抗lag-3結(jié)合蛋白的制作方法
【專利說明】抗LAG-3結(jié)合蛋白 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因（LAG-3)且引起表達(dá)LAG-3的活化的T細(xì)胞的 耗竭的抗原結(jié)合蛋白，特別是抗體，編碼此類抗原結(jié)合蛋白的多核苷酸，含有所述抗原結(jié)合 蛋白的藥物組合物，和所述抗原結(jié)合蛋白在治療和/或預(yù)防與致病性T細(xì)胞的參與相關(guān)的 疾病中的用途。
[0002] 發(fā)明背景 淋巴細(xì)胞活化基因-3 (LAG-3)是調(diào)節(jié)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、增殖和活化的負(fù)共刺激受體（Sierro S等人；Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15:91-101)。免疫球蛋白超家族成員，LAG-3 是⑶4樣蛋白，其，像⑶4,結(jié)合至MHC II類分子，但與⑶4相比親和力高兩倍且位點(diǎn)不同 (Huard B 等人，（1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:5744-9)。除了施加非常不同的 功能（CD4是正共刺激分子）以外，兩種受體也被差異調(diào)節(jié)。CD4在所有成熟CD4+ T細(xì)胞 的表面上組成型表達(dá)，其中僅小部分駐留于細(xì)胞內(nèi)，而大部分LAG-3分子保留于細(xì)胞中接 近于微管組織中心，且僅誘導(dǎo)隨后抗原特異性T細(xì)胞活化（Woo SR等人，（2010) Eur J Immunol 40:1768-77)。LAG-3作為T-細(xì)胞應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)劑的作用基于用LAG-3敲除小鼠的 研究和在體外和體內(nèi)系統(tǒng)模型中使用阻斷性抗LAG-3抗體（Sierro S等人，Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Hannier S 等人（1998)，J Tmmunol 161: 4058-65; Macon-Lemaitre L等人（2005)，Immunology 115: 170-8; Workman CJ等人（2003)，Eur J Tmmunol 33:970-9)。
[0003] 在細(xì)胞表面，LAG-3被表達(dá)為二聚體，這對(duì)于形成穩(wěn)定的MHC II類結(jié)合位點(diǎn)是 需要的（Huard B 等人（1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 5744-9)?？扇苄问降?LAG-3也存在于健康供體和結(jié)核病和癌癥患者的血清中（Lienhardt C等人（2002)，Eur J Immunol 32: 1605-13; Triebel F 等人（2006) .Cancer Lett 235: 147-53)，且該形式可 以與 LAG-3+ T 細(xì)胞的數(shù)目相關(guān)（Siawaya J 等人（2008). J of Infection 56: 340-7)。 LAG-3作為增強(qiáng)的淋巴細(xì)胞耗竭劑的目標(biāo)抗原的關(guān)鍵屬性是其當(dāng)與目前在臨床上的其他藥 劑（即，Campath? (T/B 細(xì)胞）、Amevive (最多 CD45R0+ T-細(xì)胞）或 Rituxan (B-細(xì)胞）） 相比時(shí)的相對(duì)選擇性表達(dá)概況。很少分子已經(jīng)被鑒定為人中的體內(nèi)T細(xì)胞活化的持續(xù)標(biāo) 志物。這些包括 LAG-3、0X40、MHC II 類、CD69、CD38、ICOS 和 CD40L。然而，除了 LAG-3 和 0X40以外，這些分子中的大多數(shù)也在人天然T regs或其他細(xì)胞類型上組成型表達(dá)。LAG-3 表達(dá)于健康人中的小比例的T細(xì)胞（約1-4%)和類似比例的NK細(xì)胞中（Baixeras E等人 (1992)，J Exp Med 176: 327-37; Huard B 等人（1994)，Immunogenetics 39: 213-7)〇用抗⑶3活化后，約30-80%的⑶4+和⑶8+ T細(xì)胞在24至48小時(shí)之內(nèi)表達(dá)LAG-3 ;該百分 比在 IL2、IL7 和 IL12 存在的情況下增加 （Sierro S 等人，Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Bruniquel D 等人（1998)，Immunogenetics 48: 116-24)。用回憶 抗原（即，CMV或破傷風(fēng)類毒素）抗原特異性刺激之后，大多數(shù)活化的T細(xì)胞是LAG-3+。此 外，在人中，LAG-3表達(dá)于健康人血液中的CD4+ CD25+ FoxP3+ T regs的亞群（1-10%)上。 該群體似乎在體外通過細(xì)胞接觸和ILlO依賴性機(jī)制是功能抑制的，因此，可以代表最近活 化的天然或誘導(dǎo)的 T regs 的群體[Camisaschi C, Casati C, Rini F 等人（2010) .LAG-3 expression defines a subset of CD4+CD25highFox3P + regulatory T cells that are expanded at tumour sites. J. Immunol 184: 6545-51)。LAG-3 已經(jīng)在造血譜系的其他細(xì) 胞類型（諸如漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和NKT細(xì)胞）上，但僅在小鼠中，且主要在活化之 后，被檢測(cè)到（Sierro S, Romero P & Speiser D; Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101)。
[0004] LAG-3+ T細(xì)胞的耗竭可用于治療或預(yù)防T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的免疫炎性病癥。在其中 大多數(shù)自體反應(yīng)細(xì)胞在疾病部位被自身抗原長(zhǎng)期活化和/或在外周重新循環(huán)的自身免疫 疾病中，耗竭性抗原結(jié)合蛋白的短時(shí)程可以選擇性耗竭該自身免疫性T細(xì)胞庫，提供長(zhǎng)期 緩解。該方法的優(yōu)先性已經(jīng)用泛淋巴細(xì)胞耗竭性抗體Campath?得到證明，其中在多發(fā)性 硬化癥試驗(yàn)中，單一 12mg注射與標(biāo)準(zhǔn)治療相比使復(fù)發(fā)率降低74% (The CAMMS223 Trial Investigators (2008)，N Engl JMed. 359:1786-801)。由于 LAG-3 與 CD52 (Campath? 的目標(biāo)）相比更選擇性的表達(dá)，所以對(duì)幼稚和靜息記憶性T細(xì)胞和自然T regs庫的影響應(yīng) 當(dāng)減少。預(yù)計(jì)這導(dǎo)致改善的治療指數(shù)、維持效力，但感染和惡性腫瘤以及與Campath?相關(guān) 的自身免疫的發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)降低。此外，在狒狒結(jié)核菌素皮膚攻擊模型中，LAG-3靶向嵌合抗 體IMP731在外周中和皮膚攻擊部位處均介導(dǎo)LAG-3+ T-細(xì)胞的耗竭，導(dǎo)致結(jié)核菌素皮膚攻 擊響應(yīng)的降低（Poirier N 等人（2011)，Clin Exp Tmmunol 164: 265-74)。在進(jìn)一步研 究中，LAG-3多克隆抗體從大鼠心臟同種異體移植物中耗竭LAG-3+浸潤性T細(xì)胞且延長(zhǎng)這 些移植物的存活（Haudebourg T 等人（2007)，Transplantation 84: 1500-1506)。
[0005] 本領(lǐng)域需要結(jié)合LAG-3且引起LAG-3+活化的T細(xì)胞的耗竭的抗原結(jié)合蛋白，特別 是人源化抗體，其可用于治療自身免疫疾病，諸如銀肩病、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā) 性膽汁性肝硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、SjSgren氏綜合征、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎和 自身免疫性肝炎；感染性疾病、過敏性疾病和癌癥。
[0006] 發(fā)明概述 本發(fā)明廣泛涉及抗原結(jié)合蛋白，諸如人源化的抗體，其結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因 3(LAG-3)，且能夠引起LAG-3+活化的T細(xì)胞的耗竭。更具體地，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白可 以包含 SEQ ID No. 5 的 CDRL1、CDRL2 和 CDRL3。
[0007] 本文描述的抗原結(jié)合蛋白可以用于治療或預(yù)防與致病性T細(xì)胞的參與相關(guān)的疾 病，例如自身免疫疾病，諸如銀肩病、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、系 統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、SjSgren氏綜合征、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎和自身免疫性肝炎；感 染性疾病、過敏性疾病和癌癥。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白和 任選一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體的藥物組合物。
【附圖說明】
[0008] 圖1 :抗體與表達(dá)LAG-3的EL4 (A)和活化的人⑶3+ T細(xì)胞⑶的結(jié)合。Synagis， 針對(duì)無關(guān)目標(biāo)的單克隆抗體，用作陰性對(duì)照。
[0009] 圖2 :腹膜內(nèi)施用的無巖藻糖基化的抗體H5L7BW對(duì)注射后24小時(shí)從腹膜腔取回 的共同施用的活化的人PBMC的影響。A)共同施用I X IO7個(gè)活化的人PBMC和5mg/kg對(duì)照 抗體（H5L7BW或Campath?)之后24小時(shí)的人CD4+LAG-3+和CD8 +LAG-3+ T細(xì)胞的定量（供體 A :對(duì)照 n=2 ;H5L7BW n=2，MabCampath n=l ;供體 B :對(duì)照 n=2 ;H5L7BW n=3，Campath? n=2)。 B)總 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞的定量。（*ρ〈0·001)。
[0010] 圖3 :無巖藻糖基化的抗體H5L7BW及其非ADCC增強(qiáng)的變體H5L7對(duì)腹膜內(nèi)共同施 用且在注射后5小時(shí)從腹膜腔取回的活化的人PBMC的影響。Α)共同施用I X IO7個(gè)活化 的人PBMC和5mg/kg對(duì)照抗體（H5L7BW或H5L7)之后5小時(shí)的人CD4+LAG-3+和CD8 +LAG-3+T細(xì)胞的定量（n=3/組）。抝總⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的定量。（*p〈0. 001)。
[0011] 圖4 :將人活化的PBMC施用于SCID小鼠的腹膜中之前18小時(shí)靜脈內(nèi)施用的無 巖藻糖基化的抗體H5L7BW的影響。A) i.p.注射5 X IO6個(gè)（n=l/組）或I X IO7個(gè)0/N (n=4/組）活化的人PBMC之后5小時(shí)的人⑶4+LAG-3+和⑶8 +LAG-3+T細(xì)胞的定量。B)總 CD4+和CD8+ T細(xì)胞的定量。注射活化的人PBMC之前18小時(shí)靜脈內(nèi)注射5mg/kg H5L7BW或 對(duì)照抗體。（*Ρ〈〇· 001，# Ρ=〇· 0052)。
[0012] 圖5 :將活化的人PBMC施用于SCID小鼠的腹膜中之前18小時(shí)靜脈內(nèi)施用的 H5L7BW、H5L7 或頂 Ρ731 (5mg/kg)的影響。A) i.p.注射 I X IO7 個(gè)（η=4/組）活化的人 PBMC之后5小時(shí)的人⑶4+LAG-3+和⑶8 +LAG-3+T細(xì)胞的定量。注射人PBMC之前18小時(shí)靜脈 內(nèi)注射5mg/kg H5L7BW、H5L7、頂P731或?qū)φ湛贵w。B)總CD4+和CD8+ T細(xì)胞的定量。注射 活化的人PBMC之前18小時(shí)靜脈內(nèi)注射5mg/kg LAG-3耗竭性抗體或?qū)φ湛贵w。（*p〈0. 001)。
[0013] 發(fā)明詳述 本發(fā)明廣泛涉及結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因3(LAG-3)的抗原結(jié)合蛋白，且更具體地，可以 引起LAG-3+活化的T細(xì)胞的耗竭的抗原結(jié)合蛋白。
[0014] 如本文所使用的術(shù)語"抗原結(jié)合蛋白"是指能夠結(jié)合LAG-3的抗體及其片段。除 非另外指明，如本文所使用的術(shù)語"LAG-3"是指淋巴細(xì)胞活化基因3。術(shù)語"LAG-3"在其 范圍內(nèi)包括，但不限于作為例如活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的表面上的二聚物表達(dá)的 LAG-3(在本領(lǐng)域中也已知為，例如，CD223)，和例如人血清中發(fā)現(xiàn)的LAG-3的可溶形式，在 本文中稱為"sLAG-3"。除非另外指明，本文提及"sLAG-3"和"LAG-3"是人多肽。在一個(gè)具 體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合作為例如活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的表面上 的二聚物表達(dá)的LAG-3的形式（在本領(lǐng)域中也已知為，例如，CD223)的抗原結(jié)合蛋白。更 具體地，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合活化的T細(xì)胞上表達(dá)的LAG-3且能夠引起所述活化的T細(xì)胞 的耗竭的抗原結(jié)合蛋白。
[0015] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合LAG-3且包含來自SEQ ID No. 5的⑶RLl (其 中位置27E是脯氨酸）的抗原結(jié)合蛋白。
[0016] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO. 1的⑶RLl的抗原結(jié)合蛋白。
[0017] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合LAG-3且包含來自SEQ ID No. 5的 ⑶RLl的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含來自SEQ ID NO. 5的⑶RL2和 /或⑶RL3或其⑶R變體。
[0018] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包含SEQ ID NO. 2的⑶RL2和/或SEQ ID NO. 3的⑶RL3或其⑶R變體的抗原結(jié)合蛋白。
[0019] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合LAG-3且包含來自SEQ ID No. 5的 ⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的抗原結(jié)合蛋白。
[0020] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包含來自SEQ ID NO 10的⑶RH1、⑶RH2和 CDRH3或其CDR變體中的一種或多種的抗原結(jié)合蛋白。
[0021] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含來自SEQ ID NO. 5的⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3和 來自SEQ ID NO: 10的CDRH1、CDRH2和CDRH3的抗原結(jié)合蛋白。
[0022] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包含選自SEQ ID NO. 6的CDRH1、SEQ ID NO. 7的⑶RH2和SEQ ID NO. 8的⑶RH3的一個(gè)或多個(gè)⑶R或其⑶R變體的抗原結(jié)合蛋白。
[0023] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包含以下CDR的抗原結(jié)合蛋白： CDRLl: SEQ ID NO. 1 CDRL2: SEQ ID NO. 2 CDRL3: SEQ ID NO. 3 CDRHl: SEQ ID NO. 6 CDRH2: SEQ ID NO. 7 CDRH3: SEQ ID NO. 8。
[0024] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白包含來自SEQ ID NO. 5的⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的可變輕鏈，和包含來自SEQ ID NO: 10的⑶RHl、⑶RH2和 ⑶RH3的可變重鏈。
[0025] 在一個(gè)具體方面，所述抗原結(jié)合蛋白是人源化抗體，任選為IgG。
[0026] 如本文所使用，術(shù)語"⑶R"是指抗原結(jié)合蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列。這些 是免疫球蛋白重和輕鏈的高變區(qū)。在免疫球蛋白的可變部分中存在三個(gè)重鏈和三個(gè)輕鏈 CDRs (或 CDR 區(qū)）。
[0027] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，存在⑶R序列的多種編號(hào)常規(guī)；Chothia (Chothia 等人（1989) Nature 342: 877-883)、Kabat (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed. , U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))、AbM (University of Bath) 和 Contact (University College London)。用 Kabat、Chothia、AbM 和接觸方法中的至少 兩種可以測(cè)定最小重疊區(qū)，以提供"最小結(jié)合單元〃。最小結(jié)合單元可以是CDR的亞部分。 抗體的結(jié)構(gòu)和蛋白折疊可以意指其他殘基是CDR序列的考慮部分，并且將由技術(shù)人員理解 為這樣。
[0028] 除非另有說明和/或不存在具體鑒定的序列，本文提及"⑶R"、"⑶RL1"、"⑶RL2"、 " CDRL3 "、" CDRH1"、" CDRH2 "、" CDRH3 "是指根據(jù)表1中鑒定的任何已知規(guī)則編號(hào)的氨基酸序 列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，利用的編號(hào)規(guī)則是Kabat規(guī)則。本文提及"位置27E"是指使 用Kabat編號(hào)規(guī)則定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的位置27E存在的氨基酸。技術(shù)人員將理解， 該位置具有根據(jù)其他已知規(guī)則（諸如，例如，Chothia)的等效物，其中位置27E等效于位置 30B〇
[0029] 下表1代表使用每種編號(hào)規(guī)則對(duì)每個(gè)CDR或結(jié)合單元的一種定義。應(yīng)該注意，一 些CDR定義可以根據(jù)所用的單獨(dú)出版物而變化。
[0030] 轟1
[0031] 如本文使用的術(shù)語"⑶R變體"是指已經(jīng)修飾至少一個(gè)，例如1、2或3個(gè)氨基酸取 代、缺失或添加的CDR，其中修飾的包含CDR變體的抗原結(jié)合蛋白基本上保留了抗原結(jié)合蛋 白修飾前的生物學(xué)特性。應(yīng)當(dāng)理解的是，可以單獨(dú)或與另一個(gè)CDR組合修飾可以修飾的每 個(gè)CDR。在一個(gè)方面，所述修飾是取代，特別是保守取代，例如如表2中顯示。
[0033] 例如，在變體⑶R中，最小結(jié)合單位的氨基酸殘基可以維持相同，但包含⑶R作為 Kabat或Chothia定義的部分的側(cè)翼殘基可以被保守的氨基酸殘基取代。
[0034] 包含如上所述的修飾的CDR或最小結(jié)合單位的此類抗原結(jié)合蛋白在本文中可以 被稱為"功能性CDR變體"或"功能性結(jié)合單位變體"。
[0035] 本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白能夠結(jié)合sLAG-3。在一個(gè)方面，抗原結(jié)合蛋白-sLAG-3相 互作用的平衡解離常數(shù)（KD)為IOnM或更小，諸如InM或更小，例如IpM至300、400、500pM 或500pM至InM。技術(shù)人員將理解KD數(shù)值越小，結(jié)合就越強(qiáng)。KD的倒數(shù)（8卩，1/KD)是具有 單位M1的平衡結(jié)合常數(shù)（KA)。技術(shù)人員將理解，KA數(shù)值越大，則結(jié)合越強(qiáng)。
[0036] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠以小于InM、例如IpM至300pM的KD (當(dāng)分別使用 SEQ ID N0:51和52的重組人或食蟹猴L(fēng)AG-3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（E⑶）通過Biacore?表面等 離子共振分析來測(cè)定時(shí)）結(jié)合重組LAG-3的抗