專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種快速檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)食品質(zhì)量的方法，具體的說(shuō)，涉及一種快速檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來(lái)社會(huì)公共安全問(wèn)題的一個(gè)顯著特點(diǎn)。在食品污染所引發(fā)的腸道疾病中，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是引起食物中毒的常見(jiàn)腸道致病菌之一。有效控制食品污染擴(kuò)散，對(duì)食品質(zhì)量的監(jiān)督和檢測(cè)提出了更高的要求。如何快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中的病原菌，是控制食品安全事故發(fā)生的基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌仍采用傳統(tǒng)的方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，通常需要35天。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification，簡(jiǎn)稱(chēng)LAMP)是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。該技術(shù)在Ih內(nèi)能擴(kuò)增出IO9靶序列拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。LAMP技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明采用環(huán)媒恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)，建立了快速檢測(cè)不耐熱型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的方法，縮短了檢測(cè)時(shí)間(2-3小時(shí)完成)，提高了檢測(cè)的靈敏性，為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)食品是否發(fā)生病原菌污染，預(yù)防食品安全事故發(fā)生提供了可能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的試劑盒，其含有引物SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO1attacatttaagagcggcgc；2ggttcctagcattagacatgcttt；3gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；4gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc特異性擴(kuò)增來(lái)自產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的基因。所述產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的基因?yàn)榫幋a不耐熱腸毒素的基因，其基因序列如SEQIDNO5所示。進(jìn)一步的，所述試劑盒還含有Mg2+，更進(jìn)一步的，所述試劑盒還含有顯色劑。優(yōu)選的，所述顯色劑是綠色核酸凝膠染液(SYBRGreenI)鉬酸銨或硫酸銅。本發(fā)明的另一目的是提供一種快速檢測(cè)食品是否被產(chǎn)腸毒素大腸桿菌污染的方法，包括以下步驟1)提取待檢樣本中的DNA；2)用引物對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物如SEQIDNO:14所示；3)對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。其中，步驟2)的擴(kuò)增條件為，dNTPs濃度為0.6mM,Bst酶添加量為8U，擴(kuò)增溫度為55-65°C，擴(kuò)增反應(yīng)最短反應(yīng)時(shí)間為40min。步驟3)所述的檢測(cè)DNA擴(kuò)增結(jié)果的方法是觀察是否生成焦磷酸鎂沉淀或沉淀顯色。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供如SEQIDNO:14所示寡核苷酸序列的用途，其用于擴(kuò)增或檢測(cè)來(lái)自病原體產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的基因。本發(fā)明依據(jù)不耐熱腸毒素(LT)編碼基因的6個(gè)保守區(qū)，采用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)LAMP引物，優(yōu)化了dNTPs濃度、BstDNA聚合酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件，結(jié)果理想，并對(duì)該方法進(jìn)行了特異性、敏感性試驗(yàn)，初步探索了可實(shí)際應(yīng)用的試劑盒條件。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicΕ.coli，ETEC)的核苷酸序列總長(zhǎng)度約為70kb，主要有兩類(lèi)致病基因一類(lèi)為菌毛蛋白基因(或稱(chēng)粘著素、定居因子)，已知的粘著素有K88，K99，987P，CFA,PCFO166,F41等。另一類(lèi)為腸毒素基因，ETEC的主要毒力因子為耐熱性腸毒素(heat-stableenterotoxin,ST)禾口不耐熱性腸毒素(heat-labileenterotoxin,LT)，ST和LT是導(dǎo)致幼齡動(dòng)物腹瀉的直接致病因子。ETEC借助這些粘著素定居于宿主腸道粘膜的上皮細(xì)胞上，從而大量繁殖，產(chǎn)生大量腸毒素。LAMP技術(shù)的特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒溫條件(65°C左右)保溫四十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，直接擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度(或顏色反應(yīng))進(jìn)行判斷是否發(fā)生反應(yīng)。根據(jù)上述原理，發(fā)明人進(jìn)行了下述工作1、LAMP檢測(cè)方法的建立以本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增enterotoxigenicΕ.coli,ETEC特征基因片段。判斷是否存在特異性擴(kuò)增來(lái)確定ETEC的存在。2、LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化在不同的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、鎂離子濃度、dNTP濃度、Betaine濃度下擴(kuò)增。3、特異性試驗(yàn)以本發(fā)明建立的方法擴(kuò)增各產(chǎn)毒素大腸菌參考株及其它細(xì)菌，考察該方法的特異性。4、敏感性試驗(yàn)逐步降低樣品的菌液濃度，記錄特異性條帶亮度強(qiáng)弱，直至無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，以此研究該方法的靈敏性。5、判定LAMP結(jié)果陰陽(yáng)性方法探索1.由于LAMP反應(yīng)形成大量擴(kuò)增產(chǎn)物，可以直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑SYBRGreenI，無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈橙色，有擴(kuò)增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。2.LAMP檢測(cè)還可以通過(guò)評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來(lái)進(jìn)行。LAMP反應(yīng)中，在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀。它有極高的特異性，可以用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)反應(yīng)管中的沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。①鉬酸銨在冷時(shí)鉬酸銨與焦磷酸鹽溶液無(wú)沉淀發(fā)生；但在加熱時(shí)，則有黃色磷鉬酸銨沉淀生成。②硫酸銅硫酸銅與焦磷酸鹽生成灰藍(lán)色沉淀。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法可以快速方便地將被病原菌產(chǎn)腸毒素大腸桿菌污染的食品檢測(cè)出來(lái)，為食品生產(chǎn)和銷(xiāo)售提供了一種新的監(jiān)控方法。圖1產(chǎn)腸毒素大腸桿菌不耐熱腸毒素基因的特異性擴(kuò)增片段的電泳2限制性內(nèi)切酶酶切試驗(yàn)M為分子量標(biāo)記，泳道1-2分別為L(zhǎng)AMP產(chǎn)物擴(kuò)增片段的限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物與LAMP產(chǎn)物擴(kuò)增片段，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物被EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切后的DNA片段與預(yù)期片段大小一致(372bp，285bp，240bp，200bp)圖3特異性實(shí)驗(yàn)M為分子量標(biāo)記，N為無(wú)模版對(duì)照，泳道1-10分別為C83902產(chǎn)腸毒素大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、侵襲性大腸桿菌、普通變形桿菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、球形芽孢桿菌、八疊球菌、臘樣芽孢桿菌.只有C83902產(chǎn)腸毒素大腸桿菌DNA模版被擴(kuò)增，其余9種菌株均無(wú)LAMP擴(kuò)增。表明LAMP法對(duì)不耐熱腸毒素大腸桿菌的檢測(cè)特異性較好。圖4靈敏性實(shí)驗(yàn)隨著菌液濃度的降低，特異性條帶亮度逐漸變?nèi)?，至菌液稀?0_8時(shí)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。M-IOObp分子量標(biāo)記；泳道1:10_4；泳道2:10_5；泳道3:10_6；泳道4:10_7；泳道5:10_8；泳道6:10_9;ΝΤ:無(wú)模板對(duì)照具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)條件1、材料1.1主要菌株實(shí)驗(yàn)涉及的主要菌種權(quán)利要求一種檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的試劑盒，其特征是含有下列引物SEQIDNO1attacatttaagagcggcgc；SEQIDNO2ggttcctagcattagacatgcttt；SEQIDNO3gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；SEQIDNO4gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc可以特異性擴(kuò)增來(lái)自產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的基因?yàn)榫幋a不耐熱腸毒素的基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征是所述的不耐熱腸毒素基因序列如SEQIDNO5所示。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述試劑盒還含有Mg2+。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是含有顯色劑。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征是所述顯色劑是綠色核酸凝膠染液(SYBRGreenI)鉬酸銨或硫酸銅。7.一種快速檢測(cè)食品是否被產(chǎn)腸毒素大腸桿菌污染的方法，包括以下步驟1)提取待檢樣本中的DNA;2)用引物對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物如SEQIDNO:14所示；3)對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征是步驟2)的擴(kuò)增條件為，dNTPs濃度為0.6mM,Bst酶添加量為8U，擴(kuò)增溫度為55_65°C，擴(kuò)增反應(yīng)最短反應(yīng)時(shí)間為40min。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征是步驟3)所述的檢測(cè)DNA擴(kuò)增結(jié)果的方法是觀察是否生成焦磷酸鎂沉淀或沉淀顯色。10.如SEQIDNO:14所示寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于擴(kuò)增或檢測(cè)來(lái)自病原體產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的基因。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明試劑盒含有基因序列如SEQIDNO1～4所示的引物，可以特異性擴(kuò)增來(lái)自產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的基因。利用本發(fā)明的試劑盒可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)被產(chǎn)腸毒素大腸桿菌污染的食品，為食品生產(chǎn)和銷(xiāo)售監(jiān)督提供了一種簡(jiǎn)便可靠的方法。文檔編號(hào)G01N21/78GK101974616SQ20091021668公開(kāi)日2011年2月16日申請(qǐng)日期2009年12月10日優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日發(fā)明者萬(wàn)紅梅,代娟,何洋,李玉鋒申請(qǐng)人:西華大學(xué)