專利名稱：酶催化制備阿糖胞苷酯的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物催化與生物合成、生物醫(yī)藥以及材料領域，涉及一種在非水介質(zhì)中酶催化制備阿糖胞苷酯的方法。
背景技術：
阿糖胞苷是一類非天然核苷，屬于脫氧胞嘧啶核苷類似物，具有很高的抗白血病活性，是臨床上用于治療急性骨髓性白血病最有效的化療藥物之一。阿糖胞苷酯類衍生物是阿糖胞苷的前藥之一，其通過?；⑻前仗腔糠值牧u基而得。藥理學試驗結果表明，阿糖胞苷羧酸酯類衍生物比阿糖胞苷本身更適合于系統(tǒng)或者局部惡性腫瘤治療，尤其對于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的惡性腫瘤，療效更顯著。此外阿糖胞苷羧酸酯類衍生物在治療實體腫瘤中也表現(xiàn)出良好的活性，因此，其作為新型抗腫瘤藥物已引起了人們的廣泛關注。
目前阿糖胞苷羧酸酯類衍生物均采用化學法合成。其主要問題是糖環(huán)上羥基眾多，且反應活性相似，采用一般化學方法直接酯化時，區(qū)域選擇性很低，易產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，產(chǎn)物分離困難；為合成確定位置的?；a(chǎn)物，需要對糖環(huán)特定羥基進行保護和去保護等操作，反應步驟多、工藝復雜；采用堿性催化劑，易產(chǎn)生含堿廢液，對環(huán)境造成嚴重污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術工藝存在的問題，提供一種非水介質(zhì)中酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其選擇性高，產(chǎn)物結構易控，反應副產(chǎn)物少，產(chǎn)物阿糖胞苷酯純度高，從而克服傳統(tǒng)化學方法的選擇性低導致底物利用率低，產(chǎn)物純度低的缺點；本發(fā)明的非水介質(zhì)中酶催化制備阿糖胞苷酯的方法是采用非水介質(zhì)，以羧酸酯或者酸酐為?；w，利用酶催化阿糖胞苷進行?；磻?，合成得到阿糖胞苷酯。
本發(fā)明的方法更詳細地包括如下步驟(1)在反應器中依次加入阿糖胞苷、非水介質(zhì)、羧酸酯或者酸酐；(2)按酶用量為100～4000U/克阿糖胞苷的比例加入酶，在溫度為25～60℃、振蕩速度為100～250rpm/min、反應1～48小時，分離得到阿糖胞苷酯。
所述非水介質(zhì)包括有機溶劑體系或離子液含量為0～40％質(zhì)量的有機溶劑和離子液混和體系，用量為0.5～10L/克阿糖胞苷；所述羧酸酯或者酸酐與阿糖胞苷的摩爾比為1.1∶1～2.0×103∶1。
所述酶是脂肪酶、蛋白酶或酯酶。
脂肪酶來源于Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Rhizomucormiehei、Burkholderia acepacia、Pseudomonas fluorescens、Aspergillus niger、Mucor miehei、Porcine pancreas、或Human pancreas；蛋白酶來源于Aspergillusmelleus、Bacillus subilis、Bacillus lichemiformis；酯酶來源于Porcine liver。
5、根據(jù)權利要求3所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于所述羧酸酯中脂肪酸酯的碳鏈長度為C2～C24，含有0～6個雙鍵；芳香酯含有1個或1個以上苯環(huán)；酸酐的脂肪酸碳鏈長度為C3～C18。
所述有機溶劑包括烷烴類、醇類、酯類、醚類、酮類、含氮化合物溶劑中的一種或一種以上。
所述烴類指飽和烴、不飽和烴、芳烴類中的一種或一種以上；醇類指一元醇、多元醇中的一種或一種以上；醚類指脂肪族醚、芳醚、二噁烷、四氫呋喃中的一種或一種以上；酮類指脂肪族酮、芳酮中的一種或一種以上、含氮化合物溶劑指腈類、胺類、吡啶中的一種或一種以上。
第(2)步中，采用如下方法分離阿糖胞苷酯反應混合物經(jīng)過濾除酶后，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后以甲醇、乙醇有機溶劑和乙酸乙酯重結晶或者經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，即得阿糖胞苷酯。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比具有如下的優(yōu)點1.采用高效的生物催化劑酶來催化阿糖胞苷酯合成，酶催化反應具有高度選擇性，產(chǎn)物結構易控，反應副產(chǎn)物少，產(chǎn)物阿糖胞苷酯純度高，由于克服了傳統(tǒng)化學方法的選擇性低導致底物利用率低，產(chǎn)物純度低的缺點；2.無須基團保護和去保護，反應過程簡單易控，產(chǎn)物易分離；3.反應條件溫和、環(huán)境友好。
具體實施例方式
實施例1將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、0.194g(2.26×10-3mol)乙酸乙烯酯、10L吡啶的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入200U來源于Candida antarctica的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置于30℃、100rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇重結晶，即得0.527g(90％)阿糖胞苷5’-乙酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例2將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、918g(4.10mol)月桂酸乙烯酯、50mL吡啶的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入2000U來源于Candida antarctica的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置于40℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應12h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙酸乙酯和甲醇溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以乙酸乙酯重結晶，即得0.77g(88％)阿糖胞苷5’-月桂酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例3將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、197g(5.16×10-1mol)二十四碳酸甲酯、150mL N，N-二甲基甲酰胺的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入4000U來源于Candida antarctica的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置于60℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙酸乙酯和甲醇的混合液溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以乙酸乙酯重結晶，即得1.07g(88％)阿糖胞苷5’-二十四碳酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例4將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、44.3g(5.16×10-1mol)丙烯酸乙烯酯、5L吡啶和己烷的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入200U來源于Human pancreas的脂肪酶(250,000U/g)，常壓下置于60℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙酸乙酯溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以乙醇重結晶，即得0.528g(90％)阿糖胞苷5’-丙烯酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例5將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、1402g(4.10mol)4，7，10，，13，16，19-二十二烯酸甲酯、150mL吡啶和異丙醚的混合溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入4000U來源于Human pancreas的脂肪酶(250,000U/g)，常壓下置于60℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇重結晶，即得0.98g(87％)阿糖胞苷5’-二十二烯酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例6將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、282g(5.16×10-1mol)油酸酐、1L N，N-二甲基甲酰胺的反應液加入具塞三角瓶中，結合加入4000U來源于Mucor miehe的脂肪酶(1,000U/g)，常壓下置于60℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇重結晶，即得0.92g(88％)阿糖胞苷5’-油酸酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例7將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、29.4g(2.26×10-1mol)丙酸酐、150mL N，N-二甲基甲酰胺和辛烷的混和溶劑的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入4000U來源于Burkholderia acepaciai的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置于60℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應4h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙酸乙酯和甲醇的混合液溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以乙酸乙酯重結晶，即得0.55g(90％)阿糖胞苷5’-丙酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例8將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、33.4g(2.26×10-1mol)苯甲酸乙烯酯、150mL吡啶和乙睛的混和溶劑的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入1000U來源于Burkholderia acepaciai的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置于60℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應24h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.643g(90％)阿糖胞苷5’-苯甲酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例9將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、33.4g(2.26×10-1mol)苯甲酸乙烯酯、90mL吡啶和60mL離子液的混和溶液的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入600U來源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶(30,000U/g)，常壓下置于25℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應36h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.643g(90％)阿糖胞苷5’-苯甲酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例10將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、145g(4.10×10-1mol)萘乙酸酐、120mL乙睛和30mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入1000U來源于Bacillus lichemiformis的蛋白酶(6,000U/g)，常壓下置于60℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應4h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.761g(90％)阿糖胞苷5’-萘乙酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例11將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、26.3g(2.05×10-1mol)戊酸乙烯酯、150mL四氫呋喃的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入300U來源于Bacillus lichemiformis的蛋白酶(6,000U/g)，常壓下置于30℃、100rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.606g(90％)阿糖胞苷5’-戊酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例12將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、636g(2.05mol)硬脂酸乙烯酯、150mL吡啶的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入4000U來源于Bacillus lichemiformis的蛋白酶(6,000U/g)，常壓下置于60℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應24h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，得0.924g(88％)阿糖胞苷5’-硬脂酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例13將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、5.99g(2.05×10-2mol)的6，9，12-十八烯酸甲酯、90mL四氫呋喃和60mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，接著加入200U來源于Aspergillus melleus的蛋白酶(1，500U/g)，常壓下置于55℃、200rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.915g(88％)阿糖胞苷5’-十八烯酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例14將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、1.23g(2.26×10-3mol)油酸酐、105mL N，N-二甲基甲酰胺和45mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，結合加入4000U來源于Porcine liver的酯酶(15,000U/g)，常壓下置于60℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.92g(88％)阿糖胞苷5’-油酸酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例15將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、282g(5.16×10-1mol)油酸酐、105mL N，N-二甲基甲酰胺和45mL離子液的混和溶液的反應液加入具塞三角瓶中，結合加入4000U來源于Porcine liver的酯酶(15,000U/g)，常壓下置于60℃、250rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.92g(88％)阿糖胞苷5’-油酸酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例16將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、665g(4.10mol)肉桂酸甲酯、150mL N，N-二甲基甲酰胺和辛烷的混合溶劑的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入2000U來源于Aspergillus melleus的蛋白酶(1,500U/g)，常壓下置于35℃、150rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.675g(88％)阿糖胞苷5’-肉桂酸酯(光學純度達98％以上)。
實施例17將含有0.5g(2.05×10-3mol)阿糖胞苷、334g(2.26×10-3mol)苯甲酸乙烯酯、150mL吡啶和叔丁醇的混合溶劑的反應液加入到具塞三角瓶中，接著加入2000U來源于Aspergillus melleus的蛋白酶(1,500U/g)，常壓下置于35℃、150rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應48h后，反應混合物經(jīng)過濾除酶，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后加入乙醇(或者乙酸乙酯、甲醇或者乙酸乙酯和甲醇的混合液)溶解，經(jīng)過硅膠柱色譜分離純化，最后以甲醇(或者乙醇或者乙酸乙酯)重結晶，即得0.714(90％)阿糖胞苷5’-苯甲酸酯(光學純度達98％以上)。
權利要求
1.一種酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于采用非水介質(zhì)，以羧酸酯或者酸酐為?；w，利用酶催化阿糖胞苷進行酰化反應，合成得到阿糖胞苷酯。
2.根據(jù)權利要求1所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于包括如下步驟(1)在反應器中依次加入阿糖胞苷、非水介質(zhì)、羧酸酯或者酸酐；(2)按酶用量為100～4000U/克阿糖胞苷的比例加入酶，在溫度為25～60℃、振蕩速度為100～250rpm/min、條件下反應1～48小時，分離得到阿糖胞苷酯；所述非水介質(zhì)包括有機溶劑體系或離子液含量為0～40％質(zhì)量的有機溶劑和離子液混和體系，用量為0.5～10L/克阿糖胞苷；所述羧酸酯或者酸酐與阿糖胞苷的摩爾比為1.1∶1～2.0×103∶1。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于所述酶是脂肪酶、蛋白酶或酯酶。
4.根據(jù)權利要求3所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于所述脂肪酶來源于Candida antarctica、Thermomyces lanuginosus、Rhizomucormiehei、Burkholderia acepacia、Pseudomonas fluorescens、Aspergillus niger、Mucor miehei、Porcine pancreas、或Human pancreas；蛋白酶來源于Aspergillusmelleus、Bacillus subilis、Bacillus lichemiformis；酯酶來源于Porcine liver。
5.根據(jù)權利要求3所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于所述羧酸酯中脂肪酸酯的碳鏈長度為C2～C24，含有0～6個雙鍵；芳香酯含有1個或1個以上苯環(huán)；酸酐的脂肪酸碳鏈長度為C3～C18。
6.根據(jù)權利要求3所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于所述有機溶劑包括烷烴類、醇類、酯類、醚類、酮類、含氮化合物溶劑中的一種或一種以上。
7.根據(jù)權利要求6所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于所述烴類指飽和烴、不飽和烴、芳烴類中的一種或一種以上；醇類指一元醇、多元醇中的一種或一種以上；醚類指脂肪族醚、芳醚、二噁烷、四氫呋喃中的一種或一種以上；酮類指脂肪族酮、芳酮中的一種或一種以上、含氮化合物溶劑指腈類、胺類、吡啶中的一種或一種以上。
8.根據(jù)權利要求5或6所述的酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，其特征在于第(2)步中，采用如下方法分離阿糖胞苷酯反應混合物經(jīng)過濾除酶后，真空蒸發(fā)濃縮，濃縮液真空干燥后以甲醇、乙醇有機溶劑和乙酸乙酯重結晶或者經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，即得阿糖胞苷酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在非水介質(zhì)中酶催化制備阿糖胞苷酯的方法，是在非水介質(zhì)中，以羧酸酯或者酸酐為?；w，利用酶催化阿糖胞苷進行?；磻铣砂⑻前挣?。本發(fā)明具有反應條件溫和、環(huán)境友好、反應具有高度區(qū)域選擇性和反應過程簡單可控、產(chǎn)物易分離的優(yōu)點。
文檔編號C12P19/38GK1661030SQ20041007750
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月22日 優(yōu)先權日2004年12月22日
發(fā)明者宗敏華 申請人:華南理工大學