專利名稱：通過氧化還原反應(yīng)改變血漿蛋白質(zhì)結(jié)合專一性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改變血漿蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的方法，該血漿蛋白質(zhì)具有可通過氧化還原反應(yīng)而改變的結(jié)合專一性。本發(fā)明還涉及一種通過使天然存在于正常受試者的血液、血漿或血清中的自身抗體去屏蔽(unmasking)而獲得自身抗體的方法。
背景技術(shù)：
術(shù)語“自身免疫疾病”指的是免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地攻擊人自身身體的細(xì)胞、組織或器官的一類疾病。典型地，自身免疫疾病涉及身體自身成分，例如常見的蛋白質(zhì)和脂類的抗體結(jié)合。與自身化合物(或者，更典型地，與在每種生物中都存在的如此常見的化合物)結(jié)合的抗體稱作自身抗體。例如，磷脂和/或磷脂結(jié)合性血漿蛋白質(zhì)的自身抗體結(jié)合與以下疾病相關(guān)，例如全身性紅斑狼瘡(SLE)、深部靜脈及復(fù)發(fā)性動(dòng)脈血栓形成、肺栓塞、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、血小板減少癥、舞蹈病、癲癇、青斑、自發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、風(fēng)濕狀況以及許多膠原性疾病。其它與自身抗體相關(guān)的疾病包括多發(fā)性硬化、克羅恩病、盤狀紅斑狼瘡、淋巴瘤性甲狀腺腫、牛皮癬、糖尿病以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。大約有80種不同的自身免疫疾病，作為一類疾病，這些疾病影響著數(shù)百萬人。
關(guān)于自身免疫疾病病原學(xué)的傳統(tǒng)理論認(rèn)為，這些疾病由在患病個(gè)體中產(chǎn)生了過量的自身抗體引起，可能是由于編碼這些自身抗體的基因過度表達(dá)。根據(jù)這一理論，受影響個(gè)體的血液含有水平升高的引起該疾病的特定自身抗體，而正常個(gè)體血液中不含這種自身抗體或者僅僅含有微不足道的量。該理論表面上得到了傳統(tǒng)檢測(cè)的支持，在這些檢測(cè)中含量豐富的自身抗體可在來自患有自身免疫疾病的受試者的血液或者血液制品，如血漿或者血清中檢測(cè)到，相反在來自沒有患自身免疫疾病的受試者的血液或血液制品中則檢測(cè)到自身抗體為零或者極微量。
本發(fā)明是基于在此報(bào)道的一個(gè)驚人發(fā)現(xiàn)，即正常個(gè)體的血液中實(shí)際上也含有相當(dāng)數(shù)量的多種類型及專一性的自身抗體。如果對(duì)血液或者血液制品進(jìn)行氧化處理，例如通過用氧化劑或者電流按照這里描述的方法進(jìn)行處理，就能夠從正常個(gè)體的血液或血液制品中檢測(cè)或分離出這些自身抗體。對(duì)于正常血液中顯著數(shù)量的自身抗體的發(fā)現(xiàn)是以前沒有報(bào)道過的，并且就發(fā)明人所知，這些自身抗體在正常血液中以顯著量存在在本發(fā)明之前完全是未知的。
不受任何特定理論所限，很顯然，如果自身抗體可通過處理取自沒有任何自身免疫疾病癥狀的人的正常血液而獲得，那么正常人體的免疫系統(tǒng)必然能常規(guī)地產(chǎn)生并循環(huán)這些自身抗體，但它們以其被屏蔽或阻斷的某些形式存在，或者被阻止具有任何損害作用。
正常個(gè)體中顯著數(shù)量的自身抗體的發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)問題，即為什么在標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)(通常基于抗體與其相應(yīng)抗原的結(jié)合)中不能檢測(cè)到自身抗體，并且為什么在正常個(gè)體中自身抗體不引起疾病。
基于這里描述的早期實(shí)驗(yàn)，對(duì)于正常血液中如何能含有自身免疫抗體，而這些抗體不能通過常規(guī)的篩選過程檢測(cè)到，而且還不引起疾病，最初的假定解釋是，正常個(gè)體中的自身抗體在其產(chǎn)生后以某種方式受到了隔離。例如，隔離作用可以是大分子的形式，例如低密度或高密度脂蛋白(LDL，HDL)，或者一些能夠隔絕自身抗體并將其與血流中的其它成分分開的其它類型的微粒、囊泡或者微團(tuán)?；谶@種理論，自身免疫疾病的引發(fā)不是由于自身抗體本身的產(chǎn)生，而是由于隔離自身抗體的大分子、微粒、囊泡或者微團(tuán)的降解、破壞或者形成缺乏。該理論看起來得到了最初的試驗(yàn)支持，在這些試驗(yàn)中，對(duì)樣品進(jìn)行相當(dāng)劇烈的處理，包括振蕩和加熱之后，從血液或血清樣品中得到了自身抗體。
然而，如這里所述，在后來的試驗(yàn)中顯示，本發(fā)明的更為簡(jiǎn)單的方法，例如將血液或血液制品暴露于氧化劑或者DC電流，就足以從正常血液中獲得自身抗體，并且該過程是可逆的。而且，研究發(fā)現(xiàn)，自身抗體可通過商購的IvIg產(chǎn)品的處理來獲得，該產(chǎn)品不存在任可類型的大分子隔離單元?；谶@些試驗(yàn)，關(guān)于正常血液中如何能含有自身免疫抗體，而這些抗體不能通過常規(guī)的篩選過程檢測(cè)到，而且還不引起疾病，一種更可信的理論是，自身抗體隨其它抗體一道自由循環(huán)，但在正常個(gè)體中，自身抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)以某種方式被阻斷或者失活?；谶@種理論，通過氧化而使自身抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)去阻斷，可引發(fā)自身免疫疾病。而且，該理論提出了一種更普通的機(jī)制，通過該機(jī)制可改變一些血漿蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的上述發(fā)現(xiàn)的一種直接實(shí)際應(yīng)用是，使得可以幾乎無限制地提供想要獲得的自身抗體，而該自身抗體可在用于自身免疫疾病和其它aPL相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷的診斷試劑盒中用做標(biāo)準(zhǔn)。以前，收集大量的自身抗體進(jìn)行商業(yè)應(yīng)用是十分困難的，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為自身抗體必須從患有自身免疫疾病或者在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中自身抗體顯示為陽性的個(gè)體中才能獲得。通過對(duì)個(gè)體患者進(jìn)行靜脈切開放血術(shù)或者收集來自一組已知自身抗體檢測(cè)為陽性的患者的血液能夠獲得的這種血液的量是有限的。其它獲得自身抗體的方法，例如在美國專利US5885793中記載的篩選噬菌體文庫的方法，也是十分困難而且耗時(shí)的。
由于可預(yù)測(cè)或預(yù)示在特定個(gè)體中的氧化應(yīng)激之后會(huì)出現(xiàn)什么抗體，因而測(cè)定血液樣品中存在或不存在屏蔽的抗體具有重要的診斷價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種改變血漿蛋白的結(jié)合專一性的方法，該血漿蛋白的結(jié)合專一性可通過其氧化還原狀態(tài)的變化而改變。
本發(fā)明的另一目的在于，提供一種從來自正常個(gè)體的血液、血漿或者血清中獲得自身抗體的方法。
本發(fā)明的另一目的在于，提供一種通過對(duì)受試者施以足夠使所述受試者體內(nèi)的自身抗體失活的抗氧化劑，來治療患有自身免疫疾病的受試者的方法。
本發(fā)明的另一目的在于，提供一種通過使受試者的自身抗體在體外失活來治療所述患有自身免疫疾病的受試者的方法。
本發(fā)明的另一目的在于，提供一種包括生物流體或者含蛋白質(zhì)的生物流體提取物的產(chǎn)品，所述流體或流體提取物曾暴露于足以改變至少一種其中所含蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的氧化劑或者DC電流。
本發(fā)明的另一目的在于，提供一種來自于一個(gè)或多個(gè)在常規(guī)臨床檢測(cè)中沒有檢測(cè)到自身抗體存在的個(gè)體的血液、血漿或血清樣品，該血液、血漿或血清樣品已經(jīng)過處理，從而之后證明存在有自身抗體。
這些以及其它的目的可通過改變生物流體中或含蛋白質(zhì)的生物流體提取物中至少一種循環(huán)蛋白的結(jié)合專一性的方法來實(shí)現(xiàn)，該循環(huán)蛋白質(zhì)帶有具結(jié)合專一性的結(jié)合位點(diǎn)，通過將該生物流體或提取物中的蛋白質(zhì)暴露于氧化劑或者直流(DC)電流以使該循環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性發(fā)生改變，從而改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的氧化還原狀態(tài)，則可改變所述結(jié)合專一性。
這些目的還可通過包含下述步驟的方法來實(shí)現(xiàn)提供組合物，其包括至少一種懸浮或溶解于液體介質(zhì)中的血漿蛋白質(zhì)，該血漿蛋白質(zhì)具有可通過改變其氧化還原狀態(tài)而改變的結(jié)合專一性；以及將該組合物暴露于足以改變?cè)撗獫{蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的氧化劑或者DC電勢(shì)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種從生物流體或者生物流體提取物中獲取自身抗體或者其它屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)的方法，其通過將生物流體或其提取物中的自身抗體或者其它屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)暴露于足以改變自身抗體或其它屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的氧化劑或DC電流，使自身抗體或者其它屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)能夠與抗原或配體結(jié)合，由此變得可檢測(cè)，并可從生物流體或提取物中回收，以及從該生物流體中回收該自身抗體或其它屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種通過向患有自身免疫疾病的受試者施以足以使受試者體內(nèi)自身抗體失活的量的抗氧化劑，來治療自身免疫疾病的方法。對(duì)患有自身免疫疾病的個(gè)體的治療可包括在體外處理血液，以減少未屏蔽的蛋白質(zhì)并將它們替換為屏蔽的蛋白質(zhì)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，即篩選正常個(gè)體的生物流體或提取物，以確定哪些自身抗體被屏蔽，并由此構(gòu)建該個(gè)體中，在通過氧化或電動(dòng)勢(shì)而被暴露或者去屏蔽的情況下，可能引起自身免疫疾病的自身抗體的潛在抗體分布圖。
作為特定的、非限制性的例子，血液、血漿或血清，或者血液提取物，如免疫球蛋白混合物，可被暴露于氧化劑或者DC電流，以造成血液、血漿、血清或提取物中所含的至少一種自身抗體的結(jié)合專一性的變化，使自身抗體變得在血液、血漿、血清或提取物中可檢測(cè)，并可從血液、血漿、血清或提取物中回收。
附圖簡(jiǎn)述

圖1的表格列出了通過在下面描述的許多實(shí)施例中所使用的內(nèi)部(in-house)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)形式檢測(cè)的特定抗磷脂抗體(aPL)。
圖2的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育。
圖3的組合表格概括了來自7位aPL陰性的正常個(gè)體的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育。
圖4的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血清樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育，特征是該過程中馬紅細(xì)胞(RBC)被替換成人RBC。
圖5的表格概括了按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法進(jìn)行的血清樣品溫育的aPL檢測(cè)結(jié)果，但馬血清被替換成人血清。
圖6的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，除溫育在室溫下(22℃)進(jìn)行以外，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育。
圖7的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育，特征為用0.7mm Degalan(塑料)小珠作為溫育混合物中的顆粒狀固體。
圖8的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，除溫育混合物保持靜止而不搖動(dòng)或振蕩以外，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育。
圖9的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育，其中增加將溫育混合物加熱到56℃30分鐘的特征。
圖10的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育，特征為采用了來自不同供應(yīng)商(Becton Dickinson，Sparks，Md)的細(xì)菌生長培養(yǎng)基來取代來自Biomerieux的細(xì)菌生長培養(yǎng)基。
圖11的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育，特征為培養(yǎng)在厭氧條件下進(jìn)行。
圖12的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育，特征為用K562細(xì)胞(人腫瘤細(xì)胞系)替代RBC。
圖13的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，但將細(xì)菌生長培養(yǎng)基替換為用于培養(yǎng)人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基。
圖14的表格概括了來自正常aPL陰性的母嬰的臍帶血樣品的aPL測(cè)定結(jié)果。
圖15的表格概括了來自正常aPL陰性受試者的血液樣品的aPL測(cè)定結(jié)果，其按照在實(shí)施例的開頭部分所描述的方法溫育，特征為用硝普酸鈉(SNP)替代溫育混合物中的RBC。
圖16的表格概括了按照在實(shí)施例的開頭部分描述的方法溫育的血液樣品的狼瘡抗凝血?jiǎng)┗钚詼y(cè)定結(jié)果。在采用本發(fā)明的步驟使血清轉(zhuǎn)化之前從血液的狼瘡抗凝血?jiǎng)殛幮缘氖茉囌咧蝎@得血液樣品。
圖17的表格列出了血液樣品中已鑒定出的其它類型的自身抗體，所述血液樣品按照在實(shí)施例的開頭部分描述的方法溫育。列出的抗體通過免疫熒光顯微鏡檢術(shù)來鑒定。
圖18的圖表示，通過對(duì)密度梯度分離的人白細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)而確定的單核細(xì)胞細(xì)胞群的前向散射(forward scatter)(大小)和側(cè)向散射(sidescatter)(粒度)分布圖。
圖19A-D為流式細(xì)胞術(shù)柱狀圖，顯示了各種血清中的單核細(xì)胞活性。在該柱狀圖中，如果存在的話，抗體活性可通過沿著水平軸的中值通道值(medianchannel value)(對(duì)數(shù)標(biāo)度)的位移來測(cè)定。圖19A顯示了來自匯集的正常人血清(NHS)的單核細(xì)胞反應(yīng)活性。圖19B顯示了來自單個(gè)正常受試者的血清的單核細(xì)胞活性。圖19C顯示了來自圖19B中所示的受試者的血液樣品中的單核細(xì)胞活性，其中血液樣品按照在實(shí)施例的開頭部分描述的方法處理。圖19D顯示了陽性對(duì)照血清的單核細(xì)胞活性。
圖20的表格概括了采用RELISA篩選測(cè)定法的各種樣品的抗核抗體(ANA)測(cè)試結(jié)果。
圖21的表格概括了在tris緩沖液中與氯高鐵血紅素一起溫育的IvIg樣品的aPL測(cè)定結(jié)果。
圖22的圖表示在一系列與氯高鐵血紅素一起培養(yǎng)的IvIg制品中測(cè)定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(通過光密度測(cè)定，OD)，作為加入到制品中的人血清量(以μl為單位)的函數(shù)。
圖23的圖表示在一系列與氯高鐵血紅素一起培養(yǎng)的稀釋的人血清制品中測(cè)定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(通過光密度測(cè)定，OD)，作為加入到制品中的氯高鐵血紅素量(以μl為單位)的函數(shù)。
圖24的圖顯示以在一系列與氯高鐵血紅素和維生素C一起培養(yǎng)的IvIg制品中測(cè)定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)，作為加入到制品中的維生素C量(以μl為單位)的函數(shù)。
圖25的圖表示在一系列與NaOH溶解的氯高鐵血紅素、DMSO溶解的血卟啉IX(hpIX)、NaOH溶解的hpIX、只有NaOH、只有DMSO以及DMSO溶解的氯高鐵血紅素一起培養(yǎng)的IvIg制品中測(cè)定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)。
圖26的圖表示在一系列與漸增量的氯高鐵血紅素以及漸增量的氯高鐵血紅素和血液結(jié)合素(hpx)一起培養(yǎng)的IvIg制品中測(cè)定的aPS的量(通過光密度測(cè)定而測(cè)定，OD)。
圖27顯示了從三種細(xì)胞裂解產(chǎn)物獲得的Western印跡，用氯高鐵血紅素處理的IvIg，和未經(jīng)處理的IvIg作為初級(jí)抗體，還有其中以抗人HRP標(biāo)記的綴合物作為對(duì)照的印跡。
圖28A和28B的圖顯示在一系列IvIg制品中測(cè)定的aPL依賴型和aPL獨(dú)立型aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)，其中將連接著9伏特電池的電極浸入含有IvIg的磷酸緩沖鹽溶液中2分鐘。
圖29的圖表示在一系列IvIg制品中測(cè)定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)，其中將連接著6伏特電池的電極浸入含有IvIg的磷酸緩沖鹽溶液中60秒。
圖30的圖表示在一系列IvIg制品中測(cè)定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)，其中將連接著6伏特電池的電極浸入含有IvIg的磷酸緩沖鹽溶液中，作為浸入時(shí)間的函數(shù)。
圖31A、31B和31C的圖分別表示，在暴露于連接著6伏特電池的電極240秒之前和之后，在對(duì)照溶液中測(cè)定的aCL、aPE以及aPS的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)。
圖32的圖分別顯示在用PBS稀釋的aPS與aCL陽性患者血清中測(cè)定的aPS以及aCL的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)。在該實(shí)驗(yàn)中，將連接著6伏特電池的石墨電極浸入稀釋的血清中不同的時(shí)間。
圖33的圖分別顯示在用PBS稀釋的aPE陽性患者血清中測(cè)定的aPS、aCL、aPE以及aPC的量(作為平均值的倍數(shù)而測(cè)定，MoMs)。在該實(shí)驗(yàn)中，將連接著6伏特電池的石墨電極浸入稀釋的血清中不同的時(shí)間。
圖34的圖分別顯示在用PBS稀釋的aPE陽性患者血清中測(cè)定的aPS、aCL以及aPE的量(通過光密度測(cè)定，OD)。在該實(shí)驗(yàn)中，通過將與6伏特電池相連的石墨電極浸入ABP中不同的時(shí)間，來處理用于測(cè)定蛋白質(zhì)依賴型aPL結(jié)合性的10％的成年牛血漿(ABP)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及改變生物流體或生物流體提取物中至少一種血漿蛋白質(zhì)或者循環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的方法。
如這里所使用的，術(shù)語“循環(huán)蛋白質(zhì)”和“血漿蛋白質(zhì)”用于指天然存在于動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)。循環(huán)蛋白質(zhì)的例子包括抗體和其它血漿蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法并不意味著對(duì)所有血漿蛋白質(zhì)或循環(huán)蛋白質(zhì)都適用，而是適用于具有這樣的特性的任何血漿蛋白質(zhì)或者循環(huán)蛋白質(zhì)，即具有可通過改變蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)而改變的結(jié)合專一性。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，存在具有這種特性的循環(huán)蛋白質(zhì)，如自身抗體，這構(gòu)成了本發(fā)明的基礎(chǔ)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有可通過改變氧化還原狀態(tài)而改變的結(jié)合專一性的非抗體蛋白質(zhì)的例子包括激肽原和凝血酶原和/或β2糖蛋白。
術(shù)語“屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)”是為本發(fā)明而新創(chuàng)造的，其特指并描述在正常個(gè)體的血液中存在的循環(huán)蛋白質(zhì)，但通過基于受體-配體結(jié)合的常規(guī)結(jié)合測(cè)定是不能檢測(cè)到的，因?yàn)樵谡€(gè)體中或者在取自正常個(gè)體的樣品中，其結(jié)合位點(diǎn)被屏蔽或者阻斷，或者被阻止與抗原相結(jié)合，而且，當(dāng)含有屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)的樣品通過改變其氧化還原狀態(tài)進(jìn)行處理時(shí)，例如按照本發(fā)明的方法，通過暴露于氧化劑或者電流中，所述循環(huán)蛋白質(zhì)變得能夠與抗原結(jié)合，因此在樣品中變得可檢測(cè)到。屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是自身抗體。如同本發(fā)明的發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的那樣，自身抗體在正常血液中以顯著的量循環(huán)，但是在基于抗體-抗原結(jié)合的常規(guī)測(cè)定中是不可測(cè)得的。如這里所探討的那樣，當(dāng)自身抗體受到足以改變其結(jié)合專一性的的氧化-還原條件時(shí)，自身抗體變得可檢測(cè)并可回收。已通過氧化去屏蔽的自身抗體包括抗磷脂抗體、抗核仁(硬皮病相關(guān))抗體、抗核纖層蛋白(核孔處非常明亮的部分)抗體、抗線粒體(細(xì)胞質(zhì))抗體、以及抗中心粒抗體。此外還發(fā)現(xiàn)，最初檢測(cè)為HCV(丙型肝炎病毒)陰性的血液、血清或者IvIg樣品在按照本發(fā)明的方法處理后，其HCV檢測(cè)為陽性，表明在正常個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中存在屏蔽的抗-HCV抗體。
術(shù)語“改變蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性”指的是使蛋白質(zhì)改變或變化的過程，例如通過氧化或者還原，使其與先前不能專一性結(jié)合的抗原或者配體變得能夠?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，或者使其與先前能專一性結(jié)合的抗原或者配體變得不能專一性結(jié)合。術(shù)語“去屏蔽”指的是改變屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的過程，使得該蛋白質(zhì)變成可以通過基于改變了的結(jié)合專一性的結(jié)合測(cè)定而測(cè)得。
術(shù)語“自身抗體”指的是由動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生并與自身抗原結(jié)合的任何天然存在的抗體，自身抗原也就是動(dòng)物自身產(chǎn)生的化合物或者抗原。
術(shù)語“生物流體”包括任何包含循環(huán)蛋白質(zhì)的體液，包括血漿、血清和全血、唾液、尿液、乳液和其它分泌物。術(shù)語“含蛋白質(zhì)的生物流體提取物”指的是任何從生物流體中收集或者分離的制品，例如免疫球蛋白碎片?？捎糜诒景l(fā)明的血液、血清或者血漿可以是從個(gè)體中新鮮獲得的，也可以獲自諸如從血庫或者其它血液收集機(jī)構(gòu)中獲得的匯集的血液或血漿制品這樣的來源。出于本發(fā)明的目的，血液、血清或血漿還可來自過期或者被血庫或血液收集機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)為不符合標(biāo)準(zhǔn)的收集物。盡管這里的描述集中于人類血液、血漿和血清，但本發(fā)明的相同工序也可用于動(dòng)物血液，并可獲得類似的動(dòng)物抗體以用于獸醫(yī)學(xué)相關(guān)目的。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中采用的血液或者血清應(yīng)被稀釋以減少血液、血漿或者血清中可能存在的任何抗氧化劑。
在本發(fā)明的方法中，生物流體中的至少一種循環(huán)蛋白質(zhì)或者血漿蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性，通過將其暴露于氧化劑或者電流而發(fā)生改變。例如，屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性可被改變，從而使該蛋白質(zhì)去屏蔽，也就是說，使其能夠與在采用本發(fā)明的方法之前不能結(jié)合的抗原結(jié)合。然后通過基于專一性結(jié)合的分離方法，將具有改變的結(jié)合專一性的蛋白質(zhì)分離并回收。
如果采用氧化劑來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，氧化劑可以是任何能夠改變生物分子的氧化還原狀態(tài)的化合物。更具體地，氧化劑是能夠作為其它作為電子供體的分子的電子受體而被還原的分子。氧化劑的例子包括但不限于氯高鐵血紅素、葉綠素或者其它含有強(qiáng)氧化性金屬的環(huán)狀化合物，以及KMnO4。通常，當(dāng)采用氧化劑時(shí)，生物流體或其提取物與氧化劑的混合物必須溫育一段時(shí)間，通常約為一天或者過夜。使用的氧化劑的濃度應(yīng)當(dāng)足以改變具有可改變的結(jié)合專一性的蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性，但其濃度又不能對(duì)蛋白質(zhì)造成破壞。在自身抗體的情況下，研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的自身抗體可與不同的抗氧化劑發(fā)生不同的相互作用。例如，對(duì)于aPC自身抗體的去屏蔽來說，與氯高鐵血紅素的反應(yīng)結(jié)果不佳，但與KMnO4的反應(yīng)結(jié)果很好。
如果采用DC電流來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，本方法可通過任何供給電流的裝置來實(shí)現(xiàn)，例如通過將陽極和陰極電極浸入含有待處理樣品的導(dǎo)電溶液中。通常，含有生物流體的溶液可暴露于具有足夠大小和足夠持續(xù)時(shí)間的電勢(shì)以便能改變具有可改變的結(jié)合專一性的蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性。研究發(fā)現(xiàn)，通過將溶液暴露于6-24伏特的電勢(shì)下數(shù)秒到數(shù)分鐘，就可得到陽性結(jié)果。如同在實(shí)施例中討論的那樣，在電流中的暴露時(shí)間延長可導(dǎo)致結(jié)合專一性的改變的可逆性。
采用AC電流來產(chǎn)生陽性結(jié)果的努力沒有成功。
不束縛于特定的理論，在自身抗體的情況下，優(yōu)選地，該自身抗體以足以氧化該自身抗體的Fab部分的抗原結(jié)合位點(diǎn)的量或時(shí)間暴露于氧化劑或者電流。
特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)是否具有可通過改變其氧化還原狀態(tài)而改變的結(jié)合專一性，以及任何改變?cè)撎囟康牡鞍踪|(zhì)的結(jié)合專一性的一系列條件的有效性，可以很容易地通過ELISA或者其它的配體-受體測(cè)定來檢測(cè)。這些測(cè)定可在對(duì)蛋白質(zhì)施加氧化還原條件之前和之后來進(jìn)行，以觀察該過程是否改變了該蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性。例如，回收特定自身抗體的最好氧化劑可以很容易地通過簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來確定。
本發(fā)明的另一方面是通過給受試者施以足以使該受試者中的自身抗體失活的量的抗氧化劑，或者通過抽取受試者的血液樣品，將該血液樣品暴露于足以使所述血液樣品中的自身抗體失活的抗氧化劑或者電流中，然后將血液樣品返回到受試者體內(nèi)，來治療患有自身免疫疾病的受試者的可能性。
本發(fā)明的另一方面是一種方法，即篩選正常個(gè)體的生物流體或提取物以測(cè)定哪些自身抗體被屏蔽，并由此構(gòu)建如果經(jīng)氧化或電動(dòng)勢(shì)而被暴露或去屏蔽，能在該個(gè)體中引起自身免疫疾病的自身抗體的潛在抗體分布圖。例如，概括地說，取自受試者的血液、血漿或血清樣品可通過檢測(cè)來確定樣品中可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型。其后，取自受試者的血液、血漿或血清樣品可通過將樣品暴露給氧化劑或者DC電流來進(jìn)行處理，通過檢測(cè)該處理后的來自受試者的血液、血漿或血清樣品，可確定該處理的樣品中可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型。其后，可將處理步驟之前樣品中可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型，與處理步驟之后樣品中可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型進(jìn)行比較。
研究發(fā)現(xiàn)，未處理的血液、血漿、血清或者IvIg樣品和按照本發(fā)明的方法處理的血液、血漿或血清或者IvIg樣品可以冷凍干燥并運(yùn)輸或者儲(chǔ)存。當(dāng)樣品復(fù)原時(shí)，它們保持各自的活性。
實(shí)施例在對(duì)本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了描述的情況下，給出下列實(shí)施例來解釋本發(fā)明的具體應(yīng)用，包括現(xiàn)在已知的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式。這些實(shí)施例大致按時(shí)間先后循序呈現(xiàn)，因此顯示了對(duì)達(dá)到本發(fā)明效果的成分和步驟的認(rèn)識(shí)進(jìn)程。這些具體的實(shí)施例并不意味著限制了本申請(qǐng)中所述的發(fā)明范圍。
關(guān)于這里描述的實(shí)施例1-17中的每一個(gè)，除非另外指明，通常采用下列步驟將取自aPL陰性的正常受試者的10ml的全血或者5ml的血清或血漿樣品，和4-5ml包裝的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞，加入到含有30ml Biomerieux牌細(xì)菌生長培養(yǎng)基(至少含有下列成分蒸餾水、胰酶解豆酪蛋白培養(yǎng)液、酵母提取物；葡萄糖；蔗糖；氯高鐵血紅素；甲萘醌(維生素K3)；鹽酸吡哆醛(維生素B6)；以及磺酸聚茴香腦鈉(sodium polyanetholesulfonate，SPS)和炭)的小瓶中。然后，在37℃下以搖動(dòng)或振蕩的方式溫育該混合物18-22小時(shí)。溫育并離心后，采用能提供24個(gè)分開的aPL檢測(cè)結(jié)果的綜合性內(nèi)部ELISA aPL形式，來檢測(cè)溫育后的血液或血清/RBC樣品中抗磷脂抗體(aPL)的存在。該檢測(cè)步驟在下列出版物中有更為詳細(xì)的描述，這些出版物在此引用作為參考Wagenknecht DR等，The Evolution，Evaluation and Interpretation of AntiphospholipidAntibody Assays，Clinical Immunology Newsletter，Vol.15 No.2/3(1995)pp28-38和Mclntyre JA等，F(xiàn)requency and Specificities of AntiphospholipidAntibodies(aPL)in Volunteer Blood Donors，Immunobiology 207(1)59-63，2003。
圖1顯示了通過采用綜合性內(nèi)部ELISA aPL形式測(cè)得的24個(gè)分開的aPL專一性。評(píng)估了四種專一性，1)aPS＝抗磷脂酰絲氨酸，2)aCL＝抗心磷脂，3)aPE＝抗磷脂酰乙醇胺，以及4)aPC＝抗磷脂酰膽堿。對(duì)于這些aPL專一性中的每一種，都找出了三種免疫球蛋白同種型IgG、IgA和IgM。分別在緩沖液稀釋添加物，10％的成年牛血漿(ABP，其含有磷脂結(jié)合性血漿蛋白質(zhì))或者1％牛血清蛋白(BSA，其缺乏磷脂結(jié)合性血漿蛋白質(zhì))存在(依賴)和不存在(獨(dú)立)時(shí)，評(píng)測(cè)每種專一性和每種同種型。受試者血液樣品的最終稀釋度為1/50到1/100之間。
在附圖中給出了這里描述的各種實(shí)驗(yàn)的24個(gè)aPL專一性結(jié)果。陽性/陰性判定結(jié)果以基于來自775位正常血液供體的測(cè)試血漿樣品的平均值的倍數(shù)(MoM)表示，如在上述Mclntyre JA，Immunobiology中所描述的?！?++”的存在表示抗體活性強(qiáng)。標(biāo)記“+”和“++”分別表示抗體活性低和中等。這些圖中還給出了每個(gè)aPL專一性和同種型組合的正常范圍值。
在標(biāo)示為PL結(jié)合蛋白質(zhì)“依賴型”的列中的陽性結(jié)果意味著，抗磷脂抗體(aPL)實(shí)際上是與最初已結(jié)合于所示特定磷脂的血漿蛋白質(zhì)相結(jié)合。通?？膳cPS和CL結(jié)合的血漿蛋白質(zhì)包括如下β2-糖蛋白I、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、膜聯(lián)蛋白V(annexinV)以及補(bǔ)體成分因子H和C4(例如，參見Mclntyre，J.A.，Wagenknecht，D.R.和Faulk，W.P.，Antiphospholipid antibodiesDiscovery，definition，detection and disease。Prog.Lipid Res.42(3)176-237，182頁)。對(duì)于所有磷脂來說，血漿蛋白質(zhì)結(jié)合的生理特性并沒有知道得很精確，但是這種結(jié)合被認(rèn)為誘導(dǎo)了血漿蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，因此將隨后被個(gè)體的自身抗體靶定的新的或者隱蔽的表位暴露出來。通常可與磷脂PE結(jié)合的血漿蛋白質(zhì)包括如下高或者低分子量的激肽原，和因子IX和激肽釋放酶原。后兩種蛋白質(zhì)可通過它們與高分子量激肽原的結(jié)合中的重現(xiàn)精度(fidelity)來檢測(cè)。與PC結(jié)合的血漿蛋白質(zhì)至今還末界定。在一些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)血漿蛋白質(zhì)獨(dú)立型aPL進(jìn)行了研究(見圖3)。一種對(duì)這種活性的可能解釋為，其表示了存在殘余的原始血液樣品中存在的磷脂結(jié)合性血漿蛋白質(zhì)。
實(shí)施例1將來自正常受試者的血液樣品按照上述過程進(jìn)行溫育并檢測(cè)。aPL ELISA的結(jié)果在圖2中顯示。如圖2所示，與正常范圍列中顯示的正常、未處理的血液相比，溫育后的血液樣品顯示了自身抗體活性的大量存在。特別地，對(duì)于aPS(IgG)、aCL(所有同種型)和aPE(IgG)的蛋白質(zhì)依賴型種類顯示了強(qiáng)烈的自身抗體活性。IgG aPC的自身抗體活性低或者不存在是在較早采用氯高鐵血紅素作為氧化劑的實(shí)施例和過程中的一個(gè)特征性發(fā)現(xiàn)。該結(jié)果表明，PC的自身抗體，尤其是IgG同種型，是不同的，而且或許不能以與其它自身抗體相同的方式被活化。在后來的實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)，在采用KMnO4處理的樣品中也能檢測(cè)到明顯的aPC水平(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例2將從7位健康的受試者上采集的血液樣品按照上述步驟溫育并檢測(cè)。特別地，所有7位受試者的血液均在20分鐘的時(shí)間段內(nèi)抽取，并在相同的條件下溫育20小時(shí)。圖3是表示這7份樣品的aPL血清轉(zhuǎn)化范圍的綜合表格。這些結(jié)果表明，測(cè)得的aPL水平是變化的，同時(shí)在不同個(gè)體之間存在同種型。然而，如同本發(fā)明所顯示的那樣，每個(gè)個(gè)體都具有在溫育后可測(cè)得的aPL抗體。
實(shí)施例3在第一個(gè)試驗(yàn)中，將來自正常受試者的血清樣品按照上述基本步驟進(jìn)行溫育并檢測(cè)。在溫育混合物中，采用馬紅細(xì)胞(RBC)來代替人RBC。aPL ELISA的結(jié)果顯示于圖4中。如圖4所示，得到了明顯的aPL活性，特別是與aPS(IgG和IgM)和aCL(IgA和IgM)相關(guān)的活性。
在第二個(gè)試驗(yàn)中，按照上述基本步驟，以馬血清替代人血清與人RBC一起溫育，并進(jìn)行檢測(cè)。aPL ELISA的結(jié)果顯示于圖5中。如圖5所示，沒有檢測(cè)到aPL活性。(用于該試驗(yàn)的ELISA采用人抗體專一性堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體探針來檢測(cè)aPL，因此溫育的樣品中是否存在馬aPL是未知的。)圖4和5中顯示的概括結(jié)果清楚地表明，在本發(fā)明的血清轉(zhuǎn)化步驟過程中得到的所有aPL均來源于人血清，而且不是由人RBC釋放出來的，因?yàn)榈谝粋€(gè)試驗(yàn)中采用了缺乏人抗體的馬RBC來替代人RBC，但仍然顯示了陽性結(jié)果，相反，在第二個(gè)試驗(yàn)中在存在人RBC的情況下使用馬血清，但顯示了陰性結(jié)果。
實(shí)施例4將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，除溫育在室溫(22℃)下進(jìn)行，來代替較高的溫度以外。圖6顯示，當(dāng)在室溫下溫育時(shí)，樣品沒有發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果表明，血清轉(zhuǎn)化步驟可能是溫度敏感的。
實(shí)施例5將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，其特征在于采用0.7mm Degalan(塑料)小珠作為溫育混合物中的顆粒狀固體來代替炭。由于在最初顯示血清轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)中采用了炭，進(jìn)行該試驗(yàn)用于測(cè)定炭是否在血清轉(zhuǎn)化過程中起著特殊的作用。圖7顯示，即使是使用塑料小珠來替代炭，樣品也表現(xiàn)出了血清轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果表明，本質(zhì)上，炭的作用是機(jī)械的，而不是化學(xué)的，而且任何顆粒狀固體都可采用，例如塑料、樹脂或者玻璃珠。不限于任何特定理論，可以推理出該顆粒狀成分起到了RBC膜的磨料的作用，通過與RBCAE1/Band 3蛋白或者SNO-血紅蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)分子相互作用，或者與二者都相互作用，可能引起NO離子從RBC中釋放。這種機(jī)械磨損的可能性得到了實(shí)施例6中的觀察結(jié)果的支持，其中未搖動(dòng)或振蕩的溫育混合物顯示了陰性檢測(cè)結(jié)果。特定的固相還起到幫助自身抗體釋放的機(jī)械作用。
實(shí)施例6將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，但溫育混合物保持靜止，而不是振蕩或者搖動(dòng)。圖8顯示，當(dāng)保持靜止時(shí)樣品沒有發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)可有助于固體顆粒與RBC之間的相互作用。靜止的溫育條件不促進(jìn)aPL的釋放，盡管少量的運(yùn)動(dòng)，例如將樣品轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，可導(dǎo)致少量aPL的釋放。
實(shí)施例7將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，但增加的特征為在溫育以及離心除去RBC和炭后，將溫育混合物加熱到56℃ 30分鐘。圖9顯示通過該過程，檢測(cè)到的aPL的量明顯增加。
實(shí)施例8將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，其特征在于采用來自不同供應(yīng)商(Becton Dickinson，Sparks，MD)的細(xì)菌生長培養(yǎng)基來代替來自Biomerieux的細(xì)菌生長培養(yǎng)基。圖10顯示在Becton Dickinson培養(yǎng)基中的樣品表現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)化，表明本發(fā)明的方法不依賴于來自特定供應(yīng)源的細(xì)菌生長培養(yǎng)基。
實(shí)施例9將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，其特征在于以厭氧條件下(氮?dú)鈼l件下)的溫育來代替需氧條件下(氧氣和CO2存在條件下)的溫育。圖11顯示，即使是在厭氧條件下，樣品也表現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)化，因此本發(fā)明的方法不依賴于需氧的環(huán)境。
實(shí)施例10將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，其特征在于采用K562細(xì)胞(人類造血腫瘤細(xì)胞系)來代替紅細(xì)胞。此外，與在本發(fā)明的方法中通常采用3-4ml包裝的RBC相比，在培養(yǎng)基中僅存在1130萬個(gè)K562細(xì)胞。圖12顯示，樣品呈現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)化。
其它實(shí)驗(yàn)顯示，與其它分離的細(xì)胞類型，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞一起溫育的樣品通常不呈現(xiàn)aPL血清轉(zhuǎn)化。特別地，不僅淋巴和骨髓系列的白細(xì)胞不支持aPL的釋放，而且稱為L14的豬B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞系也不支持其釋放(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，血紅蛋白可能是溫育混合物中的關(guān)鍵成分，因?yàn)镵562細(xì)胞和RBC都含有血紅蛋白，而淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞不含。
實(shí)施例11將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，但除細(xì)菌生長培養(yǎng)基被用于生長人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI代替以外。圖13顯示沒有血清轉(zhuǎn)化發(fā)生。該試驗(yàn)表明了用于本發(fā)明目的的細(xì)菌培養(yǎng)基中的一些成分的重要性。而RPMI是一種設(shè)計(jì)為培養(yǎng)人細(xì)胞的培養(yǎng)基，但當(dāng)其代替小瓶培養(yǎng)液時(shí)，它不能支持aPL的釋放。這兩種不同的微生物小瓶培養(yǎng)液(microbiology vial broth)與RPMI的成分列表和比較表明，RPMI中缺少氯高鐵血紅素和稱為維生素K3的甲萘醌(一種人工制備的前維生素K)。眾所周知，氯高鐵血紅素是源自RBC的(Fe+++)離子的卟啉螯合劑，甲萘醌是一種脂溶性維生素。這表明在自身抗體的釋放中，氧化還原反應(yīng)可能起作用。
實(shí)施例12將胎盤臍帶血樣品按照上述基本步驟培養(yǎng)并檢測(cè)。胎盤臍帶血在嬰兒出生后和胎盤與子宮壁分離前抽取。在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定中，母親的血液和嬰兒臍帶血中都沒有顯示出有aPL存在。當(dāng)按照這里描述的本發(fā)明的方法處理后，證明了臍帶血樣品中存在強(qiáng)的aPL抗體活性，如圖14所示。這些抗體僅為IgG，這一觀察結(jié)果是與抗體來源于母體相一致的。由于在出生前母親將IgG輸送到胎兒體內(nèi)，該實(shí)驗(yàn)似乎表明，通過滋養(yǎng)層上的特定Fcγ受體(FcγRn)傳遞給胎兒的屏蔽的母體自身抗體，在胎兒血液中仍然保持被胎兒屏蔽。由于在通過本發(fā)明的方法進(jìn)行血清轉(zhuǎn)化之前，母親的血液和臍帶血都顯示為aPL陰性，而且由于沒有檢測(cè)到IgM或IgA免疫球蛋白的存在，因此這些結(jié)果支持了在血清轉(zhuǎn)化之后臍帶血中觀察到的IgG aPL是來源于母體的觀點(diǎn)。而且有趣的是，表達(dá)FcγRn的滋養(yǎng)層并沒有表達(dá)HLA抗原。
實(shí)施例13將來自正常受試者的血漿樣品按照上述基本步驟溫育并檢測(cè)，其特征在于用硝普酸鈉(SNP，200μM)代替溫育混合物中的RBC。圖15顯示樣品表現(xiàn)出了血清轉(zhuǎn)化。
由于SNP是強(qiáng)的一氧化氮(NO)供體，因此這些結(jié)果給出了在自身抗體釋放過程中涉及NO自由基的支持證據(jù)，并進(jìn)一步支持了RBC和固體顆粒起到從RBC供給NO-作用的理論。除硝普酸鈉以外的其它自由基介導(dǎo)的反應(yīng)也可引起自身抗體釋放。
實(shí)施例14將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育，并檢測(cè)其狼瘡抗凝血?jiǎng)┗钚?。狼瘡抗凝血?jiǎng)┗蛘咭种苿┦橇硪环N類型的aPL，通常僅能通過功能性實(shí)驗(yàn)室測(cè)定而被檢測(cè)到。圖16中的結(jié)果顯示，在取自狼瘡抑制劑陰性的個(gè)體并按照本發(fā)明的方法處理的血清轉(zhuǎn)化的血液中有強(qiáng)的狼瘡抗凝血?jiǎng)?LA)活性。在dRVVT測(cè)定中當(dāng)通過將正常血漿加入到血清轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)液中以進(jìn)行初始校正時(shí)，溫育1-2小時(shí)會(huì)導(dǎo)致抑制劑的重新出現(xiàn)。建議該時(shí)間幀(time frame)為LA或者未屏蔽的抗體與通過混合研究所引入的相關(guān)磷脂結(jié)合血漿蛋白質(zhì)結(jié)合所花費(fèi)的時(shí)間。由于按1∶1的混合提供了足夠的凝血因子水平來校正凝血因子不足的樣品中的凝血時(shí)間，因而其還排除了凝血因子不足的可能性。正常血漿存在時(shí)，稀釋的凝血酶原時(shí)間(dPT)不校正，并在用正常血漿溫育后觀察到凝血時(shí)間延長，表明了強(qiáng)狼瘡抑制劑的存在。
實(shí)施例15將來自5位正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育，并通過熒光顯微鏡檢術(shù)來檢測(cè)其它類型的自身抗體的存在。在按照本發(fā)明的教導(dǎo)處理之前，來自這5位個(gè)體的血清和血漿樣品為陰性。圖17中列出了采用Hep-2細(xì)胞系鑒定的另外的自身抗體的專一性。鑒定了抗核仁(硬皮病相關(guān))、抗核纖層蛋白(在核孔處非常亮)、抗線粒體(細(xì)胞質(zhì))以及抗中心?？贵w。結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明的方法釋放的自身抗體還可通過不同的檢測(cè)方法，如與基于ELISA的檢測(cè)相對(duì)的熒光顯微鏡檢術(shù)來檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)，除aPL以外還有許多種類型的自身抗體，在其血清和血漿于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室分析中對(duì)于這些抗體檢測(cè)為陰性的個(gè)體的血液中被屏蔽。
從這些結(jié)果可以預(yù)期，還有更多的自身抗體專一性等待通過檢測(cè)經(jīng)本發(fā)明處理的血液來發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例16將來自正常受試者的血液樣品按照上述基本步驟溫育，并采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光綴合的抗人IgG抗體來檢測(cè)其與單核細(xì)胞的反應(yīng)性。采用未處理的集中的(untreated-pooled)正常人血清(NHS)，來自本發(fā)明使用的同一正常受試者的血清，和陽性對(duì)照人血清進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。(處理后的血液顯示沒有與淋巴細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞的自身反應(yīng)性；這些數(shù)據(jù)沒有顯示。)圖18示出了通過流式細(xì)胞術(shù)確定的正常受試者的單核細(xì)胞細(xì)胞群的前向散射(尺寸)和側(cè)向散射(粒度)分布圖。該單核細(xì)胞細(xì)胞群通過顯示與CD14單克隆抗體的反應(yīng)性來確定。圖19A顯示了與NHS的抗單核細(xì)胞反應(yīng)性。在線性標(biāo)尺上顯示的中值反應(yīng)性(median reactivity)為743.50。圖19B顯示了正常受試者血清的自身-抗-單核細(xì)胞活性；該受試者不具有對(duì)自身單核細(xì)胞的抗體活性。顯示的中值反應(yīng)性為737.00。圖19C顯示了按照本發(fā)明的方法處理后，取自圖19B中顯示的受試者的血液樣品的自身-抗-單核細(xì)胞活性。中值顯示為864.00，表明存在強(qiáng)的自身-抗-單核細(xì)胞活性。盡管按照本發(fā)明的教導(dǎo)處理的血漿按1/8的稀釋度使用，但與未稀釋的陽性對(duì)照血清相比，其顯示了更高的與單核細(xì)胞的反應(yīng)性。因此，該實(shí)施例表明，按照本發(fā)明的方法處理的血液或者血清樣品釋放了以單核細(xì)胞作為專一性靶標(biāo)的自身抗體。當(dāng)按照本發(fā)明的教導(dǎo)進(jìn)行處理時(shí)，同樣的結(jié)果也從來自其他個(gè)體的另外4份樣品中得到了證實(shí)。
實(shí)施例17采用RELISA篩選測(cè)定法，就抗-核-抗體(ANA)的存在進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)未處理的臍帶血清；按照本發(fā)明的方法進(jìn)行無搖動(dòng)溫育的臍帶血；按照本發(fā)明的方法進(jìn)行處理并搖動(dòng)的臍帶血；來自ANA-陰性健康供體(鑒定為ACS)的未處理血清；以及來自相同ANA-陰性健康供體并按照本發(fā)明的方法溫育的血清。如圖20中所示，在按照本發(fā)明的方法處理的臍帶血和血清樣品中檢測(cè)到了顯著數(shù)量的ANA。根據(jù)圖16和17中的結(jié)果，可以預(yù)計(jì)還有更多的自身抗體專一性等待通過檢測(cè)經(jīng)本發(fā)明處理的血液來發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例18
為了弄清紅細(xì)胞在自身抗體釋放現(xiàn)象中的作用，設(shè)計(jì)了采用可模仿紅細(xì)胞行為的更簡(jiǎn)單的成分來取代紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，紅細(xì)胞和炭被硝普酸鈉(SNP)和三氯化鐵所替代。由于硝普酸鈉是強(qiáng)的一氧化氮制造者，而且眾所周知RBC是NO-的載體，因而進(jìn)行這種替代。加入三氯化鐵(FeCl3母液，25uM)作為血紅蛋白中鐵離子的替代物。
將裝有細(xì)菌生長培養(yǎng)基和5ml人血漿或血清以及各種濃度的硝普酸鈉(SNP，200μm)和外源三氯化鐵(終濃度為4.1μm)(用于代替紅細(xì)胞和炭)的培養(yǎng)瓶，37℃下溫育然后加熱到56℃ 30分鐘。樣品顯示了aPL的血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，但僅有IgG(數(shù)據(jù)未顯示)。
該結(jié)果表明，在抗體去屏蔽時(shí)可能涉及NO-，并表明培養(yǎng)瓶中的固相材料的機(jī)械作用使紅細(xì)胞破碎并釋放NO-?；蛘撸琋O的釋放和改變可導(dǎo)致血紅蛋白分子參與氧化還原反應(yīng)。
實(shí)施例19為了確定將自身抗體去屏蔽的效果是否是由于血清或者血液中含自身抗體的大分子結(jié)構(gòu)的降解引起，或者是否由抗體本身的結(jié)合專一性的直接改變所引起，進(jìn)行了一系列采用商業(yè)靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IvIg)來代替人血漿或者血清的實(shí)驗(yàn)。商業(yè)IvIg是來自多個(gè)供體的集中的血漿的酒精沉淀級(jí)分，通常來自1000-10000個(gè)供體。典型地，IvIg主要包含IgG，并通常沒有IgA、IgM和其它血漿蛋白質(zhì)。當(dāng)通過ELISA測(cè)試來測(cè)定未處理的IvIg中的自身抗體的存在時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。由于其制備方式，IvIg還不含脂蛋白微球、囊泡或其它大分子結(jié)構(gòu)。因此，如果溫育處理后IvIg的自身抗體的存在檢測(cè)為陽性，則必然該自身抗體是通過已經(jīng)存在于IvIg制品中的IgG抗體的改變而獲得的，而不是通過隱藏自身抗體的結(jié)構(gòu)或者囊泡的降解來獲得的。
在下面的實(shí)施例中，使用的商業(yè)IvIg制品為凍干的IvIg(Immune GlobulinIntravenous(Human)Gammar-PI.V.，Aventis Behring，Kankakee，Illinois)。
5克商業(yè)的凍干IvIg的制品在無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS，100mg/ml)中復(fù)原。將1.7ml復(fù)原的IvIg溶液加入到裝有細(xì)菌生長培養(yǎng)基(不含紅細(xì)胞和炭)的培養(yǎng)瓶中，并于37℃溫育20小時(shí)。經(jīng)溫育的混合物顯示了血清轉(zhuǎn)化和aPL IgG的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。(如同預(yù)期的那樣，僅檢測(cè)到IgG，而沒有檢測(cè)到IgA或者IgM)。
在相似的試驗(yàn)中，在室溫下于搖瓶中溫育的混合物中檢測(cè)到了自身抗體，但結(jié)果不象在37度下的那么好(結(jié)果未示出)。
將IvIg-細(xì)菌生長培養(yǎng)基混合物加熱到37℃以上并不能帶來自身抗體的進(jìn)一步增加。
作為對(duì)照，直接將IvIg從培養(yǎng)瓶中取出來檢測(cè)aPL和其它自身抗體，結(jié)果為陰性。
實(shí)施例20在實(shí)施例19中，表明自身抗體可通過在細(xì)菌生長培養(yǎng)基中溫育商業(yè)IvIg制品來獲得。下一步是試圖測(cè)定細(xì)菌生長培養(yǎng)基中哪些成分在產(chǎn)生可檢測(cè)的自身抗體中起著作用。
首先，將2％胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)(其含有酪蛋白的胰消化物(pancreaticdigest)大豆的木瓜消化物(papaya digest)＝17∶3的蛋白胨)(余量為水)中的IvIg在37℃下振蕩溫育20小時(shí)。檢測(cè)經(jīng)溫育的混合物中aPL的存在，結(jié)果為陰性。
接著，將IvIg在含有大豆培養(yǎng)液、硝普酸鈉(SNP)和氯高鐵血紅素(一種含鐵(三價(jià)鐵)的原卟啉)的試管中于37℃下振蕩溫育20小時(shí)。采用的量為在總量為1ml的大豆培養(yǎng)液中含60微升的IvIg，5微升的SNP和5微升的氯高鐵血紅素。經(jīng)溫育的混合物中aPL的存在測(cè)定為陽性，特別是aPS(15MoM)和aPE(41MoM)。(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例21進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來測(cè)定只使用氯高鐵血紅素的溫育是否足以在IvIg中或者在血漿或血清中引起自身抗體的出現(xiàn)。
將復(fù)原的凍干IvIg(濃度為100mg/ml)加入含有氯高鐵血紅素的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中并在37℃下溫育20小時(shí)。使用量為300μl的IvIg溶液，5μl的氯高鐵血紅素溶液(75μg)，總體積為1ml。
如圖21所示，經(jīng)溫育的混合物顯示了顯著量的aPS和aPE的IgG，以及較少量的aCL的IgG。
當(dāng)血清或者血漿與氯高鐵血紅素在相似的條件下溫育時(shí)，沒有檢測(cè)到自身抗體。
實(shí)施例22
當(dāng)IvIg與氯高鐵血紅素一起培養(yǎng)可獲得自身抗體存在的陽性結(jié)果，相反，當(dāng)血清或者血漿與氯高鐵血紅素一起培養(yǎng)卻獲得陰性結(jié)果，這一事實(shí)表明，血清或者血漿可能含有抑制或者干擾獲得自身抗體的過程的物質(zhì)。
在一系列實(shí)驗(yàn)中，與實(shí)施例21中的步驟相似，IvIg在Tris緩沖液中與氯高鐵血紅素一起在37℃下溫育20小時(shí)，但增加了在溫育前將逐漸增加量的人血清(發(fā)明人的)加入到這些批料(batch)中這樣的特征。檢測(cè)每一批中aPS、aCL、aPE和aPC自身抗體的存在，結(jié)果顯示于圖22中。圖22中顯示的結(jié)果表明，增加量的血清對(duì)抗磷脂抗體的釋放具有抑制效應(yīng)。當(dāng)以血漿代替血清時(shí)顯示了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)于這些結(jié)果的一種可能的解釋是，含有三價(jià)鐵狀態(tài)的鐵分子并已知可作為活性氧化劑的氯高鐵血紅素，可起到氧化某些免疫球蛋白分子的結(jié)合位點(diǎn)的作用，從而使改變的結(jié)合位點(diǎn)能夠與自身的抗原結(jié)合。該過程可被血液中的一些物質(zhì)，可能是抗氧化劑所抑制。
實(shí)施例23用Tris緩沖液將人血清(發(fā)明人的)稀釋至1/10。在一系列實(shí)驗(yàn)中，1ml為一批的這種稀釋的血清與逐漸增加量的氯高鐵血紅素一起溫育，具體是，0μ1、10μl、25μl、50μl。(以前發(fā)現(xiàn)氯高鐵血紅素本身不足以引起自身抗體從血液或血清中釋放，盡管其足以引起從IvIg中的釋放。因此，對(duì)血清進(jìn)行稀釋的目的是稀釋任何血液中存在的干擾物質(zhì)的影響，例如抗氧化劑。)測(cè)定這些批中aPS、aCL、aPE、aPC自身抗體的存在，結(jié)果顯示于圖23中。圖23中顯示的結(jié)果表明，盡管當(dāng)加入0或者10μl的氯高鐵血紅素時(shí)，沒有檢測(cè)到明顯量的自身抗體，但加入25μl的氯高鐵血紅素時(shí)，可以檢測(cè)到明顯量的自身抗體。出于未知的原因，加入50μl的氯高鐵血紅素時(shí)，檢測(cè)到的自身抗體的量較少。
實(shí)施例24設(shè)計(jì)了下一系列試驗(yàn)來測(cè)定血液中存在的諸如維生素C的抗氧化劑是否能抑制自身抗體的釋放。在一系列實(shí)驗(yàn)中，IvIg在Tris緩沖液中與氯高鐵血紅素一起溫育，但增加了在加入IvIg之前和溫育前將逐漸增加量的抗壞血酸(維生素C)加入到含氯高鐵血紅素的緩沖液中并使其混合30分鐘這樣的特征。如圖24中所示，大約有78％的氯高鐵血紅素誘導(dǎo)的aPE的釋放被1mg的維生素C抑制，該維生素C的量代表了維生素C的生理濃度。存在aPS釋放的雙相曲線(biphasic curve)，其增加了低濃度的維生素C可作為氧化劑，但在高濃度時(shí)變成抗氧化(還原)劑的可能性。
實(shí)施例25設(shè)計(jì)了下一系列試驗(yàn)來測(cè)定氯高鐵血紅素溶解于其中的載體是否對(duì)獲得的結(jié)果有影響，以及氯高鐵血紅素中的鐵原子是否必須。在一系列實(shí)驗(yàn)中，IvIg在Tris緩沖液中與氯高鐵血紅素或與其它添加劑一起溫育。特別地，在一個(gè)例子中，氯高鐵血紅素用NaOH溶解。在另一個(gè)例子中，其用DMSO溶解。在其他例子中，采用一種與氯高鐵血紅素相同但不含鐵(Fe+++)的分子，血卟啉IX(hpIX)來替代氯高鐵血紅素，并用NaOH或DMSO溶解。在其它例子中，以NaOH和DMSO作為對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)(不加氯高鐵血紅素或者h(yuǎn)pIX)。如圖25所示，使用NaOH溶解的氯高鐵血紅素產(chǎn)生了自身抗體存在的陽性結(jié)果，而氯高鐵血紅素+DMSO、hpIX+NaOH、hpIX+DMSO、只有NaOH和只有DMSO都不產(chǎn)生陽性結(jié)果。
實(shí)施例26為了進(jìn)一步確認(rèn)氯高鐵血紅素引起抗體的氧化，將等摩爾量的血紅素結(jié)合蛋白(Hpx)加入到IvIg PBS氯高鐵血紅素混合物中。Hpx是一種對(duì)血紅素鐵具有極高結(jié)合親和力的抗氧化分子。購自SciPac(Kent，England)的凍干Hpx以10mg/ml在PBS中復(fù)原。圖26中顯示的為加入逐漸增加濃度的氯高鐵血紅素到IvIgG中，并相應(yīng)地加入等摩爾濃度的Hpx而得到的aPS的氧化還原數(shù)據(jù)。由于氯高鐵血紅素和Hpx而的結(jié)合相互作用為1∶1，所以Hpx能夠消除氯高鐵血紅素中存在的鐵離子的氧化還原能力。
實(shí)施例27為了說明可通過IvIg氧化處理得到的自身抗體的廣泛范圍和活性，采用氯高鐵血紅素處理的IvIg或者未處理的IvIg作為一級(jí)抗體，并采用抗-人HRP標(biāo)記的綴合物作為對(duì)照(HRP＝辣根過氧化物酶)，使用來自3種不同的細(xì)胞系的細(xì)胞裂解產(chǎn)物建立了一系列免疫印跡實(shí)驗(yàn)。印跡顯示于圖27中?！癇”裂解產(chǎn)物是取自淋巴瘤患者的稱為Raja的B淋巴細(xì)胞系?！癟”裂解產(chǎn)物是再次取自白血病患者的稱為Jurkat的T淋巴細(xì)胞來源的細(xì)胞系。U87MG裂解產(chǎn)物為惡性膠質(zhì)瘤母細(xì)胞系(腦癌)。還原的裂解產(chǎn)物以50mg/ml的濃度在凝膠中進(jìn)行電泳。為了獲得氯高鐵血紅素處理的IvIg制品，將75μg的氯高鐵血紅素與1ml含有6mgIvIgG的PBS結(jié)合。在37度下溫育20小時(shí)。在圖27中，將其中采用氯高鐵血紅素處理的IvIg作為一級(jí)抗體的印跡標(biāo)記為“測(cè)試IgG”；其中采用未處理的IvIg作為一級(jí)抗體的印跡標(biāo)記為“對(duì)照”，而將不采用一級(jí)抗體而施加了抗-人HRP-標(biāo)記的綴合物的印跡標(biāo)記為“Secondary”。氯高鐵血紅素處理和未處理的IgG制品分別稀釋1/1000。采用的抗-人HRP-標(biāo)記的綴合物稀釋度為1/5000。
這些數(shù)據(jù)清楚的顯示，與不顯示活性的未處理的IvIgG和綴合物對(duì)照相比，氯高鐵血紅素處理的IvIg對(duì)人細(xì)胞成分具有豐富的活性。
實(shí)施例28進(jìn)行了下一實(shí)驗(yàn)來測(cè)定除氯高鐵血紅素之外的氧化劑，特別是不含鐵的氧化劑是否能有效地使自身抗體去屏蔽。將25μg高錳酸鉀(KMnO4)以100μM的濃度和2mg的IvIg加入總體積為1ml的磷酸緩沖鹽溶液中，將該混合物于37℃下溫育過夜。在經(jīng)溫育的混合物中，可檢測(cè)到aPC和aPS。aCL通常能檢測(cè)到，但不能檢測(cè)到aPE(數(shù)據(jù)未顯示)。后來確定了為什么未檢測(cè)到aPE的原因是由于KMnO4改變了在ELISA檢測(cè)中使用的PE磷脂抗原。
實(shí)施例29在說明了自身抗體可通過氧化反應(yīng)去屏蔽以后，下一問題是是否電化學(xué)方法，例如電池提供的電動(dòng)勢(shì)能夠達(dá)到同樣的效果。
將IvIg溶解于磷酸緩沖鹽溶液中，并且在每個(gè)試驗(yàn)中，將鍍鋅鋼、銅、或者不銹鋼電極與9伏電池的正極和負(fù)極端子連接，并浸入到溶液中1-2分鐘。在該過程中，在溶液中觀察到起泡現(xiàn)象，而且PBS溶液的顏色發(fā)生了改變(當(dāng)采用銅導(dǎo)線時(shí)為藍(lán)色，采用不銹鋼導(dǎo)線時(shí)為棕色，采用鍍鋅鋼導(dǎo)線時(shí)為綠色)。如圖28A和28B中所示，處理的溶液在aPL依賴型測(cè)試中檢測(cè)到aPS、aCL、aPE和aPC自身抗體的存在為陽性，在aPL獨(dú)立型測(cè)試中檢測(cè)到aPS、aPE和aPC自身抗體的存在為陽性。
實(shí)施例30為了避免金屬與溶液相互作用從而確定只有電流的影響，采用石墨電極來代替金屬電極。石墨是惰性的，但能夠?qū)㈦娮觽鬟f到導(dǎo)電溶液中而不參與反應(yīng)。
將IvIg溶解于磷酸緩沖鹽溶液中，并將與6伏電池的正極和負(fù)極端子連接的石墨電極浸入到溶液中60秒。如圖29所示，處理的溶液檢測(cè)到aPS、aPE和aPC自身抗體的存在為陽性。
實(shí)施例31在涉及將電流施加到磷酸緩沖鹽溶液中的IvIg溶液中的實(shí)驗(yàn)之中，我們注意到pH明顯增加，可能是由于形成了NaOH。為了保持反應(yīng)在生理pH水平下進(jìn)行反應(yīng)，采用細(xì)胞培養(yǎng)基RMPI來代替磷酸緩沖鹽溶液。
進(jìn)行了下一系列實(shí)驗(yàn)來測(cè)定暴露于電流中的時(shí)間對(duì)自身抗體的去屏蔽的影響。將IvIg溶解于RMPI這種細(xì)胞培養(yǎng)基中，將與6伏電池的正極和負(fù)極端子連接的石墨電極以各種時(shí)間長度浸入溶液中。如圖30所示，在暴露于電流中60秒后得到了依賴型aPL的最大釋放。奇怪的是，在2分鐘到4分鐘的時(shí)間內(nèi)，aPL的量下降或者消失。
實(shí)施例32由于前面的實(shí)驗(yàn)表明aPL抗體能通過將IvIg暴露于電流后獲得，但進(jìn)一步暴露于電流中后aPL抗體會(huì)消失，因此下一問題是，自身抗體的去屏蔽是否能通過電流來逆轉(zhuǎn)。也就是說，陽性對(duì)照血清是否能處理成不再能檢測(cè)到自身抗體呢？在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過將與6伏電池的正極和負(fù)極端子連接的石墨電極浸入到按1∶400稀釋的aCL陽性對(duì)照血清、按1∶75稀釋的aPE陽性對(duì)照血清和按1∶400稀釋的aPS中至多240秒，使它們暴露于電流中。如圖31A-31C所示，每種對(duì)照血清各自的專一性都變成了陰性。
實(shí)施例33基于實(shí)施例32中的結(jié)果，下一要問的問題是，如果將患者的血清暴露于電流中，患有自身免疫疾病的患者的自身抗體是否能夠被重新屏蔽。將取自具有升高水平的aPS和aCL的患者的血清用磷酸緩沖鹽溶液按1/400稀釋(在PBS中的稀釋的量以能使OD值在10-15分鐘內(nèi)達(dá)到1.000為準(zhǔn))，并將與6伏電池的正極端子和負(fù)極端子相連的石墨電極浸入到溶液中不同的時(shí)間。如圖32所示，在自身免疫患者血清樣品中可檢測(cè)到的aCL和aPS的量在30秒后明顯下降，在2分鐘之后不再能夠檢測(cè)到。這些實(shí)驗(yàn)采用其他患者的抗體重復(fù)進(jìn)行，并得到了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例34在早期的實(shí)驗(yàn)中，將取自具有非常專一和高的滴度IgA aPE的患者的血液樣品暴露于常規(guī)微生物培養(yǎng)瓶中的氯高鐵血紅素。我們觀察到在暴露于氯高鐵血紅素之后，她的IgA aPE消失了，并在aPL ELISA中檢測(cè)到出現(xiàn)了IgG aPS、aCL，而且更驚人的是，還有IgG aPE。那時(shí)，對(duì)這種現(xiàn)象的解釋還不那么容易弄清楚。
在發(fā)現(xiàn)采用電流能更快地去屏蔽之后，使得通過另一位具有高aPE的患者來證明早期的結(jié)果成為可能。在本實(shí)驗(yàn)中，將取自具有高aPE患者的血清在PBS中按1/75稀釋，并將與6伏電池的正極和負(fù)極端子相連的石墨電極浸入到溶液中不同時(shí)間。如圖33所示，在施加6伏的DC電流30秒內(nèi)，伴隨著去屏蔽和檢測(cè)到aPS和aCL IgG，aPE變得不可檢測(cè)(被屏蔽)。剛剛?cè)テ帘蔚腶PL的峰值出現(xiàn)僅僅大約30秒，在暴露2-4分鐘后又再次被屏蔽。
上述試驗(yàn)所提出的一個(gè)重要的技術(shù)方面在于，對(duì)患者的PE進(jìn)行處理使其從測(cè)定中所采用的血漿蛋白稀釋液中除去，在本發(fā)明的情況下，血漿蛋白稀釋液為10％的成年牛血漿(ABP)。在其他未顯示的實(shí)驗(yàn)中，在加入ELISA稀釋液中使用的血漿蛋白質(zhì)之前，將稀釋的患者血清暴露于6伏EMF條件下。這些實(shí)驗(yàn)的重要方面在于，表明了EMF影響患者的抗體，而不是稀釋液中使用的血漿蛋白質(zhì)的EMF改變。
這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持了氧化還原反應(yīng)決定了不同抗體專一性的出現(xiàn)和消失這一觀察結(jié)果。從這些實(shí)驗(yàn)中我們還認(rèn)識(shí)到，氧化還原作用似乎局限于抗體結(jié)合位點(diǎn)，即抗體分子的Fab部分。這是因?yàn)椋诰Y合物持續(xù)識(shí)別抗體分子的不同抗體重鏈靶標(biāo)(Fc部分)時(shí)，在ELISA中使用的異源抗人抗體標(biāo)記的綴合物沒有受到影響。因此，當(dāng)人抗體沒有被氧化還原消耗或者破壞時(shí)，最令人信服的解釋是，抗體分子的Fab部分中的抗體結(jié)合位點(diǎn)帶有可獲得的電子，其參與了氧化/還原過程。
實(shí)施例35進(jìn)行了下面的實(shí)驗(yàn)來觀察除了自身抗體之外的其它血漿蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性是否能被氧化-還原所改變。在這些實(shí)驗(yàn)中，將10％成年牛血漿(ABP)溶液，即已用于測(cè)定蛋白質(zhì)依賴型aPL結(jié)合的含有磷脂結(jié)合性蛋白質(zhì)的相同溶液，暴露于6伏特電池的電流中不同時(shí)間。然后將處理后的ABP樣品用于aPS、aCL和aPE陽性患者血清的ELISA測(cè)定，來觀察對(duì)ABP的處理是否對(duì)ELISA結(jié)果有影響。如圖34所示，在時(shí)間為零時(shí)(未處理的ABP)，陽性患者的血清給出了通常見到的在ABP中的aPL響應(yīng)。當(dāng)10％的ABP暴露于氧化-還原(EMF)一段時(shí)間時(shí)，檢測(cè)到的aPL的量減少，2分鐘后，aPE陽性血清不再為陽性。這些結(jié)果表明，對(duì)患者aPL反應(yīng)性負(fù)責(zé)的血漿蛋白質(zhì)通過暴露于電流中而發(fā)生了改變。例如，由于激肽原是負(fù)責(zé)為aPE依賴型反應(yīng)提供陽性ELISA信號(hào)的血漿蛋白質(zhì)(激肽原與PE結(jié)合，然后抗體與激肽原結(jié)合，然而aPE將不會(huì)與PE或者激肽原單獨(dú)結(jié)合)，因而這表明ABP樣品中的激肽原通過氧化還原暴露而發(fā)生了改變。在暴露240秒時(shí)aCL也呈現(xiàn)陰性，并且由于該患者血清需要凝血酶原和/或β2糖蛋白(或者兩種物質(zhì)都涉及)以在aPL ELISA中產(chǎn)生陽性信號(hào)，因而這兩種蛋白質(zhì)也必須通過氧化還原反應(yīng)來改變。同樣的兩種蛋白質(zhì)均在aPS實(shí)施例中涉及到。
顯然，鑒于上述教導(dǎo)，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多改變和變化。因此應(yīng)理解，在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可采取與特定描述不同的方式來實(shí)踐本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種包括如下步驟的方法提供組合物，其含有至少一種懸浮或溶解于液體介質(zhì)中的血漿蛋白質(zhì)，該血漿蛋白質(zhì)具有可通過改變其氧化還原狀態(tài)而改變的結(jié)合專一性，以及將該組合物暴露于足以改變所述血漿蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的氧化劑或者電勢(shì)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述液體介質(zhì)是稀釋或者未稀釋的全血、血清或者血漿。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包括懸浮或者溶解于液體介質(zhì)中的靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IvIg)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述血漿蛋白質(zhì)是IgG、IgA或者IgM同種型的抗體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述血漿蛋白質(zhì)是IgG、IgA或者IgM同種型的自身抗體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述血漿蛋白質(zhì)是除抗體之外的血漿蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化劑是氯高鐵血紅素。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化劑是KMnO4。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化劑是葉綠素。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化劑是具有被還原能力的分子，其通過作為其它起電子供體作用的分子的電子受體而被還原。
11.一種包括如下步驟的方法提供包括生物流體或者生物流體提取物的組合物，其中該生物流體或其提取物含有至少一種屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有這樣的結(jié)合位點(diǎn)，即該結(jié)合位點(diǎn)具有可通過改變其氧化還原狀態(tài)而改變的結(jié)合專一性，將該組合物暴露于足以改變所述屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性的氧化劑或者電勢(shì)中，由此使該循環(huán)蛋白質(zhì)去屏蔽，以及從組合物中回收該去屏蔽的循環(huán)蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述生物流體是稀釋或者未稀釋的全血、血清、血漿或者胎盤臍帶血。
13.一種從含有抗體的生物流體或者含有抗體的生物流體提取物中獲得并分離自身抗體的方法，所述生物流體或其提取物含有在進(jìn)行該方法之前不能與自身抗原結(jié)合，因而不能通過基于受體-配體結(jié)合的測(cè)定來檢測(cè)的自身抗體，該方法包括如下步驟將該生物流體或提取物暴露于足以改變?cè)撟陨砜贵w的結(jié)合專一性的氧化劑或者DC電流中，使所述自身抗體變得能夠與抗原結(jié)合，由此使其變得可檢測(cè)，并可通過受體-配體結(jié)合分離方法從所述生物流體或者其提取物中回收，以及從所述生物流體中回收該自身抗體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述生物流體是稀釋或者未稀釋的全血、血清或血漿。
15.權(quán)利要求13的方法，其中含抗體的生物流體提取物是靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IvIg)。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述氧化劑是氯高鐵血紅素或者葉綠素。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述氧化劑是KMnO4。
18.一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括對(duì)患有自身免疫疾病的受試者施加抗氧化劑的步驟，該抗氧化劑的量足以使所述受試者體內(nèi)的自身抗體失活。
19.一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括如下步驟從患有自身免疫疾病的受試者中抽取血液樣品，將所述血液樣品暴露于足以使所述血液樣品中的自身抗體失活的抗氧化劑或者DC電流中，以及將血液樣品返回受試者體內(nèi)。
20.一種包括下述步驟的方法檢測(cè)取自受試者的血液、血漿或者血清樣品，以測(cè)定樣品中可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型。通過將樣品暴露于氧化劑或者DC電流，來處理取自所述受試者的血液、血漿或者血清樣品，檢測(cè)處理后的來自所述受試者的血液、血漿或者血清樣品，以測(cè)定所述處理后的樣品中的可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型，以及將處理步驟之前樣品中可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型與處理步驟之后樣品中可檢測(cè)的自身抗體的量和/或類型相比較。
21.一種產(chǎn)品，包括暴露于足以使其中包含的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性發(fā)生改變的抗氧化劑或者DC電流之后的生物流體或者含蛋白質(zhì)的生物流體提取物。
22.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中所述生物流體是全血、血清或者血漿。
23.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中含蛋白質(zhì)的生物流體提取物是靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IvIg)。
24.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中至少一種天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是抗體。
25.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中至少一種自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是自身抗體。
26.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中所述氧化劑是氯高鐵血紅素或者葉綠素。
27.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中所述氧化劑是KMnO4。
全文摘要
至少一種懸浮或溶解于液體介質(zhì)中的血漿蛋白質(zhì)，通過將該蛋白質(zhì)暴露于足以改變其結(jié)合專一性的氧化劑或者電流來改變其結(jié)合專一性。通過將該蛋白質(zhì)氧化而改變其結(jié)合專一性，可從血液或血液制品或提取物中回收屏蔽的蛋白質(zhì)(masked protein)，如自身抗體。
文檔編號(hào)C12N15/01GK1832756SQ200480015987
公開日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月9日
發(fā)明者約翰·A·麥金太爾 申請(qǐng)人:約翰·A·麥金太爾