專利名稱：草酸缺陷型Aspergillus Niger菌株生產(chǎn)多肽的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)多肽的草酸缺陷型Aspergillus Niger菌株，涉及其用途以及獲得此類菌株的方法。
背景技術(shù)：
草酸是發(fā)酵期間細(xì)胞培養(yǎng)上清液中積累的人們不想要的副產(chǎn)物，其導(dǎo)致對(duì)人們想要的化合物的下游加工中的困難。
四份名為Ru1-Ru4(下文中定義)的現(xiàn)有技術(shù)的俄國(guó)文獻(xiàn)，描述了用經(jīng)典的誘變方法來獲得草酸缺陷型Aspergillus Niger(A.niger)菌株的方法。草酸缺陷型A.niger菌株被定義為較其來源的親本菌株生產(chǎn)更少草酸的菌株。這幾篇文獻(xiàn)表示，對(duì)誘變劑的選擇并非關(guān)鍵UV、化學(xué)物質(zhì)或這兩者的組合作為誘變體，都可獲得草酸缺陷型A.niger菌株。文獻(xiàn)使用色譜試驗(yàn)來選擇較之其來源的親本菌株生產(chǎn)更少草酸或更多檸檬酸的菌株。文獻(xiàn)中沒有對(duì)用上述菌株來生產(chǎn)多肽的設(shè)想。
-Ru1On methods of selecting A.niger mutants with altered capacity tosynthesize organic acids，ID Kasatkina and E.G.Zheltova，Mikrobiologiya，vol34，no 3，p511-518，May-June 1965.
-Ru2RU2089615，New strains of A.niger has properties of producer ofcitric acid and can be used in microbiological industry(DW1998-249164).
-Ru3The variability of A.niger，a producer of citric acid，under theinfluencee of the separatee and combined action of nitrosomethylurea andultraviolet rays，E.Y.Shcherbakova，Z.S.Karadzhova and V.P.Ermakova，Mikrobiologiya，vol 43，no 3，p508-513，May-June 1974.
-Ru4Change in the ratio of citric acid and oxalic acids in A.niger underthe influence of mutagenic factors，V.M.golubtsova，E.Y.Shcherbakova，L.Y.Runkovskaya and V.P.Eramkova，Mikrobiologiya，vol 48，no 6，p1060-1065，November-December 1979.
另一份文獻(xiàn)WO 00/50576描述了草酰乙酸水解酶缺陷型宿主細(xì)胞可被用于生產(chǎn)人們想要的化合物，例如多肽、初級(jí)和次級(jí)代謝物。上述宿主細(xì)胞較之其來源的親本細(xì)胞具有較少的草酰乙酸水解酶活性。作為結(jié)果，上述草酰乙酸水解酶(oxaloacetate hydrolase，OAH)缺陷型細(xì)胞較之其來源的親本細(xì)胞生產(chǎn)更少的草酸。該專利申請(qǐng)沒有展示能表明草酰乙酸水解酶缺陷型細(xì)胞是合適的多肽生產(chǎn)者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，Pedersen et al，(Pedersen，H.，et al，Metabolic Eng.，(2000)2，34-41)后來還描述經(jīng)過包含編碼葡糖淀粉酶的DNA序列的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的草酰乙酸水解酶缺陷型Aspergillus niger菌株，在相同的培養(yǎng)條件下，生產(chǎn)的葡糖淀粉酶達(dá)不到其來源的野生型菌株的水平突變體生產(chǎn)的葡糖淀粉酶較野生型要少50％。此種突變體不適合在工業(yè)環(huán)境中被用作為多肽生產(chǎn)者。
對(duì)于下述草酸缺陷型A.niger菌株的需要仍然存在，所述菌株生產(chǎn)的多肽的量至少是野生型菌株所能生產(chǎn)出的多肽的量，其可在工業(yè)環(huán)境中被用作為多肽生產(chǎn)者。

發(fā)明內(nèi)容
適合用于在工業(yè)環(huán)境中生產(chǎn)給定多肽或酶的草酸缺陷型A.niger菌株已被分離出來，其中，令人驚奇地，在相同的培養(yǎng)條件下，草酸缺陷型菌株生產(chǎn)與其來源的野生型菌株至少相等量的多肽或酶。優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，突變體生產(chǎn)的多肽或酶的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的量。
在本申請(qǐng)中，A.niger菌株CBS 513.88被用作在A.niger培養(yǎng)物中可獲得的草酸水平的野生型參照，A.niger培養(yǎng)物中可獲得的多肽水平的野生型參照，以及A.niger培養(yǎng)物中可獲得的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的野生型參照。草酸缺陷型A.niger菌株被定義為在同樣培養(yǎng)條件下，較之A.niger菌株CBS 513.88，生產(chǎn)更少草酸的菌株。優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株所生產(chǎn)的一半。更優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株所生產(chǎn)的三分之一。最優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株所生產(chǎn)的五分之一。更優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的草酸的量不超過A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的一半。更優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的草酸的量不超過A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的三分之一。最優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的草酸的量不超過A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的五分之一。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，通過本申請(qǐng)下文中所定義的方法，已獲得所用的草酸缺陷型A.niger菌株。
優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，本發(fā)明的草酸缺陷型A.niger菌株較之其來源的野生型菌株生產(chǎn)的給定多肽更多。更優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，本發(fā)明的草酸缺陷型A.niger菌株較之A.niger菌株CBS 513.88生產(chǎn)的給定多肽更多。
對(duì)技術(shù)人員來說，多種不同的用于檢測(cè)多肽的系統(tǒng)都是已知的。檢測(cè)系統(tǒng)包括任何可能用于檢測(cè)多肽或酶活性的試驗(yàn)。僅僅舉例而言，上述試驗(yàn)系統(tǒng)包括但不限于基于比色、光度、濁度、粘度、免疫、生物、色譜的試驗(yàn)，以及其它可獲得的試驗(yàn)。
優(yōu)選地，如果所生產(chǎn)的多肽是酶，所生產(chǎn)出的活性酶的量是通過在模式反應(yīng)中測(cè)量其活性來確定的(見實(shí)施例)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的草酸缺陷型A.niger菌株是在模式反應(yīng)中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，具有可檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的菌株(見實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)信息)。更優(yōu)選地，在模式反應(yīng)中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，本發(fā)明的草酸缺陷型A.niger菌株具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在其來源的野生型菌株的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的0.1至100％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.5至90％之間，更優(yōu)選在0.5至80％之間，進(jìn)一步更優(yōu)選在1至50％之間，最優(yōu)選在1至25％之間，進(jìn)一步最優(yōu)選在1至10％之間。根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在模式反應(yīng)中檢測(cè)時(shí)，草酸缺陷型A.niger菌株具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在被保藏的CBS513.88的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的0.1至100％的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的草酸缺陷型A.niger菌株是在模式反應(yīng)中檢測(cè)時(shí)，其具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在被保藏的CBS 513.88的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的1至90％的范圍內(nèi)的菌株。
此類草酸缺陷型菌株仍具有可檢測(cè)到的OAH活性是令人吃驚的，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為OAH是對(duì)草酸形成有用的唯一分子。仍具有可檢測(cè)到的OAH活性的突變體較之不具有可檢測(cè)到的OAH活性的草酸缺陷型菌株具有若干優(yōu)點(diǎn)(Pedersen H et al，Metabolic Eng.(2000)2，34-41)在相同的培養(yǎng)條件下，它們能生產(chǎn)的給定多肽的量至少是野生型菌株所生產(chǎn)的量。此外，有機(jī)酸的內(nèi)在代謝途徑很可能不會(huì)被擾亂。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的草酸缺陷型A.niger菌株的特征在于已用包含編碼多肽的基因的表達(dá)構(gòu)建體對(duì)該菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，在相同的培養(yǎng)條件下，所述菌株生產(chǎn)的多肽的量至少是其來源的野生型菌株所生產(chǎn)出的量，其中野生型菌株也已經(jīng)經(jīng)過了與轉(zhuǎn)化草酸缺陷型菌株相同的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化。
編碼將被生產(chǎn)的多肽的基因可以與所用的草酸缺陷型A.niger菌株同源或異源。術(shù)語(yǔ)“異源”表示該多肽不是該A.niger細(xì)胞天然的。優(yōu)選地，包含在表達(dá)構(gòu)建體的基因是對(duì)A.niger來說異源的基因。
優(yōu)選的異源多肽是人血清清蛋白、乳鐵蛋白、凝乳酶或磷脂酶A2。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，已用包含編碼所述多肽的DNA序列的DNA構(gòu)建體對(duì)草酸缺陷型菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，所述多肽是酶。能被生產(chǎn)的酶是糖酶，例如纖維素酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或β-葡萄糖苷酶(β-glucosidease)、半纖維素酶，或果膠水解酶(pectinolytic enzyme)，例如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶(galactanase)、半乳糖苷酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酶(rhamnogalacturonase)、半乳糖醛酶(galacturonase)、裂解酶或淀粉分解酶；磷酸酶，例如肌醇六磷酸酶，酯酶，例如磷脂酶、蛋白水解酶(proteolytic enzyme)，氧化還原酶，例如氧化酶，轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。優(yōu)選地，將被生產(chǎn)的淀粉分解酶是α(alpha)淀粉酶(EC 3.2.1.1.，α-1，4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶或EC 3.2.1.2)。此外，優(yōu)選地，該DNA序列編碼真菌的α淀粉酶。最優(yōu)選地，編碼真菌α淀粉酶的DNA序列是從A.niger或Aspergillus oryzae中獲得的。根據(jù)另一種實(shí)施方式，將被生產(chǎn)的酶是脯氨酸特異性的內(nèi)切蛋白酶(EC 3.4.16.2)。根據(jù)另一種實(shí)施方式，將被生產(chǎn)的酶是磷脂酶A1(PLA1)(EC 3.1.1.32)。此外，優(yōu)選地，該DNA序列編碼真菌的PLA1。最優(yōu)選地，編碼真菌PLA1的DNA序列是從Aspergillus niger或Aspergillus oryzae中獲得的。
編碼將被生產(chǎn)的多肽的DNA序列可被可操作地連接到合適的DNA調(diào)控區(qū)域上，以確保所述DNA的高水平表達(dá)，以及優(yōu)選地，確保所述多肽的高分泌水平。如果將被生產(chǎn)的多肽是Aspergillus niger天然的，其天然分泌信號(hào)是優(yōu)選被使用的?；蛘?，如果將被生產(chǎn)的多肽對(duì)Aspergillus niger來說不是天然的，優(yōu)選地，制造包含融合到將被生產(chǎn)的異源基因上的Aspergillus niger葡糖淀粉酶基因的融合構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，使用Aspergillus oryzae α淀粉酶基因的調(diào)控區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的一種更為優(yōu)選的實(shí)施方式，使用A.niger葡糖淀粉酶的調(diào)控區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，使用α淀粉酶的分泌信號(hào)。DNA構(gòu)建體還可以包含選擇性標(biāo)記?；蛘?，選擇性標(biāo)記可以存在于第二DNA構(gòu)建體中。舉例而言，上述標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶基因)、營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因例如argB、trpC或pyrG，以及抗生素抗性基因，它們提供對(duì)例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性。優(yōu)選地，標(biāo)記基因是來自Aspergillus nidulans的乙酰胺酶基因。更優(yōu)選地，來自來自Aspergillusnidulans的乙酰胺酶基因被融合到gpdA啟動(dòng)子上。轉(zhuǎn)化A.niger的方法是技術(shù)人員熟知的(Biotechnology of Filamentous fungiTechnology andProducts.(1992)Reed Publishing(USA)；Chapter 6Transformation pages 113to 156)。技術(shù)人員將意識(shí)到對(duì)A.niger的成功轉(zhuǎn)化并不局限于對(duì)本文中特別示出的載體、選擇標(biāo)記系統(tǒng)、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)化方案的使用。轉(zhuǎn)化之后，典型地，在有蓋培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)A.niger群落。典型地，對(duì)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后選出的轉(zhuǎn)化子在瓶中進(jìn)行三至七天的培養(yǎng)，以檢查所述多肽的表達(dá)。
典型地，為在草酸缺陷型A.niger菌株中對(duì)多肽進(jìn)行工業(yè)環(huán)境下的生產(chǎn)，可以使用分批進(jìn)料(fed-batch)發(fā)酵方法。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，按照技術(shù)人員已知的技術(shù)來純化所述多肽。下文對(duì)此種回收技術(shù)的例子進(jìn)行了解釋。當(dāng)發(fā)酵停止時(shí)，必須殺死宿主。這是通過在某個(gè)特定溫度下加入滅菌試劑來完成的，這個(gè)溫度是該試劑能有效工作的溫度。例如，滅菌試劑可以是苯丙酸鈉或山梨酸鉀。根據(jù)所選用的滅菌試劑的種類，通過用技術(shù)人員已知的經(jīng)典冷卻方法，將培養(yǎng)液的溫度調(diào)節(jié)至該試劑相應(yīng)的工作溫度。在多肽被分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中的情況下，對(duì)細(xì)胞物質(zhì)和多肽的分離例如是簡(jiǎn)單的過濾過程用裝備有紡織布(textile cloth)的膜壓濾機(jī)來過濾發(fā)酵培養(yǎng)液(膜壓濾機(jī)和紡織布可從Harborlite獲得)。為提高過濾效果，可以使用的合適的助濾劑以及合適的濾布預(yù)涂層(pre-coat)。
為去除任何殘留的小顆粒，可以進(jìn)行額外的過濾步驟，以獲得干凈的濾液?？稍谄骄讖降湫蜑?-10微米的濾板上對(duì)所述濾液進(jìn)行精細(xì)過濾。技術(shù)人員已知若干種類型的濾板，它們?cè)诖硕际呛线m的。接著，可以用孔徑為大約0.4微米的過濾器來進(jìn)行滅菌過濾，以去除大部分的微生物。在這兩次過濾中，預(yù)涂層可被用于提高過濾效果。然后通過超濾(UF)對(duì)所述濾液進(jìn)行富集，富集因子典型地為10-25。若干種UF膜在此都是合適的。UF期間，典型的分子量小于幾千(還取決于分子形狀)的分子都從濾液中被移出。因此，UF之后，低分子量分子與目標(biāo)多肽的相對(duì)數(shù)量可被降低10-25倍。UF的持續(xù)時(shí)間根據(jù)濾液的粘度和可過濾性(filterability)(其隨原材料的天然特性的變動(dòng)而改變)而變動(dòng)。在此階段，超濾物中存在的多肽的濃度通常足夠高到能將多肽制成液體或干燥制劑的地步，具體制劑種類取決于預(yù)期應(yīng)用。
為獲得適合于高產(chǎn)量地生產(chǎn)多肽并可被用作工業(yè)環(huán)境中的多肽生產(chǎn)者的草酸缺陷型A.niger菌株，發(fā)展了一種方法。該多肽可以是與所述A.niger同源或異源的。在異源多肽或酶的情況下，可以按照如前所述的內(nèi)容，將要應(yīng)用本發(fā)明方法的野生型菌株可以先被轉(zhuǎn)化，使其能表達(dá)編碼此類多肽或酶的基因。在相同的培養(yǎng)條件下，此類草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的多肽的量至少是其來源的野生型菌株所生產(chǎn)出的量。優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)的多肽比其來源的野生型菌株更多。根據(jù)另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在相同的培養(yǎng)條件下，突變體生產(chǎn)的多肽的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)出的量。更優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，突變體生產(chǎn)的多肽比A.niger菌株CBS 513.88更多。
該方法包括如下步驟a)對(duì)A.niger進(jìn)行UV照射，b)對(duì)a)中獲得的存活的菌落進(jìn)行MTP培養(yǎng)c)對(duì)MTP培養(yǎng)物進(jìn)行篩選，其中，生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的一半的突變體被選出，d)對(duì)步驟c)所獲得的突變體進(jìn)行第二次篩選，其中，生產(chǎn)的多肽的量至少是其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的突變體被選出。
根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述方法包括如下步驟a)建立如下培養(yǎng)條件，使得在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中，微孔滴定板(MTP)上生產(chǎn)至少15mM的草酸，或在瓶培養(yǎng)物中生產(chǎn)出至少30mM的草酸，b)對(duì)A.niger進(jìn)行UV照射，c)在a)所保持的培養(yǎng)條件下對(duì)b)中獲得的存活的菌落進(jìn)行MTP培養(yǎng)，d)對(duì)MTP培養(yǎng)物進(jìn)行篩選，其中，生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的一半的突變體被選出，e)對(duì)步驟d)所獲得的突變體進(jìn)行第二次篩選，其中，生產(chǎn)的多肽的量至少是其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的突變體被選出。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，該方法包括如下步驟a)建立如下培養(yǎng)條件，使得在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中，微孔滴定板(MTP)上生產(chǎn)至少15mM的草酸，或在瓶培養(yǎng)物中生產(chǎn)出至少30mM的草酸，b)對(duì)A.niger的分生孢子進(jìn)行UV照射，
c)在a)所保持的培養(yǎng)條件下對(duì)b)中獲得的存活的菌落進(jìn)行MTP培養(yǎng)，d)對(duì)MTP培養(yǎng)物進(jìn)行篩選，其中，生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的一半的突變體被選出，e)對(duì)步驟d)所獲得的突變體進(jìn)行第二次篩選，其中，生產(chǎn)的多肽的量至少是其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的突變體被選出。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，該方法包括如下步驟a)對(duì)A.niger進(jìn)行UV照射，b)對(duì)a)中獲得的存活的菌落進(jìn)行MTP培養(yǎng)c)對(duì)MTP培養(yǎng)物進(jìn)行篩選，其中，生產(chǎn)的多肽的量至少是其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的突變體被選出，d)對(duì)步驟c)所獲得的突變體進(jìn)行第二次篩選，其中，生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的一半的突變體被選出。
上述方法的每一步將在下面被進(jìn)一步地闡述。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在第一步中，A.niger的菌落首先在培養(yǎng)基中被培養(yǎng)，其中允許在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中，MTP上生產(chǎn)至少30mM的草酸，或在瓶培養(yǎng)物中生產(chǎn)出至少100mM的草酸。發(fā)酵時(shí)間應(yīng)為至少3天。該方法的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的pH不需要被人工校正。該步驟中培養(yǎng)基的pH保持在3至7之間，優(yōu)選在3.5至6.5之間，更優(yōu)選在4至6之間。最優(yōu)選地，培養(yǎng)基的pH保持在pH 5至6之間。在那樣的pH值下，已知會(huì)有高產(chǎn)量的草酸生產(chǎn)。優(yōu)選用2-[N-嗎啡啉]乙磺酸(MES)溶液來緩沖培養(yǎng)基的pH，所述溶液的濃度在0.1至1M之間，更優(yōu)選在0.15至0.55M之間。最優(yōu)選地，MES的濃度為0.5M。該步驟的培養(yǎng)基中存在有氮源。優(yōu)選地，氮源是被細(xì)胞吸收之后不使發(fā)酵培養(yǎng)基酸化的氮源。更優(yōu)選地，該步驟培養(yǎng)基中的氮源是尿素。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，該步驟中所用的培養(yǎng)基是瓶裝的培養(yǎng)基2(flask defined medium2，F(xiàn)DM2)(見實(shí)施例1)。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，該步驟中所用的A.niger是WT2或A.niger菌株CBS513.88(見實(shí)驗(yàn)信息)。
在第二步中，對(duì)A.niger進(jìn)行UV照射，使得存活率在0.01％至60％之間。優(yōu)選地，存活率在0.05％至50％之間。更優(yōu)選地，存活率為0.1％。技術(shù)人員熟知，分生孢子是通過物理或化學(xué)手段來對(duì)A.niger進(jìn)行誘變的優(yōu)選材料。然而，突變體也還可以從菌絲體細(xì)胞來獲得。本文所述的篩選方法可用于對(duì)從分生孢子或菌絲體細(xì)胞獲得的突變體進(jìn)行篩選。
在第三步中，對(duì)第二步所獲得的存活的群落的MTP培養(yǎng)進(jìn)行至少3天。
在第三步MTP培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，可在第四步中，基于突變體草酸生產(chǎn)量來對(duì)其進(jìn)行篩選(草酸篩選步驟)。優(yōu)選地，相同的培養(yǎng)條件下，生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型所生產(chǎn)的量的三分之一的突變體被選出。更優(yōu)選地，相同的培養(yǎng)條件下，生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型所生產(chǎn)的量的五分之一的突變體被選出。
實(shí)施例中描述了可以用來對(duì)培養(yǎng)基中存在的草酸定量的試驗(yàn)。為實(shí)用的原因，最好的突變體(最低量的草酸生產(chǎn)者)被保留，以用于進(jìn)一步的鑒定。優(yōu)選地，保留5至50個(gè)突變體用于進(jìn)一步的鑒定。典型地，瓶培養(yǎng)7天之后，可以檢查是否上述被選出的突變體生產(chǎn)的草酸較野生型菌株少得多在圖7描述的情況下，突變體的發(fā)酵培養(yǎng)基中僅發(fā)現(xiàn)少于5mM的草酸，而野生型菌株中為40-45mM。7天的發(fā)酵之后，可以進(jìn)一步地檢查選出的突變體對(duì)培養(yǎng)基的酸化是否比野生型菌株要少。還可以在發(fā)酵期間不同的時(shí)間間隔，通過對(duì)生產(chǎn)出的生物物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量，以及對(duì)殘余葡萄糖濃度進(jìn)行測(cè)量，來對(duì)下述問題進(jìn)行檢查突變體中測(cè)量到的低草酸水平不是被選出的突變體生長(zhǎng)不良和/或代謝活性過低的后果。
可在草酸篩選步驟之間或之后用于突變體的第二篩選步驟如下選出生產(chǎn)的多肽的量至少是其來源的野生型在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的突變體。優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，突變體生產(chǎn)的給定多肽要比其來源的野生型菌株所生產(chǎn)的更多。根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在相同的培養(yǎng)條件下，突變體生產(chǎn)的多肽的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的量。更優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，突變體生產(chǎn)的給定多肽要比A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的更多。為進(jìn)行該最后步驟，在合適的液體培養(yǎng)基中，對(duì)前面步驟中獲得的突變體和野生型對(duì)照物進(jìn)行至少三天的培養(yǎng)。優(yōu)選地，培養(yǎng)進(jìn)行至少五天。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，使用本申請(qǐng)前文所定義的用于檢測(cè)所述多肽的系統(tǒng)，可以測(cè)定生產(chǎn)出的多肽的量。優(yōu)選地，如果所生產(chǎn)的多肽是酶，所生產(chǎn)出的活性酶的量是通過在模式反應(yīng)中測(cè)量其活性來確定的(見實(shí)施例)。
可選的第六步可被進(jìn)一步用于篩選在模式反應(yīng)中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)OAH活性的草酸缺陷型A.niger菌株。優(yōu)選地，模式反應(yīng)是實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)信息中描述的。更優(yōu)選地，該步驟使得下述草酸缺陷型菌株被選出，在模式反應(yīng)中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述菌株具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在其來源的野生型菌株的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的0.1至100％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.5至90％之間，更優(yōu)選在0.5至80％之間，進(jìn)一步更優(yōu)選在1至50％之間，最優(yōu)選在1至25％之間，進(jìn)一步最優(yōu)選在1至10％之間。根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在模式反應(yīng)中檢測(cè)時(shí)，草酸缺陷型A.niger菌株具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在被保藏的CBS 513.88的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的0.1至100％的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的草酸缺陷型A.niger菌株是在模式反應(yīng)中檢測(cè)時(shí)，其具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在被保藏的CBS 513.88的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的1至90％的范圍內(nèi)的菌株。
本發(fā)明還涉及草酸缺陷型A.niger菌株生產(chǎn)給定多肽的用途。因此，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)給定多肽的方法，其中使用本發(fā)明定義的草酸缺陷型A.niger菌株。在相同的培養(yǎng)條件下，此類菌株生產(chǎn)的所述多肽的量至少與其來源的野生型菌株所生產(chǎn)的量相等。優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，該菌株生產(chǎn)的所述多肽比其來源的野生型菌株所生產(chǎn)的更多。根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在相同的培養(yǎng)條件下，該菌株生產(chǎn)的所述多肽或酶的量至少與A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的量相等。更優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，該菌株生產(chǎn)的所述多肽或酶比A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的更多。


圖1示出了草酸試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)出的光密度以溶液中存在的草酸濃度的函數(shù)被給出。
圖2示出了發(fā)酵期間，有或沒有pH校正的情況下，F(xiàn)DM1培養(yǎng)基中野生型A.niger培養(yǎng)上清液pH的變化。
圖3示出了在有或沒有pH校正的情況下，F(xiàn)DM1培養(yǎng)基中對(duì)野生型A.niger進(jìn)行發(fā)酵的期間獲得的平均草酸產(chǎn)量。
圖4示出了在沒有pH校正的情況下，用銨或尿素作為氮源的FDM1培養(yǎng)基中，作為MES濃度函數(shù)的對(duì)野生型A.niger進(jìn)行發(fā)酵的期間獲得的平均草酸產(chǎn)量。
圖5示出了在沒有pH校正的情況下，F(xiàn)DM2培養(yǎng)基中對(duì)野生型A.niger進(jìn)行發(fā)酵的期間獲得的平均草酸產(chǎn)量。
圖6示出了在MDM1培養(yǎng)基中對(duì)野生型和一些被選出的草酸缺陷型A.niger進(jìn)行發(fā)酵期間的pH變化。
圖7示出了作為草酸產(chǎn)量函數(shù)的、野生型和34個(gè)突變體在FDM2培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵之后生產(chǎn)出的平均α淀粉酶產(chǎn)量。
圖8示出了在三種草酸缺陷型A.niger突變體和野生型中測(cè)量到的OAH活性。
圖9示出了在沒有pH校正的情況下，F(xiàn)DM2培養(yǎng)基中對(duì)野生型和草酸缺陷型A.niger進(jìn)行發(fā)酵的期間獲得的平均草酸產(chǎn)量。
圖10示出了在FDM2培養(yǎng)基中對(duì)野生型和草酸缺陷型A.niger進(jìn)行發(fā)酵的期間存在的殘余葡萄糖濃度。
圖11示出了FDM2培養(yǎng)基中發(fā)酵的野生型和草酸缺陷型A.niger的培養(yǎng)上清液中的pH變化。
圖12示出了在FDM2培養(yǎng)基中對(duì)野生型和草酸缺陷型A.niger進(jìn)行發(fā)酵的期間所產(chǎn)生的生物物質(zhì)的變化。
圖13示出了在包含估計(jì)相同的拷貝數(shù)的用于編碼脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基因的WT1和FINAL(突變體22)中的脯氨酸特異性外切蛋白酶的產(chǎn)量。
圖14示出了在搖瓶中的WT1和FINAL(突變體22)的磷脂酶A1產(chǎn)量。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)信息菌株WT1A.niger菌株被用作草酸水平、給定多肽水平和細(xì)胞內(nèi)OAH活性水平的對(duì)照物。該菌株被保藏于CBS中心，保藏編號(hào)為CBS 513.88。
WT2包含整合進(jìn)基因組的數(shù)個(gè)拷貝的包含A.oryzae α-淀粉酶基因的表達(dá)盒的WT1菌株。該基因已在別處被描述過(Wirsel et al.，(1989)，Mol.Microbiol.33-14)。用來自A.niger的葡糖淀粉酶基因的信號(hào)序列來替代A.oryzae α-淀粉酶基因編碼的原始信號(hào)序列。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來對(duì)WT2進(jìn)行構(gòu)建和篩選，這些技術(shù)在EP 635 574 A1和WO98/46772中有所描述。
OAH活性試驗(yàn)按照下文所述對(duì)不同的A.niger菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。在無擋板的500ml搖瓶中的100ml OAH培養(yǎng)基中，于30℃、170rpm對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三天的培養(yǎng)。OAH培養(yǎng)基如下面表1中所定義的。然后，通過加入Na2CO3將pH調(diào)為8，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行額外的15至18小時(shí)的培養(yǎng)。通過過濾收集菌絲體，用0.9％(w/v)的NaCl對(duì)其進(jìn)行洗滌，在液氮中冷凍，并貯存于-80℃。在液氮下于研缽中對(duì)經(jīng)冷凍的細(xì)胞進(jìn)行破碎，然后將其懸浮在下述抽提緩沖液中100mM MOPS緩沖液，pH7.5(MOPS＝嗎啡啉丙磺酸)，2mM MnCl2，20mM DTT，5％蔗糖。在Eppendorf離心機(jī)5417R中，于4℃、14000rpm下對(duì)懸浮液進(jìn)行20分鐘的離心。在25℃下對(duì)925μl的試驗(yàn)緩沖液(試驗(yàn)緩沖液100mM MOPS，pH7.5/2mM Mn2+)進(jìn)行預(yù)加熱。將25μl 40mM的草酰乙酸溶液加入到該經(jīng)過預(yù)加熱的混合物中。草酰乙酸溶液是通過將0.053g草酰乙酸溶于10ml試驗(yàn)緩沖液中來制備的。50μl離心之后獲得的懸浮液被加入到經(jīng)預(yù)熱的混合物中。根據(jù)Pedersen et al，2000，Mol.Gen.Genet.263281-286所述的方法來測(cè)定OAH活性。主要使用草酰乙酸作為底物。從草酰乙酸的吸光系數(shù)和255nm處吸光率降低的速率(delta A/min)來測(cè)定酶活，其中對(duì)吸光度降低速率的測(cè)量持續(xù)3分鐘，時(shí)間間隔為20秒。該試驗(yàn)進(jìn)行于25℃。
表1OAH培養(yǎng)基痕量金屬溶液ZnSO4·7H2O 0.143gCuSO4·5H2O 0.025gNiCl2·6H2O 0.005gFeSO4·7H2O 0.138gMnCl2·4H2O 0.060g水加至10mlOAH培養(yǎng)基，pH＝2.5或4.5，蔗糖 20gKH2PO41.5gMgSO4·7H2O 1gNaCl 1gCaCl2·2H2O 0.1gNaNO315g痕量金屬溶液 0.5ml(用HCl調(diào)pH至2.5)水加至1升蛋白質(zhì)試驗(yàn)樣品中的蛋白質(zhì)含量根據(jù)Coomassie Plus Protein試驗(yàn)按照制造商提供的說明書來測(cè)定，使用牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)(Pierce，產(chǎn)品編號(hào)23236)。
實(shí)施例1中，α淀粉酶作為下述酶的例子被給出，草酸缺陷型A.niger菌株對(duì)所述酶的生產(chǎn)水平至少與突變體來源的親本菌株在相同培養(yǎng)條件下的生產(chǎn)水平相同。
實(shí)施例1 制備作為高產(chǎn)量多肽生產(chǎn)者的草酸缺陷型Aspergillus niger突變體的方法從WT2開始來制備草酸缺陷型A.niger菌株。
1.生長(zhǎng)培養(yǎng)基在振蕩速率220rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上，在96孔微滴定板(MTP)或帶擋板的300ml瓶中，在34℃對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。
瓶中的預(yù)培養(yǎng)物被每ml 17000孢子接種。100ml培養(yǎng)物被10ml預(yù)培養(yǎng)物接種。
表2瓶中預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基1(FPM1)，pH5.5(所有成分都以克每升的形式給出)

表3瓶裝培養(yǎng)基1(FDM1)，pH6(所有成分都以克每升的形式給出)


(*2-[N-嗎啡啉]乙磺酸)瓶裝培養(yǎng)基2(FDM2)，pH6FDM2培養(yǎng)基與FDM1有著相同的組成，除了其中存在每升15克尿素，代替每升15克(NH4)2SO4。該培養(yǎng)基每升含有100克MES，而不是30克。
表4微滴定板裝的培養(yǎng)基1(MDM1)，pH6(所有成分都以克每升的形式給出)

(*2-[N-嗎啡啉]乙磺酸)
2.用于在A.niger培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)草酸的試驗(yàn)商業(yè)上可獲得的來自“Sigma Diagnostics”的試劑盒(Sigma.OXALATE診斷試劑盒，目錄編號(hào)591，2000-2001)被用于對(duì)草酸進(jìn)行定量。制造商推薦的體積被縮小，以使最終試驗(yàn)體積為48μl，試驗(yàn)在384孔MTP中進(jìn)行。Beckman Multimek 96被用于全部液體的轉(zhuǎn)移，在BMG分光熒光計(jì)中于550nm處讀出吸光率。圖1中給出了草酸試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(光密度、OD，作為草酸濃度的函數(shù))。在上述條件下發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)直到2.5mM都是線性的。
3.建立培養(yǎng)條件以使草酸生產(chǎn)最大化本部分所用的野生型菌株都是WT1。
pH被描述為對(duì)草酸生產(chǎn)來說最為關(guān)鍵的參數(shù)。為獲得高的草酸產(chǎn)量，A.niger培養(yǎng)物的pH應(yīng)被保持為接近于6(Kubicek，C.P.，et al，Appl.Environ.Microbiol.(1988)54，633-637；和Ruijter，G.J.G.，et al，.Microbiology(1999)145，2569-2576)。對(duì)于低于4的pH值草酸的產(chǎn)生會(huì)急劇下降(Ruijter，G.J.G.，van de Vondervoort，P.J.I.，and Visser，J.1999.Microbiology 145，2569-2576)。在A.niger培養(yǎng)物中很難保持接近6的pH，因?yàn)檎婢鷷?huì)生產(chǎn)出若干有機(jī)酸。為驗(yàn)證FDM1培養(yǎng)基中培養(yǎng)物pH有多關(guān)鍵，用野生型A.niger菌株來進(jìn)行三次同樣的瓶培養(yǎng)，其中通過加入滅菌的氫氧化鈉每天進(jìn)行人工pH校正或者不進(jìn)行校正。在FDM1培養(yǎng)基接種之前在FPM1培養(yǎng)基中進(jìn)行48小時(shí)的預(yù)培養(yǎng)階段。A.niger生長(zhǎng)期間，在FDM1培養(yǎng)基中存在有0.15M MES(30g/L)來緩沖培養(yǎng)基的酸化。
如圖2所示，培養(yǎng)基中存在的緩沖液不足以平衡A.niger生產(chǎn)的有機(jī)酸，圖3顯示，培養(yǎng)物pH會(huì)對(duì)草酸產(chǎn)量產(chǎn)生極大的影響。pH經(jīng)過校正的培養(yǎng)物產(chǎn)生的草酸較之pH沒有經(jīng)過校正的培養(yǎng)物要多大約5倍。
在對(duì)草酸缺陷型菌株進(jìn)行篩選的期間，A.niger在能產(chǎn)生最大的草酸產(chǎn)量的條件下生長(zhǎng)，從而可以選出草酸缺陷型菌株，并很輕易地將其與草酸生產(chǎn)為野生型水平的菌株分開。為實(shí)用的目的，在最初篩選階段，當(dāng)大量突變體仍然處于評(píng)估之時(shí)，人工pH校正無法作為獲得最大草酸產(chǎn)量的可選項(xiàng)。為在不需要校正培養(yǎng)物pH的情況下提高草酸生產(chǎn)的水平，對(duì)FDM1培養(yǎng)基中的兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，它們是培養(yǎng)基中MES的濃度以及氮源的屬性。
如圖4所示，增加MES濃度以及用尿素代替硫酸銨會(huì)對(duì)最高的草酸濃度產(chǎn)生較大的影響，這可發(fā)生于沒有pH校正的A.niger培養(yǎng)物上。圖5中，6或7天的發(fā)酵后達(dá)到最高的草酸濃度，這取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。
1M MES會(huì)影響A.niger的生長(zhǎng)，0.5M的中間濃度的MES被選擇。因此，最終被選來在篩選階段進(jìn)行瓶培養(yǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是MES濃度為0.5M并用尿素代替硫酸銨的FDM1。從此，將該培養(yǎng)基稱為FDM2。
圖5顯示在FDM2中，無需pH校正就達(dá)到的草酸濃度與經(jīng)過pH校正的FDM1中所達(dá)到的相當(dāng)(與圖3相比)。因此，這樣就不再需要pH校正了。
4.第一次篩選草酸生產(chǎn)從在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(Difco，POTATODEXTROSE AGAR，培養(yǎng)基，目錄編號(hào)213400，1996-1997年)形成孢子的WT2菌落來收集A.niger分生孢子。對(duì)10ml的含有每ml 4×106個(gè)分生孢子的懸浮液在254nm處進(jìn)行UV照射(Sylvania，15 Watts BlackLight Blue管，模式FT15T8/BLB)，直到獲得0.1783J/cm2的能量。菌落最初數(shù)量中0.1％的存活者被獲得。將經(jīng)過誘變的孢子溶液涂布到PDA培養(yǎng)基平板上，用Genomic Solutions Flexys菌落收集器(picker)收集10000個(gè)存活的菌落，它們?cè)僭?6孔微滴定板(MTP)上進(jìn)一步生長(zhǎng)。在34℃對(duì)上述被稱為“主平板(masterplate)”的MTP進(jìn)行培養(yǎng)，直到有明顯的孢子形成。
用Genomic Solutions Flexys菌落收集器將上述主平板復(fù)制涂布到含有40μl FPM1的MTP上，并在34℃培養(yǎng)48小時(shí)。然后加入170μl的MDM1，再在34℃對(duì)MTP進(jìn)行進(jìn)一步的7天的培養(yǎng)。
對(duì)10000個(gè)單獨(dú)培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行檢驗(yàn)草酸存在情況的試驗(yàn)。在所用的培養(yǎng)條件下，WT1和WT2培養(yǎng)物中所達(dá)到的草酸濃度在40mM的范圍之內(nèi)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中草酸濃度低于12mM的突變體被選出來進(jìn)行下一輪的篩選。保留下來255個(gè)突變體。第二輪篩選比第一輪更為嚴(yán)謹(jǐn)，從而可以除去假陽(yáng)性。
第二輪突變體篩選由四份MTP培養(yǎng)和草酸試驗(yàn)組成。所用的條件與上文所述的相同。下面的表5中的第二列列出了野生型MTP培養(yǎng)物和突變體中最低生產(chǎn)者所達(dá)到的草酸濃度。
表5突變體


1U/ml是每小時(shí)將1g可溶淀粉轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的α淀粉酶的量。在pH5.5和30℃通過加入碘之后在620nm處的吸光率來測(cè)量該產(chǎn)物的形成。和碘一起培養(yǎng)的時(shí)間在15至25分鐘之間。
圖6顯示，較之野生型菌株，篩選出的突變體菌株在生長(zhǎng)期間對(duì)MDM1生長(zhǎng)培養(yǎng)基的酸化較少。
5.第二次篩選α淀粉酶生產(chǎn)作為第二篩選步驟，隨后根據(jù)生產(chǎn)α淀粉酶的能力來對(duì)前段中獲得的34個(gè)突變體進(jìn)行篩選。
這34個(gè)突變體及WT2以與前述相同的方式生長(zhǎng)，對(duì)它們的α-淀粉酶生產(chǎn)能力進(jìn)行鑒定。
用來自Megazyme的α淀粉酶試驗(yàn)試劑盒(Megazyme，CERALPHAα淀粉酶試驗(yàn)試劑盒，目錄參考號(hào)K-CERA，2000-2001年)來測(cè)定培養(yǎng)物上清液中存在的α-淀粉酶活性。表5第三列列出了在WT2和34個(gè)突變體中檢測(cè)到的α淀粉酶的平均產(chǎn)量。
圖7示出了作為草酸產(chǎn)量函數(shù)的、野生型和34個(gè)突變體的平均α淀粉酶產(chǎn)量。從表5第三列和圖7中可以觀察到，所有34個(gè)突變體生產(chǎn)的α-淀粉酶都比其來源的野生型菌株明顯要多。前段中發(fā)現(xiàn)的所有草酸突變體被留下，作為能生產(chǎn)至少是其來源的野生型在相同培養(yǎng)條件下生產(chǎn)的酶的量的突變體。突變體15、19和22被選來作進(jìn)一步的篩選。
6.第三次篩選OAH活性作為額外的篩選，對(duì)前段中選出的三個(gè)突變體(15、19、22)以及作為對(duì)照的WT1和WT2測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的OAH活性。對(duì)一些菌株而言，測(cè)量進(jìn)行兩次(A、B)，如圖8中所示。用來測(cè)量OAH活性的試驗(yàn)方法在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中有所描述。突變體15和22顯示了可檢測(cè)到的OAH活性(圖8)大約是WT1或WT2的10％-20％。令人吃驚地，突變體19顯示了高的OAH活性，其與WT2的接近。令人吃驚地，上述三種草酸缺陷型突變體仍然具有相對(duì)較高的OAH活性。此外，他們還有良好的酶生產(chǎn)能力。
實(shí)施例2 對(duì)A.niger草酸缺陷型突變體的鑒定1.生長(zhǎng)培養(yǎng)基表6FPM1和FDM2培養(yǎng)基；如實(shí)施例1中所定義的。
瓶預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基2(FPM2)，pH5.5(所有成分都以克每升的形式給出)


2.對(duì)A.niger草酸缺陷型突變體的鑒定突變體18、22、15、23、19、33在48小時(shí)的FPM1預(yù)培養(yǎng)階段之后，被培養(yǎng)于FDM2培養(yǎng)基中，并根據(jù)它們的草酸產(chǎn)量和若干生長(zhǎng)參數(shù)(殘余葡萄糖、pH和形成的生物物質(zhì))對(duì)其進(jìn)行鑒定。用FDM2培養(yǎng)基獲得的結(jié)果驗(yàn)證了突變體較之野生型菌株的低水平草酸生產(chǎn)(圖9)。
用來自“Sigma Diagnostics”(Sigma，GLUCOSE診斷試劑盒，目錄號(hào)510-A，2000-2001年)葡萄糖試驗(yàn)試劑盒對(duì)野生型和突變體菌株生長(zhǎng)期間FDM2培養(yǎng)基中存在的殘余的葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)。如圖10所示，7天的生長(zhǎng)之后，一些突變體培養(yǎng)物中的葡萄糖幾乎完全被消耗殆盡，這暗示被選出的突變體中發(fā)現(xiàn)的低草酸水平并非是低代謝活性的反映。僅有突變體23看似代謝活性降低。
培養(yǎng)物的pH也被測(cè)量。如前面觀察到的(見實(shí)施例1)，突變體的培養(yǎng)基的酸化沒有野生型培養(yǎng)物的高(見圖11)。
最后，為了確保降低的突變體的草酸產(chǎn)量并非是由生長(zhǎng)不良導(dǎo)致的，通過對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)物中形成的生物物質(zhì)的干重進(jìn)行稱量來檢測(cè)生物物質(zhì)的形成。在每個(gè)關(guān)注的時(shí)間間隔處毀掉瓶子，并對(duì)瓶中全部生物物質(zhì)的干重含量予以測(cè)定。
如圖12所示，突變體顯示了多樣的生長(zhǎng)情況，但經(jīng)過7天的培養(yǎng)之后，卻都趨于達(dá)到與親本菌株WT2同樣的生物物質(zhì)水平。突變體23是唯一顯示低水平生物物質(zhì)形成的菌株，但該水平仍可與作為WT2來源的WT1野生型菌株相比。突變體23未被留下來作為用于下一步鑒定的草酸缺陷型菌株。對(duì)突變體的孢子形成能力進(jìn)行了視覺評(píng)估。我們發(fā)現(xiàn)，突變體的孢子形成水平可與其來源的野生型菌株相比。僅有一種突變體孢子形成能力看似較低。
在后面的實(shí)施例中，突變體22被用作草酸缺陷型A.niger菌株，以生產(chǎn)不同的酶。該突變體從WT2獲得，早期來自WT1。為在該突變體中表達(dá)其它的酶，按照EP 635 574 A中描述的方法去除α淀粉酶基因的所有拷貝，其中使用乙酰胺酶基因作為選擇標(biāo)記基因。在下面的實(shí)施例中，將該沒有任何外來酶編碼基因的突變體命名為FINAL。為在WT1中表達(dá)特定的酶，被引入到FINAL中的表達(dá)構(gòu)建體也被引入到WT1中，如下面的實(shí)施例所述。檢查拷貝數(shù)。對(duì)突變體22對(duì)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶和PLA1的生產(chǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并將其與WT1相比。在相同的培養(yǎng)條件下，突變體22生產(chǎn)的所有受試酶的量都與其來源的WT1相等，或是甚至更高。
實(shí)施例3 WT1和FINAL菌株對(duì)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的生產(chǎn)的比較被使用的編碼脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基因，在別處已被公開(WO 02/45524)。為在WT1和FINAL中表達(dá)WO 02/45524所述的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，通過WO 02/45524所述的共轉(zhuǎn)化將WO 02/45524中描述的構(gòu)建體(pGBFIN11-EPO)引入上述菌株。
具有近似的估計(jì)拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子被選擇來進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)用500ml帶擋板的搖瓶在保溫?fù)u床中于34℃和170rpm下，于100ml如EP635 574 A1中所述的培養(yǎng)基中進(jìn)行。四天的發(fā)酵之后，測(cè)定樣品中脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的活性。用Z-Gly(cine)-Pro(line)-pNA作為底物，在pH5和大約37℃下，及時(shí)對(duì)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的蛋白水解活性進(jìn)行分光光度的測(cè)量。1U的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶被定義為在pH5和37℃下，每分鐘轉(zhuǎn)化1微摩爾Z-Gly(cine)-Pro(line)-pNA的酶的量。
圖13顯示，具有不同的估計(jì)拷貝數(shù)的A.niger轉(zhuǎn)化子的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性被包括在42至135U/l的范圍內(nèi)。估計(jì)為一個(gè)拷貝數(shù)的菌株具有42-46U/l的活性，其與兩至三個(gè)拷貝的菌株的活性很好地相關(guān)。我們得出結(jié)論在相同的培養(yǎng)條件下，F(xiàn)INAL生產(chǎn)的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的量至少與WT1生產(chǎn)的量相等。
實(shí)施例4 WT1和FINAL菌株對(duì)磷脂酶A1(PLA1)的生產(chǎn)的比較我們選擇在WT1和FINAL中表達(dá)來自A.oryzae的PLA1。編碼該酶的基因已被公開(Watanabe I，et al，Biosci.Biotechnol.Biochem.(1999)，Vol63，numero 5，pages 820-826)。用與WO 02/045524中所述的在pGBFIN11-EPO中克隆脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的同樣的技術(shù)，將該基因克隆進(jìn)pGBFIN11。通過WO 02/45524中所述的共轉(zhuǎn)化將該構(gòu)建體引入上述菌株。WT1和FINAL的三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子被用來檢測(cè)搖瓶中PLA1的表達(dá)。用500ml帶擋板的搖瓶，在保溫?fù)u床中，于34℃和170rpm下，在100ml與如EP 635 574 A1中所述的相同的培養(yǎng)基中，對(duì)具有近似的估計(jì)拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵2、3、4、5天后，測(cè)定樣品PLA1活性。為對(duì)來自Aspergillus niger的磷脂酶(PLA1)的PLA1活性進(jìn)行分光光度的測(cè)定，使用人工底物1，2-二硫二辛酰磷脂膽堿(1，2-dithiodioctanoylphophatidylcholine，diC8，底物)。PLA1水解A1位的硫鍵，分解出硫辛酸(thio-octanoic acid)。硫辛酸與4，4-二硫吡啶(染色試劑，4-DTDP)反應(yīng)，形成4-硫吡啶酮。4-硫吡啶酮與4-巰基吡啶之間有互變異構(gòu)平衡，4-巰基吡啶吸收波長(zhǎng)為334nm的光。測(cè)量該波長(zhǎng)處的消光變化。一個(gè)單位被定義為在37℃和pH4.0下，每分鐘從1，2-二硫二辛酰磷脂膽堿釋放出1nmol硫辛酸的酶的量。
通過將1g diC8晶體溶于66ml乙醇和264ml乙酸緩沖液來制得底物溶液。乙酸緩沖液包含0.1M的pH3.85的含有0.2％Triton-X100的乙酸緩沖液。染色試劑是11mM的4，4-二硫吡啶溶液。這是通過在2ml的Eppendof樣品杯中稱量5.0mg的4，4-二硫吡啶并將其溶于1.00ml乙醇中來制得的。加入1.00ml的milli-Q水。結(jié)果被示于圖14中。其顯示，WT1培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化子中PLA1活性在4-5天之后降低。然而，F(xiàn)INAL轉(zhuǎn)化子中PLA1活性在發(fā)酵期間積累起來，而且沒有觀察到活性降低。我們得出結(jié)論在相同的培養(yǎng)條件下，F(xiàn)INAL生產(chǎn)的PLA1多于其來源的野生型副本。
關(guān)于被保藏微生物的說明(PCT Rule 13bis)

表PCT/RO/13權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)給定酶的草酸缺陷型A.niger菌株，其中，在相同的培養(yǎng)條件下，所述草酸缺陷型菌株生產(chǎn)的所述酶的量至少與其來源的野生型菌株所生產(chǎn)的量相等。
2.如權(quán)利要求1所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中，在相同的培養(yǎng)條件下，所述草酸缺陷型菌株生產(chǎn)的所述酶比其來源的野生型菌株要多。
3.如權(quán)利要求1或2所述的草酸缺陷型菌株，其中，當(dāng)在模式反應(yīng)中檢測(cè)時(shí)，所述草酸缺陷型菌株具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在其來源的野生型菌株的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的1％至25％之間。
4.一種草酸缺陷型A.niger菌株，其特征在于當(dāng)該菌株已經(jīng)過了包含編碼酶的基因的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化，在相同的培養(yǎng)條件下，所述菌株生產(chǎn)的酶的量至少是其來源的野生型菌株所生產(chǎn)出的量，其中，所述野生型菌株已經(jīng)經(jīng)過了與轉(zhuǎn)化草酸缺陷型菌株相同的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化。
5.如權(quán)利要求4所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其特征在于所述基因是異源基因。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中，在相同的培養(yǎng)條件下，所述菌株生產(chǎn)的所述酶的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生產(chǎn)的量，優(yōu)選更多。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中所述的酶是真菌α淀粉酶。
8.如權(quán)利要求7所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中所述的真菌α淀粉酶來自Aspergillus oryzae或A.niger。
9.一種獲得下述草酸缺陷型A.niger菌株的方法，所述菌株適于在相同的培養(yǎng)條件下生產(chǎn)出至少是其來源的野生型菌株所生產(chǎn)出的量的酶，所述方法包括如下步驟a)對(duì)A.niger進(jìn)行UV照射，b)在a)所保持的培養(yǎng)條件下對(duì)a)中獲得的存活的菌落進(jìn)行MTP培養(yǎng)，c)對(duì)MTP培養(yǎng)物進(jìn)行篩選，其中，生產(chǎn)的草酸的量不超過其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的一半的突變體被選出，d)對(duì)步驟c)所獲得的突變體進(jìn)行第二次篩選，其中，生產(chǎn)的酶的量至少是其來源的野生型菌株在相同培養(yǎng)條件下所生產(chǎn)的量的突變體被選出。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述方法包括額外的步驟e)，其中，對(duì)步驟d)中選出的突變體進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，以選出在模式反應(yīng)中檢測(cè)時(shí)具有的細(xì)胞內(nèi)OAH活性在其來源的野生型菌株的細(xì)胞內(nèi)OAH活性的1％至25％之間的突變體。
11.如權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的或通過權(quán)利要求9或10中任意一項(xiàng)所述的方法可獲得的草酸缺陷型A.niger菌株用于生產(chǎn)給定的酶的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及草酸缺陷型Aspergillus Niger菌株生產(chǎn)一種給定的酶的用途，其中，在同樣的培養(yǎng)條件下，草酸缺陷型菌株生產(chǎn)的酶的量至少與其來源的野生型菌株相等。優(yōu)選地，在相同的培養(yǎng)條件下，草酸缺陷型A.Niger菌株較其來源的野生型菌株生產(chǎn)更多的酶。更優(yōu)選地，草酸缺陷型A.Niger菌株是這樣的當(dāng)已用包含編碼酶的基因的表達(dá)構(gòu)建體對(duì)該菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)化時(shí)，在相同的培養(yǎng)條件下，所述菌株生產(chǎn)的酶的量至少是其來源的野生型菌株所生產(chǎn)出的量，所述野生型菌株也是已經(jīng)經(jīng)過了與轉(zhuǎn)化草酸缺陷型菌株相同的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還涉及獲得此類草酸缺陷型A.niger菌株的方法。本發(fā)明進(jìn)一步地涉及獲得一種酶的方法，其中使用草酸缺陷型A.niger菌株，在相同的培養(yǎng)條件下，該菌株生產(chǎn)的酶的量至少與其來源的野生型菌株相等。
文檔編號(hào)C12R1/685GK1836033SQ200480003643
公開日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2004年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月5日
發(fā)明者蒂鮑特·喬斯·維恩策爾, 羅希爾·莫伊倫貝格, 瓊馬克·莫里斯·克勞德·拉德里埃 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司