專利名稱：Cd20特異抗體及使用它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗CD20的單克隆抗體以及制造和使用它們的方法。
背景技術(shù)：
B淋巴細胞是體液免疫的起點，代表了相當大部分的造血惡性腫瘤并且有助于自身免疫。因此，由B細胞和它們的惡性對等物表達的細胞表面分子是免疫治療的重要靶標。MS4A基因家族的B細胞特異成員CD20在未成熟和成熟B細胞以及它們的惡性對等物的表面表達(Tedder和Engel(1994)Immunol.Today 15450-454)。
對小鼠細胞系和組織中CD20轉(zhuǎn)錄本的有限分析表明小鼠CD20也是B細胞特異的(Tedder等，(1988)J.Immunol.1414388)。人和小鼠CD20cDNA都編碼膜整合蛋白質(zhì)，其疏水區(qū)足夠長以便能夠四次穿過膜(Tedder等，(1988)J.Immunol.1414388；Tedder等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85208；Einfeld等，(1988)EMBO J.7711；Stamenkovic和Seed(1988)J.Exp.Med.1671975)。小鼠和人CD20的氨基酸序列相當保守(73％)，特別是跨膜結(jié)構(gòu)域和長的氨基末端和羧基末端胞質(zhì)域(Tedder等，(1988)J.Immunol.1414388)。胞質(zhì)域富含絲氨酸和蘇氨酸，具有多個用于磷酸化的共有序列。人CD20是非糖基化的，但是三個異形體(分子量(Mr)為33,000、35,000和37,000)是源自單一蛋白質(zhì)在不同絲氨酸和蘇氨酸殘基上的差異磷酸化(Tedder等，(1988)Molec.Immunol.251321；Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.26310009；Valentine等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.848085)。
CD20在人B細胞活化、增殖和Ca2+轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)中起作用(Tedder等，(1985)J.Immunol.135973；Bubien等，(1993)J.Cell Biol.1211121)。CD20的抗體連接會產(chǎn)生跨膜信號導致增強CD20磷酸化(Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.26310009)、誘導c-myc和B-myb癌基因表達(Smeland等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.826255；Golay等，(1992)J.Immunol.149300)、誘導細胞蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化(Deans等，(1993)J.Immunol.1514494)、增加CD18、CD58和MHC II類分子的表達(White等，(1991)J.Immunol.146846；Clark和Shu(1987)J.Immunol.138720)以及發(fā)生能夠誘導B細胞粘附的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活化(Kansas和Tedder(1991)J.Immunol.1474094)。CD20的連接促進Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(Bubien等，(1993)J.Cell Biol.1211121)，但是通常不導致細胞內(nèi)鈣([Ca2+]i)3水平增加(Bubien等，(1993)J.Cell Biol.1211121；Tedder等，(1986)Eur.J.Immunol.16881；Golay等，(1985)J.Immunol.1353795)，但廣范交聯(lián)之后除外(Deans等，(1993)J.Immunol.1514494)?？贵w與CD20的結(jié)合抑制B細胞在促分裂原刺激后由G1期進入S/G2+M階段的細胞進程，并且抑制促分裂原誘導的B細胞分化和抗體分泌(Tedder等，(1985)J.Immunol.135973；Tedder等，(1986)Eur.J.Immunol.16；Golay等，(1985)J.Immunol.1353795；Golay和Crawford(1987)Immunology62279)。廣泛的CD20交聯(lián)還可以影響程序性細胞死亡(Holder等，(1995)Eur.J.Immunol.253160；Shan等，(1998)Blood 911644)。這些不同的觀察可以通過這樣一種發(fā)現(xiàn)部分地解釋，該發(fā)現(xiàn)即CD20是一種寡聚復合物的成分，該寡聚復合物能夠形成在細胞周期進展過程中激活的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白或Ca2+離子通道(Bubien等，(1993)J.Cell Biol.1211121；Kanzaki等，(1995)J.Biol.Chem.27013099；Kanzaki等，(1997)J.Biol.Chem.27214733；Kanzaki等，(1997)J.Biol.Chem.2724964)。盡管如此，據(jù)報道在CD20缺乏(CD20-/-)的小鼠品系中B細胞的發(fā)育和功能是正常的(O′Keefe等，(1998)Immunogenetics 48125)。
大多數(shù)的人B細胞譜系惡性腫瘤表達CD20(Anderson等，(1984)Blood631424)?；诳笴D20嵌合體或放射標記單克隆抗體的療法已經(jīng)用于非霍奇金淋巴瘤(Press等，(2001)Hematology221-240；Kaminski等，(1993)N.Engl.J.Med.329459-465；Weiner(1999)Semin.Oncol.2643-51；Onrust等，(1999)Drugs 5879-88；McLaughlin等，(1998)Oncology121763-1769)。臨床研究表明抗CD20單克隆抗體治療還改善類風濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜和溶血性貧血以及其它免疫介導的疾病的臨床表現(xiàn)(Silverman和Weisman(2002)Arthritis Rheum.481484-1492；Edwards和Cambridge(2001)Rheumatology401-7)。
采用競爭性假設(shè)解釋抗CD20單克隆抗體的體內(nèi)(in vivo)治療效果。在一個模型中，CD20作為膜整合的靶標用于通過天然免疫系統(tǒng)的活化或效應子機制的啟動產(chǎn)生單克隆抗體介導的B細胞消除(Reff等，(1994)Blood83435-445；Maloney等，(1997)Blood 902188-2195；Maloney等，(1997)J.Clin.Oncol.153266-3274)。
利妥?，?Rituximab)是一種嵌合體人IgG1抗人CD20單克隆抗體，它能夠高效誘導補體(C)激活的經(jīng)典途徑和對新鮮分離的淋巴瘤細胞和B細胞系的補體依賴的細胞毒性(Reff等，(1994)Blood 83435-445；Golay等，(2001)Blood 983383-3389；Cragg等，(2003)Blood 1011045-1052；DiGaetano等，(2003)J.Immunol 1711581-1587；Bellosillo等，(2001)Blood982771-2777)。利妥?，斶€在病人(van der Kolk等，(2001)Br.J.Hematol.115807-811)和靈長類(Kennedy等，(2003)Blood 1011071-1079)體內(nèi)激活補體。此外，包括CD59在內(nèi)的補體調(diào)節(jié)蛋白在腫瘤細胞中的表達與抗CD20治療的抗性相關(guān)(Golay等，(2001)Blood 983383-3389；Treon等，(2001)J.Immunotherapy 24263-271)。雖然許多人認為補體依賴的細胞毒性是利妥?，斂贵w在體外(in vitro)和體內(nèi)消除人淋巴瘤細胞中所使用的主要途徑(Golay等，(2001)Blood 983383-3389；Cragg等，(2003)Blood1011045-1052；Di Gaetano等，(2003)J.Immunol 1711581-1587；Golay等，(2000)Blood 953900-3908；Di Gaetano等，2001)Br.J.Hematol.114800-809；Weiner(2003)Blood 101788)，但是其它人發(fā)現(xiàn)根據(jù)腫瘤細胞對補體介導裂解的易感性以及補體抑制劑CD46、CD55和CD59在腫瘤細胞上的表達不能預測利妥?，?shù)闹委熃Y(jié)果(Weng和Levy(2001)Blood981352-1357)。因為與臨床使用的同種型不同的嵌合體抗CD20單克隆抗體不能在非人靈長類中消除正常的B細胞(Anderson等，(1997)Biochem.Soc.Transac.25705-708)并且抗CD20單克隆抗體的抗腫瘤效應部分地依賴通過IgG的Fc受體(FcγR)的免疫激活(Clynes等，(2000)Nature Med.6443-446)，所以其它的抗體依賴作用也是重要的。備選地，抗CD20單克隆抗體處理改變了跨膜Ca2+轉(zhuǎn)運和B細胞功能，這打亂了細胞周期進程(Tedder和Engel(1994)Immunol.Today 15450-454)并且能夠誘導B細胞的程序性細胞死亡(Shan等，(1998)Blood 911644-1652；Demidem等，(1997)Cancer Biother.Radiopharm.12177-186)。
因為在經(jīng)歷免疫治療的人中開展機械研究是復雜的，所以很難在體內(nèi)區(qū)分這些假設(shè)(Edwards和Cambridge(2001)Rheumatology 401-7)。此外對人類的研究主要集中在血液的變化上，而血液包含＜2％的骨髓外B細胞。因此，很難精確確定抗CD20治療對大多數(shù)B細胞的作用，這些占大多數(shù)的B細胞存在于外周淋巴組織中。
本領(lǐng)域需要改變B細胞(特別是如B細胞惡性腫瘤和自身免疫病的B細胞疾病中的B細胞)功能的改進試劑和方法。還需要與常規(guī)抗CD20單克隆抗體免疫反應特性不同的新的抗CD20單克隆抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于與CD20反應的具有目的特性的新單克隆抗體的產(chǎn)生和鑒定。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段結(jié)合到B細胞的密度比一種或多種常規(guī)mAb如mAb 1F5結(jié)合到B細胞和/或它們的惡性對等物的密度高至少2倍。
作為另一方面，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段與B細胞(和/或它們的惡性對等物)上CD20的結(jié)合導致在B細胞上與mAb或抗原結(jié)合片段結(jié)合的結(jié)合位點上調(diào)。
作為進一步的方面，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段與選自HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的mAb結(jié)合同一抗原決定簇。在特定的實施方案中，mAb選自HB20-25和MB20-11。在其它實施方案中，抗原結(jié)合片段選自HB20-25和MB20-11的抗原結(jié)合片段。
在另一方面，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段包含選自HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的mAb的重鏈CDR3區(qū)或者與HB20-3、HB20-4、HB20-25或MB20-11的重鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈CDR3區(qū)。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段包含選自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的輕鏈CDR3區(qū)或者與HB20-3、HB20-4或HB20-25的輕鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈CDR3區(qū)。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段包含選自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的CDR3區(qū)或者與HB20-3、HB20-4或HB20-25的CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸相似性的CDR3區(qū)。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段包含選自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)或者與HB20-3、HB20-4或HB20-25的CDR1、CDR2和CDR3分別具有至少80％氨基酸相似性的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。
作為另一個方面，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段選自(a)包含含有SEQ ID NO3(HB20-3)、SEQ ID NO5(HB20-4)、SEQ IDNO9(HB20-25)或SEQ ID NO21(MB20-11)重鏈可變區(qū)或者與SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或SEQ ID NO21的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(b)包含含有SEQ ID NO31(HB20-3)、SEQ ID NO33(HB20-4)或SEQID NO37(HB20-25)輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO31、SEQ ID NO33或SEQ ID NO37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；和(c)包含根據(jù)(a)和(b)的重鏈和輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。
作為另一個方面，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段選自(a)包含含有SEQ ID NO3(HB20-3)重鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO31(HB20-3)輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO31的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(b)包含含有SEQ ID NO5(HB20-4)重鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO5的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO33(HB20-4)輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO33的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；和
(c)包含含有SEQ ID NO9(HB20-25)重鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO37(HB20-25)輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。
在其它特定實施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段包含選自HB20-3(SEQ ID NO3)、HB20-4(SEQ ID NO5)、HB20-25(SEQ ID NO9)和MB20-11(SEQ IDNO21)的mAb的重鏈可變區(qū)。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段包含選自HB20-3(SEQ ID NO31)、HB20-4(SEQ ID NO33)和HB20-25(SEQ ID NO37)的mAb的輕鏈可變區(qū)。
作為進一步的方面，本發(fā)明提供了特異結(jié)合小鼠CD20的mAb或抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明mAb和抗原結(jié)合片段的藥物組合物。
作為一個實施方案，本發(fā)明提供了包含mAb或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物，其中mAb或其抗原結(jié)合片段與選自HB20-1、HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb特異結(jié)合同一抗原決定簇。
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明mAb和抗原結(jié)合片段的細胞系。
作為進一步的方面，本發(fā)明提供了消除哺乳動物受試者內(nèi)B細胞的方法，包括以有效消除B細胞和/或它們的惡性對等物的量向哺乳動物受試者施用本發(fā)明的mAb或抗原結(jié)合片段或藥物組合物。
作為另一個進一步的方面，本發(fā)明提供了治療B細胞疾病的方法，包括向患有B細胞疾病的哺乳動物受試者施用治療有效量的能夠特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段具有能夠?qū)е轮辽?5％的循環(huán)B細胞和/或它們的惡性對等物被消除的125mg/m2或更低的治療有效劑量范圍。
作為另一個進一步的方面，本發(fā)明提供了治療B細胞疾病的方法，包括向患有B細胞疾病的哺乳動物受試者施用治療有效量的本發(fā)明mAb或抗原結(jié)合片段或藥物組合物。
在前述方法的特定實施方案中，B細胞疾病是B細胞惡性腫瘤或自身免疫病。
作為進一步的方面，本發(fā)明提供了治療B細胞疾病的方法，包括向患有B細胞疾病的哺乳動物受試者施用治療有效量的(i)本發(fā)明mAb或抗原結(jié)合片段或藥物組合物，和(ii)能夠增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物。
作為另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異結(jié)合CD20的mAb的方法，包括(a)在足以引起抗體反應的條件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳動物；(b)從哺乳動物收集抗體產(chǎn)生細胞；(c)將抗體產(chǎn)生細胞與培養(yǎng)的無限增殖化細胞融合以形成產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞；(d)在足以產(chǎn)生單克隆抗體的條件下培養(yǎng)雜交瘤細胞；和(e)從培養(yǎng)物中回收特異結(jié)合CD20的單克隆抗體。
作為另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異結(jié)合CD20的mAb的方法，包括(a)在足以引起抗體反應的條件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳動物；(b)從哺乳動物收集產(chǎn)生特異結(jié)合CD20的抗體的細胞；(c)從抗體產(chǎn)生細胞中分離免疫球蛋白編碼基因；(d)將免疫球蛋白編碼基因?qū)爰毎援a(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細胞；(e)在足以使免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯以及單克隆抗體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞；和(e)從培養(yǎng)物中回收特異結(jié)合CD20的單克隆抗體。
本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明核酸、載體、mAb或抗原結(jié)合片段或藥物組合物用于消除B細胞(和/或它們的惡性對等物)和/或用于治療B細胞疾病的用途。
作為另一方面，本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明mAb和抗原結(jié)合片段重鏈和輕鏈的分離的核酸。進一步提供了包含分離核酸的載體和細胞。
本發(fā)明的這些方面和其它方面在本發(fā)明下面的描述中更加詳細地闡述。
附圖簡述

圖1A-1M圖解說明Cd20基因的定向分布。圖1A，編碼Cd20基因3′末端的基因組克隆。圖1B，含有外顯子5-8(實心方形)的野生型Cd20的內(nèi)含子-外顯子的組織。外顯子的編號基于人CD20結(jié)構(gòu)(Tedder等，(1989)J.Immunol.1422560-2568)。圖1C，尋靶載體結(jié)構(gòu)。圖1D，同源重組后Cd20等位基因的結(jié)構(gòu)，在外顯子6中的EcoRV限制位點被刪除了。圖1E，來自兩了野生型和四個CD20-/-的同窩小鼠的基因組DNA的Southern印跡分析，基因組DNA用EcoRV消化，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜并且用圖1D中所標出的5′DNA探針雜交。圖1F，使用結(jié)合外顯子6(EcoRV位點的5′端)和7的引物從野生型和CD20-/-的同窩小鼠基因組DNA的PCR擴增。G3PDH擴增作為陽性對照顯示。圖1G，從野生型和CD20-/-的同窩小鼠脾臟RNA產(chǎn)生的cDNA的PCR擴增。每個反應混合物包含一個與外顯子3所編碼序列雜交的有義鏈引物和與外顯子6或Neor基因啟動子序列雜交的兩個反義引物。用外顯子3和6的引物擴增的DNA長度為445bp，而用外顯子3和Neo引物擴增一個749bp的片段。圖1H，MB20-13單克隆抗體與CD20cDNA轉(zhuǎn)染的(粗線)或非轉(zhuǎn)染的(虛線)300.19細胞或CHO細胞的反應性。細線代表單獨用次級抗體或同種型對照單克隆抗體染色的CD20cDNA轉(zhuǎn)染的細胞。免疫熒光染色通過流式細胞術(shù)分析顯示。圖1I來自CD20-/-或野生型同窩小鼠的脾細胞用MB20-7(使用藻紅蛋白綴合的抗小鼠IgG2b抗體顯色)和抗CD19(FITC綴合的)單克隆抗體免疫熒光染色的流式細胞術(shù)分析。通過方形描繪的象限表示為使用不反應的單克隆抗體對照確定的陰性和陽性細胞群體。圖1H和圖1I結(jié)果代表著從12個抗小鼠CD20單克隆抗體得到的結(jié)果。圖1J，CD20-/-和野生型同窩小鼠中B淋巴細胞的分布。門內(nèi)細胞群體對應著表4所述的細胞并且代表著使用10個同窩小鼠所得到的結(jié)果。圖1K，CD20-/-B細胞的促細胞分裂原反應。來自CD20-/-和野生型同窩小鼠的純化脾臟B細胞(2×105/孔)與抗IgM F(ab′)2抗體片段、抗IgM抗體+IL-4或者LPS培養(yǎng)。數(shù)值是三次重復培養(yǎng)的平均值(±SEM)并且代表4次獨立實驗的結(jié)果。圖1L，通過同種型特異ELISA測定的6個CD20-/-(實心直方圖)和野生型(空心直方圖)同窩小鼠的平均(±SEM)血清Ig水平。圖1M，T細胞依賴的體液免疫反應。在第0天和第21天，用DNP-KLH免疫2只CD20-/-(實心環(huán)，實線)和野生型(空心方形，虛線)小鼠，在指定的時間收集血清。通過同種型特異ELISA測定血清抗DNP抗體。顯示平均的CD20-/-(實線)和野生型(虛線)抗體水平。
圖2A-2I顯示在B細胞發(fā)育中CD20表達。圖2A，使用MB20-7(粗線)或同種型對照(虛線)單克隆抗體對小鼠類淋巴母細胞系的免疫熒光染色。通過使用流式細胞術(shù)分析的雙色免疫熒光染色測定來自野生型C57BL/6小鼠的骨髓(圖2B)、血液(圖2C)、外周淋巴結(jié)(PLN；圖2D)、脾臟(圖2E)和腹膜腔(圖2F)的淋巴細胞單細胞懸液。圖2G，用四色流式細胞術(shù)分析評價的骨髓B細胞亞群的CD20表達。祖B細胞鑒定為淋巴細胞中具有前向和側(cè)向散射特性的CD43+B220lo細胞。前B細胞是IgM-CD43-B220lo細胞。根據(jù)相對的IgM和B220密度將未成熟和成熟CD43-B細胞分成3個部分(I、II和III)。使用同種型匹配的對照單克隆抗體作為陰性對照(斑點線)評價背景的熒光染色。圖2H，如通過相對熱穩(wěn)定抗原(HAS)和CD21表達密度定義的T1、T2或成熟(M)脾臟B細胞的CD20表達。圖2I，通過CD23表達和相對IgM和CD21密度定義的T1、T2、邊緣區(qū)(MZ)和成熟(M)脾臟B細胞的CD20表達。所有結(jié)果是從≥3個兩月齡野生型小鼠得到的典型結(jié)果。
圖3A-3C顯示小鼠CD20和CD20-/-B細胞的生物化學特征。圖3A，分別使用HB20-8(PB4；人CD20)和MB20-1(小鼠CD20)單克隆抗體從表面生物素化Raji(人)和A20(小鼠)B細胞系免疫沉淀的CD20(箭頭)。顯示了用同種型匹配對照單克隆抗體(C抗體)的免疫沉淀。在還原凝膠圖中的垂直虛線表示平行電泳的各個凝膠的結(jié)果。圖3B，CD20表達的Western印跡分析。將Raji(1×106個細胞/泳道)、A20和300.19B細胞系或純化小鼠脾臟B細胞(5×106個細胞/泳道)的裂解物在還原條件下煮沸，通過SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用MB20-1單克隆抗體雜交。圖3C，使用和不使用PMA孵育的原代B細胞和B細胞系中CD20的磷酸化。在無磷酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)的A20細胞(2×107)、LPS活化的小鼠脾臟B細胞(2×107)和Raji細胞(1×107)用包含32PO4的培養(yǎng)基孵育90分鐘。將每一培養(yǎng)物的一半用PMA(200ng/mL)孵育30分鐘，然后用去污劑裂解細胞。
圖4A-4D顯示在CD20-/-B細胞中改變的Ca2+反應。來自CD20-/-和野生型同窩小鼠的indo-1負載B細胞通過IgM(圖4A)、CD19連接(圖4B)或毒胡蘿卜素(圖4C)誘導的Ca2+反應。在1分鐘(箭頭)，在EGTA存在或不存在情況下，加入最適濃度的山羊抗IgM F(ab′)2抗體片段、抗CD19單克隆抗體或毒胡蘿卜素。增加的indo-1熒光比值指示增加的[Ca2+]i。結(jié)果是至少6次實驗的代表性結(jié)果。圖4D，通過流式細胞術(shù)分析的使用藻紅蛋白綴合的抗CD19單克隆抗體的免疫熒光染色評價來自CD20-/-(細線)和野生型(粗線)同窩小鼠脾細胞的CD19表達。虛線表示用對照單克隆抗體對野生型脾細胞的染色。
圖5A-5B顯示CD20-/-和野生型同窩小鼠的純化脾臟B細胞中蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。圖5A，B細胞(2×107/樣品)用F(ab′)2抗IgM抗體片段孵育到達所顯示的時間并用去污劑裂解。蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并且用抗磷酸化酪氨酸(抗pTyr)抗體免疫印跡。將印跡膜洗掉探針并用抗SHP-1抗體重新雜交作為蛋白質(zhì)上樣量相同的對照。圖5B，信號分子被CD20-/-B細胞的酪氨酸磷酸化。來自野生型和CD20-/-同窩小鼠的純化脾臟B細胞用F(ab′)2抗小鼠IgM抗體(40μg/mL)刺激達所標明的時間。用去污劑裂解細胞并將裂解物用抗磷酸化酪氨酸抗體進行Western印跡分析以評價蛋白質(zhì)的磷酸化。接著將印跡膜洗掉探針并用抗ERK2抗體重新雜交以證實樣品間蛋白質(zhì)上樣量相同。對于每幅圖顯示了分子量標準(kDa)的遷移。所有結(jié)果是至少三次單獨實驗的代表性結(jié)果。
圖6A-6C顯示抗CD20單克隆抗體與小鼠脾臟B細胞的反應性。圖6A，用代表性抗CD20(實線)或同種型匹配對照(虛線)單克隆抗體(10μg/mL)染色的CD19+細胞的熒光強度。圖6B，用一段范圍單克隆抗體濃度的抗CD20單克隆抗體染色的平均熒光強度(MFI)。箭頭表示當使用0.5μg/mL時單克隆抗體染色的平均強度。圖6C，用抗CD20(實線)或同種型匹配對照(虛線)單克隆抗體(0.5μg/mL)染色的CD19+細胞的熒光強度。在所有情況下，單克隆抗體染色通過使用PE綴合的同種型特異次級抗體的流式細胞術(shù)分析。結(jié)果是從≥3個實驗所得到的代表性結(jié)果。
圖7A-7D顯示體內(nèi)B細胞消除。圖7A，用MB20-11或同種型匹配對照單克隆抗體處理的野生型或CD20-/-小鼠血液(第2天)和脾臟(第7天)典型的B細胞消除，它是通過使用流式細胞術(shù)分析的免疫熒光染色確定的。數(shù)目表示門內(nèi)B220+B細胞的百分數(shù)。圖7B，用MB20或同種型對照單克隆抗體處理的≥2個野生型同窩小鼠后血液(第2天或第7天，每mL)和脾臟(第7天)B細胞的總數(shù)(±SEM)。標明了從MB20或同種型對照單克隆抗體處理小鼠所得到的平均值結(jié)果之間的顯著性差異；*p＜0.05，**p＜0.01。圖7C，用MB20-11單克隆抗體以不同劑量(對于每個數(shù)據(jù)點≥2只小鼠)處理野生型同窩小鼠7天后血液和脾臟B細胞數(shù)(±SEM)。標明了未處理(0)和單克隆抗體處理小鼠之間的顯著性差異；**p＜0.01。圖7D，用MB20-11(實心圓)或同種型對照(空心圓)單克隆抗體在第0天處理后野生型小鼠血液和脾臟B細胞數(shù)(±SEM)(每組≥5只小鼠)。在時間0之后所顯示數(shù)值代表著在1小時內(nèi)得到的數(shù)據(jù)。
圖8A-8E顯示FcγR依賴的B細胞消除。圖8A，在第0天用MB20-11(實心圓)或同種型對照(空心圓)單克隆抗體處理FcRγ-/-、FcγRI-/-、FcγRII-/-和FcγRIII-/-小鼠后血液B細胞的消除。數(shù)值表示在單克隆抗體處理之前(時間0)和之后1小時或2、4或7天后平均循環(huán)B細胞的數(shù)量(±SEM，每mL)(每個時間點≥5只小鼠)。圖8B，在單克隆抗體處理7天后典型的脾臟B細胞消除。數(shù)字表示所顯示的門內(nèi)B220+淋巴細胞的百分數(shù)。圖8C，用MB20-11(實心條)或同種型對照(空心條)單克隆抗體處理7天后平均脾臟B細胞數(shù)量(±SEM)(每組≥5只小鼠)。數(shù)字表示與對照單克隆抗體處理的同窩小鼠相比用抗CD20單克隆抗體處理的小鼠內(nèi)B220+淋巴細胞的平均相對百分數(shù)。圖8D，與在第0天用MB20-1(實心正方形)或同種型對照(空心正方形)單克隆抗體處理的野生型同窩小鼠相比，在第0天用MB20-1(實心圓)或同種型對照(空心圓)單克隆抗體處理的FcRγ-/-同窩小鼠的B細胞消除。在MB20-1或?qū)φ諉慰寺】贵w處理FcRγ-/-同窩小鼠7天后典型的腎臟B細胞消除。數(shù)字表示B220+淋巴細胞的百分數(shù)。柱形圖表示用MB20-1或同種型對照單克隆抗體處理FcRγ-/-(實心條)或野生型(空心條)小鼠7天后的平均脾臟B細胞數(shù)量(±SEM)(每組≥5只小鼠)。圖8E，與在第0天用MB20-18(實心正方形)或同種型對照(空心正方形)單克隆抗體處理的野生型同窩小鼠相比，在第0天用MB20-18(實心圓)或同種型對照(空心圓)單克隆抗體處理的FcRγ-/-同窩小鼠的血液和脾臟(第7天)B細胞的消除。柱狀圖表示用MB20-18或同種型對照單克隆抗體處理FcRγ-/-(實心條)或野生型(空心條)小鼠7天后的平均脾臟B細胞數(shù)量(±SEM)(每組≥5只小鼠)。圖8A-E，指出了在MB20或者同種型對照單克隆抗體處理小鼠之間的顯著性差異；*p＜0.05，**p＜0.01。
圖9A-9D顯示體內(nèi)B細胞消除是補體依賴的。圖9A，MB20單克隆抗體對于脾臟B細胞的體外補體依賴細胞毒性。數(shù)值代表在≥3次實驗中碘化丙啶陽性(Pl+)的B220+細胞的平均百分數(shù)(±SEM)。圖9B，在第0天用MB20-11(實心圓)或同種型對照(空心圓)單克隆抗體處理C3-/-、C4-/-或C1q-/-小鼠后的B細胞消除。血液中的數(shù)值表示用單克隆抗體處理之前(時間0)和之后1小時或2、4或7天平均循環(huán)B細胞數(shù)量(±SEM，每mL)(每個時間點≥5只小鼠)。在MB20-11(實心條)和同種型對照(空心條)單克隆抗體處理7天后典型的脾臟B細胞頻度和平均B細胞數(shù)量(±SEM)(每組≥5只小鼠)。圖9C-D，與在第0天用MB20-1或MB20-18(實心正方形)或同種型對照(空心正方形)單克隆抗體處理野生型小鼠相比，在第0天用MB20-1或MB20-18(實心圓)或同種型對照(空心圓)單克隆抗體處理的C3-/-小鼠后血液和脾臟B細胞的消除。在MB20-1或?qū)φ諉慰寺】贵w處理C3-/-同窩小鼠7天后典型的脾臟B細胞消除。數(shù)字表示所標明門內(nèi)B220+淋巴細胞的百分數(shù)。柱形圖表示MB20-1或同種型對照單克隆抗體處理C3-/-(實心條)或野生型(空心條)小鼠7天后平均脾臟B細胞數(shù)量(±SEM)(每組≥5只小鼠)。圖9A-D，指出了在MB20或者同種型對照單克隆抗體處理小鼠之間的顯著性差異；*p＜0.05，**p＜0.01。
圖10A-10B顯示單核細胞介導的B細胞消除。如所示(箭頭)用氯膦酸鹽(CLOD)處理野生型小鼠以消除巨噬細胞，而其它小鼠具有白細胞亞群遺傳缺陷。圖10A，MB20-11(實心圓)或同種型對照(空心圓)單克隆抗體處理0天后血液B細胞的消除。對于氯膦酸鹽處理的小鼠，單克隆抗體處理1小時和2、4和7天后確定血液B細胞數(shù)，其中垂直虛線指示單克隆抗體處理時間0。對于CSF1OP小鼠，由于這些小鼠個體小且有死亡危險，單克隆抗體處理1小時后未對循環(huán)的B細胞數(shù)進行定量。對于其他小鼠遺傳型顯示了在單克隆抗體處理1小時的時間點處的B細胞數(shù)。圖10B，MB20-11(實心條)或同種型對照(空心條)單克隆抗體處理7天后代表性的流式細胞術(shù)分析和平均脾臟B細胞數(shù)(±SEM)(每組≥5只小鼠)。顯示了同種型對照或MB20單克隆抗體處理細胞的平均結(jié)果之間的顯著性差異；*p＜0.05，**p＜0.01。
圖11A和11B顯示已知的小鼠抗人CD20單克隆抗體的氨基酸序列比對(表1)。圖11A，重鏈氨基酸編號和每個單克隆抗體V、D和J區(qū)編碼序列起始端的指定是按照常規(guī)方法進行的(Kabat等，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest.U.S.Government Printing Office.Bethesda，MD)，其中氨基酸位置1-94和互補決定區(qū)CDR1和2由VH基因編碼。破折號顯示序列中所插入缺口以便對相似氨基酸序列進行最大程度比對。為了清楚顯示在VH、D和J片段之間引入缺口。圖11B，抗CD20單克隆抗體的輕鏈Vκ氨基酸序列分析。氨基酸編號和每個單克隆抗體編碼序列起始端的指定是按照常規(guī)方法進行的(Kabat等，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest.U.S.Government Printing Office.Bethesda，MD)。將預測信號序列剪切位點之后的氨基酸編號為1。破折號顯示序列中所插入缺口以便對相似氨基酸序列進行最大程度比對。為了清楚顯示在Vκ和J片段序列之間引入缺口。
圖12描述顯示于圖11中的已知小鼠抗人CD20單克隆抗體所推導的單克隆抗體重鏈和輕鏈序列的UPGMA(使用算術(shù)平均數(shù)的不加權(quán)配對組方法(unweighted pair group method using arithmetic averages))樹。為了比較的目的，顯示了三種小鼠抗人CD20單克隆抗體，即HB20-03、HB20-04和HB20-25單克隆抗體。相對水平樹枝長度是序列親緣關(guān)系的量度。例如，已知小鼠抗人CD20單克隆抗體的重鏈和輕鏈彼此之間相比比它們與HB20-03、HB20-04和HB20-25單克隆抗體的序列相比更加相似，而HB20-03、HB20-04和HB20-25單克隆抗體的序列彼此最相似。在第三欄，在序列分析之前，將重鏈和輕鏈序列連接形成連續(xù)的H+L鏈序列。該分析表明已知的抗CD20單克隆抗體和HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體之間的重鏈和輕鏈的組合是不相關(guān)的。使用Geneworks版本2.0(IntelliGenetics，Inc.，Mountain View，CA)產(chǎn)生UPGMA樹。
圖13顯示了圖11中所示的已知的小鼠抗人CD20單克隆抗體和能夠與人和小鼠CD20反應的HB20和MB20系列單克隆抗體(表1)所推導出的單克隆抗體重鏈V(D)J序列的氨基酸序列比較。數(shù)據(jù)顯示為所推導出的單克隆抗體重鏈序列的UPGMA樹。相對水平樹枝長度是序列親緣關(guān)系的量度。基于右側(cè)所標明的序列相似性將重鏈分組(A-G)。
圖14A-14N顯示能夠與人和小鼠CD20反應的HB20和MB20系列單克隆抗體(表1)重鏈VH-D-JH接合序列的核苷酸和預測氨基酸序列。圖14A，HB20-01、HB20-02和HB20-06的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和核苷酸序列(SEQ ID NO2)；圖14B，HB20-03的氨基酸序列(SEQ ID NO3)和核苷酸序列(SEQ ID NO4)；圖14C，HB20-04的氨基酸(SEQ ID NO5)和核苷酸(SEQ ID NO6)序列；圖14D，HB20-05的氨基酸序列(SEQ ID NO7)和核苷酸序列(SEQ ID NO8)；圖14E，HB20-25的氨基酸序列(SEQ IDNO9)和核苷酸序列(SEQ ID NO10)；圖14F，MB20-01和MB20-13的氨基酸序列(SEQ ID NO11)和核苷酸序列(SEQ ID NO12)；圖14G，MB20-02的氨基酸序列(SEQ ID NO13)和核苷酸序列(SEQ ID NO14)；圖14H，MB20-07的氨基酸序列(SEQ ID NO15)和核苷酸序列(SEQ ID NO16)；圖14I，MB20-08的氨基酸序列(SEQ ID NO17)和核苷酸序列(SEQ IDNO18)；圖14J，MB20-10的氨基酸序列(SEQ ID NO19)和核苷酸序列(SEQ ID NO20)；圖14K，MB20-11的氨基酸序列(SEQ ID NO21)和核苷酸序列(SEQ ID NO22)；圖14L，MB20-14的氨基酸序列(SEQ ID NO23)和核苷酸序列(SEQ ID NO24)；圖14M，MB20-16的氨基酸序列(SEQ IDNO25)和核苷酸序列(SEQ ID NO26)；和圖14N，MB20-18的氨基酸序列(SEQ ID NO27)和核苷酸序列(SEQ ID NO28)。雙下劃線表示與5′PCR引物重疊的序列，并且由于使用冗余引物擴增每個序列所以該序列可以不同于實際DNA序列(表1)。在序列中用垂直條 指定出V、D和J序列之間的鄰近接合邊緣。所推導出的與已知D區(qū)DNA序列同源的序列用單下劃線表示。小寫字母核苷酸顯示接合邊緣的核苷酸加入或體細胞高變的潛在位點。
圖15顯示已知的小鼠抗人CD20單克隆抗體和能夠與人和小鼠CD20反應的HB20和MB20系列單克隆抗體重鏈VH-D-JH接合序列的氨基酸序列比對。相對于與其他單克隆抗體序列的同源性將每個單克隆抗體分組。所顯示的序列相對等級次序基于與2B8(利妥?，?單克隆抗體序列的親緣關(guān)系。按照常規(guī)方法對重鏈氨基酸編號并指定每個單克隆抗體V、D和J區(qū)編碼序列的起點(Kabat等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest.U.S.Government Printing Office，Bethesda，MD)，其中氨基酸位置1-94和CDR1和2由VH基因編碼。圓點表示每個單克隆抗體之間是相同的以及全部單克隆抗體的共有氨基酸序列。破折號表示在序列中所插入的缺口以便對相似氨基酸序列進行最大化比對。為了清楚顯示在VH和D片段之間的序列中引入缺口。為了清楚顯示CDR區(qū)加框表示。
圖16顯示圖11所示的已知的小鼠抗人CD20單克隆抗體和能夠與人和小鼠CD20反應的HB20和MB20系列單克隆抗體所推導出的單克隆抗體輕鏈VJ序列的氨基酸序列比對。數(shù)據(jù)顯示為所推導出的單克隆抗體輕鏈V和J序列的UPGMA樹。相對水平樹枝長度是序列親緣關(guān)系的量度?；谟覀?cè)所標明的序列相似性將輕鏈分組(A-G)。
圖17A-17N顯示能夠與人和小鼠CD20反應的HB20和MB20系列單克隆抗體(表1)輕鏈V-J序列的核苷酸和預測氨基酸序列。雙下劃線表示與5′PCR引物重疊的序列，并且由于使用冗余引物擴增每個序列所以該序列可以不同于實際DNA序列(表1)。圖17A，HB20-01、HB20-02和HB20-06的氨基酸序列(SEQ ID NO29)和核苷酸序列(SEQ ID NO30)；圖17B，HB20-03的氨基酸序列(SEQ ID NO31)和核苷酸序列(SEQ ID NO32)；圖17C，HB20-04的氨基酸序列(SEQ ID NO33)和核苷酸序列(SEQ IDNO34)；圖17D，HB20-05的氨基酸序列(SEQ ID NO35)和核苷酸序列(SEQ ID NO36)；圖17E，HB20-25的氨基酸序列(SEQ ID NO37)和核苷酸序列(SEQ ID NO38)；圖17F，MB20-01的氨基酸序列(SEQ ID NO39)和核苷酸序列(SEQ ID NO40)；圖17G，MB20-02的氨基酸序列(SEQ IDNO41)和核苷酸序列(SEQ ID NO42)；圖17H，MB20-03的氨基酸序列(SEQ ID NO43)和核苷酸序列(SEQ ID NO44)；圖17I，MB20-07的氨基酸序列(SEQ ID NO45)和核苷酸序列(SEQ ID NO46)；圖17J，MB20-08的氨基酸序列(SEQ ID NO47)和核苷酸序列(SEQ ID NO48)；圖17K，MB20-10的氨基酸序列(SEQ ID NO49)和核苷酸序列(SEQ ID NO50)；圖17L，MB20-13的氨基酸序列(SEQ ID NO51)和核苷酸序列(SEQ IDNO52)；圖17M，MB20-14的氨基酸序列(SEQ ID NO53)和核苷酸序列(SEQ ID NO54)；和圖17N，MB20-18的氨基酸序列(SEQ ID NO55)和核苷酸序列(SEQ ID NO56)。小寫字母核苷酸顯示接合邊緣的核苷酸加入或體細胞高變的潛在位點?！癗”表示序列中的核苷酸是不確定的并且因此相應氨基酸是未知的。
圖18顯示已知的小鼠抗人CD20單克隆抗體和能夠與人和小鼠CD20反應的HB20和MB20系列單克隆抗體(表1)輕鏈VJ序列的氨基酸序列比對。相對于與其它單克隆抗體序列的同源性將每個單克隆抗體分組。所顯示的序列相對等級次序基于與全部抗CD20單克隆抗體的共有輕鏈序列的親緣關(guān)系。按照常規(guī)方法對輕鏈氨基酸編號并指定每個單克隆抗體V和J區(qū)編碼序列的起點(Kabat等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest.U.S.Government Printing Office，Bethesda，MD)。圓點表示每個單克隆抗體之間是相同的和全部單克隆抗體的共有氨基酸序列。破折號表示序列中所插入的缺口以便對相似氨基酸序列進行最大化比對。為了清楚顯示在V和J片段的序列之間引入缺口。為了清楚顯示CDR區(qū)加框表示。
圖19描述已知的小鼠抗人CD20單克隆抗體和能夠與人和小鼠CD20反應的HB20和MB20系列單克隆抗體所推導出的單克隆抗體重鏈和輕鏈序列的UPGMA分析。在序列分析之前將重鏈V(D)J和輕鏈(VJ)序列結(jié)合形成連續(xù)的H+L鏈序列?；谟覀?cè)所標明的重鏈和輕鏈之間的序列相似性(圖13和圖16)將重鏈和輕鏈對分組。
圖20A-B顯示結(jié)合至B細胞表面的抗CD20單克隆抗體密度調(diào)控著抗CD20單克隆抗體誘導的B細胞消除效率。檢測了雜合CD20+/-小鼠的B細胞消除并與野生型同窩小鼠相比較，在雜合CD20+/-小鼠中所表達的細胞表面CD20為正常密度的50％。用10或250μgMB20-11單克隆抗體(實心條)或者同種型匹配對照(空心條)靜脈注射處理兩組同窩小鼠(n≥3小鼠/組)，并在7天時通過流式細胞術(shù)定量血液(每mL)(圖20A)和脾臟(總數(shù))(圖20B)的B220+B細胞數(shù)。數(shù)值表示為B細胞數(shù)平均值(±SEM)，并顯示了與對照單克隆抗體處理的同窩小鼠相比在MB20-11單克隆抗體處理的同窩小鼠中剩余B細胞的百分數(shù)。指出了每組小鼠平均值之間的顯著性差異；*p＜0.05，**p＜0.01。當使用250μg MB20-11單克隆抗體時能夠有效消除CD20+/-和野生型同窩小鼠中循環(huán)B細胞和脾臟B細胞。然而，當使用10μgMB20-11單克隆抗體時，在CD20+/-小鼠中僅消除部分B細胞，而在野生型同窩小鼠中消除了絕大部分B細胞。
圖21A-21B顯示MB20-11單克隆抗體與CD20的結(jié)合增加細胞表面CD20密度(圖21A)。通過對純化的小鼠脾臟B細胞進行間接免疫熒光染色顯示增加的MB20-11單克隆抗體結(jié)合，在用熒光染料綴合的山羊抗小鼠IgG2a次級抗體染色之前，用同種型對照(C)或MB20-11單克隆抗體(10μg/mL)將純化的小鼠脾臟B細胞孵育所標明的時間，隨后用流式細胞儀分析。對于0時間點，在洗滌和用次級抗體染色之前，在冰上將細胞與單克隆抗體孵育30分鐘。圖21B，與MB20-18單克隆抗體相比，MB20-11單克隆抗體結(jié)合細胞表面CD20的典型時間過程。每個值表示為如圖21A中所描述的純化脾臟B細胞熒光染色的平均熒光通道數(shù)目。這些結(jié)果代表在≥3次獨立實驗中所獲得的結(jié)果。
圖22A-B顯示HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體以比已知抗CD20單克隆抗體更高的密度結(jié)合細胞表面CD20。顯示了人血液淋巴細胞(圖22A)和Raji B類淋巴母細胞系(圖22B)與1F5、HB20-3和B1抗CD20單克隆抗體的反應性(實線)或單獨與次級抗體的反應性(虛線)。使用預先測定的飽和的且呈現(xiàn)最佳染色的濃度的抗CD20單克隆抗體1F5為以1∶200稀釋的腹水；HB20-3為HB20-3雜交瘤的組織培養(yǎng)上清液；或者為10μg/mL純化單克隆抗體或者組織培養(yǎng)上清液的B1單克隆抗體。在所有情況下，使用PE綴合的同種型特異次級抗體通過流式細胞儀分析觀察單克隆抗體染色。結(jié)果代表在≥3次實驗中所獲得的結(jié)果。
圖23A-23B顯示靜脈注射(圖23A)或皮下注射(圖23B)施用MB20-11單克隆抗體有效地在體內(nèi)消除循環(huán)B細胞和組織B細胞。用MB20-11單克隆抗體以所示劑量皮下或靜脈注射處理野生型小鼠。數(shù)值表示為通過流式細胞儀估計的第7天時血液(每mL)或者脾臟(總數(shù))B220+B細胞數(shù)平均值(±SEM)(n≥2)。指出了每組小鼠平均值之間的顯著性差異；*p＜0.05，**p＜0.01。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分地基于能夠結(jié)合人CD20的一組單克隆抗體(mAb)的產(chǎn)生，其中與傳統(tǒng)抗CD20mAb(例如1F5或2B8)相比該組單克隆抗體具有獨特的結(jié)合特性和其它特征。具體而言，本發(fā)明的mAb和抗原結(jié)合片段在分子水平能夠與傳統(tǒng)抗CD20抗體區(qū)別開來，例如通過輕鏈和/或重鏈可變區(qū)或可變區(qū)的特定片段如互補決定區(qū)(“CDR”)的核苷酸和氨基酸序列。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的mAb和抗原結(jié)合片段能夠以比傳統(tǒng)mAb更高的密度結(jié)合B細胞，該特性對于消除B細胞的方法、對于治療或診斷方法或用作實驗試劑(例如鑒定B細胞或純化B細胞)是有利的。
本發(fā)明還提供能夠特異結(jié)合小鼠CD20的mAb和抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還提供了從分離自CD20-/-哺乳動物(例如小鼠)的抗體產(chǎn)生細胞(例如B細胞)產(chǎn)生的抗CD20單克隆抗體。
現(xiàn)在本發(fā)明描述有關(guān)附圖，其中顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本發(fā)明能夠以不同方式體現(xiàn)并且不應該解釋為本發(fā)明局限于本文列出的實施方案。更確切地說，提供了這些實施方案以致于本公開能夠徹底和全面并且完全地向本領(lǐng)域技術(shù)人員傳遞本發(fā)明的范圍。例如，至于一個實施方案闡明的特征可以整合到另一個實施方案中，并且特定實施方案闡明的特征可以從那個實施方案中刪除。此外，根據(jù)目前公開，文中所建議的對實施方案的多種變更和補充對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，其不脫離目前的發(fā)明。
除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語都具有與該發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解相同的意義。在本發(fā)明描述中使用的術(shù)語只是為了描述特定實施方案的目的并且不是旨在對本發(fā)明進行限制。
如在本發(fā)明描述和后附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”旨在也包括復數(shù)形式，除非在上下文中另外明確指出。
所有公開、專利申請、專利和本文提到的其它文獻全部整合作為參考。
除非另外指出，可以使用標準方法用于本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段生產(chǎn)、核酸序列操作、轉(zhuǎn)化細胞生產(chǎn)等。此種技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。見例如SAMBROOK等，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，第2版，(Cold Spring Harbor，NY，1989)；F.M，.AUSUBEL等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，New York)。
抗CD20mAb、抗原結(jié)合片段和細胞系作為一方面，本發(fā)明提供了能夠特異結(jié)合CD20的mAb和其抗原結(jié)合片段。如本文所使用，術(shù)語“特異結(jié)合CD20的mAb”和“抗CD20mAb”和相似語句是可互換的。在特定實施方案中，mAb或抗原結(jié)合片段特異結(jié)合人CD20和/或小鼠CD20。mAb或抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合CD20蛋白質(zhì)的任何區(qū)域，但是在代表性實施方案中其結(jié)合CD20的細胞外區(qū)域。
如在本文所使用的多種語法形式的術(shù)語“抗體”或“抗體分子”指免疫球蛋白分子(包括IgG、IgE、IgA、IgM、IgD)和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分即包含抗體結(jié)合部位或互補位并能結(jié)合抗原的分子?！翱贵w結(jié)合部位”或“抗原結(jié)合部位”是特異結(jié)合抗原的包含重鏈和輕鏈可變區(qū)和高可變區(qū)(CDR)的抗體分子的結(jié)構(gòu)部分。如本領(lǐng)域已知，抗體的特定特性涉及免疫球蛋白同種型。在代表性實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是IgG2a、IgG1或IgG2b同種型分子?？贵w或片段還可以來自包括鳥類(例如雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉等)和哺乳動物(例如人、非人靈長類、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、綿羊、馬、豬、狗、貓等)種的任何來源的物種。
如本文所使用，術(shù)語“單克隆抗體”或“mAb”指從基本上同質(zhì)的抗體群體得到的抗體，即群體中包含的單個抗體是相同的，除了少量存在的天然發(fā)生突變的可能性以外。mAb是高度特異的并且直接針對抗原上的單一抗原決定簇(即表位)。這種特性與多克隆抗體制品形成對照，多克隆抗體一般包括針對不同抗原決定簇的抗體。
術(shù)語“抗體”和“mAb”在本文以最廣的意義使用并且具體而言涵蓋多特異抗體(例如雙特異抗體)、棵抗體、抗體綴合物和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出目的生物學活性即可。此外，術(shù)語“抗體”和“mAb”包含完整(即完全)免疫球蛋白分子或包含互補位的抗體的抗原結(jié)合片段，包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、雙抗體、線形抗體、單鏈抗體分子和從抗體片段形成的多特異抗體。
單鏈Fv或“sFv”抗體片段包含抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈上。通常，F(xiàn)v多肽還包含位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的多肽接頭，它保證sFv能夠形成目的結(jié)構(gòu)用于抗原結(jié)合。對于sFv的綜述見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第133卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，269-315頁(1994)。本領(lǐng)域描述了單鏈抗體的產(chǎn)生，見例如美國專利號5,260,203，其公開在本文整合作為參考。在生產(chǎn)單鏈抗體的一個代表性方法中，使用從所免疫動物的脾臟分離的RNA制備組合免疫球蛋白噬菌粒文庫，并且通過內(nèi)皮組織淘選選擇表達適當抗體的噬菌粒。該方法相對常規(guī)雜交瘤技術(shù)的優(yōu)點是能夠產(chǎn)生大約104倍的抗體并且通過一輪進行篩選，并且通過在單鏈中組合H和L鏈產(chǎn)生了新的特異性，這進一步增加了發(fā)現(xiàn)適當抗體的機會。
術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合部位的小的抗體片段，其中片段包含與同一多肽鏈中的輕鏈可變區(qū)連接的重鏈可變區(qū)。接頭太短以致于不允許在同一條鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對，通過這種接頭迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合部位。雙抗體在本領(lǐng)域是已知的，見例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci906444-6448(1993)。
如本文使用的詞語“線形抗體”指包含能夠形成一對抗原結(jié)合部位的一對串聯(lián)Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的抗體。線形抗體可以是雙特異性的或單特異性的并且更加詳細描述于Zapata等，Protein Eng.81057-1062(1995)。
已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)用于抗體片段的生產(chǎn)。傳統(tǒng)上，這些片段是通過完整抗體的蛋白水解消化衍生的(見例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science 22981(1985))。然而，這些片段可以通過重組核酸技術(shù)在轉(zhuǎn)化宿主細胞中直接產(chǎn)生。例如，可以從大腸桿菌(E.coli)直接回收Fab′-SH片段并且化學連接形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992))。備選地，通過使用能夠促進F(ab′)2分子裝配的亮氨酸拉鏈GCN4形成了F(ab′)2。根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細胞培養(yǎng)物中直接分離Fv、Fab或F(ab′)2片段。產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對于技術(shù)人員是顯而易見的。
如本文所公開，本發(fā)明代表性的mAb包括HB20-1、HB20-2、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-6、HB20-25、MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18。HB20-1、HB20-2、HB20-3、HB20-4、HB20-5和HB20-6以前分別叫做HB13a、HB13b、HB13c、HB13d、HB13e和HB13f。
本發(fā)明還包含本文明確公開的mAb和抗原結(jié)合片段的功能等效物，其中功能等效物與本文明確描述的抗體的相應鏈或區(qū)域相比具有基本相似的重鏈、輕鏈、重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和/或CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)核酸和/或氨基酸序列(如下面更詳細的描述)并且特異地結(jié)合CD20，并且任選地表現(xiàn)出本文明確描述的抗體和抗體片段的一種或多種其它功能特性(例如結(jié)合密度、B細胞消除效率)。在一個例證性實施方案中，本發(fā)明的mAb和抗原結(jié)合片段與本文明確描述的mAb和抗原結(jié)合片段結(jié)合同一抗原決定簇(即表位)。
對于技術(shù)人員而言，常規(guī)通過表位作圖(沒有過多的實驗)確定一種抗體是否具有本文公開的單克隆抗體的特異性。例如核酸和/或氨基酸序列可以確定所述抗體的一種或多種重鏈和/或輕鏈CDR區(qū)或者重鏈和/或輕鏈可變區(qū)。在這些區(qū)域具有相同(或者功能等效)的氨基酸殘基序列的抗體分子具有相同或相似結(jié)合特異性。評定和比較可變區(qū)和CDR區(qū)相似性以確定功能等效的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
確定一種單克隆抗體是否與本文所述抗體具有相同特異性的另一種方法是通過比較抗體互補位的三維結(jié)構(gòu)(如通過基于氨基酸序列的計算機模型預測)。表位-抗體互補位之間的相互作用一般涉及四種力范德瓦爾斯力(偶極-偶極相互作用)、氫鍵、疏水相互作用和離子(庫侖)鍵。非共價結(jié)合穩(wěn)定了抗體-抗原復合物并且將復合物維持在一起。相互作用是通過兩個分子的三維結(jié)構(gòu)確定的。因此，對抗體互補位、表位和/或表位-抗體互補位復合物的三維結(jié)構(gòu)的預測允許與其它抗體進行免疫特異性比較。
備選地或另外地，通過使用基于抗原片段化(抗體隨機或通過特異遺傳構(gòu)造與其結(jié)合)的技術(shù)并且通過確定所得到片段與抗體的反應性實現(xiàn)表位作圖。也可以在核酸水平實現(xiàn)片段化，例如通過PCR技術(shù)接著通過在放射性氨基酸存在下體外轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。對于進一步的細節(jié)見例如Harlow和Lane，Using Antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999，390-392頁。
根據(jù)表位作圖的進一步的方法，合成了一組重疊的肽并且在固相上排成陣列，其中每一個肽對應著蛋白質(zhì)抗原的小的線性片段。然后用測試抗體探測肽的板并且使用酶標記的次級抗體檢測所結(jié)合的抗體(Harlow和Lane，同上，393-396頁)。
本領(lǐng)域眾所周知的表位作圖的另外方法是從隨機合成肽文庫或噬菌體展示肽文庫中選擇抗體。例如，可以通過將編碼肽的寡核苷酸的復雜混合物克隆入f1型ssDNA噬菌體的小外殼蛋白基因的氨基末端來構(gòu)建噬菌體展示文庫。此種噬菌體展示文庫是商業(yè)可得的，例如可以從New EnglandBiolabs得到。文庫可以作為原種擴增，然后將足以代表每一獨立克隆的多拷貝的等分試樣與目的抗體混合。通過稱作“生物淘洗(biopanning)”的步驟收集抗體結(jié)合的噬菌體并且去除未結(jié)合的噬菌體。洗脫結(jié)合的噬菌體并用于感染細菌，并將所選擇的原種進行擴增。使最終選擇原種的單個噬菌斑生長并通過例如ELISA檢查特異的抗體反應性，并且對插入位點附近的DNA進行測序。對抗體結(jié)合的肽的編碼序列的分析闡述了抗體的特異性。對于進一步的細節(jié)見例如Smith和Scott，Methods Enzymol.217228-257(1993)和Harlow和Lane，同上，397-398頁。
確定mAb是否與本文描述的mAb具有相同的特異性的另一種方法(雖然可靠性較差)是通過確定前者能否阻止后者與靶分子(例如CD20)的結(jié)合。如果被測試的mAb與本文描述的mAb競爭，如通過在用于結(jié)合靶分子的標準競爭測定中mAb結(jié)合降低所示，則兩個mAb結(jié)合同一表位或密切相關(guān)的表位。然而，這不是權(quán)威性測試。即使所測試的抗體能夠降低本文所公開抗體與靶分子的結(jié)合，所測試mAb和本文公開的mAb結(jié)合的真實表位仍然可以是不同的。例如，所測試mAb與其抗原決定簇的結(jié)合遮蔽了本文描述的mAb的抗原決定簇并且由于所測試mAb的物理體積而不是由于結(jié)合同一表位簡單地阻止其結(jié)合。因此，為了證實特異性常常采用與競爭方法聯(lián)合使用的更精確的方法(例如可變區(qū)的氨基酸測序和建立三維模型)。
確定mAb可能具有本文描述mAb特異性的另一種方法是將本文公開的mAb與靶分子(例如CD20)預孵育然后加入被測試的mAb以確定被測試的mAb結(jié)合靶分子的能力是否被抑制了。如果被測試mAb被抑制了，則它可能具有與本文公開的mAb相同的或功能等效的表位特異性。然而，該方法受到了如上面討論的競爭研究相同的限制，并且同樣也不是相同特異性的必要決定性條件。
在本發(fā)明特定的實施方案中，mAb或其抗原結(jié)合片段特異結(jié)合CD20，其中結(jié)合CD20和/或B細胞的mAb或抗原結(jié)合片段的密度與傳統(tǒng)抗CD20mAb(例如2H7、B9E9、1H4、2B8、1F5和/或Leu-16抗體)結(jié)合CD20和/或B細胞相比高至少大約30％、40％、50％、60％、75％、85％、2倍、3倍、4倍或甚至5倍。此外，本發(fā)明的mAb在消除低密度表達CD20的惡性B細胞中具有更好的治療效果。這些傳統(tǒng)的抗體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是可得的(見例如Shan等，(1999)J.Immunol.1626589-6595；Schultz等，(2000)Cancer Res.606663-6669；Haisma等，(1998)Blood 92184-190；Stashenko等，(1980)J.Immunol.1251678)。不希望受本發(fā)明的任何特定理論限制，抗體結(jié)合的密度可歸于抗體結(jié)合表位的可接近性或可得性。因此，根據(jù)該實施例，看來與上述的一種或多種傳統(tǒng)抗體相比，本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段針對的是在細胞表面可接近性增加的表位。與傳統(tǒng)抗體相比，本發(fā)明該實施方案中的抗體和抗原結(jié)合片段能夠以較低劑量誘導B細胞消除，所以它們對于治療應用是有利的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解與傳統(tǒng)抗體相比，結(jié)合密度增加的程度會按照靶標例如所使用細胞系的不同而變化。在一個例證性的實施方案中，單克隆抗體或抗原結(jié)合片段上調(diào)B細胞上的結(jié)合部位(即表位的可接近性)，這導致mAb或抗原結(jié)合片段與B細胞和/或它們的惡性對等物結(jié)合的較高密度。
確定結(jié)合到細胞的抗體密度的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如Sato等，J.Immunology 1656635-6643(2000)；其公開了估計細胞表面CD19的密度的方法)。其它標準的方法包括斯卡查德分析法(Scatchard analysis)。例如，對抗體或片段進行分離和放射性標記并且測定放射性標記抗體的特異活性。然后將抗體與表達CD20的靶細胞接觸。測定與細胞結(jié)合的放射性并且基于特異的活性確定結(jié)合到細胞的抗體或抗體片段的量。
備選地，可以采用熒光激活細胞分選(FACS)分析。通常，抗體或抗體片段結(jié)合到表達CD20的靶細胞上。然后加入結(jié)合抗體的第二種試劑，例如熒光染料標記的抗免疫球蛋白抗體。然后測定熒光染料染色并且用來確定結(jié)合到細胞的抗體或抗體片段的密度。
作為另一個適宜的方法，抗體或抗體片段用可檢測標記如熒光團直接標記并結(jié)合到靶細胞上。確定標記到蛋白質(zhì)的比率并且與以已知標記數(shù)量結(jié)合到其上的標準珠相比較。對結(jié)合到細胞的標記的數(shù)量與已知的標準的比較用于計算結(jié)合到細胞的抗體的量。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，功能等效抗體或片段對于消除B細胞和/或治療B細胞疾病方面與本文描述的抗體或片段具有相同或相似的效力。本發(fā)明的該方面在下面更詳細描述。為了圖解說明，在代表性實施方案中，功能等效的抗體或片段實現(xiàn)以大約125mg/m2、75mg/m2、37.5mg/m2、10mg/m2、3.75mg/m2、1mg/m2、0.75mg/m2、0.375mg/m2、0.1mg/m2、0.05mg/m2、0.001mg/m2、0.0005mg/m2或更低的劑量消除至少大約25％、35％、50％、75％、85％、90％、95％或98％或更多的循環(huán)和/或組織B細胞達至少大約5、7、14、21、30、45、60、120或180天或更長時間。其它特定的劑量、消除程度和消除時間在下面更詳細描述。
在本發(fā)明的代表性實施方案中，本發(fā)明的mAb或抗原結(jié)合片段包含如本文所描述的mAb的重鏈或輕鏈。在其它代表性實施方案中，本發(fā)明的mAb或抗原結(jié)合片段包含來自如本文所描述的mAb的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。在另外的其它實施方案中，mAb或抗原結(jié)合片段包含來自本文所公開mAb的重鏈V和/或D和/或J區(qū)和/或輕鏈V和/或J區(qū)。在另外的其它代表性實施方案中，mAb或抗原結(jié)合片段包含本文所述mAb的重鏈CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)和/或輕鏈CDR1和/或CDR2和/或CDR3區(qū)。根據(jù)該實施方案，mAb或抗原結(jié)合片段可以包含來自如本文所述mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)(重鏈和輕鏈)。
在特定實施方案中，抗人CD20抗體或其抗原結(jié)合片段特異結(jié)合CD20并且具有包含氨基酸序列FYXYXXX1YGAX2XXY的重鏈CDR3區(qū)，其中X可以是任意氨基酸，并且其中X1可以是任意氨基酸且優(yōu)選地是Y或S，并且其中X2可以是任意氨基酸且優(yōu)選地是M或L，并且其中F是苯丙氨酸，Y是酪氨酸，G是甘氨酸，A是丙氨酸，M是蛋氨酸，L是亮氨酸并且S是絲氨酸。如圖15和18所示定義CDR。
在某些實施方案中，抗人CD20抗體或其抗原結(jié)合片段還包含含有氨基酸序列NXXXX的重鏈CDR1區(qū)，其中X可以是任意氨基酸并且N是天冬酰胺。
在另一個實施方案中，抗人CD20抗體或其抗原結(jié)合片段還包含含有氨基酸序列XHFWXX3XWX的輕鏈CDR3區(qū)，其中X可以是任意氨基酸序列，H是組氨酸，F(xiàn)是苯丙氨酸，W是色氨酸并且X3可以是任意氨基酸且優(yōu)選地是T或I，其中T是蘇氨酸并且I是異亮氨酸。
此外，本發(fā)明的mAb和抗原結(jié)合片段包含與上面指定的氨基酸序列(例如重鏈或輕鏈、重鏈和/或輕鏈可變區(qū)、V、D和/或J區(qū)或一個或多個CDR)具有相當大的序列同源性例如至少大約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列。備選地，編碼這些區(qū)域的核酸與本文描述的抗體的相應區(qū)域的核苷酸序列具有至少大約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高核苷酸相似性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對本文公開的氨基酸序列和核苷酸序列進行一定的修改。例如，通過克隆或擴增方法或其它核酸分子或蛋白質(zhì)分子的實驗室操作能夠修飾序列，以提供與CD20和/或B細胞結(jié)合的提高了的親合力和/或密度，和/或增強與Fc受體的相互作用。
在特定實施方案中，mAb或抗原結(jié)合片段(a)包含含有本文明確公開的mAb重鏈可變區(qū)或與本文明確公開的mAb重鏈可變區(qū)氨基酸序列具有相當大的氨基酸序列相似性(如上所述)的重鏈可變區(qū)的重鏈；(b)包含含有本文所公開的mAb輕鏈可變區(qū)或與本文明確公開的mAb輕鏈可變區(qū)氨基酸序列具有相當大的氨基酸序列相似性(如上所述)的輕鏈可變區(qū)的輕鏈；或者(c)包含如上面(a)和(b)所述重鏈和輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。在特定實施方案中，本發(fā)明mAb或抗原結(jié)合片段包含含有本文明確公開的mAb重鏈可變區(qū)或與其具有相當大的氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈，并且還包含含有本文所公開的相同mAb輕鏈可變區(qū)或與其具有相當大的氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈。
如本領(lǐng)域中已知，大量不同的程序用于鑒定核酸或多肽是否與已知序列具有序列同一性或相似性。使用本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)可以確定序列同一性和/或相似性，這些技術(shù)包括但不限于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2，482(1981)的局部序列同一性算法、通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，443(1970)的序列同一性比對算法、通過Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444(1988)的相似性查找方法、通過這些算法的計算機化執(zhí)行法(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，WI)、Devereux等，Nucl.Acid Res.12，387-395(1984)所描述的Best Fit序列程序，優(yōu)選地使用缺省設(shè)置，或者通過檢查確定序列同一性和/或相似性。
有用算法的例子是PILEUP。PILEUP使用漸進配對比對從一組相關(guān)序列創(chuàng)建多重序列比對。它還可以繪制成樹以顯示用于創(chuàng)建比對的聚類關(guān)系。PILEUP使用Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35，351-360(1987)的簡化的漸進比對方法；該方法與Higgins和Sharp，CABIOS 5，151-153(1989)所描述的方法相似。
有用算法的另一個例子是BLAST算法，它描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，5873-5787(1993)。特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，該程序是從Altschul等，Methods in Enzymology，266，460-480(1996)得到的。WU-BLAST-2使用幾個查找參數(shù)，這些參數(shù)優(yōu)選地設(shè)置為缺省值。這些參數(shù)是動態(tài)的值并且是依賴于特定序列的組成以及特定數(shù)據(jù)庫(目的序列所檢索的數(shù)據(jù)庫)的組成由程序自身確立的；然而，這些值可以調(diào)整以增加靈敏度。
另外有用的算法是Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25，3389-3402所報道的缺口BLAST。
通過相匹配的相同殘基數(shù)除以所對齊區(qū)域內(nèi)“較長”序列的殘基總數(shù)可以確定氨基酸序列同一性值的百分數(shù)?！拜^長”序列是在對齊區(qū)域內(nèi)具有最多實際殘基的序列(忽略了為了最大化比對分值而通過WU-Blast-2所引入的缺口)。
比對可以包括在被比對的序列中引入缺口。另外，對于比本文特定公開的多肽含有更多或更少氨基酸的序列，應該理解在實施方案中序列同一性的百分數(shù)將基于與氨基酸總數(shù)相關(guān)的相同氨基酸的數(shù)目來確定。因此，例如在一個實施方案中，使用較短序列中氨基酸的數(shù)目來確定比本文明確公開序列更短的序列的序列同一性。在同一性百分數(shù)的計算中，對于序列變體的各種表現(xiàn)形式如插入、缺失、替換等不指定相對加權(quán)。
在一個實施方案中，僅同一性分值賦予正值(+1)并且將包括缺口在內(nèi)的所有形式的序列改變指定為“0”值，這避免了在序列相似性計算中需要如下所描述的加權(quán)范圍或參數(shù)。例如，通過用匹配的相同殘基數(shù)除以對齊區(qū)域內(nèi)“較短”序列的總殘基數(shù)并乘以100來計算序列同一性的百分數(shù)。“較長”序列是在對齊區(qū)域內(nèi)具有最多實際殘基的序列。
在其它實施方案中，mAb、抗原結(jié)合片段或與本文明確描述的mAb或相應抗原結(jié)合片段或特異區(qū)具有“相當大的序列相似性”的特異區(qū)域是由如下的核酸編碼的，該核酸能夠在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準條件下與文中明確公開的核酸的相應片段雜交并且編碼如本文所定義的功能性等效的mAb或抗原結(jié)合片段。
為了舉例說明，此類核酸序列與本文所明確公開序列的雜交可以在低嚴格性、中嚴格性或者甚至嚴格性條件(例如分別為以下代表性條件于37℃用含有5×Denhardt溶液的35-40％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗滌的嚴格條件；于42℃用含有5×Denhardt溶液的40-45％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗滌的嚴格條件；和/或于42℃用含有5×Denhardt溶液的50％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗滌的嚴格條件)下進行。見，例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第二版，1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解由于遺傳密碼的簡并性編碼本發(fā)明mAb和抗原結(jié)合片段的核酸可以存在變化。遺傳密碼簡并性允許不同的核酸序列編碼相同的多肽，這在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
通過存在(或缺乏)非翻譯序列如內(nèi)含子序列和5’和3’非翻譯序列，可以向核酸序列中進一步引入的變異。
既然發(fā)明者已經(jīng)產(chǎn)生并表征了具有預期特性的一組抗CD20的mAb，對于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員而言可以常規(guī)產(chǎn)生相似或改良的抗體或片段。例如，可以以重鏈和/或輕鏈可變區(qū)(或其部分，如一個或多個CDR)序列作為起點來鑒定具有預期特性的其它抗體。作為一種方法，可以產(chǎn)生包含本文所公開序列變體的噬菌體文庫?？梢曰谌我忸A期特性對噬菌體文庫進行篩選，特性如CD20反應性、結(jié)合密度、B細胞消除效率、治療B細胞疾病的效率等。
而且，為了修飾本文明確公開的mAb和其抗原結(jié)合片段的氨基酸和核酸序列，可以基于本領(lǐng)域已知的任意特性進行氨基酸替代，這些特性包括氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性和差異，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等等。在特定實施方案中，在氨基酸序列中進行保守替代。如本文所使用，“保守氨基酸替代”是這樣一種替代，即其天然發(fā)生機率比偶然發(fā)生替代的機率高大約10倍的替代(例如，通過Dayhoff等，Atlas ofProtein Sequence and Structure，1971，95-96頁和圖9-10所描述的計算方法所定義)。
在進行氨基酸替代時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用生物學功能方面的重要性在本領(lǐng)域中是普遍理解的(見Kyte和Doolittle，(1982)J.Mol.Biol.157105；本文整體引用作為參考)。人們公認氨基酸的相對親水特性有助于所得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，反過來，這又限制蛋白質(zhì)與其它分子例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等等的相互作用。
基于其疏水性和電荷特性已經(jīng)指定了每個氨基酸的親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，同前)，并且它們是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
在本領(lǐng)域中還應當理解，可以基于親水性進行氨基酸取代。在美國專利號4,554,101(本文整體引用作為參考)中敘述了由其相鄰氨基酸的親水性所控制的蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性與蛋白質(zhì)的生物學特性相關(guān)。
如在美國專利號4,554,101中所詳細描述，已經(jīng)指定了氨基酸殘基的親水性數(shù)值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(±3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在其它實施方案中，本發(fā)明的功能等效mAb和抗原結(jié)合片段包括那些包含一個或多個來自本文所公開的mAb或抗原結(jié)合片段的上面所指定區(qū)域(例如重鏈或輕鏈、重鏈和/或輕鏈可變區(qū)或其部分)的mAb和抗原結(jié)合片段，其中本文所公開的mAb或抗原結(jié)合片段具有不超過14、12、10、8、6、5、4、3、2或1個氨基酸替代、缺失和/或插入。在特定實施方案中，本發(fā)明的mAb或抗原結(jié)合片段包含CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)，其中每個CDR區(qū)包含不超過5、4、3、2或1個氨基酸替代、缺失和/或插入。在代表性的實施方案中，CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)各自包含不超過5、4、3、2或1個保守氨基酸替代。
抗體或片段還可以具有多于一個抗原特異性，例如可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體還可以結(jié)合另一個CD20表位。另外，雙特異性抗體還可以對其它抗原如CD19、CD22、CD52、CD3、CD28或HLA-DR10(Lym-1)；或者Fc受體如CD16、CD64和CD89；T細胞受體(例如T細胞受體復合物的ζ鏈)或者其它細胞表面分子如諸如細胞因子受體、激素或生長因子受體的受體具有結(jié)合特異性。
抗體和其片段還還可以是“嵌合”抗體。嵌合抗體和抗原結(jié)合片段包含來自兩個或多個不同物種(例如小鼠和人)的部分。將具有目的特異性的小鼠可變區(qū)剪接入人恒定區(qū)基因片段中可以產(chǎn)生嵌合抗體(見，例如美國專利號4,816,567)。以這種方式，能夠修飾非人(例如小鼠)抗體以使得它們更加適合于人的臨床應用。
本發(fā)明mAb還可以是“人源化的”或“CDR移植”形式的非人(例如小鼠)mAb，這使其作為用于人的治療劑比鼠mAb具有更多的優(yōu)點，特別是它們不會象小鼠抗體一樣很快地從人體循環(huán)中消除，并且當施用于人受試者時通常不會引發(fā)不良免疫反應。一般而言，人源化抗體具有一個或多個從非人類來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，這些“輸入”殘基一般取自“輸入”可變區(qū)。制備人源化抗體的方法在本領(lǐng)域中通常是眾所周知的，并且能夠容易地應用于本文所公開的mAb。例如，按照Winter和其同事(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))的方法通過將嚙齒類CDR序列替換人抗體中相應序列基本上可以實現(xiàn)人源化。在特定實施方案中，非人類(例如小鼠)抗體的人源化形式是人抗體(接受者抗體)，其中接受者抗體的高變區(qū)(CDR)殘基由來自非人類物種(供者抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物并具有目的特異性、親和性和結(jié)合容量的高變區(qū)殘基所替換。在一些情況下，人免疫球蛋白骨架區(qū)殘基也由相應非人類的殘基替換(所謂的“回復突變”)。通過序列和結(jié)構(gòu)分析，或者通過使用計算機模型進行的可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)分析，能夠確定此類回復突變的位置。另外，噬菌體展示文庫也可以用于改變抗體序列中所選則位置的氨基酸。還可以通過人抗體的骨架區(qū)的選擇影響人源化抗體的特性。此外，為了進一步改進抗體特性如親和性，可以修飾人源化和嵌合抗體使其包含在接受者抗體或供者抗體中均未發(fā)現(xiàn)的殘基。一般而言，人源化抗體將包含全部或基本上全部的對應非人免疫球蛋白CDR區(qū)的至少一個、兩個或者甚至三個CDR區(qū)，并且全部或基本上全部骨架區(qū)殘基是人免疫球蛋白序列的殘基。人源化抗體任選地還包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般為人免疫球蛋白恒定區(qū)。對于更加詳細的內(nèi)容，見Jones等，Nature 321522-525(1986)；和Reichmann等，Nature 332323-329(1988)。因此，本發(fā)明的一個實施方案中提供的mAb是通過移植以引入人免疫球蛋白成分而實現(xiàn)人源化的，基本上不妨礙抗體結(jié)合抗原(即CD20)的能力。
本發(fā)明mAb或抗原結(jié)合片段可以是沒有綴合其它試劑如治療劑的裸抗體或抗原結(jié)合片段。備選地，可以將mAb或抗原結(jié)合片段綴合上治療劑(即形成免疫連接物)例如細胞毒劑、小分子化合物、激素、生長因子、細胞因子、酶、RNA酶、核酶或包含編碼序列、反義RNA和RNAi的核酸分子。
舉例說明的細胞毒劑包括但不限于蛋白質(zhì)毒素如蓖麻毒素、白喉毒素、葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素、相思豆毒素或其它核糖體失活蛋白(ribosomal inactivating proteins)。通過使用化學交聯(lián)劑的化學方法或者通過構(gòu)建編碼全部或部分蛋白質(zhì)毒素的融合蛋白質(zhì)構(gòu)建體的重組核酸技術(shù)，能夠?qū)⑦@些蛋白質(zhì)連接至抗體或抗體片段。其它例證性的細胞毒劑包括高能放射性同位素如90Y、131I或111In。其它細胞毒劑包括細胞毒性藥物和細胞抑制藥物如氨甲喋呤、苯丁酸氮芥、阿霉素、柔紅霉素和長春花新堿。
備選地，mAb或抗原結(jié)合片段可以用可檢測標記進行標記。代表性的可檢測標記包括放射性標記、重金屬、發(fā)色團、熒光團和酶，其中酶的終產(chǎn)物是可檢測的。例如用可檢測標記進行標記的抗體和抗原結(jié)合片段可以用于診斷方法和實驗室方法。
抗CD20的mAb可以通過本領(lǐng)域已知的任何標準方法制備，例如通過雜交瘤方法(Koehler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；和Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，59-103頁，(AcademicPress，1986))或者通過如美國專利號4,816,567和Wood等，Nature314446-9(1985)所公開的重組技術(shù)。
一般通過單個細胞如雜交瘤細胞的克隆產(chǎn)生單克隆抗體，其中雜交瘤細胞能夠產(chǎn)生具有相同抗體結(jié)合部位的抗體分子的同質(zhì)群體。雜交瘤細胞是通過抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞或自永生化細胞系融合形成的。此類抗體制備首先由Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)描述，本文整體引用作為參考。另外的方法描述于Zola，Monoclonal AntibodiesaManual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987)。篩選如此制備的雜交瘤培養(yǎng)上清液，證實是否存在能夠結(jié)合CD20和/或具有本文所描述的其它目的特征的抗體分子。
一般地，為了產(chǎn)生能夠生產(chǎn)抗CD20mAb的雜交瘤，將骨髓瘤或其它自永生化細胞系與來自CD20超免疫哺乳動物脾臟、淋巴結(jié)的淋巴細胞或其它抗體產(chǎn)生細胞融合(見，例如Kearney等，J.Immunol.，1231548-50(1979))。
在一個實施方案中，用于制備雜交瘤的骨髓瘤細胞系與淋巴細胞來自同一物種。本發(fā)明中使用的適當?shù)男∈蠊撬枇鍪荖S-1骨髓瘤細胞系，NS-1骨髓瘤細胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心Manassas，Virginia，UnitedStates of America得到。
一般使用聚乙二醇(PEG)1500將脾細胞與骨髓瘤細胞融合。通過它們對HAT的敏感性選擇出融合的雜交細胞。通過使用本文所述的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和熒光激活細胞分選(FACS)鑒定能夠生產(chǎn)所公開單克隆抗體的雜交瘤。
抗體產(chǎn)生細胞可以從近交小鼠品系例如C57BL/6品系得到。在其它實施方案中，抗體產(chǎn)生細胞來自CD20-/-哺乳動物例如CD20-/-小鼠。在一個代表性的實施方案中，CD20-/-小鼠最初衍生于129品系小鼠。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且如本文所描述的技術(shù)可以產(chǎn)生CD20-/-小鼠，見例如Hogan等，(1986)Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.。
本發(fā)明的抗CD20mAb可以是完全的人類抗體。制備完全的人類抗體的方法是本領(lǐng)域已知的并且包括對轉(zhuǎn)基因動物和噬菌體展示技術(shù)的使用。
還可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，當免疫時，這些轉(zhuǎn)基因動物能夠在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生全部人類抗體。例如，已經(jīng)描述過在嵌合體突變和生殖系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因排列轉(zhuǎn)移進入此種生殖系突變的小鼠中會導致在抗原激發(fā)的情況下產(chǎn)生人類抗體。見，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature 362，255-258(1993)。
Mendez等(Nature Genetics 15146-156(1997))進一步改進了技術(shù)并且產(chǎn)生了命名為“Xenomouse II”的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，當用抗原激發(fā)時，Xenomouse II轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了高親和性的完全人類抗體。這可以通過將兆堿基的人類重鏈和輕鏈基因座通過生殖系整合進入上述內(nèi)源JH片段缺失的小鼠中實現(xiàn)。Xenomouse II含有1,020kb的人重鏈基因座并且還含有800kb的人κ基因座，其中重鏈基因座包含大約66個VH基因、完整的DH和JH區(qū)和三個不同的恒定區(qū)(μ、δ和χ)，κ基因座基因座包含32個Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。在包括基因重排、裝配和抗體譜在內(nèi)的所有方面，這些小鼠產(chǎn)生的抗體十分像人類的抗體。因為內(nèi)源的JH片段的缺失阻止了在鼠內(nèi)基因座的重排，所以相對于內(nèi)源抗體而言人類抗體是優(yōu)選表達的。
產(chǎn)生mAb的其它方法也是已知的。見例如Sastry等，Proc Natl AcadSci USA 865728-5732(1989)和Huse等，Science 2461275-1281(1989)所描述的從免疫球蛋白庫分離mAb的方法。
備選地，可以使用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348，552-553(1990))從非免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)(V)全套基因中體外生產(chǎn)人類抗體和抗體片段。根據(jù)該技術(shù)，將抗體V區(qū)基因按閱讀框架克隆入絲狀噬菌體如M13或fd的小外殼蛋白或者主要外殼蛋白基因上并且作為功能抗體片段在噬菌體顆粒表面上展示。由于絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體功能特性的篩選也導致對表現(xiàn)這些特性的抗體編碼基因的篩選。因此，噬菌體模擬了B細胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種形式開展；見例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3，564-571(1993)。
幾種來源的V基因片段可以用于噬菌體展示。Clackson等，Nature352，624-628(1991)從來源于免疫小鼠脾臟的V基因的小的隨機整合文庫中分離了多組抗噁唑酮抗體。可以將來源于非免疫供體的全套V基因進行構(gòu)建并且基本上可以按照Marks等，J.Mol.Biol.222，581-597(1991)或者Griffith等，EMBO J.12，725-734(1993)描述的技術(shù)分離針對多組抗原(包括自身抗原)的抗體。在自然免疫反應中，抗體基因以高頻率積累突變(體細胞高變)。所導入的一些變化賦予了較高的親和性，并且在后來的抗原激發(fā)中表現(xiàn)出高親和性表面免疫球蛋白的B細胞優(yōu)先復制和分化。通過采用已知稱為“鏈改組”的技術(shù)模擬了這種天然過程(Marks等，Bio/Technol.10，779-783)。在該方法中，通過噬菌體展示得到的“初級的”人類抗體可以通過將重鏈和輕鏈V區(qū)基因的序列替換成非免疫供體V區(qū)基因全套天然變體(天然變體庫)進行改進。這種技術(shù)允許產(chǎn)生具有nM范圍的親和性的抗體和抗體片段。構(gòu)建十分龐大的噬菌體抗體庫的策略已由Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21，2265-2266(1993)描述。
關(guān)于產(chǎn)生單克隆抗體的進一步的信息還可見Goding，J.W.，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第3版，AcademicPress，Inc.，London，San Diego，1996；Liddell和WeeksAntibodyTechnologyA Comprehensive Overview，Bios Scientific PublishersOxford，UK，1995；Breitling和DubelRecombinant Antibodies，JohnWiley&Sons，New York，1999和Phage DisplayA Laboratory Manual，Barbas等編著，Cold Springs Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，2001。
本發(fā)明者意外發(fā)現(xiàn)可以從CD20-/-哺乳動物產(chǎn)生不同特性(例如CDR區(qū)、結(jié)合密度等)的新的抗體。因此，在一個代表性的實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生能夠特異結(jié)合CD20的單克隆抗體的方法，包括(a)在足以引起抗體反應的條件下，用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳動物(例如小鼠)；(b)從哺乳動物收獲抗體產(chǎn)生細胞(例如B細胞)；(c)將抗體產(chǎn)生細胞與培養(yǎng)的無限增殖化細胞(例如骨髓瘤細胞)融合以形成產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞；(d)在足以產(chǎn)生單克隆抗體的條件下培養(yǎng)雜交瘤細胞；和(e)從培養(yǎng)物中回收特異結(jié)合CD20的單克隆抗體。方法任選地可以包括分離產(chǎn)生抗CD20mAb的雜交瘤細胞系。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異結(jié)合CD20的mAb的方法，包括(a)在足以引起抗體反應的條件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳動物；(b)從哺乳動物收集產(chǎn)生特異結(jié)合CD20的抗體的細胞；(c)從抗體產(chǎn)生細胞中分離免疫球蛋白編碼基因；(d)將免疫球蛋白編碼基因?qū)氩煌募毎援a(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細胞；(e)在足以使免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯以及單克隆抗體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞；和(e)從培養(yǎng)物中回收特異結(jié)合CD20的單克隆抗體。在特定的實施方案中，從抗體產(chǎn)生細胞或者從不同的抗體產(chǎn)生細胞中分離重鏈和輕鏈基因并且將其導入轉(zhuǎn)化的細胞。轉(zhuǎn)化的細胞可以是任意適宜細胞，例如哺乳動物細胞或細胞系如CHO或BHK細胞。
如上所述，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤細胞、雜交瘤細胞系和雜交瘤細胞培養(yǎng)物。本發(fā)明的代表性的雜交瘤細胞系包括雜交瘤HB20-1、HB20-2、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-6、HB20-25、MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18。
按照布達佩斯條約，在2004年5月5日將雜交瘤細胞系HB20-3、HB20-4、HB20-25、MB20-1、MB20-11和MB20-18保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，USA，并且ATCC登錄號分別為＿＿(HB20-3)、＿＿(HB20-4)、＿＿(HB20-25)、＿＿(MB20-1)、＿＿(MB20-11)和＿＿(MB20-18)。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明mAb、抗原結(jié)合片段、抗體重鏈和/或抗體輕鏈或其部分(例如可變區(qū)，CDR區(qū))的核酸。核酸可以是DNA、RNA或其嵌合分子，可以是單鏈的或者雙鏈的，并且可以是完全或部分合成的或天然的。核酸包含修飾核苷酸或核苷酸類似物。此外，核酸可以來源于任何物種，包括哺乳動物物種例如人、非人靈長類、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、綿羊、馬、豬、狗、貓等。
在特定的實施方案中，核酸是分離的核酸。如本文所使用，“分離的”核酸意思是從天然存在生物的至少一些其它成分分離的核酸或者基本上不含有這些成分的核酸，其中所述的其它成分如通常與核酸結(jié)合的細胞結(jié)構(gòu)成分或者其它多肽或核酸。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸的載體，包括表達載體和基因遞送載體。適宜的載體包括細菌表達載體、真菌表達載體、哺乳動物載體、酵母表達載體和植物表達載體。代表性的載體包括細菌人工染色體、粘粒、酵母人工染色體、噬菌體、質(zhì)粒、脂載體和病毒載體(例如腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒等)。
可以設(shè)計表達載體用于在原核或真核細胞中表達多肽。例如，可以在細菌細胞例如大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞(例如在桿狀病毒表達系統(tǒng)中)或者哺乳動物細胞中表達多肽。一些適宜的宿主細胞在Goeddel，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，Calif.(1990)中有進一步討論。用于在釀酒酵母(S.cerevisae)中表達的載體的例子包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EMBO J.6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)。用于在培養(yǎng)的昆蟲細胞(例如Sf 9細胞)中表達核酸以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的可得到的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.d.(1989)Virology 17031-39)。
哺乳動物表達載體的例子包括pCDM8(Seed，(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)，EMBO J.6187-195)。
載體通常包含與本發(fā)明核酸有效連接的表達控制元件(例如啟動子)。應當理解依賴于目的表達水平和組織特異表達可以使用多種表達控制元件。此外，啟動子可以是組成型的或者可誘導的(例如金屬硫蛋白啟動子或者激素誘導啟動子)。表達控制元件可以是宿主細胞自身的或者外來的并且可以是天然序列或者人工合成序列。通常選擇能夠在目的靶細胞內(nèi)具有功能的啟動子。核酸還可以進一步與其它適當?shù)谋磉_控制序列相連，例如轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和多聚腺苷酸信號。在哺乳動物細胞中常常采用病毒調(diào)節(jié)元件。例如在哺乳動物表達載體中經(jīng)常使用的啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。
此外，一般需要特異起始信號以便有效翻譯所插入的蛋白質(zhì)編碼序列。這些翻譯控制序列包括ATG起始密碼子和鄰近序列，它可以是多種來源的，可以是天然的和合成的。
本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明分離核酸和載體的宿主細胞(例如酵母、細菌、哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞)。細胞可以是用本發(fā)明核酸或載體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的。在特定的實施方案中，核酸穩(wěn)定整合入宿主細胞的基因組中。此外，細胞可以是培養(yǎng)的細胞(即分離的)或者活的生物體內(nèi)的原位(in situ)細胞。
使用方法本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段、核酸和藥物組合物可以在多種研究、診斷和/或治療應用中使用。為了舉例說明，本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段能夠特異結(jié)合B細胞特異標志物-CD20。因此，這些試劑可以用于鑒定B細胞的方法、研究CD20功能的方法以及用于免疫親和純化CD20或B細胞的方法。分離B細胞的方法可以用于實驗室研究、治療或診斷方法。例如，從患有B細胞惡性腫瘤的受試者中取出組織或細胞，使用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段純化B細胞，并且將已經(jīng)消除了B細胞的組織或細胞重新導入受試者。此外，本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段和組合物可以用于診斷目的，例如為了鑒定淋巴瘤。本發(fā)明方法還提供了使用綴合有治療劑(如上所述)的抗體或抗原結(jié)合片段將分子進行B細胞特異遞送。此外，本發(fā)明還提供了消除B細胞的治療方法，例如治療B細胞疾病如B細胞惡性腫瘤和自身免疫病。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了在動物受試者體內(nèi)(例如哺乳動物受試者)消除B細胞的方法，包括以有效消除B細胞的量向哺乳動物受試者施用本發(fā)明的mAb、抗原結(jié)合片段或者組合物。通過“有效消除B細胞的量”意思是達到至少大約25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的B細胞減少(即消除)的有效量。在一些實施方案中，這里沒有或基本上沒有可檢測的B細胞。檢測B細胞和測量B細胞消除的方法是本領(lǐng)域已知的(見，例如實施例9-12，14和17)。在代表性實施方案中，在外周循環(huán)和/或組織(例如脾臟和淋巴結(jié))B細胞中實現(xiàn)了至少大約25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者更高的消除。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，為了臨床應用測量/監(jiān)測了外周循環(huán)的B細胞，該方法一般比估計組織中B細胞消除的方法侵害性小。
本發(fā)明進一步提供了治療B細胞疾病的方法，包括將患有B細胞疾病的動物(例如哺乳動物)施用治療有效量的本發(fā)明的一種或多種單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或者藥物制劑。在特定的實施方案中，B細胞疾病是B細胞惡性腫瘤或者自身免疫病。
術(shù)語“B細胞惡性腫瘤”和其語法變體具有有關(guān)B細胞惡性腫瘤或者贅生物的最廣的意義，其中B細胞惡性腫瘤或者贅生物一般在淋巴組織如骨髓或者淋巴結(jié)中產(chǎn)生，但是也可以在非淋巴組織例如甲狀腺、胃腸道、唾液腺和結(jié)膜中產(chǎn)生。本發(fā)明的治療方法特別是涉及CD20陽性B細胞惡性腫瘤，其包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(NHL)的B細胞亞型、伯基特淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、多毛細胞白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥和幼淋巴細胞白血病。非霍奇金淋巴瘤B細胞亞型是一個用于包括由惡性B淋巴細胞產(chǎn)生的一大組(超過29種類型)淋巴瘤的術(shù)語，并且它代表著已知類型淋巴瘤的大部分亞型，包括但不限于低度惡性/濾泡型NHL、小淋巴細胞(SL)NHL、中度惡性/濾泡型NHL、中度惡性彌漫型NHL、高度惡性免疫母細胞NHL、高度惡性原始淋巴細胞性NHL、高度惡性小無裂細胞NHL和巨大腫塊NHL。
自身免疫病部分地起因于自身耐受的損壞，這導致了后來的針對自身的免疫反應，包括自身抗體的產(chǎn)生和免疫球蛋白在受影響組織中的沉積。自身抗體形成了免疫復合物，促進了補體和Fc受體介導的組織炎癥反應和破壞。大多數(shù)自身免疫病起因于能夠與正常身體組織反應的抗體的產(chǎn)生或者其產(chǎn)生加重病情。由于B淋巴細胞是自身抗體的來源，因此它們正當?shù)爻蔀榱酥委熯@些類型免疫介導疾病的靶標。B淋巴細胞還可以遞呈抗原并且調(diào)節(jié)效應子T淋巴細胞的發(fā)育。
已經(jīng)鑒定出超過80種自身免疫病。在美國國立健康研究院的自身免疫病協(xié)調(diào)委員會(Autoimmune Diseases Coordinating Committee)出版的自身免疫病研究計劃(Autoimmune Diseases Research Plan)中廣泛討論了自身免疫病、其病原學和治療。根據(jù)本發(fā)明能夠治療的代表性的自身免疫病包括但不限于免疫復合物病，例如導致腎小球腎炎、古德帕斯丘綜合癥、壞死性血管炎、淋巴結(jié)炎、結(jié)節(jié)性動脈外膜炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的那些免疫復合物病。其它例證性的自身免疫病包括但不限于類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性硬化病、皮肌炎/多發(fā)性肌炎、抗磷脂抗體綜合征、硬皮病、尋常性天皰瘡、ANCA相關(guān)性血管炎(例如韋格納肉芽腫病、顯微鏡下多動脈炎)、葡萄膜炎、舍格倫綜合征、克隆病、賴特爾綜合征、強直性脊椎炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、吉-巴綜合征、橋本甲狀腺炎和心肌病。能夠根據(jù)本發(fā)明治療的其它與抗體產(chǎn)生相關(guān)的疾病包括但不限于多發(fā)性硬化、特應性皮炎、血小板減少性紫癜、粒細胞缺乏、自身免疫性溶血性貧血、針對外來抗原如妊娠過程中的胎兒A-B-O血型的免疫反應、重癥肌無力、I型糖尿病、格雷夫斯病和過敏性反應。
本發(fā)明方法可以用于治療涉及B細胞或者抗體的任何其它疾病或不良狀況，包括例如免疫排斥。
“治療有效”量是足以對受試者的不良狀況產(chǎn)生一些改善或者緩解或者預防或延遲不良狀況再發(fā)或復發(fā)的抗CD20抗體或者抗原結(jié)合片段的量。
可以通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)監(jiān)測受試者以便跟蹤B細胞惡性腫瘤或者特定自身免疫病的臨床指標(clinical indicia)。例如，在B細胞惡性腫瘤的情況下，使用抗CD20抗體可以監(jiān)測腫瘤進程(例如在實體瘤的情況下腫瘤的大小)、循環(huán)B細胞或活檢組織的表型。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解可以根據(jù)多種因素包括年齡、性別、受試者的種類和狀況、預期消除的程度、所治療的疾病和/或所使用的特定抗體或抗原結(jié)合片段來選擇劑量，并且劑量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如，如本文所述非霍奇金淋巴瘤病人或者患有自身免疫病的病人可以接受從大約0.0005至大約1500mg/m2/周、具體而言從大約0.001至大約150mg/m2/周、更加具體而言從大約0.25至大約75mg/m2/周、更加具體而言從大約2.5至大約50mg/m2/周的抗CD20抗體。
在本發(fā)明的實施方案中，抗體和抗原結(jié)合片段能夠以比傳統(tǒng)的抗CD20抗體更高的密度結(jié)合B細胞，并且因此能夠更有效地(即在較低的劑量)消除B細胞(如上面所定義)。備選地或者另外地，更有效的消除是抗體與之反應的特定表位的結(jié)果。在代表性的實施方案中，抗體或者抗原結(jié)合片段(任選地以作為藥物組合物部分的可藥用載體中)的劑量至少大約0.0005、0.001、0.05、0.075、0.1、0.25、0.375、0.5、1、2.5、5、10、20、37.5、50或100mg/m2和/或少于大約200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.1、0.075或0.01mg/m2。在另一個例證性的實施方案中，劑量為大約0.0005和200mg/m2之間、大約0.001和150mg/m2之間、大約0.075和125mg/m2之間、大約0.375和100mg/m2之間、大約2.5和75mg/m2之間、大約10和75mg/m2之間、大約20和50mg/m2之間。
在本發(fā)明方法的一些實施方案中，可以以低于大約375mg/m2的劑量、低于大約37.5mg/m2的劑量、低于大約0.375mg/m2的劑量和/或在大約0.075mg/m2和大約125mg/m2之間的劑量施用本發(fā)明的mAb、抗原結(jié)合片段和/或組合物。
所指定的劑量能夠?qū)е翨細胞消除(如上面所述)達到至少大約3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150或180天或者更長的時間階段。
在本發(fā)明的代表性的實施方案中，大約125mg/m2或更低劑量的抗體或抗原結(jié)合片段導致B細胞消除(如上面所述)達至少大約7、14、21、30、45、60、90或120天。在另一個代表性的實施方案中，大約37.5mg/m2或更低的劑量消除B細胞達至少大約7、14、21、30、45、60、90或120天。在其它實施方案中，大約0.375mg/m2或更低的劑量導致B細胞消除達至少大約7、14、21、30、45或60天。在另一個實施方案中，大約0.075mg/m2或更低的劑量導致B細胞消除達至少大約7、14、21、30、45或60天。在另外的其它實施方案中，大約0.01mg/m2、0.005mg/m2或者甚至0.001mg/m2或更低的劑量導致B細胞消除達至少大約3、5、7、10、14、21或30天。根據(jù)這些實施方案，劑量可以通過任何適宜的途徑施用(如下所述)，但是任選地通過皮下途徑施用。
作為另一方面，本發(fā)明提供了這樣一種發(fā)現(xiàn)，即以比當前可得方法中采用的劑量更低的抗體或者抗體片段的劑量可以實現(xiàn)B細胞消除和/或B細胞疾病的治療。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了消除B細胞和/或治療B細胞疾病的方法，包括向動物受試者(例如哺乳動物受試者)施用有效量的能夠特異結(jié)合CD20的mAb或其抗原結(jié)合片段，其中大約200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.25、0.1、0.075、0.05、0.001、0.0005mg/m2或更低的劑量導致至少大約25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的B細胞(循環(huán)和/或組織B細胞)消除達至少大約3、5、7、10、14、21、30、45、60、75、90、120、150或180天或更長。在代表性的實施方案中，大約125mg/m2或75mg/m2或更低的劑量導致至少大約50％、75％、85％或90％的B細胞消除達至少大約7、14、21、30、60、75、90、120、150或180天。在其它實施方案中，大約50、37.5或10mg/m2的劑量導致至少大約50％、75％、85％或90％的B細胞消除達至少大約7、14、21、30、60、75、90、120或180天。在另外的其它實施方案中，大約0.375或0.1mg/m2的劑量導致至少大約50％、75％、85％或90％的B細胞清除達至少大約7、14、21、30、60、75或90天。在進一步的實施方案中，大約0.075、0.01、0.001或0.0005mg/m2的劑量導致至少大約50％、75％、85％或90％的B細胞消除達至少大約7、14、21、30或60天。根據(jù)這些實施方案，劑量可以通過任何適宜的途徑施用(如下所述)，但是任選地通過皮下途徑施用。
根據(jù)該實施方案，抗體或抗原結(jié)合片段是如本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段(包括功能等效抗體和抗原結(jié)合片段)。
在其它特定實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段以與傳統(tǒng)抗體相比更高的密度結(jié)合CD20或者B細胞(如上所述)。
本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段和藥物組合物可以與其它治療劑或者療法聯(lián)合使用。例如在B細胞惡性腫瘤的情況下，此種療法或治療包括單獨的化學療法、放射免疫療法(RIT)、化學療法和體外放射療法(聯(lián)合模式治療，CMT)或者聯(lián)合模式放射免疫療法(CMRIT)或者它們的聯(lián)合等。因此，本發(fā)明的抗CD20抗體和抗體片段可以與CHOP(環(huán)磷酰胺-羥基阿霉素-硫酸長春新堿(長春新堿)-潑尼松龍)聯(lián)合進行，CHOP是治療非霍奇金淋巴瘤最常用的化學治療策略。此外，本文的抗CD20抗體可以與包括抗CD19、抗CD22(例如在美國專利號5,484,892、美國申請系列號10/371,797的美國專利出版物號2004/0001828、美國申請系列號10/372,481的美國專利出版物號2003/0202975和美國臨時申請系列號60/420,472中所述，其每一個的全部內(nèi)容在本文整合作為CD22抗原和抗CD22抗體教導方面的參考)和諸如RituxanTM(C2B8；利妥?，?；IDEC藥物)的其它抗CD20抗體在內(nèi)的其它抗體聯(lián)合施用。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了消除哺乳動物受試者中B細胞的方法，其包括施用本發(fā)明的mAb和/或其抗原結(jié)合片段，并且進一步包括向受試者施用一種或多種額外的抗體和/或其抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，額外的抗體可以是抗CD22抗體、抗CD19抗體或者兩者。一種或多種額外的抗體和/或其抗原結(jié)合片段可以以與本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合片段的施用相關(guān)的任何順序進行施用。例如，一種或多種額外的抗體和/或其抗原結(jié)合片段可以在向受試者施用本發(fā)明的抗體和/或抗原結(jié)合片段之前、同時和/或之后施用。一種或多種額外的抗體和/或其抗原結(jié)合片段可以與本發(fā)明的抗體和/或抗原結(jié)合片段存在于同一種藥物組合物中，和/或存在于不同的藥物組合物中。按照如本申請所提供和如本領(lǐng)域所熟知的施用劑量和方式的任何教導，本發(fā)明的抗體和/或抗原結(jié)合片段施用的劑量和方式和一種或多種額外的抗體和/或其抗原結(jié)合片段的劑量可以是相同的或者不同的。
在一個特定的實施方案中，除了向受試者施用本發(fā)明的抗體以外還施用了能夠增強單核細胞或巨噬細胞功能(例如至少大約25％、50％、75％、85％、90％、9％或更多)的化合物。此種化合物是本領(lǐng)域已知的并且包括(沒有限制)細胞因子如白細胞介素(例如IL-12)和干擾素(例如α或γ干擾素)。能夠增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物或者增強劑可以與抗體或抗原結(jié)合片段配制在同一種藥物組合物中。當單獨施用時，抗體/片段和化合物可以同時施用(相互間隔幾小時階段內(nèi))，可以在治療的同一療程內(nèi)施用或者順序施用(即病人首先接受抗體/片段治療療程然后接受能夠增強巨噬細胞/單核細胞功能的化合物的療程，或者反之亦然)。
可以將本發(fā)明的抗體和抗體片段與本發(fā)明中已知的其它抗體一起使用來開展本發(fā)明的該實施方案，并且該實施方案特別適用于對抗CD20單克隆抗體治療(例如使用已經(jīng)存在的抗體如C2B8的治療)抵抗的受試者、當前正在進行或者先前已經(jīng)使用化學療法治療的受試者、已經(jīng)有過復發(fā)的B細胞疾病受試者、無免疫應答的受試者或者另外巨噬細胞或單核細胞功能受損的受試者。本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，主要通過單核細胞介導的抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)在B細胞消除中的作用比先前認為的更重要。對抗CD20治療產(chǎn)生抗性或者患有B細胞疾病復發(fā)的病人的普遍存在歸因于(至少部分歸因于)巨噬細胞或者單核細胞功能的損害。因此，本發(fā)明提供了能夠與抗CD20抗體和抗原結(jié)合片段施用方法聯(lián)合使用的增強ADCC和/或巨噬細胞和/或單核細胞功能的方法。
根據(jù)本發(fā)明，盡管本發(fā)明可以用于獸醫(yī)的目的以治療非人類哺乳動物和鳥類，受試者還可以是人類受試者?？梢蚤_展本發(fā)明診斷和治療方法的哺乳動物受試者的非限定性實例包括小鼠、大鼠、豚鼠、豬、山羊、綿羊、非人靈長類、馬、狗、貓、牛、兔和人類。禽類包括雞、火雞、鵪鶉、鵝和鴨。
雖然如本領(lǐng)域眾所周知，在任何給定的情況下最適宜的途徑會取決于此類因素如物種、年齡、性別或受試者總體狀況、被治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度和/或被施用的特定組合物的性質(zhì)(即劑量、劑型)，但是本發(fā)明的抗體組合物可以使用任何施用方式進行施用，施用方式包括但不限于吸入(例如通過氣霧劑)、頰內(nèi)(例如舌下)、局部(即皮膚和粘膜表面，包括氣管表面)、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、大腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口腔內(nèi)、淋巴管內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、直腸或者陰道施用，并且可以通過蠕動的方式或者以貯存庫的形式遞送。在特定的實施方案中，施用途徑是通過大丸劑或者在一段時間內(nèi)連續(xù)灌注，一周一次或兩次。
施用的適宜策略會隨著被治療的受試者和疾病而變化，但是典型地是在初次施用后通過隨后的注射或其它施用方式以一個以上間隔重復給藥。給藥之間的間隔可以短至幾小時或者長至一周或幾周。備選地，可以采用連續(xù)靜脈灌注以維持血液中的有效濃度。
本文所公開的抗體還可以在體外方法中使用?？贵w選擇性結(jié)合CD20，CD20表達于B淋巴細胞并且在B淋巴細胞發(fā)育的特異階段表達。照這樣，本發(fā)明的抗體可以用于從細胞的混合樣品如全血中特異消除B淋巴細胞。然后，富集的B淋巴細胞組分或者已消除B淋巴細胞的組分可以在需要的實驗中使用，而沒有其它細胞類型干擾或與其相互作用的危險。利用本文公開的抗體從混合的細胞群體體外分離B淋巴細胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。作為非限定性的實例，F(xiàn)ACS、淘選和磁性分離技術(shù)可以用來使用本文所公開的抗體從混合的細胞群體中分離B淋巴細胞。
本文公開的抗體還可以用來區(qū)分B淋巴細胞發(fā)育亞群。CD20在祖B淋巴細胞中不表達。在前B淋巴細胞中可以看到一些表達。未成熟、T1和T2過渡的B淋巴細胞中表達較高數(shù)量的CD20。成熟的B淋巴細胞表達較低水平的CD20。綜合該信息和上面討論的技術(shù)或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)，可以用于確定所研究的B淋巴細胞正處于發(fā)育的何種階段。
藥物組合物本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明抗體或抗體片段的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含可藥用載體與本文描述的一種或多種抗體或抗體片段，抗體或抗體片段作為活性成分溶解或分散于可藥用載體中。
如本文所使用，關(guān)于組合物、載體、稀釋劑和試劑的術(shù)語“可藥用”指能夠施用于動物并且不產(chǎn)生不良生理效應或毒性的材料。
藥物組合物制劑是藥物化學領(lǐng)域眾所周知的。見例如Remington’sPharmaceutical Sciences，(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1975)，特別是由Blaug，Seymour編寫的第87章)。藥物組合物包括但不限于粉末、糊劑、軟膏、膠凍劑、蠟、油類、脂類、無水吸收性堿、水包油或油包水乳劑、聚乙二醇乳劑(多種分子量大小的聚乙二醇)、半固體凝膠和包含聚乙二醇的半固體混合物。一般的劑量形式是適于通過腸胃外(例如靜脈施用或者皮下施用)途經(jīng)施用的無菌等滲的水溶液。本發(fā)明的抗體或抗體片段在藥物制劑中的濃度可以很大程度地變化，例如體積比從少于大約0.01％、0.1％、0.5％、1％或2％的量至5％、10％、20％或50％或更多的量，并且可以根據(jù)所選擇施用的特定劑型通過液體體積、粘滯度等初步選擇。
本發(fā)明的藥物組合物還可以通過脂質(zhì)體施用。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、膠束、不溶解的單層、液態(tài)結(jié)晶、磷脂分散劑、薄片層(lamella layers)等。
在制備中，將本發(fā)明的欲遞送的組合物作為脂質(zhì)體的一部分單獨混合，或者與結(jié)合目的靶標的分子例如抗體或其它治療或免疫原組合物一起混合。在本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體可以從標準的形成囊泡的脂形成，其中形成囊泡的脂一般包括中性和帶負電荷的磷脂和固醇如膽固醇。一般通過考慮脂質(zhì)體的大小、脂質(zhì)體在血流中的酸不穩(wěn)定性和穩(wěn)定性來指導脂的選擇。制備脂質(zhì)體的多種方法是可得的，如在例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國專利號4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述。
包含溶解或分散于其中的活性成分的藥物組合物的制備是本領(lǐng)域眾所周知的。一般此種組合物制備成液體溶液或懸浮液；然而，也可以制備成適于在使用前用液體制成溶液或懸浮液的固體形式。還可以將制劑制成乳化的。
活性成分可以與賦形劑以適宜在本文所述方法中使用的量相混合，其中賦形劑是可藥用的并且是可與活性成分配伍的。適宜的賦形劑例如水、鹽、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合。此外，如果需要，組合物可以包含少量的能夠增強有效成分效果的輔助物質(zhì)例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等。
藥物組合物可以包括其組分的可藥用鹽?？伤幱名}包括酸加成鹽(與多肽的游離氨基形成的)，其中酸加成鹽是與無機酸如鹽酸或磷酸或者有機酸如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等形成的。與游離的羧基形成的鹽也可以從無機堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵和如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因的有機堿衍生而來。
代表性的液體載體是無菌水溶液，其中所述的無菌水溶液除了活性成分和水以外不包含其它物質(zhì)，或者包含如在生理pH值處的磷酸鈉的緩沖液、生理鹽水或者兩者如磷酸緩沖鹽。含水的載體還可以進一步包含一種以上的緩沖液鹽以及如氯化鈉和氯化鉀的鹽、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶質(zhì)。
液體組合物除包含水外還包含與水排斥的液相。此種額外的液相的代表是甘油、如棉籽油的植物油和水油乳劑。
在本發(fā)明中已經(jīng)敘述的內(nèi)容將在下面的實施例中更加詳細地解釋，本文包括的實施例僅僅是為了說明的目的并且它們不旨在限制本發(fā)明。
實施例1材料和方法CD20-/-小鼠的產(chǎn)生將編碼Cd20基因3，末端的DNA從129/Sv品系的小鼠DNA噬菌體文庫中分離、作圖并且測序以鑒定內(nèi)含子/外顯子邊界(圖1A和圖1B)(Tedder等，(1989)J.Immunol.1422560)?；?qū)ぐ惺褂冒挥趐MC1-HSV基因下游的從PstI(第5外顯子)至EcoRV(第6外顯子，～1.8kb)的DNA片段的基于pBluescript SK的載體(p594)。將大約10kb的KpnI DNA片段插入到新霉素抗性(Neor)標記的下游(圖1C)。根據(jù)標準的方法使用單一的SalI限制性位點將質(zhì)粒線性化并且將其轉(zhuǎn)染進入129品系來源的可以使用G418進行選擇的胚胎干(ES)細胞中(Koller和Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932)。在115個新霉素抗性ES細胞克隆中有6個攜帶著靶向的等位基因(圖1D)。通過使用同一探針對用BamHI(大于12kb的片段減小至6.5kb的帶)、KpnI(7.2kb變成5.5kb)和SspI(5.6kb變成7.0kb)消化的DNA進行Southern分析進一步證實了正確的靶向。一個ES細胞克隆的細胞產(chǎn)生80-100％嵌合的雄性后代，這些后代與C57BL/6小鼠雜交≥7代。雜合的后代進行雜交以產(chǎn)生純合的CD20-/-和野生型同窩小鼠(圖1E)。在多數(shù)情況下，使用CD20-/-小鼠和(C57BL/6×129)F1小鼠的野生型同窩小鼠得到的結(jié)果是相同的，因此，將結(jié)果混在一起。使用了不同年齡的3-10個同窩小鼠開展脾臟和腹膜腔亞群分析，因此只有野生型和CD20-/-小鼠之間的比較是有效的。將小鼠飼養(yǎng)于無特異抗原的具有屏障的設(shè)備中并且在2-3月齡時使用。
敲除小鼠如所述制備FcγRI-/-和FcγRIII-/-小鼠(Bruhns等，(2003)Immunity18573-581)。C57BL/6，F(xiàn)cγRII-/-(B6，129S-Fcgr2tm1Rav)，F(xiàn)cγRIII-/-(C57BL/6-Fcgr3tm1Sjv)，Beige(C57BL/6-Lystbg/bg)，Perforin(穿孔蛋白)-/-(C57BL/6-Pfptm1Sdz)，CSF1op(Csf1op)和nude(C57BL/6-Hfh11nu)小鼠來自Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)。FcR通用γ鏈(FcRγ)缺乏的小鼠(FcRγ-/-，B6.129P2-Fcerg1tm1)來自Taconic農(nóng)場(Germantown，NewYork)。如所述的(Botto等，(1998)Nat.Genet.1956-59)C1q-/-小鼠經(jīng)MarkWalport(imperial College，London，UK)允許由Garnett Kelsoe(杜克大學)提供，如所述(Zhang等，(1999)Immunity 10323-332)的LAT-/-小鼠來自Weiguo Zhang(杜克大學)，并且如所述(Wessels等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9211490-11494)的C3-/-和C4-/-小鼠來自Michael Carroll(Centerfor Blood Research，Boston，MA)。使用標準的方法(Van Rooijen和Sanders(1994)J.Immunol.Methods 17483-93)在第-2、1和4天通過尾靜脈注射脂質(zhì)體包封的氯膦酸鹽(0.1mL/10g體重；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)產(chǎn)生了巨噬細胞缺乏的小鼠。將所有的小鼠飼養(yǎng)于無特異抗原的具有屏障的設(shè)備中并且在2-3月齡時使用免疫熒光分析使用建立的良好方法(Zhou等，(1994)Mol.Cell.Biol.143884)將單細胞的白細胞懸浮液用預先確定的最適濃度的每種抗體在冰上染色20-60分鐘。在FACScan or FACScalibur流式細胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA)上分析細胞的前向和側(cè)向散射特性。使用不發(fā)生反應的對照單克隆抗體(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)并使用將≥98％的細胞排斥的門設(shè)置來確定背景染色。使用的抗體包括CD19單克隆抗體(MB19-1)(Tedder等，(1988)Mol.Immunol.251321；Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.26310009；Valentine等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.848085)；B220克隆抗體(RA3-6B2)(DNAX Corp.，Palo Alto，CA)；Thy1.2(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)；與IgM、I-A、CD5、CD11b、CD23和CD43反應的抗體(BD PharMingen，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)和抗小鼠IgG3、IgM和IgD的抗體(Southern Biotechnology Associates Inc.，Birmingham，AL)。
抗體使用標準方法(Steeber等，(1997)J.Immunol.159952-963)用轉(zhuǎn)染有編碼人CD20的cDNA的小鼠前B細胞系免疫BALB/c小鼠，產(chǎn)生了HB20-1至HB20-6的單克隆抗體。HB20-25小鼠抗人CD20單克隆抗體是在具有C57BI/6×129遺傳背景的CD20-/-小鼠中產(chǎn)生，使用類似于先前描述(Steeber等，(1997)，同上)的方法用轉(zhuǎn)染有編碼人CD20的cDNA的小鼠前B細胞系300.19免疫該種CD20-/-小鼠。如上所述，所有MB20單克隆抗體均在具有C57BI/6×129遺傳背景的CD20-/-小鼠中產(chǎn)生。
通過將NS-1骨髓瘤細胞與來自CD20-/-小鼠的脾細胞融合產(chǎn)生了能夠生產(chǎn)CD20特異性小鼠單克隆抗體的雜交瘤，其中用鼠CD20-綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染的300.19細胞免疫該CD20-/-小鼠(Kearney等，(1979)J.Immunol.1231548)?？笴D20單克隆抗體MB20-1、MB20-2和MB20-14是IgG1同種型的；MB20-6、MB20-11和MB20-16是IgG2a同種型的；MB20-7、MB20-8、MB20-10和MB20-18是IgG2b同種型的并且MB20-3和MB20-13是IgG3單克隆抗體。通過用編碼融合蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染每一個細胞系，產(chǎn)生表達與GFP融合的小鼠CD20的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和300.19前B細胞系(Tedder等，(1988)J.Immunol.1414388)。通過基于熒光的細胞分選根據(jù)GFP的表達分離轉(zhuǎn)染的細胞。
通過第5屆人類白細胞分化抗原國際討論會和會議(FifthInternational Workshop and Conference on Human LeukocyteDifferentiation Antigens)(Boston，MA；November 3-7，1993)得到抗CD20單克隆抗體1F5(Shan等，(1999)J.Immunol.1626589-6595)、B9E9(Schultz等，(2000)Cancer Res.606663-6669)和1H4(Haisma，etat.(1998)Blood92184-190)。從Beckman-Coulter(Miami，F(xiàn)L)得到的B1抗CD20單克隆抗體(Stashenko等，(1980)J.Immunol.1251678)用作純化的單克隆抗體或稀釋的腹水。
細胞內(nèi)Ca2+的測定在用山羊F(ab’)2抗IgM抗體(5-40μg/mL；Cappel/ICNPharmaceuticals，Inc.，Aurora，OH)、抗小鼠CD19單克隆抗體(MB19-1；40μg/mL)、毒胡蘿卜素(1μM；Sigma，St.Louis，MO)或者離子霉素(2.67μg/mL；CALBIOCHEMBiosciences，Inc.，La Jolla，CA)處理細胞之后，使用標準方法(Shan等，(1998)Blood 911644)通過流式細胞術(shù)檢測[Ca2+]i水平的變化。在一些情況下，在上述的試劑處理之后向細胞懸浮液中加入EGTA(終濃度5mM)。
B細胞活性測定通過使用Thy1.2抗體包被的磁珠(DYNALInc.，Lake Success，NY)去除T細胞來純化脾臟B細胞(＞93％B220+)。為了進行信號轉(zhuǎn)導研究，在加入F(ab’)2抗小鼠IgM抗體片段(40μg/mL)之前將B細胞于37℃在含有5％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育(2×107/mL)5分鐘。在加入含有400μM EDTA和100μM正釩酸鈉的冷的鹽溶液后，使用建立的良好的方法(Bradbury等，(1992)J.Immunol.1492841；Fujimoto等，(1999)J.Immunol.1627088)用去污劑裂解細胞。對于CD20的結(jié)構(gòu)研究，用EZ-LINKTM硫代-NHS-生物素(0.5mg/mL；Pierce，Rockford，IL)將B細胞進行表面生物素化，然后用去污劑裂解。將細胞裂解液用IgG1單克隆抗體(1μg)和50μL 50％的G蛋白-SEPHAROSETM懸浮液(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)預清除，并且使用2μg單克隆抗體和G蛋白-SEPHAROSETM將蛋白質(zhì)免疫沉淀。將珠子用高鹽和低鹽RIPA緩沖液洗滌兩次，用磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌兩次，然后在上樣緩沖液(含有或不含有10％的β-巰基乙醇)中煮沸、電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將全細胞裂解液的印跡膜用MB20-1單克隆抗體、過氧化物酶綴合的4G10抗體(UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)或者用抗磷酸化CD19(Y513)、抗磷酸化PLCγ(Y783)、抗磷酸化Syk(Y525/Y526)、抗磷酸化BTK(Y223)、抗磷酸化Src家族激酶抗體(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA)或者抗活化MAPK抗體(PROMEGA，Madison，WI)雜交。將膜洗掉探針并用兔抗SHP-1多克隆抗體(Upstate Biotechnology)、或者抗Lyn(lyn-44)、抗Fyn(Fyn3)和抗ERK2(C-14)抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)再次雜交。使用鏈霉親和素綴合的辣根過氧化物酶(SouthernBiotechnology Assoc.，Birmingham，AL)和增強化學發(fā)光試劑盒(ECLTM；Pierce，Rockland，IL)檢測生物素化的蛋白質(zhì)或抗體。
為了研究CD20的磷酸化，將原代B細胞(107/mL)在脂多糖(LPS)(大腸桿菌血清型0111B4，10μg/mL，Sigma，St.Louis，MO)存在的條件下培養(yǎng)48小時。然后將原代B細胞和細胞系在無磷酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時，在含有200μCi/mL[32P]正磷酸鹽(PerkinElmer，Boston，MA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)90分鐘，洗滌，裂解，免疫沉淀并通過SDS-PAGE分離，然后按照標準的方法進行放射自顯影(Kansas和Tedder(1991)J.Immunol.1474094；Leveille等，(1999)Eur.J.Immunol.2965)。
功能測定通過[3H]胸腺嘧啶核苷參入的標準方法(Engel等，(1995)Immunity339)測定脾臟B細胞增殖。用2，4-二硝基苯酚綴合的匙孔血藍蛋白(100μg，DNP-KLH；CALBIOCHEM-Novabiochem，La Jolla，CA)免疫8周齡小鼠，或者用按照眾所周知的方法(Jacob等，(1991)J.Exp.Med.1731165)在鋁中沉淀的(4-羥基-3-硝基苯基乙酰基)綴合的雞丙種球蛋白(50μg，NP18-CGG)免疫8周齡小鼠兩次。通過ELISA(Engel等，(1995)Immunity 339；Takahashi等，(1998)J.Exp.Med.187885)測定血清DNP和NP特異抗體的水平，使用標準方法(Takahashi等，(1998)J.Exp.Med.187885)評價了抗體反應的相對親和性/親和力。
免疫治療將200μL PBS中的無菌抗小鼠CD20和同種型對照單克隆抗體(0.5-250μg)通過外側(cè)尾部靜脈注射。除非另外指出，所有實驗均使用250μg單克隆抗體。在治療后1小時和2、4、7、28、48、50、52、54、56或58天收集血液和腎臟。在紅細胞裂解后通過血細胞計數(shù)器定量血液白細胞的數(shù)量，通過使用免疫熒光染色和流式細胞術(shù)分析確定B220+B細胞的頻度。使用Oncology Tool Dose Calculator(www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)比較了在人和小鼠中的抗體劑量(表7)。
補體測定通過使用Thy1.2抗體包被的磁珠(DYNAL，Lake Success，NY)去除T細胞來純化野生型小鼠脾臟B細胞(＞93％B220+)。按照標準的方法(Gazzano-Santoro等，(1997)J.Immunol.Methods 202163-171)定量了補體介導的體外殺B細胞作用。用每一抗CD20單克隆抗體(0.5μg/mL)和幼兔補體(稀釋50倍；GIBCO-BRL，Grand Island，NY)與脾臟B細胞于37℃孵育2小時。向每一管中加入PBS并于37℃孵育4小時，然后洗滌細胞并用碘化丙啶(PI)和抗B220單克隆抗體染色，通過流式細胞術(shù)分析測定碘化丙啶的排斥。
重鏈和輕鏈基因的利用使用RNEASY小提試劑盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)從1-10×105個雜交瘤細胞中提取胞質(zhì)RNA。使用oligo-dT引物(dT18)和SUPERSCRIPTTM試劑盒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)從胞質(zhì)RNA合成第一鏈cDNA。使用1μL的cDNA溶液作為模板用于VH基因的PCR擴增。PCR反應在100μL體積的反應混合物中進行，反應混合物由10mMTris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)、50pmol的每一引物和5單位Taq DNA聚合酶(ISCBioexpress，Kaysville，UT)組成。擴增30個循環(huán)(94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘；循環(huán)變溫器，PerkinElmer)。使用本領(lǐng)域眾所周知(Kantor等，(1996)J.Immunol.1581175-1186)的混雜的正義5’VH引物(MsVHE；5’GGG AAT TCG AGG TGC AGC TGC AGG AGT CTG G 3’；SEQ IDNO110)和與Cμ編碼區(qū)互補的反義引物(引物Cμ-in；5’GAG GGG GAAGAC ATT TGG GAA GGA CTG 3’；SEQ ID NO111)、與Cγ區(qū)互補的反義引物(引物Cγ1；5’GAG TTC CAG GTC ACT GTC ACT GGC 3’；SEQID NO112)或者與Cα區(qū)互補的反義引物(引物Cα；5’GTG AAT TCA GGCGGC CGC TAA 3’；SEQ ID NO113)擴增VH基因。使用Vκ正義引物(表1)和Cκ反義引物(5’ACT GGA TGG TGG GAA GAT G 3’；SEQ IDNO114)擴增輕鏈cDNA。使用QIAQUICK凝膠純化試劑盒(QIAGEN)從瓊脂糖凝膠中純化擴增的PCR產(chǎn)物，并且在使用具有AMPLITAQDNA聚合酶的Perkin Elmer染料終止測序系統(tǒng)和首次PCR擴增中的相同引物擴增之后使用ABI 377 PRISMDNA測序儀雙向直接測序。所有VH和輕鏈區(qū)均在正義和反義DNA鏈上完全測序(圖14和圖17)。
表1
Leu-16也叫做L27。
#8和10的氨基酸序列相同，不同之處是重鏈中有一對堿基不同且輕鏈中有三對堿基不同。
抗人和抗小鼠CD20單克隆抗體的重鏈和輕鏈CDR序列分別列于表2和表3。
表2
表3
抗體序列比對來自產(chǎn)生抗CD20單克隆抗體的已知雜交瘤的重鏈和輕鏈序列是來自1F5(Shan等，(1999)J.Immunol.1626589-6595)、B9E9(Schultz等，(2000)Cancer Res.606663-6669)、2H7(美國專利號6,120,767)、2B8(美國專利號5,843,439)、1H4(Haisma等，(1998)Blood 92184-190)、Leu-16(Wu等，(2001)Protein Eng.141025-1033)。
統(tǒng)計學分析所有的數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM。使用Student t-檢驗確定種群平均值間的顯著性差異。
實施例2CD20-/-小鼠的產(chǎn)生打靶載體用新霉素抗性基因取代了CD20中編碼部分第二胞外環(huán)、第四跨膜結(jié)構(gòu)域和大的羧基末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的外顯子(圖1A-1D)。使用靶向ES細胞產(chǎn)生建立者小鼠，將建立者的雜合后代雜交，按照孟德爾的頻率產(chǎn)生了Cd20基因破壞的純合小鼠。對純合后代基因組DNA的Southern印跡和PCR分析進一步證實了正確的Cd20基因靶向和外顯子6-8的基因組缺失(圖1E和圖IF)。如通過對CD20-/-小鼠脾細胞cDNA的PCR擴增所證實，在CD20-/-小鼠中缺乏野生型的CD20mRNA(圖1G)。通過PCR在CD20-/-小鼠中檢測到低水平的CD20-Neor融合基因轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本翻譯出一個與Neor基因啟動子序列所編碼的88個氨基酸的肽融合的在第157位氨基酸截短的異常CD20肽。使用一組12個小鼠抗小鼠CD20單克隆抗體證實在CD20-/-小鼠中缺乏細胞表面CD20的蛋白質(zhì)表達，該組單克隆抗體與用CD20-GFP cDNA轉(zhuǎn)染的300.19和CHO細胞發(fā)生免疫反應，但是不與非轉(zhuǎn)染細胞發(fā)生免疫反應(圖1H)。這些單克隆抗體與來自野生型小鼠的CD19+脾細胞所表達的細胞表面CD20表位反應，但不與來自CD20-/-小鼠的CD19+脾細胞發(fā)生反應(圖1I)。因此，靶向Cd20基因的突變消除了細胞表面CD20的表達。
實施例3CD20-/-小鼠中B細胞的發(fā)育在所觀察的9年內(nèi)，CD20-/-小鼠同它們的野生型同窩小鼠一樣能夠正常生長和繁殖，并且在第一年不存在任何明顯的解剖學和形態(tài)學異常或易于感染。CD20-/-小鼠在骨髓中具有正常頻度的IgM-B220lo祖/前B細胞、IgM+B220lo未成熟B細胞和IgM+B220hi成熟B細胞(圖1J，表4)和正常數(shù)量的AA4.1+或HSAhiB220lo未成熟/過渡B細胞。在CD20-/-小鼠和它們的野生型同窩小鼠中，血液、脾臟和淋巴結(jié)IgM+B220+B細胞的數(shù)量沒有顯著差異(表4)。
表4
a數(shù)值代表來自3-10個野生型和CD20-/-2月齡同窩小鼠的表達所指明細胞表面標記物的淋巴細胞(根據(jù)側(cè)向和前向散射特性)數(shù)目或百分數(shù)的平均值(±SEM)。
b根據(jù)從每一組織獲得的細胞總數(shù)計算出的B細胞數(shù)。
c數(shù)值表示每毫升的細胞數(shù)。
d一對腹股溝淋巴結(jié)的數(shù)值。
*意味著與野生型同窩小鼠具有顯著性差異，p＜0.05；**p＜0.01。
與野生型同窩小鼠的未成熟和成熟B細胞相比，在CD20-/-小鼠中B細胞IgM表達顯著較低(表4，圖1J)。此外，在CD20-/-同窩小鼠脾臟中，IgMhiB220loB細胞數(shù)降低～50％。降低的IgMhiB220loB細胞數(shù)反映在大多數(shù)B細胞中降低的IgM表達，但是由于在CD20-/-和野生型同窩小鼠中CD1dhiCD21+表型的細胞數(shù)沒有顯著的差異(表4)，所以降低的IgMhiB220loB細胞數(shù)并不導致邊緣區(qū)B細胞的損失。同樣，代表從骨髓新近遷移來的過渡T1(CD21loHSAhi)和T2(CD21hiHSAint)B細胞數(shù)沒有減少(表4)。相反，通常在CD20-/-小鼠中T1細胞數(shù)的頻度和數(shù)量較高，這與在CD20-/-小鼠骨髓中觀察到的成熟IgM+B220hiB細胞的頻度增加相似。因為在CD20-/-小鼠腹膜腔中CD5+B220loB1a細胞數(shù)降低64％，所以IgMhiB220loB細胞數(shù)的降低部分地助于脾臟B1細胞的減少。在CD20-/-和野生型同窩小鼠中腹腔IgM+B220+B細胞的總數(shù)相似是因為CD5-B220hiB細胞數(shù)的增加(表4，圖1J)。在CD20-/-和野生型同窩小鼠中B1bB細胞(CD11b+CD5-B220lo)數(shù)相似(表4)。從CD20-/-小鼠骨髓、血液、淋巴結(jié)或者脾臟分離的B細胞大小(光散射特性)與來自野生型同窩小鼠的B細胞相比沒有明顯的差別。對脾臟組織切片的免疫組織化學分析表明B220+B細胞具有正常的結(jié)構(gòu)和組織。因此，CD20表達除了導致降低IgM表達、減少脾臟IgMhiB220loB細胞亞型以及降低腹膜腔內(nèi)B1細胞數(shù)以外，CD20表達對于B細胞發(fā)育和組織定位是不需要的。
實施例4CD20-/-B細胞功能將純化的CD20-/-B細胞對一定范圍抗體濃度(1-40μg/mL)的表面IgM連接的增殖反應與野生型的B細胞進行比較(圖1K)。當B細胞通過一定濃度(0.1-10μg/mL)LPS(圖1K)活化或者使用IL-4(10-100U/mL)和亞最佳濃度(5μg/mL)抗IgM抗體活化時，增殖仍然正常。因此，CD20的喪失對促細胞分裂原誘導的增殖沒有可檢測的影響。在CD20-/-小鼠的血清中所有Ig的同種型均為正常水平(圖1L)。CD20-/-小鼠還可以產(chǎn)生所有同種型的初次和二次抗體應答，這與在用T細胞依賴抗原DNP-KLH免疫野生型同窩小鼠后所觀察到的結(jié)果相似(圖1M)。此外，在用NP-CGG(每組5只小鼠)免疫后，CD20-/-小鼠和它們的野生型同窩小鼠產(chǎn)生相當?shù)某醮魏投蜪gM和IgG1抗NP的抗體應答。而且，在CD20-/-小鼠中產(chǎn)生的初次和二次IgG1抗NP抗體應答的親和性與它們的野生型同窩小鼠中產(chǎn)生的相似。因此，在體液免疫反應產(chǎn)生過程的T-B細胞的相互作用、同種型轉(zhuǎn)換或親和力成熟中不需要CD20的功能。
實施例5B細胞發(fā)育過程中CD20的表達使用一組小鼠抗小鼠CD20單克隆抗體在兩種前B細胞系(300.19和38B9)和兩種T細胞系(BW5147和BL4)沒有見到細胞表面蛋白質(zhì)CD20的表達，而70Z前B細胞系、A20和AJ9成熟B細胞系和NS-1漿細胞瘤細胞為CD20+的(圖1H和圖2A)。同樣，骨髓中只有一些B220+細胞的亞型表達CD20(圖2B)；30±3％的B220lo淋巴細胞為CD20+，而所有的B220hiB細胞為CD20+(n＝6只小鼠)。在骨髓CD19+細胞中，CD20+細胞具有相似的組成比例(51±2％；n＝6)。與此相一致，CD43+B220+祖B細胞不表達CD20，而10±1％(n＝3)的CD43-IgM-B220lo前B細胞以低密度表達CD20(圖2G)。根據(jù)其光散射特性可見所有的CD20+前B細胞(CD43-IgM-B220lo)是小的，這表明CD20的表達主要起始于重鏈表達之時或附近時間。與此相一致，大多數(shù)未成熟的IgM+B220loB細胞表達CD20(76±9％，n＝3；組分I，圖2G)。骨髓中未成熟IgMhiB220+B細胞(組分II，圖2G)或者CD19loB細胞的亞群表達的CD20比成熟B220hiB細胞(組分III，圖2G)或者CD19hiB細胞(圖2B)表達的密度高277±53％(n＝3)。因此，在小的前B細胞向未成熟B細胞過渡過程中CD20第一次表達，隨著B細胞的成熟CD20表達增加并且此后隨著進入再循環(huán)B細胞的成熟B220hi池CD20表達降低。
在脾臟、血液、外周淋巴結(jié)和腹膜腔中，絕大多數(shù)的IgM+或B220+B細胞表達CD20(圖2C-2F)。在血液(9±1％，n＝3)和脾臟(7±2％，n＝3)B細胞中觀察到小部分CD20hiB220lo細胞亞群的(圖2C和圖2E)。脾臟中的CD20hiB220loB細胞主要是過渡T1和T2B細胞(圖2H)并且很可能是從骨髓新近遷移進入的細胞。T1細胞(CD21loHSAhi)表達的CD20比成熟B細胞表達的CD20的密度高139±23％(n＝3)，而T2細胞(CD21hiHSAhi)表達的CD20的密度比其高58±11％(n＝3)。T1細胞(CD21-CD23-IgMhi)和邊緣區(qū)B細胞(CD21+CD23-IgMhi)(Loder等，(1999)J.Exp.Med.19075)也以比大多數(shù)脾臟B細胞表達水平更高的水平表達CD20(圖2I)。在一些小鼠中觀察到少量的CD20-外周B細胞，但是數(shù)量一般小于B220+細胞的2％。在腹膜腔中，CD5+和CD5-B細胞表達的CD20相似(圖2F)。在所檢測的任何組織中，其它亞群的淋巴細胞沒有可檢測水平的CD20表達。因此，小鼠CD20專一表達于B細胞中并且其表達在小的前B細胞成熟晚期開始。
實施例6CD20的結(jié)構(gòu)特征通過使用與小鼠CD20反應的MB20-1單克隆抗體和與人CD20的細胞質(zhì)表位反應的PB4單克隆抗體，從表面標記的B細胞系中沉淀小鼠和人CD20分子從而對它們進行比較。在非還原條件下，小鼠CD20比人CD20遷移更快，但是它們?nèi)匀灰灾辽賰蓚€分子量(Mr)為33,000和35,000的不同分子遷移(圖3A)。在還原條件下，小鼠CD20以至少兩個分子量為40,000和42,000的分子遷移(圖3A)。如人CD20分子一樣(Tedder等，(1988)Molec.Immunol.251321；Deans等，(1993)J.Immunol.1514494)，多種細胞表面分子與小鼠CD20共沉淀。在共沉淀人CD20相關(guān)分子方面，PB4單克隆抗體比能夠與CD20細胞外結(jié)構(gòu)域反應的單克隆抗體更好。因為在western印跡分析中MB20-1單克隆抗體只與小鼠CD20反應并且MB20-1單克隆抗體不能從CD20-/-小鼠B細胞裂解液中沉淀出CD20或其它蛋白質(zhì)(圖3B)，所以在小鼠中CD20相關(guān)分子的共沉淀不是因為單克隆抗體的交叉反應。出乎意料的是，甚至在佛波酯(PMA)處理后，在靜息的原代小鼠B細胞、抗IgM抗體或者LPS活化的B細胞、或B細胞系中小鼠CD20不是主要的磷蛋白(圖3C)，這與人B細胞是一樣的(Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.26310009；Genot等，(1993)J.Immunol.15171)。如人CD20的特征一樣(Tedder和Schlossman(1988)J.Biol.Chem.26310009；Valentine等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.848085)，在LPS活化的未成熟細胞或B細胞系中，PMA誘導的CD20的磷酸化沒有明顯導致CD20蛋白質(zhì)分子量從遷移較快的分子向遷移較慢的分子的改變。因此，除了幾個不同的特征外，小鼠和人CD20具有許多相同的結(jié)構(gòu)特征。
實施例7在CD20-/-B細胞中降低的[Ca2+]i反應盡管在CD20-/-小鼠中，B細胞發(fā)育正常，但是在使用最佳濃度(40μg/mL；圖4A)和亞最佳濃度(5μg/mL)的抗IgM抗體進行IgM連接之后，與野生型B細胞相比CD20-/-小鼠脾臟B220+B細胞對[Ca2+]i反應降低。在CD20-/-B細胞中即刻[Ca2+]i反應的動力學沒有改變。然而，在CD20-/-B細胞中最大[Ca2+]i增加的幅度低34±4％(p＜0.001，n＝9)，同樣地，在以后的時間點觀察到的所維持的升高水平也較低。在CD20-/-和野生型B細胞中，通過EGTA螯合細胞外的Ca2+降低了IgM交聯(lián)后的[Ca2+]i增加的動力學和幅度。與野生型B細胞相比，在CD20-/-B細胞中EGTA存在條件下[Ca2+]i反應的最大幅度降低了38±7％(p＜0.002，n＝7)。
與野生型B細胞相比，在CD20-/-B細胞中CD19誘導的[Ca2+]i反應顯著降低(70±4％，p＜0.001，n＝5)(圖4B)。較低的[Ca2+]i反應不是源自CD20-/-B細胞中降低的CD19表達(圖4D)。在野生型和CD20-/-兩種B細胞中，使用EGTA將細胞外的Ca2+螯合大部分消除了CD19誘導的[Ca2+]i反應。由于與野生型B細胞相比，在CD20-/-B細胞中毒胡蘿卜素和離子霉素誘導的[Ca2+]i反應的平均值略高(圖4C)，所以CD20-/-B細胞在IgM或者CD19連接之后[Ca2+]i反應的降低可能不是源自內(nèi)部的Ca2+儲存或者外部Ca2+濃度的不同。在CD20-/-B細胞中[Ca2+]i反應的降低也不可能源自遺傳背景的不同。CD20-/-小鼠和它們的野生型同窩小鼠是從129品系的ES細胞產(chǎn)生的，但是與C57BL/6小鼠回交至少7代。在對照實驗中，對于C57BL/6、(C57BL/6×129)F1和129B細胞(n＝4)而言，如果IgM誘導和CD19誘導的[Ca2+]i反應不是相同的話，則它們也是相似的。因此，CD20-/-小鼠中降低的[Ca2+]i反應很可能來自CD20功能的缺乏，而不是背景的差異。由于在CD19交聯(lián)之后所觀察到的[Ca2+]i反應主要取決于Ca2+流量并且在CD20-/-小鼠中CD19誘導的[Ca2+]i反應明顯地被擾亂，所以CD20的功能對于跨膜Ca2+轉(zhuǎn)運特別重要。
實施例8CD20-/-B細胞中的信號轉(zhuǎn)導作用通過確定IgM連接后純化B細胞總的胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化來鑒定CD20缺失對B細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導作用的影響。雖然在個別實驗的個別小鼠B細胞中觀察到一些變異，但是來自CD20-/-和野生型同窩小鼠的靜息脾臟B細胞中酪氨酸磷酸化的總體水平是相似的(圖5A)。在IgM連接后，來自CD20-/-和野生型同窩小鼠的B細胞中的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化也是相似的。在來自CD20-/-和野生型同窩小鼠的B細胞中，IgM下游的單個信號分子的磷酸化也是相似的，這些信號分子包括Lyn和其它Src激酶、PLCγ、CD19、BTK和MAP激酶(圖5B)。因此，CD20的缺乏不可能明顯改變基礎(chǔ)的或者IgM誘導的跨膜信號。
實施例9抗CD20單克隆抗體體內(nèi)消除B細胞評價了代表每種IgG同種型的12種小鼠抗小鼠CD20單克隆抗體體內(nèi)結(jié)合B細胞并消除它們的能力。每一單克隆抗體一致地與CD19+原代B細胞反應，并且具有不依賴單克隆抗體同種型的特征性平均熒光強度(圖6A)。當使用一定范圍的單克隆抗體濃度評價單克隆抗體與原代B細胞的反應性時，在1-10μg/mL濃度范圍內(nèi)時大多數(shù)抗體達到了染色的飽和水平(圖6B)。當平均后，在大約0.5μg/mL的單克隆抗體濃度時達到了單克隆抗體染色最大對數(shù)刻度的50％(箭頭，圖6B)。當所有單克隆抗體以0.5μg/mL使用時，每一單克隆抗體與CD19+原代B細胞一致反應，并且具有低或高的特征性平均熒光強度(圖6C，表5)。使用小鼠CD20 cDNA轉(zhuǎn)染的前B細胞系并使用抗小鼠Ig級次抗體得到了相似的結(jié)果?；谠摲治?，MB20-1單克隆抗體是具有最低相對親和力/親和性的抗體，而MB20-18單克隆抗體與B細胞強烈反應并且染色B細胞的水平是12種抗CD20單克隆抗體中最高的(表5)。因此，每一單克隆抗體與B細胞特異反應，并且如通過流式細胞術(shù)所評價，它們表現(xiàn)出比較好的結(jié)合特性。
表5
a數(shù)值代表用0.5μg/mL的每種MB20單克隆抗體對脾臟CD19+B細胞免疫熒光染色的平均線性熒光強度(圖6C)。使用同種型特異的次級抗體顯示脾細胞的染色。在所有情況下對照染色≤6。
b數(shù)值(±SEM)顯示與同種型匹配對照單克隆抗體處理相比，用單克隆抗體處理(n≥3)7天后從血液或脾臟中消除的B220+B細胞的％。
以每只小鼠250μg的量將每一抗小鼠CD20單克隆抗體給與小鼠，該單一劑量相當于比375mg/m2的劑量低大約10倍的量，其中375mg/m2的劑量是在人類抗CD20治療中給與四次的劑量(Press等，(2001)Hematology221-240；Kaminski等，(1993)N.Engl.J.Med.329459-465；Weiner(1999)Semin.Oncol.2643-51；Onrust等，(1999)Drugs5879-88；McLaughlin等，(1998)Oncology 121763-1769)。在這些條件下，多重單克隆抗體對外周B細胞數(shù)量具有有效和持久的作用，而其它單克隆抗體具有異質(zhì)的體外作用(圖7)。單克隆抗體在2天內(nèi)誘導B細胞從循環(huán)中的消除和在7天內(nèi)誘導B細胞從脾臟中消除的效果與單克隆抗體的同種型密切相關(guān)(表5，圖7A和圖7B)，次序為IgG2a＞IgG1＞IgG2b＞IgG3。MB20-11和其它IgG2a單克隆抗體(MB20-6和MB20-16)消除＞95％的血液B細胞和大約93％的脾臟B細胞。少量的剩余外周B細胞主要代表著從骨髓遷移入的表型上不成熟的細胞。當給與如0.5μg/小鼠的較低的單一劑量時，MB20-11單克隆抗體消除了顯著數(shù)量的循環(huán)B細胞，而要在7天內(nèi)顯著消除脾臟B細胞則需要5倍的mAb量(2.5μg/小鼠)(圖7C)。同樣驚人的發(fā)現(xiàn)是單一注射MB20-11單克隆抗體能夠在單克隆抗體處理1小時之內(nèi)消除循環(huán)B細胞，持續(xù)的作用可以維持B細胞開始重新進入循環(huán)和脾臟之前的大約57天時間(圖7D)。通過比較，沒有一種單克隆抗體能夠處理CD20-/-小鼠時具有顯著的作用，并且在同樣的條件下用同種型對照單克隆抗體處理不影響B(tài)細胞數(shù)量(圖7)。同樣，在抗CD20單克隆抗體治療的小鼠中，循環(huán)和組織Thy1.2+T細胞數(shù)沒有變化(圖7A)，這與限制B細胞表達CD20時的結(jié)果一致。
實施例10FcγR在B細胞消除中的作用使用FcγR缺失小鼠(Takai等，(1994)Cell 76519-529)確定了先天免疫系統(tǒng)在抗CD20單克隆抗體處理的B細胞消除中的作用。小鼠效應細胞表達IgG的三類不同F(xiàn)cγR高親和性的FcγRI(CD64)和低親和性的FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)分子(Ravetch和Clynes(1998)Ann.Rev.Immunol.16421-432)。FcγRI和FcγRIII是異源寡聚復合物，其中各自的結(jié)合配體的γ鏈與共同的γ鏈(FcRγ)結(jié)合。在FcγR裝配中和效應細胞功能(包括巨噬細胞的吞噬作用和NK細胞的細胞毒作用(Takai等，(1994)Cell76519-529))的FcγR激發(fā)中需要FcRγ鏈的表達。高親和性的FcγRI優(yōu)先結(jié)合單體的次序為IgG2a＞IgG2b＞IgG3/IgG1，而兩個低親和性的受體結(jié)合不同同種型的多聚體IgG(Fossati-Jimack等，(2000)J.Exp.Med.1911293-1302)。FcγRIII結(jié)合次序是IgG2a＞IgG1＞IgG2b＞＞IgG3(Fossati-Jimack等，(2000)J.Exp.Med.1911293-1302)。
與在野生型小鼠中幾乎完全消除B細胞(圖7)相比，在FcRγ-/-小鼠中MB20-11單克隆抗體處理后4天后僅減少了20-35％的循環(huán)B細胞數(shù)(圖8A)，并且從第7天至第18天沒有作用。而且，與用對照單克隆抗體處理的同窩小鼠相比，在FcRγ-/-小鼠中MB20-11單克隆抗體處理實際上增加了脾臟B細胞數(shù)(圖8B和圖8C)，這主要是由于未成熟的B細胞數(shù)增加了。同種型匹配對照單克隆抗體在FcRγ-/-小鼠中沒有明顯的作用。在FcγRI-/-小鼠中MB20-11單克隆抗體在1小時時開始誘導B細胞數(shù)的降低，但是在第2天不完全地消除了循環(huán)B細胞。在FcγRI-/-小鼠中，MB20-11單克隆抗體只是部分地消除B細胞，并且與對照單克隆抗體處理的同窩小鼠相比，還有21％的脾臟B細胞維持到第7天。通過比較，MB20-11單克隆抗體能夠在7天內(nèi)消除野生型、FcγRII-/-和FcγRIII-/-小鼠中≥95％的循環(huán)和組織B細胞。使用兩個獨立的FcγRIII-/-小鼠系(Bruhns等，(2003)Immunity 18573-581；Hazenbos等(1996)Immunity 5181-188)得到了與本文所觀察一樣的結(jié)果。FcRγ鏈的缺乏能夠?qū)gG1MB20-1和IgG2bMB20-18單克隆抗體導致的B細胞消除產(chǎn)生相似的作用。MB20-1單克隆抗體處理FcRγ-/-小鼠后沒有導致循環(huán)B細胞顯著降低，而在野生型小鼠中循環(huán)B細胞被消除了(圖8D)。同樣，MB20-1單克隆抗體處理FcRγ-/-小鼠后沒有導致脾臟B細胞顯著降低，而在野生型小鼠中脾臟B細胞數(shù)降低93％。MB20-18單克隆抗體處理FcRγ-/-小鼠后導致循環(huán)B細胞顯著降低，但是沒有達到在野生型小鼠中出現(xiàn)的程度(圖8E)。然而，MB20-18單克隆抗體處理FcRγ-/-小鼠后沒有導致脾臟B細胞顯著降低，而在野生型小鼠中脾臟B細胞數(shù)降低74％。因此，抗CD20單克隆抗體治療主要通過需要FcRγ鏈表達的途徑消除B細胞。
實施例11補體在B細胞消除中的作用由于認為補體活化是抗CD20單克隆抗體治療過程中B細胞消除的主要機制，所以使用補體缺乏(Wessels等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9211490-11494))和C1q缺乏(Zhang等，(1999)Immunity 10323-332)小鼠確定了補體在抗CD20單克隆抗體處理所導致的B細胞消除中的作用。首先在體外確定了每個抗CD20單克隆抗體的補體激活能力。在補體存在的情況下，大多數(shù)抗CD20單克隆抗體誘導顯著的B細胞裂解，如通過相對于同種型匹配對照單克隆抗體的碘化丙啶攝入所顯示，但不同的抗體其細胞毒性能力會有所變化(圖9A)。在這些體外分析中，如果沒有補體存在，則沒有一種抗CD20單克隆抗體能夠誘導B細胞發(fā)生PI攝入或者程序性細胞死亡。雖然MB20-11單克隆抗體也能有效的體外誘導顯著的補體介導的B細胞裂解，但是MB20-18單克隆抗體啟動了最有效的補體依賴的B細胞裂解。然而，每一單克隆抗體體外誘導補體依賴的殺B細胞的能力與每一單克隆抗體體內(nèi)消除B細胞的能力是不相關(guān)的(圖7B)。然而，MB20-11單克隆抗體有效地清除了C3-/-和C4-/-小鼠中的全部血液B細胞和≥90％的脾臟B細胞(圖9B)。該觀察結(jié)果不是單克隆抗體同種型特異的，因為MB20-1和MB20-18單克隆抗體在C3-/-和野生型小鼠中以相似的程度有效消除了血液和脾臟B細胞(圖9C和圖9D)。因此，抗CD20單克隆抗體的治療主要通過FcγR依賴和C3、C4和C1q不依賴機制消除B細胞。
實施例12單核細胞介導的體內(nèi)B細胞消除由于抗CD20單克隆抗體治療的消除能力與單克隆抗體同種型和FcγR表達直接相關(guān)，所以確定了NK細胞、T細胞和巨噬細胞對FcγR介導的B細胞消除的貢獻。通過用脂質(zhì)體包封的氯膦酸鹽處理會產(chǎn)生呈現(xiàn)巨噬細胞缺乏的小鼠，在用MB20-11單克隆抗體處理該種小鼠1小時沒有顯著消除循環(huán)B細胞，并且在到達7天時仍具有正常數(shù)量的循環(huán)B細胞(圖10A)。同樣地，與對照單克隆抗體處理的同窩小鼠相比，在氯膦酸鹽處理的小鼠中脾臟B細胞數(shù)量在第7天僅降低39％(圖10B)。由于CSF-1缺乏(CSF-1op)導致產(chǎn)生了巨噬細胞亞群發(fā)生組織特異性缺失的小鼠(Cecchini等，(1994)Development 1201357-1372)，在用MB20-11單克隆抗體處理后該小鼠也表現(xiàn)出循環(huán)B細胞的清除并且在第7天只有84％的表型成熟的脾臟B細胞被消除(圖10)。通過比較，缺乏功能性T細胞的無胸腺裸鼠和LAT-/-小鼠(Zhang等，(1999)Immunity 10323-332)消除＞96％的血液和脾臟B細胞。同樣，在NK細胞功能缺陷的beige和perforin-/-小鼠(Kagi等，(1994)Nature36931-37)中抗CD20單克隆抗體處理去除了大約95％的循環(huán)B細胞和脾臟B細胞(圖10)。這些發(fā)現(xiàn)表明CSF-1依賴和不依賴的巨噬細胞亞型是體內(nèi)CD20+B細胞消除的主要效應細胞，并且基本上排除了T細胞、NK細胞和穿孔蛋白依賴的機制。
實施例13單克隆抗體的序列分析在大多數(shù)B淋巴細胞的細胞表面分子中CD20是獨特的，因為只有相對小部分的分子表達于細胞表面，據(jù)估計大約為42個氨基酸。因此，由于空間的限制大多數(shù)抗CD20單克隆抗體阻斷了與其它抗CD20單克隆抗體的結(jié)合。因此這就留給人們一種印象，即大多數(shù)抗CD20單克隆抗體結(jié)合CD20蛋白質(zhì)的相似(如果不是相同的話)的區(qū)域或表位，但這仍然沒有證明。然而，蛋白質(zhì)抗原和能夠結(jié)合這些抗原特異表位的單克隆抗體之間的相互作用是復雜的，并且對于每一單克隆抗體和其特異氨基酸序列幾乎是唯一的。該水平的抗原和抗體相互作用復雜性有助于產(chǎn)生針對大多數(shù)抗原的多種抗體庫。然而，小鼠也表達作為自身抗原的CD20這一事實限制了抗CD20抗體的多樣性。因此，在正常情況下，小鼠不能產(chǎn)生針對人CD20中小鼠也具有的抗原決定簇的抗體，因為這些單克隆抗體會發(fā)生自身反應。因此，在正常小鼠中產(chǎn)生的抗CD20單克隆抗體可能結(jié)合有限數(shù)量的人CD20中存在且獨特的所述表位。
與能夠針對大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原產(chǎn)生的多種抗體庫相比，小鼠的近交品系通過產(chǎn)生相當多的同質(zhì)抗體而對半抗原或結(jié)構(gòu)簡單抗原發(fā)生反應(Blier和Bothwell(1988)Immunol.Rev.10527-43)。限制體液反應的最好實例之一是C57BL/6(Ighb)小鼠對(4-羥基-3-硝基苯基)乙酰基(NP)半抗原的反應(Imanishi和Mkel(1975)J.Exp.Med.141840-854)。用NP偶聯(lián)的蛋白質(zhì)載體免疫的C57BL/6小鼠產(chǎn)生了具有稀有λ1輕鏈的血清抗體，而單獨用載體蛋白質(zhì)免疫實際上沒有產(chǎn)生λ1抗體或λ1+B細胞(Imanishi和Mkel(1975)，同上；Mkel和Karjalainen(1977)Immunol.Rev.34119-138；Reth等，(1978)Eur.J.Immunol.8393-400；Reth等，(1979)Eur.J.Immunol.91004-1013；Karjalainen等，(1980)J.Immunol.125313-317；Weiss和Rajewsky(1990)J.Exp.Med.1721681-1689；Jacob等，(1991)J.Exp.Med.1731165-1175；Cumano和Rajewsky(1986)EM80J.52459-2466)。在抗NP反應的早期(免疫后4-8天)，大比例的抗原活化λ1+B細胞表達與VH基因大的J558(V1)家族中所選擇成員結(jié)合的多種D基因片段，其中所述的成員包括V186.2(V1S2)、C1H4、CH10、V23(V1S4)、24.8、V102(V1S7)和V583.5(Jacob和Kelsoe(1992)J.Exp.Med.176679-687；Bothwell等，(1981)Cell 24625-637；Allen等，(1988)EMBOJ.71995-2001；Jacob等，(1993)J.Exp.Med.1781293-1307)。在免疫后10天，多數(shù)λ1+B細胞表達V1S2至DFL16.1的重排基因，該重排基因編碼具有YYGS(SEQ ID NO115)共有氨基酸基序的富含酪氨酸的CDR3區(qū)(Weiss和Rajewsky(1990)，同上；Bothwell等，(1981)，同上；Jacob等，(1993)，同上；Cumano和Rajewsky(1985)Eur.J.Immunol.15512-520；McHeyzer-Williams等，(1993)J.Exp.Med.178295-305)。與λ1輕鏈配對的V1S.2至DFL16.1重鏈重排分子稱作規(guī)范的抗NP B細胞抗原受體(Reth等，(1978)，同上；Reth等，(1979)，同上)，其支配著C57BL/6小鼠對NP的初級和二次體液免疫反應。因此，這些特異抗體基因片段的利用認為能夠預測單克隆抗體的抗原特異性。
在Ighb小鼠中抗NP抗體反應的同質(zhì)性(Imanishi和Mkel(1975)，同上)反映了BALB/c小鼠對磷酸膽堿的反應(Crews等，(1981)Cell 2559-66)；在品系A(chǔ)的小鼠中產(chǎn)生抗p-azophenylarsonate抗體的反應(Pawlak等，(1973)J.Exp.Med.13722-31)；在BALB/c和DBA/2小鼠中的2-苯基噁唑酮反應(Mkel等，(1978)J.Exp.Med.1481644-1656)和BALB/c小鼠對多聚(Glu60-Ala30-Tyr10)的反應(Thèze和Sommé(1979)Eur.J.Immunol.9294-301)。在這些抗體反應中低遺傳變異的原因仍不清楚。限制的抗體反應與單一V基因片段(Siekevitz等，(1983)Eur.J.Immunol.13123-132)或Igh等位基因(Siekevitz等，(1982)Eur.J.Immunol.121023-1032)的關(guān)聯(lián)表明存在一種抗原互補性的偶然的單一最佳解決方案，這導致了具有同源V(D)J重排的少數(shù)B細胞克隆的擴大。在這種情況下，種系VH基因庫中品系特異的差異將調(diào)節(jié)對結(jié)構(gòu)類似分子的抗體反應。備選地，限制的抗體反應可以通過自我耐受來約束(Manser等，(1987)Immunol.Rev.96141-162；Hande等，(1998)Immunity 8189-198)或者取決于表達能夠強有力耐受突變變化的V(D)J重排基因的淋巴細胞克隆(Manser等，(1984)Science 2261283-1288)。不管機制如何，對所定義結(jié)構(gòu)進行的抗體反應可以是同質(zhì)的并且反映了抗體庫內(nèi)有限的反應，其中這也反映了這樣一種事實，即抗體通過相似(如果不是相同的話)的分子相互作用結(jié)合同一靶抗原，其中所述的相互作用是通過抗體可變區(qū)內(nèi)特異的保守氨基酸介導的。當單克隆抗體與靶抗原的相互作用主要通過抗體分子的互補決定區(qū)(CDR)內(nèi)的氨基酸介導時，則骨架氨基酸對于抗原結(jié)合活性也是重要的。因此，結(jié)構(gòu)相似的抗體可能結(jié)合同一抗原或者靶分子的相同區(qū)，而具有不同V區(qū)的結(jié)構(gòu)相異抗體可能通過不同的分子相互作用與抗原的不同區(qū)域發(fā)生相互作用。
由于能夠結(jié)合靶抗原同一區(qū)域的結(jié)構(gòu)相似的抗體更可能結(jié)合靶抗原的同一分子部位，所以確定了所公布的抗人CD20單克隆抗體的氨基酸序列。1F5(Shan等，(1999)，同上)、B9E9(Schultz等，(2000)，同上)、2H7(美國專利號6,120,767)、2B8(美國專利號5,843,439)、1H4(Haisma等，(1998)，同上)和Leu-16(Wu等，(2001)，同上)單克隆抗體的重鏈和輕鏈V區(qū)在氨基酸序列上是同源的(圖11)。這種水平的保守反映了這樣一種事實，即這些單克隆抗體的每一個在核苷酸水平也是相似的。通過相似的V(D)J基因片段的組合產(chǎn)生了這些抗CD20單克隆抗體的重鏈，其中V區(qū)來自V1S121*01基因片段，D區(qū)來自L16、Q52或SP2基因片段并且J區(qū)來自J1或J2基因片段(表1)。相似地，從V4-72*01基因片段與來自J1*02或J5*01基因片段的J區(qū)產(chǎn)生了輕鏈。已知的抗CD20單克隆抗體間同質(zhì)性的水平表明，這些單克隆抗體中的每一個結(jié)合人CD20上的相似或相同部位。
通過與更大的一組抗人CD20和抗小鼠CD20單克隆抗體的比較，顯示了已知的抗CD20單克隆抗體間的氨基酸序列同源性水平。為了比較，首先將已知的抗CD20單克隆抗體與具有同源核苷酸和氨基酸序列的第二組抗人CD20單克隆抗體(HB20-03、HB20-04和HB20-25)進行對比。如圖12所示，使用UPGMA樹(使用算術(shù)平均數(shù)的不加權(quán)配對組方法)顯示重鏈和輕鏈V區(qū)間的可比較的相似性。在這些圖中，樹枝尖之間的水平距離是序列親緣關(guān)系的度量。例如，已知的小鼠抗人CD20單克隆抗體的重鏈和輕鏈彼此之間比與HB20-03、HB20-04和HB20-25單克隆抗體的序列之間更相似，其中在HB20-03、HB20-04和HB20-25單克隆抗體中彼此最相似。在輕鏈V區(qū)序列中，1H4和B9E9的序列最相似，但是與2H7、1F5和2B8單克隆抗體的序列也相當相似。同樣地，HB20-3和HB20-4單克隆抗體具有相當相似的氨基酸序列，這與HB20-25單克隆抗體的相應序列相比相似性相對較小。然而，HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體的輕鏈序列甚至更不同于已知抗CD20單克隆抗體的序列。當將每一單克隆抗體之間配對的重鏈和輕鏈的序列同源性進行比較時，可見已知的抗CD20單克隆抗體與HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體之間的序列同源性水平相當不同(圖12)。這表明這兩組單克隆抗體是不同的并且很可能通過不同的分子相互作用結(jié)合人CD20或者結(jié)合到CD20蛋白質(zhì)的不同部位。還可預計，HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體將享有不同于已知抗CD20單克隆抗體所共享生物學特性的生物學特性。
通過與更大一組的抗人CD20和抗小鼠CD20單克隆抗體的比較，進一步顯示了已知抗CD20單克隆抗體之間的氨基酸序列同源性水平。一般地，2B8、B9E9、1F5、1H4和Leu-16重鏈與HB20-01、HB20-02和HB20-06單克隆抗體的重鏈在序列上是相似的(圖13和圖15)?；谛蛄邢嗨菩裕瑢⑦@些重鏈VoJ片段指定為A組序列(圖13)。2H7單克隆抗體的氨基酸序列是相似的，但是與其它的A組重鏈不同，所以該重鏈被指定為B組重鏈。HB20-03、HB20-04和HB20-25結(jié)構(gòu)相似并且被指定為C組重鏈。HB20-05單克隆抗體同樣也是結(jié)構(gòu)不同的并且被指定為D組重鏈。許多抗小鼠CD20單克隆抗體(MB20-08、MB20-10、MB20-18、MB20-07、MB20-02和MB20-14)具有結(jié)構(gòu)相似的重鏈并且把它們指定為E組重鏈。MB20-11和MB20-16單克隆抗體的重鏈是十分不同的并且代表著F組。MB20-01和MB20-13單克隆抗體的重鏈與所有其它抗CD20單克隆抗體的重鏈結(jié)構(gòu)上十分不同，將它們指定為G組重鏈。重鏈氨基酸序列的這些不同的組與用于產(chǎn)生每一抗CD20重鏈的不同V(D)J基因片段的使用密切相關(guān)(表1)。因此，已知的抗CD20單克隆抗體重鏈在結(jié)構(gòu)上不同于本文所公開的大多數(shù)抗CD20單克隆抗體重鏈。
通過對一組抗人CD20和抗小鼠CD20單克隆抗體輕鏈的比較，進一步顯示了已知抗CD20單克隆抗體間氨基酸序列同源性的顯著水平。2B8、B9E9、1F5、1H4、Leu-16和2H7輕鏈序列相當相似，但是與其它抗CD20單克隆抗體的輕鏈不同(圖16和圖18)?；谛蛄邢嗨菩?，將這些輕鏈指定為A組序列(圖16)。多種抗小鼠CD20單克隆抗體輕鏈的氨基酸序列最相似，但與A組輕鏈不同，因此將這些輕鏈指定為B組。HB20-03、HB20-04和HB20-25結(jié)構(gòu)不同并且被指定為C組輕鏈。HB20-01、HB20-02和HB20-06單克隆抗體使用相似的輕鏈，該相似的輕鏈被指定為E組。MB20-18和MB20-01使用結(jié)構(gòu)不同的輕鏈并且因此分別指定為F組和G組。輕鏈氨基酸序列的這些不同的組與用于產(chǎn)生每一抗CD20單克隆抗體的不同VJ基因片段的使用密切相關(guān)(表1)。因此，已知的抗CD20單克隆抗體輕鏈在結(jié)構(gòu)上不同于本文所公開的抗CD20單克隆抗體所使用的輕鏈。
對配對的重鏈和輕鏈氨基酸序列的分析進一步證實不同的抗CD20單克隆抗體處于結(jié)構(gòu)不同的組并且因此通過不同的分子相互作用結(jié)合人或小鼠CD20。2B8、B9E9、1F5、1H4和Leu-16單克隆抗體使用結(jié)構(gòu)相似的重鏈和輕鏈，因此分別指定為AA(圖19，表1)。由于2H7單克隆抗體重鏈結(jié)構(gòu)上不同于其它已知的抗CD20單克隆抗體的重鏈，但能夠與相似的輕鏈配對，所以將該單克隆抗體指定為BA組單克隆抗體。CC組單克隆抗體即HB20-03、HB20-04和HB20-25代表著結(jié)構(gòu)獨特的一類抗CD20單克隆抗體。同樣地，通過使用不同的重鏈和輕鏈對實現(xiàn)唯一重鏈和輕鏈的利用和重組多樣性，不同的重鏈和輕鏈對使得將每一抗CD20單克隆抗體歸為與已知抗CD20單克隆抗體結(jié)構(gòu)不同的類(圖19)。
實施例14抗CD20單克隆抗體的結(jié)合密度和B細胞消除在不同的淋巴瘤類型以及各個腫瘤樣品的細胞中，CD20的表達是相當異質(zhì)的，這會影響抗CD20單克隆抗體治療的效果(Smith(2003)Oncogene 227359-7368)。一般地，與較高水平表達CD20的濾泡型淋巴瘤細胞相比，低水平表達CD20的慢性淋巴性白血病和小淋巴細胞性淋巴瘤細胞對利妥?，敺磻俣认鄳^低(McLaughlin等，(1998)J.Clin.Oncol.162825-2833)。因此，CD20的表達密度是影響抗CD20治療功效的重要因素，因為CD20的密度指示了能夠與B細胞結(jié)合并靶向消除它們的抗CD20單克隆抗體的數(shù)量。為了確定CD20表達密度是否影響治療功效并且為了確定密度變化影響B(tài)細胞消除的程度，使用MB20-11單克隆抗體以高劑量(250μg)和低劑量(10μg)處理雜合CD20+/-小鼠。CD20+/-小鼠B細胞表達的CD20是野生型同窩小鼠B細胞中表達密度的一半。在高劑量的抗CD20單克隆抗體處理情況下，野生型的CD20表達或雜合型不充足的CD20表達對7天內(nèi)循環(huán)或脾臟B細胞的消除沒有可檢測水平的影響，其中93-97％的B細胞從脾臟中清除了(圖20A和圖20B)。與之相對照，低劑量的抗CD20單克隆抗體有效地從野生型小鼠中消除了93-98％的循環(huán)和脾臟B細胞，但是在7天內(nèi)僅有30-40％的循環(huán)或脾臟B細胞從CD20+/-小鼠中去除(圖20A和圖20B)。因此，雖然B細胞表達的CD20只是降低50％，但是通過這種50％的降低使得抗CD20單克隆抗體處理的效果顯著地改變。而且，通過細胞表面CD20的密度嚴重影響結(jié)合到靶B細胞表面的抗CD20單克隆抗體的密度，特別是當存在較低的單克隆抗體密度時。
實施例15MB20-11單克隆抗體結(jié)合和細胞表面CD20表達細胞表面CD20的表達密度是抗CD20治療效果的重要因素(Smith(2003)，同上)。因此，嘗試在治療過程中上調(diào)CD20的表達以便增強抗CD20單克隆抗體的體內(nèi)功效，例如用G-CSF或者GM-CSF刺激病人。然而，CD20上調(diào)之外的機制可能具有所觀察到的增強效果(Ravetch和Lanier(2000)Leukemia 16693-699；van der Kolk等，(2002)Leukemia16693-699)。本文已經(jīng)證明MB20-11單克隆抗體能夠特別有效的體內(nèi)消除小鼠B細胞(圖7-10)。雖然MB20-11單克隆抗體的體內(nèi)功效似乎部分地源自它是IgG2a同種型的事實，但是其它因素也可能有助于提高治療效果。因此，在體外評估了MB20-11單克隆抗體結(jié)合脾臟B細胞表面表達的CD20的效果。出乎意料的是，與置于冰上的細胞相比或者與用其它的相似或不同同種型的MB20單克隆抗體孵育相比，MB20-11單克隆抗體與在37℃培養(yǎng)的B細胞的結(jié)合在一段時間內(nèi)誘導了更多的MB20-11單克隆抗體的結(jié)合(圖21；數(shù)據(jù)未顯示)。當平均以后，在30分鐘至8小時的時間階段內(nèi)，MB20-11單克隆抗體的結(jié)合增加97±29％(n＝4，p＜0.05)(圖21)。隨著時間增加MB20-11單克隆抗體結(jié)合的增加似乎與低的單克隆抗體親和力無關(guān)，因為在與其它MB20相似的濃度下，MB20-11單克隆抗體達到染色飽和水平，而該濃度的其它MB20不能夠誘導細胞表面增加CD20表達(圖6)。由于其它抗小鼠CD20單克隆抗體沒有該特性(圖21，數(shù)據(jù)未顯示)，所以MB20-11單克隆抗體可以結(jié)合至CD20上的獨特區(qū)域或表位。MB20-11單克隆抗體與CD20的結(jié)合或者誘導B細胞上增強CD20的細胞表面表達，或者誘導細胞表面CD20分子的構(gòu)象變化，其中該CD20分子暴露了新的MB20-11單克隆抗體結(jié)合部位。
實施例16HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體的結(jié)合密度單克隆抗體結(jié)合密度對于抗CD20單克隆抗體體內(nèi)介導的最佳B細胞消除是至關(guān)重要的(圖20)，這表明以高密度結(jié)合至B細胞的單克隆抗體可能是在治療上更加有效的。在MB20單克隆抗體組中，MB20-18單克隆抗體以最高密度結(jié)合至B細胞表面，特別是當單克隆抗體濃度有限時(圖6)。這可能有助于在其它IgG2b抗CD20單克隆抗體當中MB20-18單克隆抗體特別有效地消除體內(nèi)B細胞(圖7B)?；谒鼈儼被嵝蛄兄械娘@著差異，可以預計CC組中的HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體(表1)具有共同的生物學特性，這不同于已知抗CD20單克隆抗體的共有特性(圖12)。在這些差異，在間接免疫熒光染色測定中發(fā)現(xiàn)HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體以顯著高于已知抗CD20單克隆抗體的水平結(jié)合至表達CD20的原代B細胞和B淋巴瘤細胞系(圖22)。當平均后，HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體以比1F5、B9E9和1H4單克隆抗體高3.7倍的水平結(jié)合人血液B細胞(表6)。同樣，HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體組以分別比1F5、B9E9和1H4單克隆抗體組高4.5、3.1和4.3倍的水平結(jié)合B細胞系Raji、BJAB和DHL-4。B1單克隆抗體，首先描述的抗CD20單克隆抗體(Stashenko等，(1980)J.Immunol.1251678)，一致觀察到B1單克隆抗體能夠染色B細胞并與其它公開的抗CD20單克隆抗體相比更高密度特異性結(jié)合B細胞(表6)。雖然如此，HB20-3、HB20-4和HB20-25組單克隆抗體仍以比B1單克隆抗體更高的水平與原代B細胞和B細胞系反應(表6)。具體而言，HB20-3單克隆抗體分別以高于B1單克隆抗體69％、130％、71％和57％的水平結(jié)合至原代B細胞、Raji細胞、BJAB細胞和DHL-4細胞。因此，CC組單克隆抗體的獨特特性是與其它已知抗CD20單克隆抗體相比其對細胞表面CD20的不典型地高結(jié)合活性。
除了以比1F5單克隆抗體更高密度結(jié)合以及以更高水平與原代B細胞和B細胞系反應之外，HB20-3、HB20-4和HB20-25在重鏈CDR3和CDR1區(qū)和輕鏈CDR3區(qū)中具有共同氨基酸基序。重鏈共同基序顯示于圖15并且輕鏈共同基序顯示于圖18。例如，重鏈CDR3區(qū)包含氨基酸序列基序FYXYXXX1YGAX2XXY，其中X可以是任意氨基酸并且優(yōu)選地為Y或S，并且其中X2可以是任意氨基酸并且優(yōu)選地為M或L，并且其中F是苯丙氨酸、Y是酪氨酸、G是甘氨酸、A是丙氨酸、M是蛋氨酸、L是亮氨酸且S是絲氨酸。
重鏈CDR1區(qū)包含氨基酸序列基序NXXXX，其中X可以是任意氨基酸并且N是天冬酰胺。
另外，輕鏈CDR3區(qū)包含氨基酸序列基序XHFWXX3XWX，其中X可以是任意氨基酸序列，H是組氨酸、F是苯丙氨酸、W是色氨酸并且X3可以是任意氨基酸且優(yōu)選地為T或I，其中T是蘇氨酸且I是異亮氨酸。
表6
人血液淋巴細胞和Raji、BJAB或DHL-4B類淋巴母細胞系與抗CD20單克隆抗體在飽和濃度下的反應性或者與單獨次級抗體(對照)的反應。抗CD20單克隆抗體使用經(jīng)確定為飽和的且產(chǎn)生最佳染色的濃度。1F5、B9E9和1H4(IgG2a)單克隆抗體使用1∶200稀釋的腹水。HB20-3、HB20-4和HB20-25單克隆抗體使用的是組織培養(yǎng)上清液。B1單克隆抗體使用10μg/mL的純化單克隆抗體或使用組織培養(yǎng)上清液。在所有情況下，使用PE綴合的同種型特異性次級抗體通過流式細胞術(shù)分析觀察單克隆抗體染色。數(shù)值代表通過流式細胞儀測定的每種B細胞群體的平均線性熒光強度。結(jié)果代表在≥3次實驗中所獲得的數(shù)據(jù)。
實施例17抗CD20單克隆抗體的治療效果由于以2.5μg劑量靜脈注射MB20-11單克隆抗體有效消除了循環(huán)和組織B細胞(圖7C)，因此確定了以相似的小劑量通過皮下注射(s.c.)MB20-11單克隆抗體是否導致相當程度的B細胞消除。在以5μg劑量通過靜脈或皮下注射抗CD20單克隆抗體的小鼠中，絕大多數(shù)循環(huán)和組織B細胞被消除了(圖23A和圖23B)。正常情況下，以375mg/m2的劑量給人靜脈注射利妥?，敚@將對應著2,500μg/小鼠的劑量(表7)。通過皮下注射5-10μg的單一劑量MB20-11單克隆抗體導致小鼠B細胞的有效消除，這比目前給病人靜脈注射利妥?，?shù)牧康?50-500倍?；谀壳霸谛∈笾械陌l(fā)現(xiàn)，當以1.3-2.6mg皮下注射施用于人時，與MB20-11單克隆抗體治療上可比的抗CD20單克隆抗體能夠有效消除循環(huán)和組織B細胞。
表7
*假定重量0.02kg。
#假定重量65kg，身體表面積1.71m2。
來源來自www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm的Dose Calculator。
上述實施例作為例證說明本發(fā)明，并且不構(gòu)成本發(fā)明的限制。通過以下權(quán)利要求定義本發(fā)明，權(quán)利要求的對等要求包括于其中。
序列表<110>杜克大學<120>CD20特異抗體及使用它們的方法<130>5405.342W0<150>US 60/469,451<151>2003-05-09<160>119<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>123<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>1Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Asn Met His Trp Val Lys Lys Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
11 51 20<210>2<211>369<212>DNA<213>小家鼠<400>2gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg60tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagaagaca120cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac180aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac240atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatgggat300tactacggta gtagctacgt tgggtttttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca360gtctcctca369<210>3<211>122<212>PRT<213>小家鼠<400>3Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Asn Met His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>366<212>DNA<213>小家鼠<400>4gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg60tcctgcaagg cttctggctt cacatttacc aattacaata tgcactggtt aaagcagacg120cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag aaaatggtga tacttcctac180aatcagaaat ttaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aagcctccag cacagcctac240atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagattttat300tactacggta gttattacgg tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc360tcctca 366<210>5<211>122<212>PRT<213>小家鼠<400>5Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120<210>6<211>366<212>DNA<213>小家鼠<400>6gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg60tcctgcaagg cttctggctt cacatttacc aattacaata tgcactgggt aaagcagacg120cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag aaaatggtga tacttcctac180aatcagaggt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac240atgcacctca gcagcctgac atctgaggac actgcggtct atttctgtgc aagattttat300tattacggta gttattacgg tgctttggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc360tcctca 366<210>7<211>123<212>PRT<213>小家鼠<400>7Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr20 25 30Asn Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Leu Thr Thr100 105 110Gly Ala Lys Ala Pro Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>8<211>369<212>DNA<213>小家鼠<400>8gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg60tcctgcaagg cttctggcta cacatttatt agttacaata tgcactgggt aaagcagaaa120cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac180aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac240atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatgggat300tactacggta gtagctacgt tgggtttttg actactgggg ccaaggcacc actcgtcaca360gtctcctca369<210>9<211>122<212>PRT<213>小家鼠<400>9Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr Asn Tyr20 25 30Asn Leu His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120<210>10<211>366<212>DNA<213>小家鼠<400>10gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg60tcctgcaagg cttctggctt cagatttacc aattacaatt tgcactgggt aaaacagaca120cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga aacttcctac180aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag tacagcctac240atgcagctca gaagcctgac atctggggac tctgcggtct attactgtgc aagattttat300tactacggta gtagctacgg tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc360tcctca 366<210>11<211>117<212>PRT<213>小家鼠<400>11Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val50 55 60Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Thr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110Val Thr Val Ser Ser115<210>12<211>351<212>DNA<213>小家鼠<400>12gaggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacggaa tggcgtgggt tcgacaggct120ccaaggaagg ggcctgagtg ggtagcattc attagtaatt tggcatatag tatctactat180gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tctagagaga atgccaagaa caccctgtac240ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt atttctgtac aagaactggg300tactatgctt tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351<210>13<211>114<212>PRT<213>小家鼠<400>13Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asp Tyr20 25 30
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1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile35 40 45Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val100 105 110Ser Ala<210>20<211>342<212>DNA<213>小家鼠<400>20gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata60tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaagtgggt gaagcagagc120catggaaaga gccttgactg gataggggat attaatccta acaatggtga tattatttac180aaccagaagt tcgagggcaa ggccacattg actgtggaca agtcctccag cacggcctac240atggagcttc gtagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagaacgg300tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 342<210>21<211>113<212>PRT<213>小家鼠<400>21
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Gly Thr Met Lys Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly100 105 110Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val130 135<210>48<211>410<212>DNA<213>小家鼠<400>48atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt gtctaatgga60gaaattgtgc tcacccagtc tccaaccacc atggctgcat ctcccgggga gaagatcact120atcacctgta gtgtcagttc aaatatacgt tccaattact tgcattggta tcagcagaag180ccaggattct cccctaaact cttgatttat aggacatcca atctggcttc tggagtccca240gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaattgg caccatgaag300gctgaagatg ttgccactta ctactgccag cagggtagta gtataccgct cacgttcggt360gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc 410<210>49<211>136<212>PRT<213>小家鼠<400>49Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala20 25 30Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Asn35 40 45Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Gly Thr Met Lys Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly100 105 110Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val130 135<210>50<211>410<212>DNA<213>小家鼠<400>50atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt gtctaatgga60gaaattgtgc tcacccagtc tccaaccacc atggctgcat ctcccgggga gaagatcact120atcacctgta gtgtcagttc aaatatccgt tccaattact tgcattggta tcagcagaag180ccaggattct cccctaaact cttgatttat aggacatcca atctggcttc tggagtccca240gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaattgg caccatgaag300gctgaagatg ttgccactta ctactgccag cagggtagta gtataccgct cacgttcggt360gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc 410<210>51<211>138<212>PRT<213>小家鼠<400>51Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15Val Ile Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Ala Gln Ser Pro Thr Thr20 25 30
Thr Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser35 40 45Ser Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu85 90 95Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln100 105 110Gln Gly Ser Ser Lys Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu115 120 125Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val130 135<210>52<211>416<212>DNA<213>小家鼠<400>52atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt catagtgtct60aatggagaaa ttgtgctcgc ccagtctcca accaccacgg ctgcatctcc cggggagaag120atcactatca cctgcagtgc cagctcaagt ataacttcca attacttgca ttggtatcag180cagaagccag gattctcccc taaactcttg atttatagga catccaatct ggcttctgga240gtcccagctc gcttcagtgg cagtggatct gggacctctt actctctcac aattggcacc300atggaggctg aagatgttgc cacttactac tgccagcagg gtagtagtaa aacactcacg360ttcggtgctg ggaccaagct ggagttgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatc416<210>53<211>138<212>PRT<213>小家鼠<400>53
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15Val Ile Val Ser Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr20 25 30Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser35 40 45Ser Ser Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu85 90 95Thr Val Ala Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln100 105 110Gln Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu115 120 125Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val130 125<210>54<211>416<212>DNA<213>小家鼠<400>54atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt catagtgtct60aatggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca accaccatgg ctgcatctcc cggggagaag120atcactatca cctgcagtgt cagctcaagt ataaggtcca attatttaca ttggtatcag180cagaagccag gattctcccc taaactcttg atttatagga catccaatct ggcttctgga240gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac agttgccacc300atggaggctg aagatgttgc cacttactac tgccagcagg gtagtagtat accgctcacg360ttcggtgctg ggaccaagct ggagttgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatc416
<210>55<211>139<212>PRT<213>小家鼠<400>55Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu1 5 10 15Leu Cys Val Ser Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro20 25 30Lys Phe Leu Leu Val Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys35 40 45Ala Ser Gln Thr Val Thr Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys100 105 110Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val130 125<210>56<211>417<212>DNA<213>小家鼠<400>56atgggcatca agatggagtc acagacccag gtcttcgtat ttctactgct ctgtgtgtct60ggtgctcatg ggagtattgt gatgacccag actcccaaat tcctgcttgt atcaacagga120gacagggtta ccattacctg caaggccagt cagactgtga etaatgattt agcttggtac180
caacagaagc cagggcagtc tcctaaactg ctgatatact atgcatccaa tcgctacact240ggagtccctg atcgcttcac tggcagtgga tatgggacgg acttcacttt caccatcaac300actgtgcagg ctgaagacct ggcagtttat ttctgtcagc aggattatag ctctcctctc360acgttcggtg ctgggaccaa gctggaactg aaacgggctg atgctgcacc aactgta 417<210>57<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>57Ser Tyr Asn Met His1 5<210>58<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>58Asn Tyr Asn Met His1 5<210>59<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>59Asn Tyr Asn Leu His1 5<210>60<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>60Asp Tyr Gly Met Ala1 5<210>61<211>5
<212>PRT<213>小家鼠<400>61Asp Tyr Tyr Ile Lys1 5<210>62<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>62Asp Tyr Tyr Met Lys1 5<210>63<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>63Asp Tyr Asn Met His1 5<210>64<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>64Asp Tyr Asn Leu His1 5<210>65<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>65Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly
<210>66<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>66Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>67<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>67Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe Lys1 5 10 15Gly<210>68<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>68Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>69<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>69Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr1 5 10 15
Gly<210>70<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>70Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>71<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>71Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu1 5 10 15Gly<210>72<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>72Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu1 5 10 15Gly<210>73<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>73
Tyr Ile Ala Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>74<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>74Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Thr1 5 10 15Gly<210>75<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>75Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Phe Asp Tyr1 5 10<210>76<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400>76Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr1 5 10<210>77<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400>77Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Leu Asp Tyr1 5 10
<210>78<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>78Trp Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Phe Leu Thr Thr1 5 10<210>79<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400>79Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr1 5 10<210>80<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>80Thr Gly Tyr Tyr Ala Leu Phe Asp Tyr1 5<210>81<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>81Glu Arg Phe Ala Tyr1 5<210>82<211>4<212>PRT<213>小家鼠<400>82Ala Leu Asp Tyr1
<210>83<211>6<212>PRT<213>小家鼠<400>83Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr1 5<210>84<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>84Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala1 5 10<210>85<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>85Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala1 5 10<210>86<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>86Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr Leu Ala1 5 10<210>87<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>87Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala1 5 10<210>88
<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>88Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Lys Arg Lys Asn Tyr Leu1 5 10 15Ala<210>89<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>89Ser Val Ser Ser Ser Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His1 5 10<210>90<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>90Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His1 5 10<210>91<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>91Ser Val Ser Ser Asn Ile Arg Ser Asn Tyr Leu His1 5 10<210>92<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>92Ser Ala Ser Ser Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Leu His1 5 10
<210>93<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>93Lys Ala Ser Gln Thr Val Thr Asn Asp Leu Ala1 5 10<210>94<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>94Ser Ala Ser Tyr Arg Asn Ser1 5<210>95<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>95Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp1 5<210>96<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>96Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser1 5<210>97<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>97Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp1 5
<210>98<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>98Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5<210>99<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>99Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5<210>100<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>100Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr1 5<210>101<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>101Gln Gln Tyr Asn Ser Ser Pro Phe Thr1 5<210>102<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>102Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr1 5
<210>103<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>103Gln His Phe Trp Ser Ile Pro Trp Thr1 5<210>104<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>104Gln His Phe Trp Gly Ile Pro Trp Thr1 5<210>105<211>8<212>PRT<213>小家鼠<400>105His Gln Tyr Leu Ser Ser Phe Thr1 5<210>106<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>106Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Leu Thr1 5<210>107<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>107Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Leu Thr1 5<210>108
<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>108Gln Gln Gly Ser Ser Lys Thr Leu Thr1 5<210>109<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>109Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr1 5<210>110<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>110gggaattcga ggtgcagctg caggagtctg g31<210>111<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>111gagggggaag acatttggga aggactg 27<210>112<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>112gagttccagg tcactgtcac tggc24
<210>113<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>113gtgaattcag gcggccgcta a 21<210>114<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>114actggatggt gggaagatg 19<210>115<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR3區(qū)共有序列<400>115Tyr Tyr Gly Ser1<210>116<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>116atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg30<210>117<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>117atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc30<210>118<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>118atgggcwtca agatggagtc acakwyycw g 31<210>119<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸引物<400>119atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g 3權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合CD20的單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段結(jié)合至B細胞的密度比mAb 1F5結(jié)合至B細胞的密度至少高2倍。
2.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合人CD20。
3.權(quán)利要求2的mAb，其中mAb是通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生的(a)在足以引起抗體反應的條件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳動物；(b)從所述哺乳動物收集能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20的抗體的細胞；(c)從所述抗體產(chǎn)生細胞中分離免疫球蛋白編碼基因；(d)將所述免疫球蛋白編碼基因?qū)爰毎援a(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細胞；(e)在足以使免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯和單克隆抗體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化細胞；和(e)從培養(yǎng)物中回收特異性結(jié)合CD20的單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1的抗原結(jié)合片段，其中抗原結(jié)合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段。
5.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它是進行可檢測標記的。
6.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它連接至治療化合物。
7.權(quán)利要求6的mAb或抗原結(jié)合片段，它連接至細胞毒性試劑。
8.權(quán)利要求1的mAb，它是裸抗體。
9.權(quán)利要求1的mAb，它是雙特異性抗體。
10.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它結(jié)合CD20的細胞外結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它是嵌合mAb或抗原結(jié)合片段。
12.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它是人源化mAb或抗原結(jié)合片段。
13.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段與B細胞上的CD20的結(jié)合導致所述B細胞上mAb或抗原結(jié)合片段結(jié)合位點的上調(diào)。
14.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它與選自HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的mAb結(jié)合同一抗原決定簇。
15.權(quán)利要求14的mAb，其中mAb選自HB20-25和MB20-11。
16.權(quán)利要求14的抗原結(jié)合片段，它選自HB20-3和HB20-4的抗原結(jié)合片段。
17.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的mAb的重鏈CDR3區(qū)或者與HB20-3、HB20-4、HB20-25或MB20-11的重鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈CDR3區(qū)。
18.權(quán)利要求17的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含來自HB20-25mAb的重鏈CDR3區(qū)或者與HB20-25重鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈CDR3區(qū)。
19.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的輕鏈CDR3區(qū)或者與HB20-3、HB20-4或HB20-25的輕鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈CDR3區(qū)。
20.權(quán)利要求19的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含來自HB20-25mAb的輕鏈CDR3區(qū)或者與HB20-25重鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈CDR3區(qū)。
21.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的CDR3區(qū)或者與HB20-3、HB20-4或HB20-25的CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR3區(qū)。
22.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)或者分別與HB20-3、HB20-4或HB20-25的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。
23.權(quán)利要求22的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含來自HB20-25的CDR3區(qū)或者與該CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR3區(qū)。
24.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，選自(a)包含含有SEQ ID NO3(HB20-3)、SEQ ID NO5(HB20-4)、SEQID NO9(HB20-25)或SEQ ID NO21(MB20-11)的重鏈可變區(qū)或者與SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或SEQ ID NO21的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)重鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(b)包含含有SEQ ID NO31(HB20-3)、SEQ ID NO33(HB20-4)或SEQ ID NO37(HB20-25)的輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO31、SEQ IDNO33或SEQ ID NO37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；和(c)包含根據(jù)(a)和(b)的重鏈和輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。
25.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，選自(a)包含含有SEQ ID NO3(HB20-3)的重鏈可變區(qū)或者與SEQ IDNO3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)重鏈，和含有SEQ ID NO31(HB20-3)的輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO31的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(b)包含含有SEQ ID NO5(HB20-4)的重鏈可變區(qū)或者與SEQ IDNO5的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)重鏈，和含有SEQ ID NO33(HB20-4)的輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO33的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；和(c)包含含有SEQ ID NO9(HB20-25)的重鏈可變區(qū)或者與SEQ IDNO9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)重鏈，和含有SEQ ID NO37(HB20-25)的輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。
26.權(quán)利要求25的mAb或抗原結(jié)合片段，包括包含含有SEQ IDNO9(HB20-25)的重鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)重鏈和含有SEQ ID NO37(HB20-25)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。
27.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自HB20-3(SEQ IDNO3)、HB20-4(SEQ ID NO5)、HB20-25(SEQ ID NO9)和MB20-11(SEQID NO21)的mAb的重鏈可變區(qū)。
28.權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自HB20-3(SEQ IDNO31)，HB20-4(SEQ ID NO33)和HB20-25(SEQ ID NO37)的mAb的輕鏈可變區(qū)。
29.在可要用載體中包含權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段的藥物組合物。
30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中組合物進一步包含增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物。
31.在可要用載體中包含單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物，其中所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與選自HB20-1、HB20-3、HB20-4和HB20-25的單克隆抗體特異結(jié)合同一抗原決定簇。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，包含與單克隆抗體HB20-25特異性結(jié)合同一抗原決定簇的mAb或其抗原結(jié)合片段。
33.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中抗原結(jié)合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段。
34.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb或抗原結(jié)合片段是進行可檢測標記的。
35.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb或抗原結(jié)合片段連接至治療化合物。
36.權(quán)利要求35的藥物組合物，其中mAb或抗原結(jié)合片段連接至細胞毒性試劑。
37.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb或抗原結(jié)合片段是裸抗體。
38.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb是雙特異性抗體。
39.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb或抗原結(jié)合片段是嵌合mAb或抗原結(jié)合片段。
40.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb或抗原結(jié)合片段是人源化mAb或抗原結(jié)合片段。
41.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb選自HB20-1、HB20-3、HB20-4和MB20-25。
42.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中mAb是HB20-25。
43.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中抗原結(jié)合片段選自HB20-1、HB20-3、HB20-4和MB20-25的抗原結(jié)合片段。
44.特異性結(jié)合小鼠CD20的單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段。
45.權(quán)利要求44的抗原結(jié)合片段，其中抗原結(jié)合片段是F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段。
46.權(quán)利要求44的mAb或抗原結(jié)合片段，它是進行可檢測標記的。
47.權(quán)利要求44的mAb或抗原結(jié)合片段，它連接至治療化合物。
48.權(quán)利要求47的mAb或抗原結(jié)合片段，它連接至細胞毒性試劑。
49.權(quán)利要求44的mAb，它是裸抗體。
50.權(quán)利要求44的mAb，它是雙特異性抗體。
51.權(quán)利要求44的mAb或抗原結(jié)合片段，它結(jié)合CD20的細胞外結(jié)構(gòu)域。
52.權(quán)利要求44的mAb或抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段與B細胞上CD20的結(jié)合導致所述B細胞上mAb或抗原結(jié)合片段結(jié)合位點的上調(diào)。
53.權(quán)利要求44的mAb或抗原結(jié)合片段，其中mAb或抗原結(jié)合片段與選自MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18的mAb特異性結(jié)合同一抗原決定簇。
54.權(quán)利要求53的mAb，其中mAb選自MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18。
55.權(quán)利要求53的抗原結(jié)合片段，選自MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18的抗原結(jié)合片段。
56.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-11、MB20-14、MB20-16和MB20-18的mAb的重鏈CDR3區(qū)或者與MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-11、MB20-14、MB20-16或MB20-18的重鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈CDR3區(qū)。
57.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-7、MB20-8、MB20-13、MB20-14和MB20-18的mAb的輕鏈CDR3區(qū)或者與MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-7、MB20-8、MB20-13、MB20-14或MB20-18的輕鏈CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈CDR3區(qū)。
58.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-13、MB20-14和MB20-18的mAb的CDR3區(qū)或者與MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-13、MB20-14或MB20-18的CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR3區(qū)。
59.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-13、MB20-14和MB20-18的mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)或者分別與MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-13、MB20-14和MB20-18的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。
60.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，選自(a)包含含有SEQ ID NO11(MB20-1)、SEQ ID NO13(MB20-2)、SEQ ID NO15(MB20-7)、SEQ ID NO17(MB20-8)、SEQ IDNO21(MB20-11)、SEQ ID NO23(MB20-14)、SEQ ID NO25(MB20-16)或SEQ ID NO27(MB20-18)的重鏈可變區(qū)或者含有與SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25或SEQ ID NO27的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(b)包含含有SEQ ID NO39(MB20-1)、SEQ ID NO41(MB20-2)、SEQ ID NO43(MB20-3)、SEQ ID NO45(MB20-7)、SEQ ID NO47(MB20-8)、SEQ ID NO51(MB20-13)、SEQ ID NO53(MB20-14)或SEQID NO55(MB20-18)的輕鏈可變區(qū)或者含有與SEQ ID NO39、SEQ IDNO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53和SEQ ID NO55的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；和(c)包含根據(jù)(a)和(b)中的重鏈和輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。
61.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，選自(a)包含含有SEQ ID NO11(MB20-1)的重鏈可變區(qū)或與SEQ IDNO11的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO39(MB20-1)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO39的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(b)包含含有SEQ ID NO13(MB20-2)的重鏈可變區(qū)或與SEQ IDNO13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO41(MB20-2)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO41的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(c)包含含有SEQ ID NO15(MB20-7)的重鏈可變區(qū)或與SEQ IDNO15的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO45(MB20-7)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO45的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(d)包含含有SEQ ID NO17(MB20-8)的重鏈可變區(qū)或與SEQ IDNO17的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO47(MB20-8)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO47的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(e)包含含有SEQ ID NO11(MB20-13)的重鏈可變區(qū)或與SEQ IDNO11的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO51(MB20-13)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO51的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；(f)包含含有SEQ ID NO23(MB20-14)的重鏈可變區(qū)或與SEQ IDNO23的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO53(MB20-14)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO53的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段；和(g)包含含有SEQ ID NO27(MB20-18)的重鏈可變區(qū)或與SEQ IDNO27的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的重鏈和含有SEQ ID NO55(MB20-18)的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO55的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的mAb或抗原結(jié)合片段。
62.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自MB20-1(SEQID NO11)、MB20-2(SEQ ID NO13)、MB20-7(SEQ ID NO15)、MB20-8(SEQ ID NO17)、MB20-11(SEQ ID NO21)、MB20-14(SEQ ID NO23)、MB20-16(SEQ ID NO25)和MB20-18(SEQ ID NO27)的mAb的重鏈可變區(qū)。
63.權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段，它包含選自MB20-1(SEQID NO39)、MB20-2(SEQ ID NO41)、MB20-3(SEQ ID NO43)、MB20-7(SEQ ID NO45)、MB20-8(SEQ ID NO47)、MB20-13(SEQ ID NO51)、MB20-14(SEQ ID NO53)和MB20-18(SEQ ID NO55)的mAb的輕鏈可變區(qū)。
64.在可要用載體中包含權(quán)利要求53的mAb或抗原結(jié)合片段的藥物組合物。
65.權(quán)利要求64的藥物組合物，其中組合物進一步包含增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物。
66.產(chǎn)生權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段的細胞系。
67.權(quán)利要求66的細胞系，其中細胞系是雜交瘤細胞系。
68.權(quán)利要求67的細胞系，選自雜交瘤細胞系HB20-25和MB20-11。
69.產(chǎn)生權(quán)利要求44的mAb或抗原結(jié)合片段的細胞系。
70.權(quán)利要求69的細胞系，其中細胞系是雜交瘤細胞系。
71.權(quán)利要求70的細胞系，選自雜交瘤細胞系MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-6、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-13、MB20-14、MB20-16和MB20-18。
72.在哺乳動物受試者中消除B細胞的方法，包括以能夠消除B細胞的有效量向哺乳動物受試者施用權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要求31的藥物組合物。
73.在哺乳動物受試者中消除B細胞的方法，包括以能夠消除B細胞的有效量向哺乳動物受試者施用權(quán)利要求3的mAb或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要求32的藥物組合物。
74.權(quán)利要求73的方法，其中哺乳動物受試者是人并且其中藥物組合物是皮下施用的。
75.權(quán)利要求73的方法，其中組合物是以低于每次施用375mg/m2的劑量施用的。
76.權(quán)利要求75的方法，其中組合物是以低于每次施用37.5mg/m2的劑量施用的。
77.權(quán)利要求76的方法，其中組合物是以低于每次施用0.375mg/m2的劑量施用的。
78.權(quán)利要求74的方法，其中組合物是以0.075mg/m2和125mg/m2之間的劑量施用的。
79.權(quán)利要求72的方法，其中哺乳動物受試者是人。
80.權(quán)利要求72的方法，其中藥物組合物通過胃腸外途徑施用。
81.權(quán)利要求80的方法，其中藥物組合物通過選自鞘內(nèi)、靜脈、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用的途徑進行施用。
82.權(quán)利要求72的方法，其中向哺乳動物受試者每次施用0.075mg/m2和125mg/m2之間劑量的mAb或抗原結(jié)合片段。
83.權(quán)利要求82的方法，其中向哺乳動物受試者每次施用10mg/m2和75mg/m2之間劑量的mAb或抗原結(jié)合片段。
84.權(quán)利要求82的方法，其中達到循環(huán)B細胞至少75％的消除。
85.權(quán)利要求82的方法，其中達到組織B細胞至少60％的消除。
86.權(quán)利要求82的方法，其中所述循環(huán)B細胞的消除觀察了至少7天的階段。
87.權(quán)利要求82的方法，其中所述循環(huán)B細胞的消除觀察了至少30天的階段。
88.權(quán)利要求82的方法，其中方法包括在一段時間內(nèi)向哺乳動物受試者不止一次施用mAb、抗原結(jié)合片段和藥物組合物。
89.治療B細胞疾病的方法，包括向患有B細胞疾病的哺乳動物受試者施用治療有效量的能夠特異結(jié)合CD20的單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段，其中所述mAb或抗原結(jié)合片段具有能夠?qū)е轮辽?5％的循環(huán)B細胞被消除的125mg/m2或更低的治療有效劑量范圍。
90.權(quán)利要求89的方法，其中mAb或抗原結(jié)合片段具有37.5mg/m2或更低的有效劑量范圍。
91.權(quán)利要求89的方法，其中mAb或抗原結(jié)合片段具有10mg/m2或更低的有效劑量范圍。
92.權(quán)利要求89的方法，其中mAb或抗原結(jié)合片段具有0.375mg/m2或更低的有效劑量范圍。
93.權(quán)利要求89的方法，其中mAb或抗原結(jié)合片段具有0.075mg/m2或更低的有效劑量范圍。
94.權(quán)利要求89的方法，其中所述循環(huán)B細胞的消除觀察了至少7天的階段。
95.權(quán)利要求89的方法，其中所述循環(huán)B細胞的消除觀察了至少30天的階段。
96.權(quán)利要求89的方法，其中B細胞疾病是B細胞惡性腫瘤。
97.權(quán)利要求89的方法，其中B細胞疾病是自身免疫病。
98.權(quán)利要求89的方法，其中哺乳動物受試者是人。
99.權(quán)利要求89的方法，其中藥物組合物通過胃腸外途徑施用。
100.權(quán)利要求99的方法，其中藥物組合物通過選自鞘內(nèi)、靜脈、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用的途徑進行施用。
101.權(quán)利要求89的方法，其中方法包括在一段時間內(nèi)向哺乳動物受試者不止一次施用藥物組合物。
102.治療B細胞疾病的方法，包括向患有B細胞疾病的哺乳動物受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要求31的藥物組合物
103.權(quán)利要求102的方法，其中B細胞疾病是B細胞惡性腫瘤。
104.權(quán)利要求102的方法，其中B細胞疾病是自身免疫病。
105.權(quán)利要求102的方法，其中哺乳動物受試者是人。
106.權(quán)利要求102的方法，其中藥物組合物通過胃腸外途徑施用。
107.權(quán)利要求106的方法，其中藥物組合物通過選自鞘內(nèi)、靜脈、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用的途徑進行施用。
108.權(quán)利要求102的方法，其中方法包括在一段時間內(nèi)向哺乳動物受試者不止一次施用藥物組合物。
109.治療B細胞疾病的方法，包括向患有B細胞疾病的哺乳動物受試者施用治療有效量的(i)權(quán)利要求1的mAb或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要求31的藥物組合物，和(ii)增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物。
110.權(quán)利要求109的方法，其中哺乳動物受試者對抗CD20mAb治療具有抗性。
111.權(quán)利要求110的方法，其中哺乳動物受試者對使用mAb C2B8的治療具有抗性。
112.權(quán)利要求109的方法，其中哺乳動物受試者已經(jīng)或者目前正在用化學療法進行治療。
113.權(quán)利要求109的方法，其中哺乳動物受試者已經(jīng)有過B細胞疾病復發(fā)。
114.權(quán)利要求109的方法，其中哺乳動物受試者是無免疫應答的。
115.產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20的單克隆抗體的方法，包括(a)在足以引起抗體反應的條件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳動物；(b)從所述哺乳動物收集抗體產(chǎn)生細胞；(c)將抗體產(chǎn)生細胞與培養(yǎng)的永生化細胞融合以形成產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞；(d)在足以產(chǎn)生單克隆抗體的條件下培養(yǎng)雜交瘤細胞；和(e)從培養(yǎng)物回收特異結(jié)合CD20的單克隆抗體。
116.權(quán)利要求115的方法，其中哺乳動物是小鼠。
117.權(quán)利要求115的方法，其中抗體產(chǎn)生細胞是B細胞。
118.權(quán)利要求115的方法，其中永生化細胞是骨髓瘤細胞。
119.權(quán)利要求115的方法，進一步包括分離能夠產(chǎn)生抗CD20單克隆抗體的雜交瘤細胞系的步驟。
120.通過權(quán)利要求115的方法產(chǎn)生的單克隆抗體。
121.權(quán)利要求120的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段。
122.產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20的單克隆抗體的方法，包括(a)在足以引起抗體反應的條件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳動物；(b)從所述哺乳動物收集產(chǎn)生特異性結(jié)合CD20的抗體的細胞；(c)從所述抗體產(chǎn)生細胞分離免疫球蛋白編碼基因；(d)將所述免疫球蛋白編碼基因?qū)爰毎援a(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細胞；(e)在足以使免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯和單克隆抗體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化細胞；和(e)從培養(yǎng)物中回收特異性結(jié)合CD20的單克隆抗體。
123.包含編碼重鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的重鏈包含含有選自HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-25和MB20-11的mAb的CDR3區(qū)或者與HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-25或MB20-11的CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR3區(qū)的可變區(qū)。
124.包含編碼重鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的重鏈包含含有選自HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-25和MB20-11的mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)或者分別與HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5、HB20-25或MB20-11的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的可變區(qū)。
125-包含編碼重鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的重鏈具有選自SEQ ID NO2(HB20-1)、SEQ ID NO4(HB20-3)、SEQ ID NO6(HB20-4)、SEQ ID NO8(HB20-5)、SEQ ID NO10(HB20-25)和SEQ IDNO22(MB20-11)的重鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10或SEQ ID NO22具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的可變區(qū)。
126.包含編碼輕鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的輕鏈包含含有選自HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5和HB20-25的mAb的CDR3區(qū)或者與HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5或HB20-25的CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR3區(qū)的可變區(qū)。
127.包含編碼輕鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的輕鏈包含含有選自HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5和HB20-25的mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)或者分別與HB20-1、HB20-3、HB20-4、HB20-5或HB20-25的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的可變區(qū)。
128.包含編碼輕鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的輕鏈包含含有選自SEQ ID NO30(HB20-1)、SEQ ID NO32(HB20-3)、SEQ IDNO34(HB20-4)、SEQ ID NO36(HB20-5)和SEQ ID NO38(HB20-25)的輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ IDNO36或SEQ ID NO38具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的可變區(qū)。
129.包含權(quán)利要求123的所分離核酸的載體。
130.包含權(quán)利要求124的所分離核酸的載體。
131.包含權(quán)利要求125的所分離核酸的載體。
132.包含權(quán)利要求126的所分離核酸的載體。
133.包含權(quán)利要求127的所分離核酸的載體。
134.包含權(quán)利要求128的所分離核酸的載體。
135.包含權(quán)利要求123的所分離核酸的細胞。
136.包含權(quán)利要求124的所分離核酸的細胞。
137.包含權(quán)利要求125的所分離核酸的細胞。
138.包含權(quán)利要求126的所分離核酸的細胞。
139.包含權(quán)利要求127的所分離核酸的細胞。
140.包含權(quán)利要求128的所分離核酸的細胞。
141.包含編碼重鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的重鏈包含含有選自MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-14、MB20-16和MB20-18的mAb的CDR3區(qū)或者與MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-14、MB20-16或MB20-18的CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR3區(qū)的可變區(qū)。
142.包含編碼重鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的重鏈包含含有選自MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-14、MB20-16和MB20-18的mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)或者分別與MB20-1、MB20-2、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-11、MB20-14、MB20-16或MB20-18的CDR1、CDR2或CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR1、CDR2或CDR3區(qū)的可變區(qū)。
143.包含編碼重鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的重鏈包含含有選自SEQ ID NO12(MB20-1)、SEQ ID NO14(MB20-2)、SEQ IDNO16(MB20-7)、SEQ ID NO18(MB20-8)、SEQ ID NO20(MB20-10)、SEQID NO22(MB20-11)、SEQ ID NO24(MB20-14)、SEQ ID NO26(MB20-16)和SEQ ID NO28(HB20-18)的重鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO12、SEQ IDNO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26或SEQ ID NO28具有至少80％氨基酸序列相似性的重鏈可變區(qū)的可變區(qū)。
144.包含編碼輕鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的輕鏈包含含有選自MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-13、MB20-14和MB20-18的mAb的CDR3區(qū)或者與MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-13、MB20-14或MB20-18的CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR3區(qū)的可變區(qū)。
145.包含編碼輕鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的輕鏈包含含有選自MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-13、MB20-14和MB20-18的mAb的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)或者分別與MB20-1、MB20-2、MB20-3、MB20-7、MB20-8、MB20-10、MB20-13、MB20-14或MB20-18的CDR1、CDR2或CDR3區(qū)具有至少80％氨基酸序列相似性的CDR1、CDR2或CDR3區(qū)的可變區(qū)。
146.包含編碼輕鏈的核苷酸序列的分離的核酸，其中所述的輕鏈包含含有選自SEQ ID NO40(MB20-1)、SEQ ID NO42(MB20-2)、SEQ IDNO44(MB20-3)、SEQ ID NO46(MB20-7)、SEQ ID NO48(MB20-8)、SEQID NO50(MB20-10)、SEQ ID NO52(MB20-13)、SEQ ID NO54(MB20-14)和SEQ ID NO56(MB20-18)的輕鏈可變區(qū)或者與SEQ ID NO40、SEQ IDNO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54或SEQ ID NO56具有至少80％氨基酸序列相似性的輕鏈可變區(qū)的可變區(qū)。
147.包含權(quán)利要求141的所分離核酸的載體。
148.包含權(quán)利要求142的所分離核酸的載體。
149.包含權(quán)利要求143的所分離核酸的載體。
150.包含權(quán)利要求144的所分離核酸的載體。
151.包含權(quán)利要求145的所分離核酸的載體。
152.包含權(quán)利要求146的所分離核酸的載體。
153.包含權(quán)利要求141的所分離核酸的細胞。
154.包含權(quán)利要求145的所分離核酸的細胞。
155.包含權(quán)利要求143的所分離核酸的細胞。
156.包含權(quán)利要求144的所分離核酸的細胞。
157.包含權(quán)利要求145的所分離核酸的細胞。
158.包含權(quán)利要求146的所分離核酸的細胞。
159.在哺乳動物受試者體內(nèi)消除B細胞的方法，包括施用權(quán)利要求3的mAb或抗原結(jié)合片段，進一步包括施用抗CD22或抗CD19抗體。
160.特異性結(jié)合CD20的抗人CD20mAb或其抗原結(jié)合片段，其中mAb或其抗原結(jié)合片段的重鏈CDR3區(qū)包含氨基酸序列FYXYXXX1YGAX2XXY。
161.權(quán)利要求160的mAb抗原結(jié)合片段，進一步包含含有氨基酸序列NXXXX的重鏈CDR1區(qū)。
162.權(quán)利要求161的mAb抗原結(jié)合片段，進一步包含含有氨基酸序列XHFWXX3XWX的輕鏈CDR3區(qū)。
163.在可要用載體中包含權(quán)利要求160的mAb或抗原結(jié)合片段的藥物組合物。
164.在可要用載體中包含權(quán)利要求161的mAb或抗原結(jié)合片段的藥物組合物。
165.在可要用載體中包含權(quán)利要求162的mAb或抗原結(jié)合片段的藥物組合物。
166.權(quán)利要求163的藥物組合物，進一步包含增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物。
167.權(quán)利要求164的藥物組合物，進一步包含增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物。
168.權(quán)利要求165的藥物組合物，進一步包含增強單核細胞或巨噬細胞功能的化合物。
169.在哺乳動物受試者體內(nèi)消除B細胞的方法，包括施用權(quán)利要求163的藥物組合物。
170.在哺乳動物受試者體內(nèi)消除B細胞的方法，包括施用權(quán)利要求164的藥物組合物。
171.在哺乳動物受試者體內(nèi)消除B細胞的方法，包括施用權(quán)利要求165的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合CD20的單克隆抗體和其抗原結(jié)合片段，以及包含它們的藥物組合物。本發(fā)明進一步提供了如在消除B細胞的方法中或者在治療B細胞疾病中使用單克隆抗體、抗原結(jié)合片段和藥物組合物的方法。還提供了用于生產(chǎn)單克隆抗體的細胞、核酸和方法。
文檔編號C12N5/20GK1802388SQ200480016092
公開日2006年7月12日 申請日期2004年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者T·F·特德, J·烏奇達, Y·哈馬古奇, J·C·波 申請人:杜克大學