專利名稱：反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及使用反膠團(tuán)萃取技術(shù)直接從發(fā)酵液中分離純化納豆激酶的方法。
背景技術(shù)：
納豆是日本的一種傳統(tǒng)性食品，迄今已有2000年的歷史。1987年日本學(xué)者SumiH(Experimentia，1987，43，1110-1111)從日本傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品納豆(natto)中發(fā)現(xiàn)了一種具有高效溶栓活性的酶，并將其命名為納豆激酶(nattokinase，簡(jiǎn)稱NK)。相關(guān)科學(xué)研究表明，納豆激酶具有高效的溶栓能力，安全性好，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，生產(chǎn)成本低，作為新一代溶栓藥物，納豆激酶具有極為誘人的市場(chǎng)前景。
目前，納豆激酶的分離純化工藝常采用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法，如有機(jī)溶劑沉淀、鹽析、離心、凝膠色譜、疏水色譜、離子交換色譜等純化等方法。如付利等(生物工程進(jìn)展，1995，15(5)46-49)采用過(guò)濾、離心、鹽析對(duì)納豆激酶的粗酶液提取后，用Sephadex G-100、Sephadex G-200柱層析進(jìn)一步分離純化，最終得到的單一吸收峰經(jīng)滲析后，冷凍干燥，制成納豆激酶干粉。Nakaniski K等(UnitedStates Patent5750650，1998)從發(fā)酵液中提取納豆激酶時(shí)，采用無(wú)水乙醇沉淀、Butyl Sepharose柱層析、脫鹽濃縮后過(guò)陰離子交換柱(Mono-Q)，洗脫液再上疏水層析柱(AlkylSepharose)得到了收率為22.0％的純納豆激酶。專利(02116667.6)和專利(申請(qǐng)?zhí)?0107589.6)采用的也是傳統(tǒng)的納豆激酶分離純化方法。傳統(tǒng)的納豆激酶分離純化工藝具有步驟多，周期長(zhǎng)，酶活力回收率低等缺點(diǎn)。
反膠團(tuán)是表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成的微米級(jí)聚集體，其中的微水相能溶解蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)。通過(guò)控制萃取過(guò)程的有關(guān)工藝條件，可以選擇性地萃取目標(biāo)蛋白質(zhì)。同傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離純化手段相比，它具有酶活回收率高，可連續(xù)操作、處理量大、分離步驟少、易于放大、高選擇性、低成本的特點(diǎn)。
專利(申請(qǐng)?zhí)?2121352.6)公開(kāi)了納豆激酶的生產(chǎn)菌種及將納豆激酶用于制備血栓溶解性保健食品和食品添加劑；專利(申請(qǐng)?zhí)?0107589.6)公開(kāi)了納豆激酶的生產(chǎn)方法，并制成膠囊、保健食品及保健食品添加劑、醫(yī)用注射針劑；專利(申請(qǐng)?zhí)?2109538.8)公開(kāi)了納豆激酶的純化和凍干粉針的生產(chǎn)工藝；專利(申請(qǐng)?zhí)?9119166.8)利用基因工程的方法，表達(dá)出具有纖溶活性的納豆激酶；專利(02116667.6)利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶。到目前為止，還沒(méi)有有關(guān)采用反膠團(tuán)分離純化納豆激酶的報(bào)道或?qū)＠?

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于解決納豆激酶純化工藝復(fù)雜、步驟繁多的問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)單、易于放大、便于連續(xù)化運(yùn)行的反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法，為直接從固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵制得的納豆激酶粗提液中萃取純化納豆激酶，包括萃取步驟和反萃取步驟；1)所述的萃取步驟為1.1)配制反膠團(tuán)溶液所述反膠團(tuán)溶液的組分包括表面活性劑、助溶劑、有機(jī)溶劑和水，其重量份配比為表面活性劑∶助溶劑∶有機(jī)溶劑∶水＝(20-100)∶(0-200)∶(800-912)∶(0-2)；所述表面活性劑為陽(yáng)離子型、陰離子型和非離子型表面活性劑中的一種或兩種；所述助溶劑為丁醇、戊醇、己醇或庚醇；所述有機(jī)溶劑為戊烷、正己烷、環(huán)己烷、辛烷、異辛烷、庚烷和石油醚中的一種或兩種或多種；其配制步驟為按上述比例稱取各組分并均勻混合，震蕩后靜置，至完全溶解，制得所述反膠團(tuán)溶液；1.2)將固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵制得的納豆激酶粗提液的pH值調(diào)到4.5-8.0；離子強(qiáng)度調(diào)到0.1-0.2M；1.3)萃取納豆激酶粗提液，使納豆激酶進(jìn)入反膠團(tuán)溶液中得到攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液將上述步驟1.2)的納豆激酶粗提液作為水相與步驟1.1)配制反膠團(tuán)溶液混合，其混合的體積比為反膠團(tuán)溶液的體積∶納豆激酶粗提液的體積＝1∶1-1∶50，混合時(shí)間為1-10分鐘，萃取操作溫度為10-35℃；納豆激酶進(jìn)入反膠團(tuán)溶液，得到攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液；2)對(duì)得到的攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液進(jìn)行反萃取，使納豆激酶從反膠團(tuán)溶液中進(jìn)入反萃水相2.1)配制反萃水相，所述反萃水相組分包括反萃助劑、緩沖劑、鹽和水，其重量份配比為反萃助劑∶緩沖劑∶鹽∶水＝(4-30)∶(0.5-10)∶(5-12)∶(48-98)所述反萃助劑為乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇；所述緩沖劑為磷酸鹽、TRIS-HCl或甘氨酸-氫氧化鈉；所述鹽為氯化鉀或溴化鉀；2.1)將步驟1)得到的攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液同反萃水相混合，其體積比為攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液的體積∶反萃水相的體積＝1∶1-50∶1，混合時(shí)間為1-30分鐘，并在20-45℃溫度下離心，分離得到純化后的納豆激酶水溶液。
所述的陽(yáng)離子表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨、三辛基甲基氯化銨或Aliquat336；所述的陰離子表面活性劑為二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉；所述的非離子表面活性劑為Span60、Tween80或Tween85。
本發(fā)明中所述的納豆激酶粗提液可采用固體發(fā)酵法制得采用水發(fā)大豆、豆餅粉、豆渣、脫脂大豆粉作為發(fā)酵原料.將原料蒸煮(50-150℃，5min-3hr)冷卻、接種芽孢桿菌、發(fā)酵(20-45℃，相對(duì)濕度控制80-95％，發(fā)酵周期18-64hr)。發(fā)酵結(jié)束后，利用氯化鈉水溶液浸提，得到鈉豆激酶粗提液。
本發(fā)明所述的納豆激酶粗提液也可采用液體發(fā)酵法配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其中含有氮源，含量為0.5-50％，氮源可以是豆乳、豆餅及其水解物、豆渣及其水解物、大豆蛋白水解物、牛肉膏、玉米漿、酵母浸膏中的一種或幾種；含有碳原，含量為1-10％，碳原可以是淀粉糖漿、葡萄糖、木糖、甘油、麥芽糖、廢糖蜜中的一種或幾種；含有無(wú)機(jī)鹽類物質(zhì)，含量為0.02-2％，無(wú)機(jī)鹽可以是氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸錳中的一種或幾種。發(fā)酵溫度為25-45℃，發(fā)酵pH控制為6.8-7.0，發(fā)酵周期為18-72hr.液體發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)離心或過(guò)濾除去菌體，得到納豆激酶粗提液。
本發(fā)明提供的反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法具有如下特點(diǎn)本發(fā)明采用由表面活性劑和有機(jī)溶劑構(gòu)成的反膠團(tuán)溶液直接從發(fā)酵液中分離純化納豆激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)水相pH、離子強(qiáng)度、相比、兩相接觸時(shí)間等萃取工藝條件，可實(shí)現(xiàn)納豆激酶的高效萃取和反萃，酶活回收率達(dá)到80％以上，純化因子達(dá)到3以上。該方法具有操作時(shí)間短，易于放大，易于連續(xù)化，自動(dòng)操作，成本低，酶活回收率高，純化及濃縮可同時(shí)完成。


附圖1陰離子反膠團(tuán)納豆激酶萃取效果圖。
附圖2陽(yáng)離子反膠團(tuán)納豆激酶萃取效果圖。
其中-▲-為蛋白質(zhì)回收率隨反萃時(shí)間的變化曲線；-●-純化因子隨反萃時(shí)間的變化曲線；-■-酶活力隨反萃時(shí)間的變化曲線； 為蛋白質(zhì)回收率曲線； 為反萃率的變化曲線； 為納豆激酶酶活力回收率曲線；具體實(shí)施方式
實(shí)施例11.從液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)生的發(fā)酵液中分離純化納豆激酶以Bacilliis natto NLSSe(中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?2121352.6)為菌種，首先進(jìn)行種子培養(yǎng)，取一支甘油芽孢菌種接種于裝有20ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，37℃、170rpm搖床培養(yǎng)12小時(shí)后(OD660nm約為7-8)，0-4℃冷藏，備用。液體種子可保存一周。
然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)100ml三角瓶、裝液量為20ml、接種量為5％、37℃、170rpm搖床培養(yǎng)48小時(shí)后，5000rpm、10min離心，上清液測(cè)酶活力后，冷凍保存，保存時(shí)間不長(zhǎng)于9天。
本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由AOT/辛烷構(gòu)成，其重量份配比為AOT∶辛烷＝20∶878；按上述比例分別稱取AOT和辛烷，混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。調(diào)解發(fā)酵液的pH＝6.5；以2M氯化鈉調(diào)解發(fā)酵液的離子強(qiáng)度到0.1M。發(fā)酵液和反膠團(tuán)溶液以1∶1相比加入到三角瓶中，兩相在搖床上以240rpm的速度振蕩8min，溫度控制在20℃。將混合液以4000rpm的速度離心5min，獲得清晰分相，得到負(fù)載納豆激酶的反膠團(tuán)溶液；反萃水相包括異丙醇、氯化鉀、磷酸鹽和水。其重量份配比為異丙醇、氯化鉀、磷酸鹽和水＝15∶5∶7∶73。按上述比例分別稱取異丙醇、氯化鉀、磷酸鹽和水，混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反萃水相。
負(fù)載納豆激酶的反膠團(tuán)溶液同反萃水相等體積混合，在搖床上35℃以240rpm的速度振蕩10min，然后將混合液中以4000rpm的速度離心5min，獲得分相，得到純化后的納豆激酶水溶液。
納豆激酶發(fā)酵液和反萃水相的蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，并據(jù)此計(jì)算蛋白質(zhì)回收率；纖維蛋白水解法測(cè)定納豆激酶的活力，并據(jù)此計(jì)算酶活力的回收率；純化因子等于反萃水相的比酶活力同發(fā)酵液的比酶活力的比值。其結(jié)果見(jiàn)附圖1。圖1中，萃取效果很好，酶活力回收率最高可以達(dá)到80％，純化因子可以達(dá)到2.7左右。
實(shí)施例2大豆用三倍的水量浸泡一晝夜(室溫15℃)，然后進(jìn)行高壓蒸煮，121℃，15分鐘，冷卻后按3％的接種量接種，40℃下發(fā)酵24小時(shí)，制得納豆。納豆用兩倍量的生理鹽水浸泡提取納豆激酶，得納豆激酶粗提液。
本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由AOT和異辛烷構(gòu)成，其重量份配比為AOT∶異辛烷＝100∶800。按上述比例分別稱取AOT和異辛烷，混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。調(diào)解發(fā)酵液的pH＝6；以2M氯化鈉調(diào)解發(fā)酵液的離子強(qiáng)度到0.2M。發(fā)酵液和反膠團(tuán)溶液以1∶1相比加入到三角瓶中，兩相在搖床上以240rpm的速度振蕩8min，溫度控制在10℃。將混合液以4000rpm的速度離心5min，獲得清晰分相，得到負(fù)載納豆激酶的反膠團(tuán)溶液；反萃水相包括異丙醇、氯化鉀、Tris-HCl和水。其重量份配比為異丙醇、氯化鉀、Tris-HCl和水＝30∶4∶8∶483。按上述比例分別稱取異丙醇、氯化鉀、磷酸鹽和水，混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反萃水相。
負(fù)載納豆激酶的反膠團(tuán)溶液同反萃水相等體積混合，在搖床上35℃以240rpm的速度振蕩10min，然后將混合液中以4000rpm的速度離心5min，獲得分相，得到純化后的納豆激酶水溶液。酶活力回收率達(dá)到80％，純化因子可以達(dá)到2.7左右。
實(shí)施例3納豆激酶粗提液的制備方法如實(shí)施例1。本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由十六烷基三甲基溴化銨、正己醇和正己烷和水組成，其重量份配比為100∶100∶800∶0.5?；旌暇鶆?，靜置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。調(diào)解發(fā)酵液的pH＝4.5；以2M氯化鈉調(diào)解發(fā)酵液的離子強(qiáng)度0.2M。反膠團(tuán)溶液和發(fā)酵液以1∶25相比加入到三角瓶中，兩相在搖床上以240rpm的速度振蕩5min，溫度控制在20℃；將混合液以4000rpm的速度離心5min，獲得清晰分相，得到負(fù)載納豆激酶的反膠團(tuán)溶液；反萃水相包括異丙醇、溴化鉀、甘氨酸-氫氧化鈉和水。其重量份配比為異丙醇∶氯化鉀∶甘氨酸-氫氧化鈉∶水＝15∶5∶7∶73。按上述比例分別稱取異丙醇、溴化鉀、甘氨酸-氫氧化鈉和水，混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反萃水相，得到純化后的納豆激酶水溶液。
反萃水相與負(fù)載納豆激酶的反膠團(tuán)溶液以1∶25混合，在搖床上35℃以240rpm的速度振蕩10min，然后將混合液中以4000rpm的速度離心5min，獲得分相.萃取效果見(jiàn)圖2。
實(shí)施例4納豆激酶粗提液的制備方法同實(shí)施例1. 本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由AOT、Tween80和辛烷構(gòu)成，其重量份配比為AOT∶Tween80∶辛烷＝20∶10∶868。按上述比例分別稱取AOT、Tween80和辛烷，混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。調(diào)解發(fā)酵液的pH＝8；以2M氯化鈉調(diào)解發(fā)酵液的離子強(qiáng)度到0.1M。反膠團(tuán)溶液和發(fā)酵液以1∶50相比加入到三角瓶中，兩相在搖床上以240rpm的速度振蕩8min，溫度控制在35℃。將混合液以4000rpm的速度離心5min，獲得清晰分相。
反萃水相包括異丙醇、氯化鉀、磷酸鹽和水。其重量份配比為異丙醇、氯化鉀、磷酸鹽和水＝4∶5∶7∶73。按上述比例分別稱取異丙醇、氯化鉀、磷酸鹽和水，混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反萃水相。
負(fù)載納豆激酶的反膠團(tuán)溶液同反萃水相等體積混合，在搖床上35℃以240rpm的速度振蕩10min，然后將混合液中以4000rpm的速度離心5min，獲得分相。
酶活力回收率可以達(dá)到75％，純化因子可以達(dá)到2.5左右。
實(shí)施例5納豆激酶粗提液的制備方法如實(shí)施例1。本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由表面活性劑(Aliquat336+span60)、戊醇和戊烷和水組成，其重量份配比表面活性劑(Aliquat336+span60)∶戊醇∶戊烷∶水＝(80+20)∶100∶800∶0.5?；旌暇鶆颍o置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。
其余同實(shí)施例3。酶活力回收率可以達(dá)到65％，純化因子可以達(dá)到2左右。
實(shí)施例6本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由AOT、石油醚構(gòu)成，其重量份配比為AOT∶石油醚＝88∶912?；旌暇鶆颍o置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。前萃取混合時(shí)間為1min，溫度為15℃.反萃取混合時(shí)間為30min，溫度為10℃.其余同實(shí)施例2。酶活力回收率可以達(dá)到45％，純化因子達(dá)到2.0左右實(shí)施例7本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由三辛基甲基氯化銨、庚醇、石油醚構(gòu)成。其重量份配比為三辛基甲基氯化銨∶庚醇∶石油醚＝20∶200∶800∶0.5?；旌暇鶆?，靜置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。前萃取混合時(shí)間為10min，溫度為15℃.反萃取混合時(shí)間為1min，溫度為35℃；反萃水相的組成與實(shí)施例3相同，其重量份配比為異丙醇∶氯化鉀∶甘氨酸-氫氧化鈉∶水＝15∶10∶0.5∶98；酶活力回收率達(dá)到45％，純化因子達(dá)到3.0左右實(shí)施例8以丁醇替換實(shí)施例1反萃取水相中異丙醇。重量份比同實(shí)施例1。酶活力回收率可以達(dá)到85％，純化因子可以達(dá)到2.8左右。
實(shí)施例9本實(shí)施例中，反膠團(tuán)溶液由Aliquat336、庚醇、石油醚、異辛烷、水構(gòu)成。其重量份配比為Aliquat336∶庚醇∶石油醚∶異辛烷∶水＝20∶200∶300∶500∶2。混合均勻，靜置，直到完全溶解，得反膠團(tuán)溶液。前萃取混合時(shí)間為10min，溫度為15℃.反萃取混合時(shí)間為1min，溫度為35℃.其余同實(shí)施例3。酶活力回收率達(dá)到45％，純化因子達(dá)到3.0左右實(shí)施例10以丙醇替換實(shí)施例1反萃取水相中異丙醇。重量份比同實(shí)施例1。酶活力回收率達(dá)到85％，純化因子達(dá)到2.8左右。
權(quán)利要求
1.一種反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法，為直接從固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵制得的納豆激酶粗提液中萃取純化納豆激酶，包括萃取步驟和反萃取步驟；1)所述的萃取步驟為1.1)配制反膠團(tuán)溶液所述反膠團(tuán)溶液的組分包括表面活性劑、助溶劑、有機(jī)溶劑和水，其重量份配比為表面活性劑∶助溶劑∶有機(jī)溶劑∶水＝20-100∶0-200∶800-912∶0-2；所述表面活性劑為陽(yáng)離子型、陰離子型和非離子型表面活性劑中的一種或兩種；所述助溶劑為丁醇、戊醇、己醇或庚醇；所述有機(jī)溶劑為戊烷、正己烷、環(huán)己烷、辛烷、異辛烷、庚烷和石油醚中的一種或兩種或多種；其配制步驟為按上述比例稱取各組分并均勻混合，震蕩后靜置，至完全溶解，混合均勻，制得所述反膠團(tuán)溶液；1.2)將固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵制得的納豆激酶粗提液的pH值調(diào)到4.5-8.0；離子強(qiáng)度調(diào)到0.1-0.2M；1.3)萃取納豆激酶粗提液，使納豆激酶進(jìn)入反膠團(tuán)溶液中得到攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液將上述步驟1.2)的納豆激酶粗提液作為水相與步驟1.1)配制反膠團(tuán)溶液混合，其混合的體積比為反膠團(tuán)溶液的體積∶納豆激酶粗提液的體積＝1∶1-1∶50，混合時(shí)間為1-10分鐘，萃取操作溫度為10-35℃；納豆激酶進(jìn)入反膠團(tuán)溶液，得到攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液；2)對(duì)得到的攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液進(jìn)行反萃取，使納豆激酶從反膠團(tuán)溶液中進(jìn)入反萃水相2.1)配制反萃水相，所述反萃水相組分包括反萃助劑、緩沖劑、鹽和水，其重量份配比為反萃助劑∶緩沖劑∶鹽∶水＝4-30∶0.5-10∶5-12∶48-98；所述反萃助劑為乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇；所述緩沖劑為磷酸鹽、TRIS-HCl或甘氨酸-氫氧化鈉；所述鹽為氯化鉀或溴化鉀；2.1)將步驟1)得到的攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液同反萃水相混合，其體積比為攜帶有納豆激酶的反膠團(tuán)溶液的體積反萃水相的體積＝1∶1-50∶1，混合時(shí)間為1-30分鐘，并在20-45℃溫度下離心，分離得到純化后的納豆激酶水溶液。
2.按權(quán)利要求1所述的反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法，其特征在于，所述的陽(yáng)離子表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨、三辛基甲基氯化銨或Aliquat336。
3.按權(quán)利要求1所述的反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法，其特征在于，所述的陰離子表面活性劑為二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉。
4.按權(quán)利要求1所述的反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法，其特征在于，所述的非離子表面活性劑為Span60、Tween80或Tween85。
全文摘要
本發(fā)明涉及的反膠團(tuán)法分離純化納豆激酶的方法，特別涉及一種新的直接從母液中為直接從固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵制得的納豆激酶粗提液中萃取純化納豆激酶，包括萃取步驟和反萃取步驟；所述的萃取步驟為納豆激酶粗提液作為水相與反膠團(tuán)溶液按比例混合，在10－35℃下進(jìn)入萃取，使納豆激酶進(jìn)入反膠團(tuán)溶液；再在反萃液中進(jìn)行反萃取，在20－45℃溫度下離心，分離得到純化后的納豆激酶水溶液?？山鉀Q目前納豆激酶純化工藝復(fù)雜、步驟多、周期長(zhǎng)的問(wèn)題；酶活回收率達(dá)到80％以上，純化因子達(dá)到3以上；并且同時(shí)具有濃縮和脫色作用；采用反膠團(tuán)技術(shù)分離純化納豆激酶周期短，便于連續(xù)操作，易于放大。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1690196SQ20041003739
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者劉俊果, 邢建民, 沈睿, 陽(yáng)承利, 劉會(huì)洲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所