-MACROGI2。將質(zhì)粒pGEMT-MACROGI2轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌細胞HB101，在1％MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆。從克隆中提取質(zhì)粒pGEMT-MACROGI2 DNA，經(jīng)DNA測序確定引入的點突變無誤。MACROGI2序列見序列表SEQ.ID NO.5-6。
實施例5葡萄糖異構(gòu)酶之單一位點突變定點突變技術(shù)參考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)51-59一文之描述。以質(zhì)粒pGEMT-MACROGI2(參見實施例4)為模板，設(shè)計引物對139CF和139CR(見表1)，將MACROGI2氨基酸序列中第139位點的Phe(F)突變?yōu)镃ys(C)，獲得突變體GI-F139C。引物TF和TR見實施例1。利用引物對TF和139CR，擴增TFCR片段；引物對139CF和TR，擴增CFTR片段。擴增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM單個引物(來自一對引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng pGEMT-MACROGI2，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴增反應(yīng)程序為95℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用QIAquick DNA回收，得到TFCR片段和CFTR片段。然后擴增全長基因。擴增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFCR與40ng CFTR，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴增反應(yīng)程序為95℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用QIAquick DNA回收，得到全長突變基因GI-F139C。將GI-F139C與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-GI-F139C。將質(zhì)粒pGEMT-GI-F139C轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌細胞HB101，在1％MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆。從克隆中提取質(zhì)粒pGEMT-GI-F139C DNA，經(jīng)DNA測序確定引入的點突變無誤。GI-F139C序列見序列表SEQ.ID NO.7-8。
按照類似步驟，以質(zhì)粒pGEMT-MACROGI2(參見實施例4)為模板，設(shè)計引物對182SF和182SR(見表1)，將MACROGI1氨基酸序列中第182位點的Ala(A)突變?yōu)镾er(S)，構(gòu)建突變體GI-A182S，將突變體與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-GI-A182S。GI-A182S序列見序列表SEQ.ID NO.9-10。
實施例6葡萄糖異構(gòu)酶TS-F的提取與純化葡萄糖異構(gòu)酶的提取與純化主要參考Lee Y.E.etal.，Journal of GeneralMicrobiology.1993，1391227-1234。
將含親本葡萄糖異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒pGEMT-TS-F轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌細胞HB101，在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上，37℃選擇培養(yǎng)36小時。接種單個克隆在5ml LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L氨芐青霉素)中培養(yǎng)16小時。離心收集菌體，并懸浮于1ml 20mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至終濃度分別為250μM和5mM。然后用超聲波裂解細菌細胞。離心(10℃，15,000g，15分鐘)并收集上清液。上清液經(jīng)80℃熱處理10分鐘后，離心(10℃，15,000g，15分鐘)并收集上清液。上清液即為部分純化的葡萄糖異構(gòu)酶，可用于酶活性的測定和精液果糖含量測定。
實施例7葡萄糖異構(gòu)酶突變體的提取與純化葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1的提取與純化與實施例6同，只是所用質(zhì)粒為pGEMT-MACROGI1。純化的葡萄糖異構(gòu)酶見圖3。其它葡萄糖異構(gòu)酶突變體也照此所述提取與純化。
實施例8親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F活性的測定取10μl按實施例6制備的葡萄糖異構(gòu)酶，加入至90μl 1.0M的果糖和20mM磷酸鈉緩沖溶液中(pH 6.5)，并含CoCl2和MgCl2終濃度分別為250μM和5mM，反應(yīng)于80℃進行10分鐘。將反應(yīng)物置冰上以終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法測定，測定方法參見Trinder，P.Ann.Clin.Biochem.1981，1864-67，以及上海科華-東菱診斷用品有限公司的葡萄糖試劑盒使用說明書。用CoomassiePlus Protein AssayReagent Kit(PIERCE，USA)測定酶蛋白濃度。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉(zhuǎn)化一微摩爾果糖為葡萄糖所需的酶量。圖4顯示親本TS-F葡萄糖異構(gòu)酶之比活性。
實施例9葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1活性測定葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1活性測定與實施例8同。其它葡萄糖異構(gòu)酶突變體的活性也照此所述測定。圖4顯示葡萄糖異構(gòu)酶突變體突變體與親本TS-F葡萄糖異構(gòu)酶比活性之差異。
實例10用葡萄糖異構(gòu)酶突變體制備直接F55果葡糖漿取按實例7步驟獲得的部分純化的葡萄糖異構(gòu)酶MACROGI1酶液20μg，加入至6ml50％(W/V)葡萄糖，并含20mM磷酸鈉緩沖溶液中(pH 6.5)，并加入CoCl2和MgCl2至終濃度分別為250μM和5mM。80℃反應(yīng)24小時后，加入100μl 20％三氯醋酸終止反應(yīng)，離心(10℃，15,000g，15分鐘)并收集上清液。取10μl上清液稀釋100倍后，用國標法測定產(chǎn)生的果糖含量(參考中華人民共和國國家標準GB 8274-87)。圖5顯示葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化至果糖之轉(zhuǎn)化率。
實例11親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F熱穩(wěn)定性測定取按實例6獲得的部分純化的葡萄糖異構(gòu)酶TS-F轉(zhuǎn)入7只1.5ml離心管中。每只離心管分別加入200μl酶液，并加入200μl礦物油，將離心管置于80℃水浴中，0小時、2小時、4小時、小時、16小時、32小時、72小時后分別取出一管酶液，離心(10℃，15,000g，20分鐘)后，取上清液，按實例8測定葡萄糖異構(gòu)酶殘余蛋白和殘余比活性。圖6顯示親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F在80℃的熱穩(wěn)定。
實例12葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1熱穩(wěn)定性測定葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1熱穩(wěn)定性測定與實例11同。圖6顯示葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1在80℃的熱穩(wěn)定。
實例13pH對親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F的影響取按實例6收集的菌體，分別懸浮于1ml pH4.5醋酸鈉緩沖溶液(20mM)、或1ml pH5.0醋酸鈉緩沖溶液(20mM)、或1ml pH 5.5醋酸鈉緩沖溶液(20mM)中，或1ml pH6.0磷酸鈉緩沖溶液(20mM)、1ml pH 6.5磷酸鈉緩沖溶液(20mM)、1ml pH 7.0磷酸鈉緩沖溶液(20mM)或1ml pH 7.5磷酸鈉緩沖溶液(20mM)中，加CoCl2和MgCl2至終濃度為250μM，加MgCl2至終濃度為5mM。然后用超聲波裂解細菌細胞。離心(10℃，15,000g，15分鐘)收集上清液。上清液經(jīng)80℃熱處理10分鐘后，離心(10℃，15,000g，15分鐘)并收集上清液，上清液即為部分純化的葡萄糖異構(gòu)酶，按實例8測定葡萄糖異構(gòu)酶活性。圖7顯示pH對親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F的影響。
實例14pH對葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1的影響pH對葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1的影響的測定與實例13同。圖7顯示pH對葡萄糖異構(gòu)酶突變體MACROGI1的影響。
本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制，本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)做各種改變，這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
表1親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體PCR擴增反應(yīng)之引物

序列表序列(SEQ.ID NO.)1(a)序列特征*長度1320堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 cgaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtggggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggccgcgaaa actacgtatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatacaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac
1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)2(a)序列特征*長度440個氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
mnkyfenvsk ikyegpksnn pysfkfynpe evidgktmee hlrfsiaywh tftadgtdqfgkatmqrpwn hytdpmdiak rrveaafeff dkinapffcf hdrdiapegd tlretnknldtivamikdyl ktsktkvlwg tanlfsnprf vhgastscna dvfaysaaqv kkaleitkelgrenyvfwgg regyetllnt dmeleldnfa rflhmavdya keigfegqfl iepkpkeptkhqydfdvanv laflrkydld kyfkvniean hatlafhdfq helryaring vlgsidantgdmllgwdtdq fptdirmttl amyevikmgg fdkgglnfda kvrrasfepe dlflghiagmdafakgfkva yklvkdgvfd kfieeryasy kegigadivs gkadfkslek yalehsqivnksgrqelles ilnqylfae序列(SEQ.ID NO.)3(a)序列特征*長度1320堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否
(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggcgcggaaa actacacatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)4(a)序列特征*長度440個氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否
(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDQFGKATMQRPWNHYTDPMDIAKARVEAAFEFFDKINAPFFCFHDRDIAPEGDTLRETNKNLDTIVAMIKDYLKTSKTKVLFGTANLFSNPRFVHGASTSCNADVFAYSAAQVKKALEITKELGAENYTFWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVANVLAFLRKYDLDKYFKVNIEANHATLAFHDFQHELRYARINGVLGSIDANQGDMLLGWDTDQFPTDIRMTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDAFAKGFKVAYKLVKDGVFDKFIEERYASYKEGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQYLFAE*序列(SEQ.ID NO.)5(a)序列特征*長度1320堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatccgttt181 ggtaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggggcggaaa actacgtgtt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca
601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)6(a)序列特征*長度440個氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDPFGKATMQRPWNHYTDPMDIAKARVEAAFEFFDKINAPFFCFHDRDIAPEGDTLRETNKNLDTIVAMIKDYLKTSKTKVLFGTANLFSNPRFVHGASTSCNADVFAYSAAQVKKALEITKELGAENYVFWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVANVLAFLRKYDLDKYFKVNIEANHATLAFHDFQHELRYARINGVLGSIDANQGDMLLGWDTDQFPTDIRMTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDAFAKGFKVAYKLVKDGVFDKFIEERYASYKEGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQYLFAE*
序列(SEQ.ID NO.)7(a)序列特征*長度1320堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatccgttt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtgtggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggcgcggaaa actacgtgtt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa
序列(SEQ.ID NO.)8(a)序列特征*長度440個氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharalyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDPFGKATMQRPWNHYTDPMDIAKARVEAAFEFFDKINAPFFCFHDRDIAPEGDTLRETNKNLDTIVAMIKDYLKTSKTKVLCGTANLFSNPRFVHGASTSCNADVFAYSAAQVKKALEITKELGAENYVFWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVANVLAFLRKYDLDKYFKVNIEANHATLAFHDFQHELRYARINGVLGSIDANQGDMLLGWDTDQFPTDIRMTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDAFAKGFKVAYKLVKDGVFDKFIEERYASYKEGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQYLFAE*序列(SEQ.ID NO.)9(a)序列特征*長度1320堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatgtgttt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggcagcgaaa actacgtgtt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctAa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)10(a)序列特征*長度440個氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否(d)反義否
(e)最初來源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
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權(quán)利要求
1.一種果葡糖漿制備新方法，其特征在于該方法使用了一種耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶。
2.按照權(quán)利要求1項所述的制備方法，其特征還在于用權(quán)利要求1項所述的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶在高于70℃反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)化葡萄糖至果糖，直接生產(chǎn)果糖含量≥50％的果葡糖漿。
3.按照權(quán)利要求2項所述的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶，其特征在于耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶以液相或固相形式起作用。
4.按照權(quán)利要求1項所述的制備方法，其特征還在于用含有權(quán)利要求1項所述的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶之固相化細菌或真菌細胞在高于70℃反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)化葡萄糖至果糖，直接生產(chǎn)果糖含量≥50％的果葡糖漿。
5.一種分離的DNA分子，其特征在于它是編碼權(quán)利要求1項所述的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求5項所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.3的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有與SEQ.ID NO.3的核苷酸序列≥75％的同源性)，所述的突變包括缺失、無義、插入、錯義。
7.權(quán)利要求6項所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.IDNO.4中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有與SEQ.ID NO.4的核苷酸序列≥90％的同源性)，該修飾形式功能上相當或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
8.權(quán)利要求5項所述的DNA分子，其特征還在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.5的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有與SEQ.ID NO.5的核苷酸序列≥75％的同源性)，所述的突變包括缺失、無義、插入、錯義。
9.權(quán)利要求8項所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.IDNO.6中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有與SEQ.ID NO.6的核苷酸序列≥90％的同源性)，該修飾形式功能上相當或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
10.權(quán)利要求5項所述的DNA分子，其特征還在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.7的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有與SEQ.ID NO.7的核苷酸序列≥75％同源性)，所述的突變包括缺失、無義、插入、錯義。
11.權(quán)利要求10項所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.ID NO.8中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有與SEQ.ID NO.8的核苷酸序列≥90％同源性)，該修飾形式功能上相當或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
12.權(quán)利要求5項所述的DNA分子，其特征還在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有與SEQ.ID NO.9的核苷酸序列≥75％的同源性)，所述的突變包括缺失、無義、插入、錯義。
13.權(quán)利要求12項所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.ID NO.10中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有與SEQ.ID NO.10的核苷酸序列≥90％的同源性)，該修飾形式功能上相當或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
14.權(quán)利要求1項所述的葡萄糖異構(gòu)酶是未經(jīng)純化的粗酶。
15.權(quán)利要求1項所述的葡萄糖異構(gòu)酶是部分純化或完全純化的酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種果葡糖漿制備新方法。本發(fā)明還公開了一系列葡萄糖異構(gòu)酶突變體的氨基酸序列及編碼這些酶的核苷酸序列，以及獲得這些葡萄糖異構(gòu)酶突變體的基因與蛋白工程技術(shù)及制備方法。利用本發(fā)明之葡萄糖異構(gòu)酶突變體及果葡糖漿制備方法可以直接在70℃以上的高溫反應(yīng)條件下生產(chǎn)果糖含量≥50％的高果糖漿。
文檔編號C12P19/02GK1693473SQ20041003744
公開日2005年11月9日 申請日期2004年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月8日
發(fā)明者傅榮昭, 張琦, 劉喜元, 孫振元 申請人:張駿