專利名稱：用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種特征序列擴增(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)標記技術及其在種質純度鑒定、品系鑒別和分子標記輔助育種中的應用。
背景技術：
壇紫菜(Porphyra haitanensis)屬于紅藻門(Rhodophyta)紅毛菜科(Bangiacea)紫菜屬(Porphyra)，是人工紫菜栽培的主要品種之一，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，其經(jīng)濟效益較好。但是近幾年壇紫菜栽培業(yè)普遍存在品質下降的問題，因此，利用分子生物學手段結合傳統(tǒng)的育種方法，培育出優(yōu)良壇紫菜新品系就變得非常迫切。目前，壇紫菜優(yōu)良品系的培育主要采用大田選育、利用物理誘變或化學誘變以及體細胞工程育苗等技術篩選優(yōu)良種質，再經(jīng)過海區(qū)小規(guī)模栽培，分析主要經(jīng)濟性狀及其遺傳穩(wěn)定性等手段，過程費時費力，已很難滿足壇紫菜養(yǎng)殖生產(chǎn)的需要。新近我們培育出的優(yōu)良品系表現(xiàn)出比較突出的優(yōu)良性狀藻體生長快，成熟晚，葉狀體長度、厚度、主要營養(yǎng)物質(蛋白質、葉綠素、氨基酸等)含量均優(yōu)于當家品種，因而深受養(yǎng)殖戶的歡迎。因此，如果能夠利用特異的分子標記技術找到與這一系列優(yōu)良性狀相關的DNA片段或者基因，進而了解與其相關的遺傳變異信息，就可以利用這些分子標記，最終從大量養(yǎng)殖對象或野生壇紫菜種質資源庫中篩選到含有這些標記的壇紫菜葉狀體，再結合其它經(jīng)濟性狀指標，就可培育出新的栽培品系，并在生產(chǎn)中推廣應用，從而加快壇紫菜優(yōu)良品系選育的進程，滿足生產(chǎn)的需要。
1995年由荷蘭Keygene公司的科學家Zabeau和Vos.Peter創(chuàng)建起來的擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)標記技術，相對于其它標記技術，該標記技術多態(tài)性強，譜帶豐富、清晰可辨，而且實驗結果穩(wěn)定，重復性好。SCAR標記一般由AFLP等分子標記轉換而來，其基本原理是根據(jù)已獲得的標記片段的序列信息，設計一對特異的引物，然后通過PCR的方法來提示多態(tài)性。SCAR標記是一種十分穩(wěn)定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的SCAR標記，進而為分子標記輔助育種提供基礎資料。
本發(fā)明的另一個目的是提供由所述SCAR標記獲得的PCR引物序列。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種使用方便、靈敏度高的包含由SCAR標記獲得的PCR引物序列的用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的檢測試劑盒。
本發(fā)明所述的鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的SCAR標記，具有如下核苷酸序列5’-AGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATAC-3’。
獲取SCAR標記的方法如下利用AFLP分子標記技術，首先提取不同紫菜樣品的葉狀體總DNA，再通過總DNA的酶切、人工接頭連接、預擴增以及選擇性擴增，最后經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分析獲得壇紫菜優(yōu)良品系特有的AFLP標記的特異性條帶；然后對特異性標記片段進行回收，回收產(chǎn)物PCR再擴增并克隆到T載體上，再通過測序分析、利用引物設計軟件設計引物，最終將AFLP標記轉化成SCAR標記，該標記表現(xiàn)共顯性，由此獲得與壇紫菜優(yōu)良品系的優(yōu)良性狀相連鎖的SCAR標記。
本發(fā)明所述的由SCAR標記獲得的PCR引物具有如下序列Marker15’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’Marker25’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’本發(fā)明所述的用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的檢測試劑盒，它包含以下組分組分I10×反應緩沖溶液250μL組分II Taq DNA聚合酶 50μL組分III 無菌雙蒸水(ddH2O) 3.0mL組分I含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100，1.5mmol/LMg2+，50pmol/L正鏈引物Marker1，50pmol/L負鏈引物Marker2和200μmol/L dNTPs。
組分IITaq DNA聚合酶的濃度為2.5U/μL。
正鏈引物Marker1的序列為5’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’。
負鏈引物Marker2的序列為5’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’本發(fā)明利用AFLP標記技術，對壇紫菜優(yōu)良品系及其他一些品系進行分析，找到優(yōu)良品系特異的AFLP標記，并成功地將其轉換成SCAR標記，獲得的SCAR標記可廣泛用于品系純度鑒定、品系鑒別和分子標記輔助育種。通過所獲得的特異引物PCR擴增可對個體進行鑒定，從而從大量養(yǎng)殖對象或野生壇紫菜種質資源庫中篩選出優(yōu)良的品系，縮短了育苗周期，提高了選育的準確性。并可為種質鑒定奠定基礎，也為壇紫菜遺傳多樣性、基因定位和快速構建遺傳圖譜以及分子標記輔助育種等研究提供了參考數(shù)據(jù)。用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的檢測試劑盒使用方便，重復性好，可靠性高，檢測費用低，省時省力。


圖1為利用檢測試劑盒對不同品系及野生壇紫菜進行鑒定的凝膠電泳圖。
具體實施例方式
實施例1.鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的AFLP標記的獲得一.材料實驗用的16個紫菜樣品(陰干-20℃保存)名稱及來源見表1。
表1. 16個紫菜樣品名稱及來源

二.方法利用AFLP分子標記技術對不同品系及野生壇紫菜進行篩選。AFLP分析參照Invortron公司的AFLP Analysis System I和AFLP Starter Primer Kit說明書進行，并稍有改動。
1.壇紫菜葉狀體總DNA提取(1)將復蘇后的壇紫菜葉狀體剪切成小塊，加入適量的海螺酶(1g葉狀體加10mL 3％酶液并加入適量玻璃珠)，于黑暗條件下振蕩(100r/min，26℃)酶解，0.5h后，每間隔15min鏡檢一次，至壇紫菜小塊大部分酶解成單細胞為止；(2)酶解結束后，加1倍體積的海水(比重1.030)與酶解液混合以終止酶解反應，用200目的篩絹過濾。濾液3500g離心5min后棄上清液；(3)加入海水(比重1.030)將細胞沉淀搖勻，再次離心；
(4)重復(3)三次；(5)用雙蒸水快速沖洗沉淀，4000g離心收集離心管底的細胞用于DNA提??；(6)沉淀的細胞中加入2mL葉狀體DNA提取液(0.6％ Sarcosyl，10mmol/L EDTA，O.2％ PVP，5％ β-巰基乙醇)，用槍頭混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加入RNase A，使RNase A終濃度達到50μg/mL，混勻。37℃水浴1～1.5h，中間適當攪拌混勻幾次，避免產(chǎn)生氣泡；(7)加入蛋白酶K，使蛋白酶K終濃度達到100μg/mL，混勻，37℃水浴2h，中間適當攪拌混勻幾次，避免產(chǎn)生氣泡，取出離心管，加10％體積的2mol/L Tris-Cl(pH8.0)，混勻，冷卻到4℃；(8)加入Tris飽和的苯酚抽提10min，4℃12000g離心10min，取上清；(9)上清加入酚-氯仿(1∶1)抽提10min，4℃12000g離心10min，取上清；(10)重復(9)一次；(11)上清加入氯仿-異戊醇抽提10min，4℃12000g離心10min，取上清；(12)上清加1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.4)，再加入2倍體積的-20℃無水乙醇沉淀1h，4℃ 12000g離心10min，去上清，用70％乙醇洗滌沉淀2遍，4℃12000g離心10min，沉淀放置在37℃干燥，溶解于適量TE緩沖液中，-20℃保存。
2.總DNA的酶切PCR管(0.2mL)中加入2.5μL5×酶切反應緩沖液，125ng(≤18μL)樣品DNA，1μL EcoRI，1μL Mse I，ddH2O補齊到12.5μL。12000g離心10s，充分混勻，置于37℃溫育2h，再將酶切反應混合物置于70℃水浴15min，滅活內(nèi)切酶。
3.人工接頭連接酶切后的DNA中，加入12μL接頭溶液，0.5μL T4 DNA連接酶，12000g離心10s，充分混勻，20℃連接2h(或過夜)，置于70℃水浴15min，滅活酶。
4.預擴增25.5μL反應體系中加入2.5μL連接反應產(chǎn)物，20μL預擴增引物混合溶液，2.5μL 10×PCR反應buffer(含Mg2+)，0.5μLTaq酶(5U/μL)。預擴增反應條件94℃，30s；56℃，1min；72℃，1min，20個循環(huán)。預擴增產(chǎn)物用TE緩沖液稀釋50倍，作為選擇性擴增的模板。
5.選擇性擴增20μL反應體系中加入0.18μL EcoR I引物(27.8ng/μL)，4.5μL Mse I引物(6.7ng/μL)，2μL 10×PCR反應buffer(含Mg2+)，0.1μL Taq酶(5U/μL)，5μL模板DNA，8.14μL ddH2O。EcoR I引物和Mse I引物3’端分別為3個選擇性堿基。擴增條件為94℃，30s；65℃，30s；72℃，1min，1個循環(huán)；94℃，30s；65℃，30s；72℃，1min(每個循環(huán)復性溫度降0.7℃)，進行12個循環(huán)；94℃，30s；56℃，30s；72℃，1min；23個循環(huán)。選擇性擴增產(chǎn)物置于94℃水浴2min，迅速取出置于冰浴中使DNA解鏈變性。取10μL樣品進行變性聚丙烯酰胺電泳檢測，銀染顯色，凝膠成像分析。
三.結果根據(jù)AFLP初步分析的結果，從25對引物中篩選出11對有效引物，用這11對引物對優(yōu)良品系和部分紫菜的總DNA進行特異性AFLP標記分析，結果顯示獲得了優(yōu)良品系的特異性條帶ACA-CAC(340)、ACA-CAC(203)、AAC-CAC(177)共3個，分子量大小分別為340bp、203bp和177bp。
實施例2.優(yōu)良品系特異的SCAR標記的獲得一、材料紫菜樣品同實施例1，大腸桿菌DH5α，pMD18-T Vector二、方法1.特異AFLP片段的回收根據(jù)獲得的AFLP聚丙烯凝膠電泳圖譜，尋找優(yōu)良品系特異的AFLP標記條帶，用鋒利的刀片切下含有該條帶的凝膠?；厥盏哪z塊溶于400μL高鹽溶液(20％ ethanol，1mol/L LiCL和10mmol/L Tris-HCL，Ph7.5)中，室溫放置24h，65℃溫育2h，無水乙醇沉淀DNA并溶于20μL TE中。
2.特異AFLP片段的PCR再擴增取5μL回收的DNA為模板，用與選擇性擴增時相同的引物按下列程序94℃ 30S；56℃ 30S；72℃ 60S擴增35個循環(huán)。
3.PCR擴增產(chǎn)物的回收PCR擴增出的特異片段經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳后，用上海生物工程公司生產(chǎn)的UNIQ-5柱離心式DNA膠回收試劑盒回收，操作依試劑盒說明進行。
4.連接反應按TaKaRa pMD 18-T Vector說明書進行操作；5.感受態(tài)大腸桿菌的制備(1)大腸桿菌DH5α單菌落接種于5mL的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)3～4h(OD260為0.2～0.4)，停止培養(yǎng)；(2)冰浴30min，無菌操作倒入5mL管中，12000g離心1min收集沉淀；(3)加入0.1mol/LCaCl2(預冷)1mL，混勻后轉入1.5mL管，再12000g離心1min，去上清；(4)沉淀加入200μL 0.1mol/LCaCl2(預冷)，混勻，4℃過夜或凍存于-70℃。
6.連接產(chǎn)物的轉化(1)取感受態(tài)細胞懸液100μL，加入連接產(chǎn)物(含量小于50ng)，輕輕搖勻，冰浴30min；(2)42℃水浴中熱擊90s(不要搖動管)，迅速置于冰浴3～5min；(3)然后向管中加入1mL LB培養(yǎng)液，搖床上50r/min震蕩培養(yǎng)2～3h；(4)取200μL菌液涂布到含80μg/mL的Amp抗生素的篩選板上，待吸收后，倒置，37℃培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質粒，用PCR和酶切的方法鑒定，將陽性克隆的新鮮菌液加等體積的60％甘油保存，送至上海生物工程公司測序。
三.結果獲得了多個優(yōu)良品系特異的AFLP標記條帶，對其中的標記條帶ACA-CAC(203)進行了PCR再擴增，擴增產(chǎn)物回收連接到T載體的測序結果為AFLP標記條帶ACA-CAC(203)的序列為5’-GATTGACTGCGTACCAATTCACAGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATACGTGTTACTCAGGACTCATCAATCGTCGAC-3’。
取該序列中間的152個堿基作為優(yōu)良品系特異的SCAR標記，其序列為5’-AGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATAC-3’。
實施例3.由SCAR標記獲得的PCR引物序列一.方法以ACA-CAC(203)的SCAR標記序列為引物設計模板，通過Primer 5.0引物設計軟件設計引物。
二.引物設計原則1.兩引物中的GC含量應盡量相似；2.引物內(nèi)部避免具有明顯的二級結構；3.兩引物之間避免有互補序列，以免形成“引物二聚體”；4.引物與靶序列片段的配對須精確、嚴格，特別是在3’末端；5.特異引物應具有一定的退火溫度(不低于50℃)和一定的長度(不小于18個bp)。
三.結果根據(jù)SCAR標記序列設計了特異引物，其序列為Marker15’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’Marker25’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’。
該引物的優(yōu)點擴增條帶清晰，且擴增穩(wěn)定，重復性好，擴增片段的大小為152bp。
實施例4.鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的PCR檢測試劑盒一.材料紫菜樣品為實施例1中的壇紫菜7個(LSD、NH、JJS、BBD、DXY、GL1、CCS0401)，條斑紫菜2個(LYG和RD)；Marker 1/Marker 2特異引物組合。
二.檢測試劑盒的組分壇紫菜優(yōu)良品系特異SCAR標記檢測試劑盒，它包括以下含量的各組分組分I10×反應緩沖溶液 250μL組分II Taq DNA聚合酶 50μL組分III 無菌雙蒸水(ddH2O) 3.0mL其中組分I含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100，1.5mmol/L Mg2+，50pmol/L正鏈引物Marker1，50pmol/L負鏈引物Marker2和200μmol/LdNTPs。組分II的濃度為2.5U/μL。
三.使用方法在25μL PCR反應體系中加入組分I 2.5μL，組分II 0.5μL，模板DNA 20ng(參照實施例1中的DNA提取方法提取)，組分III補至25μL。以下述PCR反應程序進行反應95℃，3min，預變性1個循環(huán)。95℃，1min；55℃，40s；72℃，90s；35個循環(huán)。72℃，延伸5min。擴增產(chǎn)物取5μL進行12％ PAGE凝膠電泳檢測，銀染顯色，凝膠成像分析。
四.規(guī)格該檢測試劑盒可檢測100個樣品。
優(yōu)點該檢測試劑盒使用方便，擴增方法簡單，重復性好，可靠性高。檢測費用低，省時省力。
五.結果如圖1所示，泳道1～7分別為壇紫菜樣品LSD、NH、JJS、BBD、DXY、GL1和優(yōu)良品系CCS0401的擴增結果，8、9泳道為兩種條斑紫菜樣品RD和LYG的擴增結果，M為pUC MixMarker，條帶大小從上到下依次為1116、883、692、501、489、404、331、242、190、147、111和67bp。從圖中可以看到，只有CCS0401能擴增出1條大小約為150bp的條帶。
權利要求
1.用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的分子標記，其特征在于所述的特征序列擴增(SCAR)標記具有如下核苷酸序列5’-AGTAAAATGGGGAACAGCGACTTCTACAGATGATTGCGAAGGTGTCGTAACAAAACAGCCTGATATGCGTCCAACTTTAGAGAATATTCAATATATTCTTCCCCAGTTCACTGGTCATGTTCAACAAACACCACCAATTTATTCTGCGATAC-3’獲取SCAR標記的方法如下利用AFLP分子標記技術，首先提取不同紫菜樣品的葉狀體總DNA，再通過總DNA的酶切、人工接頭連接、預擴增以及選擇性擴增，最后經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分析獲得壇紫菜優(yōu)良品系特有的AFLP標記的特異性條帶；然后對特異性標記片段進行回收、回收產(chǎn)物PCR再擴增并克隆到T載體上，再通過測序分析、利用引物設計軟件設計引物，最終將AFLP標記轉化成SCAR標記，該標記表現(xiàn)共顯性，由此獲得與壇紫菜優(yōu)良品系的優(yōu)良性狀相連鎖的SCAR標記。
2.由權利要求1所述的SCAR標記獲得的PCR引物，其特征在于所述的PCR引物具有如下序列Marker15’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’Marker25’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’。
3.用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的檢測試劑盒，其特征在于檢測試劑盒包含以下組分組分I 10×反應緩沖溶液 250μL組分II Taq DNA聚合酶50μL組分III無菌雙蒸水(ddH2O)3.0mL其中組分I含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，0.1％Triton X-100，1.5mmol/L Mg2+，50pmol/L正鏈引物Marker1，50pmol/L負鏈引物Marker2和200μmol/L dNTPs；組分II Taq DNA聚合酶的濃度為2.5U/μL；所述正鏈引物Marker1的序列為5’-AGT AAA ATG GGG AAC AGC-3’；所述負鏈引物Marker2的序列為5’-ATC GCA GAA TAA ATT GGT G-3’。
全文摘要
用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的分子標記及其應用，涉及一種SCAR標記技術及其應用。利用AFLP標記技術，對壇紫菜優(yōu)良品系等進行分析，找到優(yōu)良品系特異的AFLP標記，并將其轉換成SCAR標記，用SCAR標記設計特異引物Marker1和Marker2，并將特異引物做成用于鑒定壇紫菜優(yōu)良品系的檢測試劑盒，通過特異引物PCR擴增對個體進行鑒定，從養(yǎng)殖對象或野生壇紫菜種質資源庫中篩選出優(yōu)良品系，縮短育苗周期，提高選育準確性。廣泛用于品系純度與品系鑒別和分子標記輔助育種。為種質鑒定奠定基礎，為壇紫菜遺傳多樣性、基因定位和快速構建遺傳圖譜及分子標記輔助育種等研究提供參考數(shù)據(jù)。檢測試劑盒使用方便，重復性好，可靠性高，檢測費用低，省時省力。
文檔編號C12Q1/68GK1661097SQ20041008238
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權日2004年12月31日
發(fā)明者左正宏, 陳奕欣, 李博文, 王重剛, 陳驍, 趙揚, 陳昌生 申請人:廈門大學, 集美大學