專利名稱：一種鉻－磷納米材料的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米材料，具體地說(shuō)是一種鉻-磷納米材料的生產(chǎn)方法，即利用海洋玫瑰菌屬(Roseobacter)細(xì)菌大批量生產(chǎn)新型鉻-磷(Cr-P)納米材料的方法。
背景技術(shù)：
納米材料的研究及開(kāi)發(fā)體現(xiàn)著一個(gè)國(guó)家的科技水平、并對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義。目前國(guó)內(nèi)外納米材料的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和物理法兩種；化學(xué)法和物理法合成的納米材料都存在著晶體不均勻且其均一性很差的弱點(diǎn)。近年來(lái)，一種新型的納米材料合成法-利用生物合成納米材料已經(jīng)成為可能，其主要代表是趨磁細(xì)菌；趨磁細(xì)菌合成的磁性納米材料-磁小體大小均勻、形狀規(guī)則、單磁疇、分散性好等特點(diǎn)使其成為重要的生物源納米材料。但由于趨磁細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，微好氧等特點(diǎn)使其很難培養(yǎng)，磁小體的大量生產(chǎn)有一定的困難。玫瑰菌屬(Roseobacter)屬于α-變形菌綱，是海洋異養(yǎng)細(xì)菌的最大組分之一，占海洋浮游細(xì)菌的16％，廣泛分布于從溫帶到極地的海域。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的納米材料生產(chǎn)方法中物理法和化學(xué)法產(chǎn)品均一性差、不均勻的缺點(diǎn)及生物法產(chǎn)量較低的不足，本發(fā)明提供的是一種產(chǎn)品質(zhì)量好、生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單的鉻-磷納米材料的生產(chǎn)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為利用海洋玫瑰菌屬細(xì)菌高密度發(fā)酵后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，從破碎液中純化得到鉻-磷納米材料。所述海洋玫瑰菌屬細(xì)菌高密度發(fā)酵過(guò)程為，接種海洋玫瑰菌屬細(xì)菌種子培養(yǎng)液于發(fā)酵罐中，采用改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，24℃～30℃，150～200rpm，3～5升/分鐘通氣量，培養(yǎng)48～72小時(shí)；改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基重量組成為0.3％～0.6％蛋白胨，0.1％～0.2％酵母膏，50～100umol/l奎尼酸鐵，海水1000ml，pH6.5～7.2。
較佳的發(fā)酵條件為，24℃，200rpm，3升/分鐘通氣量，培養(yǎng)48小時(shí)；較佳的2216E培養(yǎng)基重量組成為，0.5％蛋白胨，0.1％酵母膏，100umol/l奎尼酸鐵，海水1000ml，pH6.7；所述破碎液的純化是采用密度梯度離心法，其采用的蔗糖溶液梯度為32～35％、37～40％、42～45％、47～50％、52～55％、57～60％(質(zhì)量百分比)，超速離心條件為0～4℃，20,000～23,000rpm，3～5小時(shí)，細(xì)胞破碎液加樣量為0.5～1.5ml；用無(wú)菌注射器從密度梯度離心后的離心管側(cè)部將黑色條帶吸出，冷凍干燥即得到鉻-磷納米材料。較佳的蔗糖溶液密度梯度為35％、40％、45％、50％、55％、60％，超速離心條件為4℃，23,000rpm，5小時(shí)。
具體步驟如下海洋玫瑰菌屬的細(xì)菌可以在多種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如DSMZ172，607培養(yǎng)基，2216培養(yǎng)基等，比較常用的是海洋2216培養(yǎng)基，生長(zhǎng)溫度為20-30℃，pH為7.0-8.0；1)接種活化的海洋玫瑰菌屬細(xì)菌于三角瓶中，24℃～30℃搖床振蕩培養(yǎng)18～24小時(shí)作為發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)液；2)接種種子培養(yǎng)液于5升發(fā)酵罐中，采用改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，24℃～30℃，150～200rpm，3～5升/分鐘通氣量，培養(yǎng)48～72小時(shí)；3)取發(fā)酵液，離心，洗滌，加入裂解酶(Lysozyme)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎；也可采用物理方法(例如超聲波法)或其他方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎；4)使用密度梯度離心法對(duì)破碎液中的納米材料進(jìn)行純化。蔗糖溶液梯度為32～35％、37～40％、42～45％、47～50％、52～55％、57～60％(質(zhì)量百分比)，超速離心條件為0～4℃，20,000～23,000rpm，3～5小時(shí)，細(xì)胞破碎液加樣量為0.5～1.5ml；5)用無(wú)菌注射器從密度梯度離心后的離心管側(cè)部將黑色條帶吸出，冷凍干燥即得到鉻-磷納米材料。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.產(chǎn)品質(zhì)量好。利用海洋玫瑰菌屬細(xì)菌高密度發(fā)酵得到大小均勻、形狀規(guī)則的納米材料，該納米材料組分為鉻-磷(Cr-P)，以前從未見(jiàn)報(bào)道，是一種新型納米材料。
2.可大批量生產(chǎn)。本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的玫瑰菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行了優(yōu)化，確定了以改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基為生產(chǎn)鉻-磷(Cr-P)納米材料的最佳培養(yǎng)基；利用該發(fā)明進(jìn)行高密度發(fā)酵，每升發(fā)酵液可得到鉻-磷納米材料1.8×1012個(gè)/升。
3.生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單。玫瑰菌屬(Roseobacter)屬于α-變形菌綱，是海洋異養(yǎng)細(xì)菌的最大組分之一，占海洋浮游細(xì)菌的16％，廣泛分布于從溫帶到極地的海域。


圖1為海洋玫瑰菌屬菌株的透射電鏡照片，可見(jiàn)其細(xì)胞中大小為100納米，圓形的顆粒；圖2為本發(fā)明得到的鉻-磷納米材料的透射電鏡照片；圖3為本發(fā)明鉻-磷納米材料的能譜分析圖，顯示其成分主要是鉻和磷。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
接種活化的海洋玫瑰菌屬菌株于500ml三角瓶中，24℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)作為發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)液；接種種子培養(yǎng)液于5升發(fā)酵罐中，采用改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基(0.5％蛋白胨，0.1％酵母膏，50-100umol/l奎尼酸鐵，海水1000ml，pH6.7)進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基裝量2升，24℃，200rpm，3升/分鐘通氣量，培養(yǎng)48小時(shí)；取發(fā)酵液10000rpm離心30分鐘，棄上清，加入40mM Tris-Hcl(pH8)，10,000rpm離心洗滌30分鐘；加入現(xiàn)配的10mg/ml裂解酶(Lysozyme)溶液至終濃度0.1mg/ml，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎。
用超純水配置35％、40％、45％、50％、55％、60％濃度的蔗糖溶液，113℃、25分鐘滅菌。用無(wú)菌針頭分別吸取上述蔗糖溶液在離心管(12ml)中鋪成濃度梯度，每一梯度1.5ml；在離心管頂部加入1.5ml細(xì)胞破碎液，4℃，23000rpm超速離心5小時(shí)；用無(wú)菌注射器從密度梯度離心后的離心管側(cè)部將黑色條帶吸出，冷凍干燥即得到鉻-磷納米材料。
實(shí)施例2.
接種活化的海洋玫瑰菌屬菌株于500ml三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)18小時(shí)作為發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)液。接種種子培養(yǎng)液于5升發(fā)酵罐中，采用改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基(0.3％蛋白胨，0.2％酵母膏，50～100umol/l奎尼酸鐵，海水1000ml，pH7.2)進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基裝量3升，30℃，160rpm，5升/分鐘通氣量，培養(yǎng)72小時(shí)；取發(fā)酵液8000rpm離心24分鐘，棄上清，加入40mM Tris-Hcl(pH8)，8,000rpm離心洗滌24分鐘。加入現(xiàn)配的10mg/ml裂解酶溶液至終濃度0.1mg/ml，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎；用超純水配置32％、37％、42％、47％、52％、57％(質(zhì)量百分比)濃度的蔗糖溶液，113℃、25分鐘滅菌。用無(wú)菌針頭分別吸取上述蔗糖溶液在離心管(12ml)中鋪成濃度梯度，每一梯度1.5ml。在離心管頂部加入0.5ml細(xì)胞破碎液，0℃，20000rpm超速離心3小時(shí)。用無(wú)菌注射器從密度梯度離心后的離心管側(cè)部將黑色條帶吸出，冷凍干燥即得到鉻-磷納米材料。
實(shí)施例3.
接種活化的海洋玫瑰菌屬菌株于500ml三角瓶中，26℃搖床振蕩培養(yǎng)21小時(shí)作為發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)液。接種種子培養(yǎng)液于5升發(fā)酵罐中，采用改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基(0.5％蛋白胨，0.15％酵母膏，50～100umol/l奎尼酸鐵，海水1000ml，pH7)進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基裝量2.5升，28℃，180rpm，4升/分鐘通氣量，培養(yǎng)60小時(shí)；取發(fā)酵液9000rpm離心25分鐘，棄上清，加入40mM Tris-Hcl(pH8)，9000rpm離心洗滌25分鐘。加入現(xiàn)配的10mg/ml裂解酶溶液至終濃度0.1mg/ml，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎；用超純水配置33％、38％、43％、48％、54％、58％(質(zhì)量百分比)濃度的蔗糖溶液，113℃、25分鐘滅菌。用無(wú)菌針頭分別吸取上述蔗糖溶液在離心管(12ml)中鋪成濃度梯度，每一梯度1.5ml。在離心管頂部加入1.0ml細(xì)胞破碎液，2℃，21000rpm超速離心4小時(shí)。用無(wú)菌注射器從密度梯度離心后的離心管側(cè)部將黑色條帶吸出，冷凍干燥即得到鉻-磷納米材料。
權(quán)利要求
1.一種鉻-磷納米材料的生產(chǎn)方法，其特征在于利用海洋玫瑰菌屬細(xì)菌高密度發(fā)酵后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，從破碎液中純化得到鉻-磷納米材料。
2.按照權(quán)利要求1所述鉻-磷納米材料的生產(chǎn)方法，其特征在于所述海洋玫瑰菌屬細(xì)菌高密度發(fā)酵過(guò)程為，接種海洋玫瑰菌屬細(xì)菌種子培養(yǎng)液于發(fā)酵罐中，采用改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，24～30℃，150～200rpm，3～5升/分鐘通氣量，培養(yǎng)48～72小時(shí)；改進(jìn)的2216E培養(yǎng)基重量組成為0.3％～0.6％蛋白胨，0.1％～0.2％酵母膏，50～100umol/l奎尼酸鐵，海水1000ml，pH6.5～7.2。
3.按照權(quán)利要求2所述鉻-磷納米材料的生產(chǎn)方法，其特征在于所述海洋玫瑰菌屬細(xì)菌發(fā)酵條件為24℃，200rpm，3升/分鐘通氣量，培養(yǎng)48小時(shí)；2216E培養(yǎng)基重量組成為，0.5％蛋白胨，0.1％酵母膏，100umol/l奎尼酸鐵，海水1000ml，pH6.7。
4.按照權(quán)利要求1所述鉻-磷納米材料的生產(chǎn)方法，其特征在于所述破碎液的純化是采用密度梯度離心法，其采用的蔗糖溶液質(zhì)量百分比梯度為32～35％、37～40％、42～45％、47～50％、52～55％、57～60％，超速離心條件為0～4℃，20000～23000rpm，3～5小時(shí)；用無(wú)菌注射器從密度梯度離心后的離心管側(cè)部將黑色條帶吸出，冷凍干燥即得到鉻-磷納米材料。
5.按照權(quán)利要求4所述鉻-磷納米材料的生產(chǎn)方法，其特征在于所述蔗糖溶液密度梯度為35％、40％、45％、50％、55％、60％，超速離心條件為4℃，23000rpm，5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及納米材料，具體地說(shuō)是一種鉻－磷納米材料的生產(chǎn)方法，是利用海洋玫瑰菌屬(Roseobacter)細(xì)菌高密度發(fā)酵得到大量細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎后用密度梯度離心法對(duì)其中的納米材料進(jìn)行純化，冷凍干燥得到新型鉻－磷(Cr－P)納米材料。利用該發(fā)明進(jìn)行高密度發(fā)酵每升發(fā)酵液可得到鉻－磷納米材料1.8×10
文檔編號(hào)C12R1/00GK1782087SQ20041008284
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者高峻, 肖天, 潘紅苗, 岳海東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所