專利名稱：具有增加的2－酮基－d－葡萄糖酸累積的代謝工程細(xì)菌株的制作方法
1.發(fā)明背景本發(fā)明涉及通過(guò)失活內(nèi)源性膜結(jié)合2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))而改變細(xì)菌宿主細(xì)胞以積累2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid(2-KDG))的方法，2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶在失活之前催化2-KDG轉(zhuǎn)化為2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-diketogluconate(2，5-DKG))。本發(fā)明具體地涉及增強(qiáng)2-DKG在泛菌屬(Pantoea)菌株中生物合成地積累2-KDG和如此產(chǎn)生的2-KDG的用途。
商業(yè)上所需的許多產(chǎn)品，如L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)的中間產(chǎn)物，已經(jīng)在遺傳工程宿主細(xì)胞中生物催化地產(chǎn)生。盡管在許多情形下，生物轉(zhuǎn)化(bioconversion)的期望終產(chǎn)物可以是L-抗壞血酸(ASA，維生素C)，但是ASA中間產(chǎn)物存在獨(dú)立的用途，并且這些ASA中間產(chǎn)物可以是生物轉(zhuǎn)化的期望產(chǎn)物。
用于生物催化地將普通代謝物如葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)锳SA中間產(chǎn)物的一個(gè)方法顯示于

圖1。通過(guò)氧化步驟，葡萄糖被轉(zhuǎn)變?yōu)?-KDG和2，5-DKG(USP 3,790,444)。也參照產(chǎn)生ASA中間產(chǎn)物2-酮基-L-葡萄糖酸(2-KLG)的生物轉(zhuǎn)化方法，其公開(kāi)于Lazarus等人(1989，″Vitamin CBioconversion via a Recombinant DNA Approach″，GENETICS ANDMOLECULAR BIOLOGY OF INDUSTRIAL MICROORGANISMS，American Society for Microbiology，Washington D.C.由C.L.Hershberger編輯)。碳源向2-KLG的這種生物轉(zhuǎn)化(bioconversion)涉及各種中間產(chǎn)物，并且，酶促過(guò)程和輔助因子(cofactor)依賴的2，5-DKG還原酶活性(2，5-DKG reductase(DKGR))相關(guān)。此外，已經(jīng)應(yīng)用重組DNA技術(shù)，在草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)中以單一的發(fā)酵步驟(singlefermentative step)，將葡萄糖生物轉(zhuǎn)化為2-KLG(Anderson，S.等人，(1985)Science 230144-149)。
在此申請(qǐng)中，發(fā)明人關(guān)注于，增加ASA中間產(chǎn)物2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)在細(xì)菌宿主中的積累。優(yōu)選地，能夠通過(guò)內(nèi)源性膜結(jié)合2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))的酶活性、將2-KDG轉(zhuǎn)化為2，5-DKG的細(xì)菌宿主細(xì)胞以失活2-KDGDH酶的方式被改變。
然后，可以將本發(fā)明包括的改變的細(xì)菌宿主中累積的2-KDG，用于各種工業(yè)和商業(yè)用途。例如，可以將2-KDG用于溶解磷酸鹽或作為除草劑化合物(herbicidal compounds)合成中的中間產(chǎn)物，如USP3,981,860中描述的那些。此外，可以將2-KDG進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為所需的終產(chǎn)物，如異抗壞血酸(erythorbic acid)。異抗壞血酸是ASA的立體異構(gòu)體，也被稱為D-異抗壞血酸(D-araboascorbic acid)。根據(jù)Reichstein和Grussner(1934)Helv.Chim.Acta 17311-328的方法，可以化學(xué)地合成此化合物。異抗壞血酸是公知的食品添加劑、防腐劑和抗氧化劑，并且被用于工業(yè)用途和特種化學(xué)品應(yīng)用中。
2.發(fā)明概述本發(fā)明涉及，通過(guò)在碳源如葡萄糖或其它普通微生物代謝物的存在下，培養(yǎng)改變的宿主細(xì)胞，在細(xì)菌宿主細(xì)胞中積累2-KDG的方法。更具體地，通過(guò)失活編碼膜結(jié)合2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))的內(nèi)源性基因，2-KDG不轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g產(chǎn)物2，5-DKG，2-KDG在改變的宿主細(xì)胞中累積。隨后，可以從改變的宿主細(xì)胞分離出2-KDG，并將其用于各種商業(yè)用途或?qū)⑵溥M(jìn)一步用于產(chǎn)生其它所需化合物如異抗壞血酸。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主細(xì)胞中累積2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid(2-KDG))的方法，包括a)獲取改變的細(xì)菌細(xì)胞，這是通過(guò)失活細(xì)菌宿主細(xì)胞中2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))活性所需的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因?qū)嵤┑?，其中?xì)菌宿主細(xì)胞能夠在碳源如葡萄糖的存在下產(chǎn)生2，5-DKG；b)在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)改變的細(xì)菌細(xì)胞，以產(chǎn)生2-KDG，和c)使2-KDG累積。在一種實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括回收2-KDG的步驟。在第二種實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括將2-KDG轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙a(chǎn)物，具體地是異抗壞血酸的步驟。在第三種實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞選自歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、醋桿菌屬(Acetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)、泛菌屬(Pantoea)、桿菌屬(Bacillus)和埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是泛菌屬細(xì)胞，更具體地是P.citrea。在第四種實(shí)施方案中，一個(gè)基因被失活。在第五種實(shí)施方案中，兩個(gè)基因被失活。在第六種實(shí)施方案中，內(nèi)源性2-KDGDH由三個(gè)亞基組成。在第七種實(shí)施方案中，亞基包括在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列，和與其具有至少95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸序列。在第八種實(shí)施方案中，SEQID NO.4所代表的亞基被失活，其被稱為亞基B。在第九種實(shí)施方案中，通過(guò)刪除多個(gè)或多個(gè)基因，失活一個(gè)或多個(gè)基因。
在第二方面，本發(fā)明涉及，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的改變的細(xì)菌細(xì)胞。在一種實(shí)施方案中，改變的細(xì)菌細(xì)胞是泛菌屬細(xì)胞。
在又一方面，本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主細(xì)胞中累積2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid(2-KDG))的方法，包括a)通過(guò)失活在細(xì)菌宿主細(xì)胞中編碼內(nèi)源性2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconatedehydrogenase(2-KDGDH))的操縱子，獲得改變的細(xì)菌細(xì)胞，其中細(xì)菌宿主細(xì)胞能夠在葡萄糖存在下產(chǎn)生2，5-DKG；和操縱子包括脫氫酶基因和細(xì)胞色素c基因；b)在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)改變的細(xì)菌細(xì)胞，以產(chǎn)生2-KDG，和c)允許2-KDG累積。在一種實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括回收2-KDG的步驟。在第二種實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將2-KDG轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙a(chǎn)物，具體地是異抗壞血酸的步驟。
在另一方面，本發(fā)明涉及遺傳上改變的泛菌屬細(xì)胞，其包括遺傳工程的(genetically engineered)失活的操縱子，其中所述操縱子在失活之前編碼內(nèi)源性2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconatedehydrogenase(2-KDGDH))。在一種實(shí)施方案中，泛菌屬細(xì)胞是Pantoescitrea細(xì)胞。在第二種實(shí)施方案中，內(nèi)源性2-KDGDH酶由三個(gè)基因編碼，其中一個(gè)基因編碼SEQ ID NO.2的氨基酸序列或與其有至少90％同一性的氨基酸序列。在第三種實(shí)施方案中，失活是通過(guò)完全或部分刪除編碼2-KDGDH的一個(gè)或多個(gè)基因?qū)嵤┑?。在第四種實(shí)施方案中，改變的泛菌屬細(xì)胞進(jìn)一步包括失活的葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白、無(wú)功能的葡萄糖激酶基因、無(wú)功能的葡萄糖酸激酶基因、過(guò)表達(dá)的葡萄糖脫氫酶基因、過(guò)表達(dá)的葡萄糖酸脫氫酶基因或其組合。
在又一方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其編碼有2-KDGDH活性的酶。在一種實(shí)施方案中，分離的多核苷酸編碼由三個(gè)亞基組成的酶，三個(gè)亞基稱為亞基A、亞基B和亞基C，其中亞基A具有SEQ ID NO.2列出的氨基酸序列或與其有至少96％同一性的序列；亞基B具有SEQ IDNO.4列出的氨基酸序列，亞基C具有SEQ ID NO.6列出的氨基酸序列或與其有至少94％同一性的序列。在第二種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO.2的氨基酸或與其有至少96％同一性的氨基酸。在第三種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO.4的氨基酸序列。在第四種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO.6的氨基酸或與其有至少94％同一性的氨基酸。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多核苷酸具有SEQ ID NO.1的核酸序列。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸具有SEQ ID NO.3的核酸序列。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多核苷酸具有SEQ IDNO.5的核酸序列。
在又一方面，本發(fā)明涉及，在嚴(yán)緊的雜交條件下，用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5的至少20個(gè)連續(xù)的序列作為探針，以發(fā)現(xiàn)同源序列的方法，其中同源序列編碼有2-KDGDH活性的蛋白。在一種實(shí)施方案中，同源序列將編碼和SEQ ID NO.2的序列有至少96％的氨基酸序列同一性的蛋白。在另一種實(shí)施方案中，同源序列將編碼和SEQ IDNO.6的序列有至少94％的氨基酸序列同一性的蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，SEQ ID NO.3的同源序列將編碼脫氫酶蛋白。在另一種實(shí)施方案中，SEQ ID NO.5的同源序列將編碼細(xì)胞色素C蛋白。
3.附圖簡(jiǎn)述圖1描述了生成抗壞血酸(ascorbic acid(ASA))的氧化途徑(oxidative pathway)。E1代表葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase(GDH))；E2代表葡萄糖酸脫氫酶(gluconic acid dehydrogenase(GADH))；E3代表2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconic dehydrogenase(2-KDGDH或2-KGDH))；和E4代表2，5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶(2，5-diketo-D-gluconic acid reductase(2，5DKGR))。
圖2提供了一些代謝路徑的框架示意圖，所述路徑涉及細(xì)菌宿主細(xì)胞如Pantoea citrea中的葡萄糖同化作用。該圖顯示了糖酵解途徑、戊糖途徑和三羧酸循環(huán)(tricarboxylic(TCA))途徑之間的最共同聯(lián)系。下列縮寫被用于圖中并貫穿應(yīng)用在本公開(kāi)中葡萄糖脫氫酶(glucosedehydrogenase)＝(GDH)；葡萄糖酸脫氫酶(gluconic acid hydrogenase)＝(GADH)；2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconate)＝(2-KDG)；2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconic acid hydrogenase)＝(2-KDGDH或2-KGDH)；2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-diketogluconate)＝(2，5-DKG)；2，5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶(2，5-diketo-D-gluconic acid reductase)＝(2，5DKGR)；2-酮基-L-葡萄糖酸(2-keto-L-gluconic acid)＝(2-KLG)；2-酮基還原酶(2-ketoreductase)＝(2KR)；5-酮基還原酶(5-ketoreductase)＝(5KR)；5-酮基-D-葡萄糖酸(5-keto-D-gluconate)＝(5-KDG)；艾杜糖酸脫氫酶(idonate dehydrogenase)＝(IADH)；葡萄糖激酶(glucokinase)＝(GlkA)和葡萄糖酸激酶(gluconokinase)＝(GntK)。根據(jù)本發(fā)明，由2-KDGDH失活影響的酶促步驟標(biāo)示為“X”。標(biāo)有“T”的方框代表推定的轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporters)。
圖3A描述了核酸序列(SEQ ID NO.1)，其編碼Pantoea citrea2-KDGDH酶的亞基A的氨基酸序列。
圖3B描述了由SEQ ID NO.1編碼的亞基A的氨基酸序列(SEQ IDNO.2)。
圖4描述了核酸序列(SEQ ID NO.3)，其編碼Pantoea citrea2-KDGDH酶的亞基B的氨基酸序列。
圖5描述了由SEQ ID NO.3編碼的亞基B的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。
圖6描述了核酸序列(SEQ ID NO.5)，其編碼Pantoea citrea2-KDGDH酶亞基C的氨基酸序列。
圖7描述了由SEQ ID NO.5編碼的亞基C的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。
圖8是框架圖，說(shuō)明了用于失活Pantoea citrea中2-KDGDH操縱子的方法。A代表染色體2-KDGDH操縱子，它由三個(gè)可讀框(open readingframes(orfs))組成。Orf 2418代表亞基A，orf 2419代表亞基B，orf 2420代表亞基C。箭頭表示引物的方向，其中1代表引物KDGF2，2代表引物KDGF1，3代表引物KDGR1，4代表引物KDGR2。B代表應(yīng)用引物2和3得到的PCR產(chǎn)物，含有限制性酶切位點(diǎn)Hpa I和Sca I。來(lái)自B的PCR產(chǎn)物和loxP-cat序列盒(C)應(yīng)用，并被轉(zhuǎn)化入非-復(fù)制的R6K載體中，載體具有卡那霉素抗性基因(D)。將載體轉(zhuǎn)化入泛菌屬宿主，使載體的同源區(qū)和宿主染色體中2-KDGDH操縱子編碼區(qū)的同源區(qū)之間發(fā)生同源重組。也參考實(shí)施例1。
圖9說(shuō)明了由本發(fā)明包含的改變的細(xì)菌株(WKDG4)和未改變的(等基因野生型)菌株(139-2a/Ps-)形成2-KDG和2，5-DKG，如實(shí)施例2中進(jìn)一步論述，其中 代表WKDG4中的2-KDG累積； 代表139-2a/Ps-中的2-KDG累積； 代表WKDG4中的2，5-DKG累積 代表139-2a/Ps-中的2，5-DKG累積。
4.優(yōu)選實(shí)施方案詳述如無(wú)其它指明，本發(fā)明實(shí)踐將應(yīng)用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的已知范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到詳細(xì)說(shuō)明，如MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人編輯，1987和每年更新)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait編輯，1984)；PCRTHEPOLYMERASE CHAIN REACTION，(Mullis等人編輯，1994)；MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY，第二版(A.L.Demain等人編輯，1999)；MANUALOF METHODS FOR GENERAL BACTERIOLOGY(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.Briggs Philips編輯)，第210-213頁(yè)American Society forMicrobiology，Washington，DC，和BIOTECHNOLOGYA TEXTBOOKOF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，(Thomas D.Brock)第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass。
A.定義如無(wú)其它指明，此處應(yīng)用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員普遍理解的相同意義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，John Wiley和Sons，New York(1994)和Hale和Marham，THEHARPER DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，New York(1991)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中應(yīng)用的許多術(shù)語(yǔ)的普通詞典。
如此處所應(yīng)用，“2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-keto-D-gluconatedehydrogenase(2-KDGDH))”和“具有2-KDGDH活性的酶”(an enzymehaving 2-KDGDH activity)是指一種膜結(jié)合蛋白，它能夠催化細(xì)菌細(xì)胞中的2-KDG在氧化途徑中轉(zhuǎn)變?yōu)?，5-DKG，氧化途徑起始于葡萄糖或葡萄糖酸。術(shù)語(yǔ)2-KDGDH具有功能上的限定并且是指任何酶，所述酶是膜結(jié)合的、并催化2-KDG轉(zhuǎn)變?yōu)?，5-DKG。
“脫氫酶蛋白(dehydrogenase protein)”或“具有脫氫酶活性的蛋白”(a protein having dehydrogenase activity)是指催化氧化還原反應(yīng)的酶，所述反應(yīng)涉及從一個(gè)底物去除氫并將其轉(zhuǎn)移至另一分子，通常轉(zhuǎn)移至輔酶，如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide(NAD))、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotine adeninedinucleotidephosphate(NADP))和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide(FAD))。
“細(xì)胞色素c蛋白”(cytochrome C protein)是指一種電子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它具有一個(gè)或幾個(gè)血紅素基團(tuán)，其通過(guò)一個(gè)或多個(gè)，通常是兩個(gè)硫醚鍵結(jié)合到該蛋白上，硫醚鍵含有半胱氨酸殘基的巰基。第五個(gè)血紅素鐵配體通常由組氨酸氨基酸殘基提供。(Pettigrew等人(1987)CYTOCHROMES c.BIOLOGICAL ASPECTS，Springer Verlag，Berlin；Moore等人(1990)CYTOCHROMES CEVOLUTIONARY，STRUCTURAL AND PHYSIOCHEMICAL ASPECTS.SpringerVerlag，Berlin；和Ambler(1991)Biochim.Biophys.Acta.105842-47)。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“碳源”(carbon source)包括微生物通常應(yīng)用的合適的碳底物，如6碳糖，包括但不限于葡萄糖(G)、古洛糖、乳糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，均為D型或L型，或6碳糖的組合，如葡萄糖和果糖，和/或6碳糖酸，包括但不限于2-酮基-L-葡萄糖酸、艾杜糖酸(idonic acid(IA))、葡萄糖酸(gluconic acid(GA))、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gulonic acid(2KDG))、5-酮基-D-葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸、2，5-二酮基-L-葡萄糖酸、2，3-L-二酮基葡萄糖酸、脫氫抗壞血酸、異抗壞血酸(erythorbic acid(EA))和D-甘露糖酸。
當(dāng)指操縱子、基因或蛋白時(shí)，術(shù)語(yǔ)“無(wú)功能的”(non-functional)、“失活的”(inactivated)和“失活”(inactivation)意味著操縱子、基因或蛋白的已知正常功能或活性被消除、破壞或高度降低。導(dǎo)致操縱子、基因或蛋白無(wú)功能的失活包括這樣的方法如刪除、突變、取代、中斷(interruption)或插入核酸序列。
如此處所應(yīng)用，操縱子或基因的“刪除”(deletion)是指刪除一個(gè)或多個(gè)基因的完整編碼序列、刪除一個(gè)或多個(gè)基因的部分編碼序列、刪除調(diào)控區(qū)、刪除翻譯信號(hào)或刪除編碼序列包括一個(gè)或多個(gè)基因的側(cè)翼序列。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“基因”(gene)意味著參與產(chǎn)生多肽的DNA片段并包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)以及各個(gè)編碼片段(外顯子)之間的間隔序列(內(nèi)含子)。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”(polynucleotide)和“核酸”(nucleic acid)，在此可交換應(yīng)用，是指聚合形式的任意長(zhǎng)度的核苷酸，或是核糖核苷酸或是脫氧核糖核苷酸。這些術(shù)語(yǔ)包括單鏈、雙鏈或三鏈DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜交體、或包括嘌呤和嘧啶堿基或其它天然的、化學(xué)的、生物化學(xué)修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。下列是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組的多核苷酸、分支的多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物、uracyl、其它糖和連接基團(tuán)如氟代核糖(fluororibose)和硫代物(thioate)、和核苷酸分支。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中斷。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“操縱子”(operon)意味著兩個(gè)或多個(gè)基因，從一個(gè)共同的啟動(dòng)子作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位被轉(zhuǎn)錄。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括操縱子的基因是連續(xù)的基因(contiguous genes)。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”(promoter)是指核酸序列，其功能是指導(dǎo)下游基因或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄。
“處于轉(zhuǎn)錄調(diào)控下”(under transcriptional control)或“被轉(zhuǎn)錄調(diào)控的”(transcriptionally controlled)是本領(lǐng)域中熟知的術(shù)語(yǔ)，提示多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄取決于其被可操縱地連接于有助于轉(zhuǎn)錄起始或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件，所述多核苷酸序列通常是DNA序列。
“可操縱地連接”(operably linked)是指并列(juxtaposition)，其中元件處于使它們起作用的排列中?！疤幱诜g調(diào)控下”(under translationalcontrol)是本領(lǐng)域中熟知的術(shù)語(yǔ)，提示形成信使RNA后發(fā)生的調(diào)控過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”(over expressed)意味著在宿主細(xì)胞中的相同基因產(chǎn)物的拷貝數(shù)目增加。
如此處所應(yīng)用，當(dāng)描述蛋白和編碼它們的基因時(shí)，用于基因的詞語(yǔ)不大寫并且是斜體的，即，glkA。用于蛋白的詞語(yǔ)通常不斜體并且第一個(gè)字母是大寫的，即，GlkA。
術(shù)語(yǔ)“蛋白”(protein)和“多肽”(polypeptide)在此處可互換應(yīng)用。
如此處所應(yīng)用，“抗壞血酸(ASA)中間產(chǎn)物(ascorbic acid(ASA)intermediate)”意味著葡萄糖酸(gluconate(GA))；2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gulonic acid(2KDG))、2，5-二酮基-D-葡萄糖酸(2，5-diketo-D-gulonate(2，5-DKG))；2-酮基-L-葡萄糖酸(2-keto-L-gulonicacid(2-KLG))；和L-艾杜糖酸(L-idonic acid(IA))。這些化合物中的一些的化學(xué)式顯示于圖1。
如此處所應(yīng)用，宿主細(xì)胞的“氧化途徑”(oxidative pathway)意味著宿主細(xì)胞包括至少一種氧化碳源的酶，碳源如D-葡萄糖和/或其代謝物。宿主細(xì)胞中的氧化途徑可以包括一種、兩種、三種或多種酶。氧化途徑的一個(gè)例子是由葡萄糖脫氫酶活性從葡萄糖形成葡萄糖酸。氧化途徑的另一個(gè)例子是由葡萄糖脫氫酶和葡萄糖酸脫氫酶活性從葡萄糖形成2-KDG。氧化途徑的另一個(gè)例子是經(jīng)葡萄糖脫氫酶、葡萄糖酸脫氫酶和2-KDGDH活性從葡萄糖形成2，5-DKG。
如此處所應(yīng)用，宿主細(xì)胞的“分解代謝途徑”(catabolic pathway)意味著，宿主細(xì)胞包括至少一種酶，其產(chǎn)生至少一種代謝中間產(chǎn)物。經(jīng)常地，代謝中間產(chǎn)物的形成和ATP、NADPH、或NADH的形成相偶聯(lián)，例如，由氧化磷酸化碳源如D-葡萄糖和/或其代謝物形成。宿主細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑意味著，宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞胞漿中包括至少一種酶的活性。在一些實(shí)施方案中，分解代謝途徑包括兩種、三種或多種酶的活性。分解代謝途徑包括但不限于糖酵解、戊糖途徑和TCA循環(huán)途徑。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌”(bacteria)是指微小生物體的任何集合，所述生物體是原核的，即，缺少膜包繞的細(xì)胞核和細(xì)胞器。所有細(xì)菌由液態(tài)膜包繞，液態(tài)膜調(diào)節(jié)物質(zhì)流入和流出細(xì)胞。剛性的細(xì)胞壁完全包繞細(xì)菌并位于膜外。有許多不同種類的細(xì)菌，其中的一些包括但不限于桿菌(Bacillus)、鏈霉菌(Streptomyces)、假單胞菌(Pseudomonas)、和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族的菌株。
如此處所應(yīng)用，家族“腸桿菌科”是指細(xì)菌株，其具有革蘭氏陰性和兼性厭氧的一般特征。對(duì)于產(chǎn)生ASA中間產(chǎn)物，優(yōu)選的腸桿菌科菌株是那些能夠從D-葡萄糖或碳源產(chǎn)生2，5-二酮基-D-葡萄糖酸的菌株，所述碳源能夠被該菌株轉(zhuǎn)變?yōu)镈-葡萄糖。(Kageyama等人，International J.Sys.Bacteriol.42203(1992))。包含在腸桿菌科家族中的是歐文氏菌屬、腸桿菌屬、葡萄糖桿菌屬、克雷伯菌屬、埃希菌屬和泛菌屬。在本發(fā)明中，用于生成2-KDG的優(yōu)選的腸桿菌科發(fā)酵菌株是泛菌屬菌種。
泛菌屬包括成團(tuán)泛菌(P.agglomerans)、分散泛菌(P.dispersa)、P.punctata、P.citrea、P.terrea、P.ananas和P.stewartii，特別是Pantoeacitrea。Pantoea citrea可以從ATCC(Manassas，VA)，例如ATCC編號(hào)39140獲得。Pantoea citrea有時(shí)被稱為Erwinia citreus或Acetobactercerinus。因此，意圖在于，泛菌屬包括重新分類的種，包括但不限于Pantoea citrea或Acetobacter cerinus。
如此處所應(yīng)用，家族“桿菌”(Bacillus)是指棒狀的細(xì)菌株，具有革蘭氏陽(yáng)性的一般特征并能夠在氧存在下產(chǎn)生抗性內(nèi)生孢子(resistantendospores)。桿菌的例子包括枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、緩慢芽孢桿菌(B.lentus)、環(huán)狀芽胞桿菌(B.circulans)、B.lautus、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、凝結(jié)芽胞桿菌(B.coagulans)、蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)和B.brevis。
根據(jù)本發(fā)明的“改變的細(xì)菌宿主”(altered bacterial host)或“改變的細(xì)菌細(xì)胞”(altered bacterial cell)是指細(xì)菌細(xì)胞，其能夠通過(guò)內(nèi)源性2-KDGDH酶的作用將2-KDG酶促轉(zhuǎn)變?yōu)?，5-DKG，其中使內(nèi)源性2-KDGDH酶無(wú)功能。在一種實(shí)施方案中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)的未改變的細(xì)菌宿主細(xì)胞中累積的(或短暫累積的(transiently accumulated)2-KDG水平相比，改變的細(xì)菌細(xì)胞將具有更高水平的累積的2-KDG。
根據(jù)本發(fā)明的“未改變的細(xì)菌細(xì)胞”(unaltered bacterial cell)或“未改變的細(xì)菌宿主”(unaltered bacterial host)是細(xì)菌細(xì)胞，其中內(nèi)源性2-KDGDH未被失活，并且2-KDGDH酶保持導(dǎo)致2-KDG氧化為2，5-DKG的功能。
“更高水平的累積的2-KDG”(Higher level of accumulated 2-KDG)是指在基本上相同的條件下培養(yǎng)時(shí)，與相應(yīng)的未改變的細(xì)菌宿主細(xì)胞中的2-KDG量相比，改變的細(xì)菌細(xì)胞中的2-KDG量。例如，更高水平的累積的2-KDG可以是比相應(yīng)的未改變的細(xì)菌宿主中產(chǎn)生的2-KDG的量增加至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％或更多。累積水平的增加可以用多種方式表達(dá)，包括以重量百分?jǐn)?shù)(產(chǎn)物gm/底物gm)或gm/L每時(shí)間單位。更高水平的累積的2-KDG由一個(gè)或多個(gè)基因的失活產(chǎn)生，所述基因是產(chǎn)生功能性2-KDGDH所需的基因。
如此處所應(yīng)用，“染色體整合”(chromosomal intergration)是一種方法，通過(guò)該方法，導(dǎo)入的多核苷酸被并入宿主細(xì)胞染色體。方法優(yōu)選地經(jīng)同源重組發(fā)生。
如此處所應(yīng)用，“改變”(modifying)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白水平或酶活性是指，控制培養(yǎng)期間產(chǎn)生的蛋白水平或酶活性，以致于水平如所需地增加或降低。
如此處所應(yīng)用，當(dāng)指核酸或多核苷酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“修飾的”(modified)意味著，相比于野生型核酸，該核酸已經(jīng)以某些方式被改變，如經(jīng)突變；刪除部分或全部核酸；或經(jīng)操縱地連接于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)實(shí)施。如此處所應(yīng)用，當(dāng)指代核酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“突變”(mutation)是指核酸中的任何改變，以致于該核酸的產(chǎn)物被部分或全部失活。突變的例子包括但不限于點(diǎn)突變、移碼突變和編碼2-KDGDH的部分或全部基因的刪除。
如此處所應(yīng)用，“所需產(chǎn)物”(desired product)是指所需化合物，碳底物被生物轉(zhuǎn)化為該化合物。代表性的所需產(chǎn)物是葡萄糖酸、2-KDG；和5-酮基-葡萄糖酸。
如此處所應(yīng)用，當(dāng)用于指代細(xì)胞、核酸或蛋白時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組子”(combinant)是指，已經(jīng)通過(guò)導(dǎo)入異源核酸或改變天然核酸修飾了細(xì)胞、核酸或蛋白，或者該細(xì)胞來(lái)源于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)天然(非重組)形式細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的基因，或表達(dá)天然基因，所述天然基因否則表達(dá)不足或根本不表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的細(xì)菌宿主細(xì)胞是重組細(xì)胞。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的”(endogenous)是指宿主中天然發(fā)生的核酸或核酸所編碼的蛋白。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“異源的”(heterogenous)是指宿主中不天然發(fā)生的核酸或蛋白序列。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“分離的”(isolated)或“純化的”(purified)是指酶、核酸、蛋白、肽或輔助因子，其從天然聯(lián)系的至少一種成分中被去除。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“載體”(vector)是指多核苷酸構(gòu)建體，其被設(shè)計(jì)為將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、序列盒和類似物質(zhì)。
與另一序列有一定百分?jǐn)?shù)(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％或99％)的“序列同一性”(sequence identity)的多核苷酸或多肽意味著，在比較兩個(gè)序列時(shí)，當(dāng)聯(lián)配時(shí)，這些百分?jǐn)?shù)的堿基或氨基酸是相同的?？梢杂帽绢I(lǐng)域中已知的軟件程序來(lái)確定這種聯(lián)配和同源性百分?jǐn)?shù)或序列同一性，例如描述于CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人編輯，1987)增刊30，7.7.18部分中的那些程序。優(yōu)選的聯(lián)配程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，Pennsylvania)，優(yōu)選地應(yīng)用缺省參數(shù)，如下錯(cuò)配＝2；開(kāi)放空位(open gap)＝0；延伸空位(extend gap)＝2?？梢詰?yīng)用的另一序列軟件程序是TFastA Data Searching Program，可以從SequenceAnalysis Software Package版本6.0(Genetic Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，WI)得到。
本領(lǐng)域充分理解的是，糖類的酸性衍生物，可以以各種電離狀態(tài)存在，這取決于它們的周圍環(huán)境(media)，不論是在溶液中，或是如果以固體形式，在其被制備的溶液之外。應(yīng)用術(shù)語(yǔ)如，例如，葡萄糖酸指定這種分子，意圖于包括所指的有機(jī)分子的所有電離狀態(tài)。因此，例如，“葡萄糖酸”(gluconic acid)和“葡萄糖酸”(gluconate)是指相同的有機(jī)部分，并且不意圖于指定具體的電離狀態(tài)或化學(xué)形式。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”(culturing)是指在反應(yīng)器中促發(fā)酵地將碳底物生物轉(zhuǎn)化為所需產(chǎn)物。生物轉(zhuǎn)化意味著，用碳底物接觸微生物，以轉(zhuǎn)化碳底物為所需產(chǎn)物。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“包括”(comprising)及其同源詞以其包含的意義被應(yīng)用；即，等價(jià)于術(shù)語(yǔ)“包括”(including)和其相應(yīng)的同源詞。
如果上下文沒(méi)有清楚地指明，“一個(gè)”(A)、“一個(gè)”(an)、和“那個(gè)“(the)包括復(fù)數(shù)形式。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)運(yùn)體”(transporter)是指催化分子穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜(internal cell membrane)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體催化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)體催化葡萄糖酸的轉(zhuǎn)運(yùn)并且也催化其它糖酸分子或糖-酮酸穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
“細(xì)胞質(zhì)”(cytoplasma)或“細(xì)胞質(zhì)的”(cytoplasmic)是指，在細(xì)胞內(nèi)膜(inner cell membrane)之內(nèi)。細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)膜外是指細(xì)胞質(zhì)膜相反側(cè)的細(xì)胞區(qū)域，包括但不限于周質(zhì)(periplasma)。內(nèi)部的或內(nèi)膜(internal orinner membrance)(和有時(shí)稱為周質(zhì)膜)是指將細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)分隔的屏障。細(xì)胞內(nèi)(intracellular)是指靠近細(xì)胞溶質(zhì)的膜側(cè)的細(xì)胞部分。細(xì)胞內(nèi)包括細(xì)胞溶質(zhì)。
如此處所應(yīng)用，詞語(yǔ)“葡萄糖激酶”(glucokinase)(E.C.-2.7.1.2)意味著磷酸化D-葡萄糖或L-葡萄糖6位碳的酶，例如GlkA。
如此處所應(yīng)用，詞語(yǔ)“葡萄糖酸激酶”(gluconokinase)(E.C.-2.7.1.12)意味著磷酸化D-葡萄糖酸或L-葡萄糖酸6位碳的酶，例如GntK。
B.優(yōu)選實(shí)施方案多核苷酸和蛋白本申請(qǐng)涉及編碼2-KDGDH酶的分離的多核苷酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌菌種含有2-KDGDH酶。國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟命名委員會(huì)(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)(NC-IUBMB)對(duì)2-KDGDH指定編號(hào)為EC 1.1.99.4。更具體地，2-KDGDH屬于中等鏈脫氫酶/還原酶(MDR)(medium-chaindehydrogenase/reductase)種類的酶。這是大的酶超家族，有大約一千(1000)個(gè)成員。2-KDGDH已經(jīng)被歸類在MDR支類中，其顯示多羥基化合物脫氫酶(PDH)活性。(Nordling等人，(2002)Eur.J.Biochem.2694267-4276)。
2-KDGDH酶優(yōu)選地是膜結(jié)合酶，分離自泛菌屬、醋桿菌屬、歐文氏菌屬或葡萄糖桿菌屬菌種，特別是來(lái)自Pantoea citrea或Pantoeaagglomerans。已經(jīng)顯示，這些菌種從2-KDG和葡萄糖酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生2-5-DKG。
在一種實(shí)施方案中，2-KDGDH酶是多聚復(fù)合體，由包括三個(gè)基因的操縱子編碼。優(yōu)選地，三個(gè)基因是相鄰的并且是作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位被組織起來(lái)的。操縱子的第一個(gè)基因編碼稱為亞基A的蛋白。操縱子的第二個(gè)基因編碼稱為亞基B的蛋白，其中亞基B是脫氫酶蛋白。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，亞基B脫氫酶是黃素蛋白。黃素蛋白是含有核黃素的衍生物作為輔基的酶。操縱子的第三個(gè)基因編碼稱為亞基C的蛋白，其中亞基C是細(xì)胞色素c蛋白。
在一種實(shí)施方案中，分離的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的亞基A蛋白，或和SEQ ID NO.2具有至少93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸。在另一種實(shí)施方案中，分離的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的亞基B脫氫酶蛋白，或和SEQ ID NO.4具有至少93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸。在又一種實(shí)施方案中，分離的多核苷酸編碼亞基C細(xì)胞色素C蛋白，其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列，或和SEQ ID NO.2具有至少93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚地意識(shí)到，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性以及一個(gè)氨基酸可以由多于一個(gè)密碼子來(lái)編碼。這些變化作為本發(fā)明的一部分包含于此。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，編碼2-KDGDH復(fù)合體亞基A的分離的多核苷酸包括SQE ID NO.1的核酸序列；編碼被稱為亞基B的脫氫酶蛋白的分離的多核苷酸包括SEQ ID NO.3的核酸序列，編碼被稱為亞基C的細(xì)胞色素C蛋白的分離的多核苷酸包括SEQ ID NO.5的核酸序列。
本發(fā)明也提供了方法，用SEQ ID Nos.1、3或5中列出的多核苷酸序列作為探針，在其它微生物體中檢測(cè)2-KDGDH。在一種實(shí)施方案中，來(lái)自SEQ ID Nos.1、3或5中任一一個(gè)的至少10、15、20、25、30、40、50或更多的連續(xù)序列可以被用作探針，以檢測(cè)編碼2-KDGDH酶復(fù)合體中亞基A、亞基B或亞基C的多核苷酸。在另一種實(shí)施方案中，來(lái)自SEQID Nos.1、3或5中任一一個(gè)的至少20個(gè)連續(xù)序列可以被用作探針。進(jìn)一步地，來(lái)自SEQ ID No.3的至少10、15、20、25、30、40、50或更多的連續(xù)序列可以被用作探針。此外，用于本發(fā)明的寡核苷酸探針可以包括編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID Nos.2、4或6中至少5、10、15、20、25、30或更多的連續(xù)氨基酸殘基。
鑒定其它細(xì)菌微生物，特別是泛菌屬菌種中發(fā)現(xiàn)的2-KDGDH酶或2-KDGDH酶亞基的方法，在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括雜交研究方法。因此，例如，在高度嚴(yán)緊條件下和圖3A、4或6中的序列雜交的核酸序列或其互補(bǔ)序列，也可以編碼起2-KDGDH酶亞基A、亞基B或亞基C作用的蛋白。雜交包括核酸鏈通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合于互補(bǔ)鏈的過(guò)程。高度嚴(yán)緊條件是本領(lǐng)域中已知的，參見(jiàn)例如，Maniatis等人，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，第二版(1989)和SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，編者Ausubel等人。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境下將是不同的。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異地雜交。核酸雜交的詳細(xì)指南參見(jiàn)Tijssen，TECHNIQUESIN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATIONWITH NUCLEIC ACID PROBES，OVERVIEW of Principles ofHybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assay(1993)。對(duì)于指定的離子強(qiáng)度和pH下的特定序列，通常被選出的嚴(yán)緊條件是，比熱熔點(diǎn)(thermal melting point)Tm低大約5至10度。Tm是50％的探針互補(bǔ)于靶序列，平衡地雜交于靶序列的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)緊條件是那些條件，其中鹽濃度在pH7.0至8.3下低于大約1.0M鈉離子，典型地是大約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽類)，并且對(duì)于短的探針(例如，對(duì)于10至50個(gè)核苷酸)，溫度至少為30℃，對(duì)于長(zhǎng)的探針(例如，多于50個(gè)核苷酸)，是至少60℃。也可以通過(guò)加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺獲得嚴(yán)緊條件。在另一種實(shí)施方案中，應(yīng)用較低嚴(yán)緊的雜交條件。例如，可以應(yīng)用中度或低度嚴(yán)緊條件。
也可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)篩選同源序列，參見(jiàn)Chen等人，(1995)Biotechniques 18(4)609-612。其它方法包括蛋白質(zhì)生物分析或免疫分析技術(shù)，其包括基于膜的、基于溶液的、或基于芯片的技術(shù)，用于檢測(cè)和/或定量核酸或蛋白質(zhì)。
進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及分離的細(xì)胞色素c蛋白，其具有SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列，和分離的脫氫酶，其具有SEQ ID NO.4中列出的氨基酸序列。亞基A具有SEQ ID NO.1中列出的核酸序列，其編碼SEQID NO.2中列出的氨基酸序列，相對(duì)于Pujol及Kado(2000)J.Bacteriol.1822230-2237中公開(kāi)的編碼酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶亞基前體的多核苷酸，分別具有89.6％的同一性和95.8％的同一性。亞基B具有SEQ IDNO.3中列出的核酸序列，其編碼SEQ ID NO.4中列出的氨基酸序列，相對(duì)于Pujol及Kado(2000)supra中公開(kāi)的編碼酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶亞基前體的多核苷酸，分別具有89.9％的同一性和99.8％的同一性。亞基C具有SEQ ID NO.5中列出的核酸序列，其編碼SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列，相對(duì)于Pujol及Kado(2000)supra中公開(kāi)的編碼酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶亞基前體的多核苷酸，具有85.5％的同一性和94.3％的同一性。Pujol及Kado中公開(kāi)的推斷的2-酮基葡萄糖酸脫氫酶操縱子的核苷酸序列，已經(jīng)保存在GenBank中，收錄編號(hào)是AF131202。
脫氫酶分析方法是公知的，可以采用Bouvet等人(1989)Int.J.Syst.Bacteriol.3961-67中描述的方法，應(yīng)用補(bǔ)充有2KDG的MGY中生長(zhǎng)的細(xì)胞。也參考Shinagawa和Ameyama(1982)Meth.Enzymol.89194-198。
用于檢測(cè)葡萄糖酸、2-KDG和2，5-DKG的進(jìn)一步的定性分析方法是本領(lǐng)域中已知的，例如，可以通過(guò)應(yīng)用HPLC得到。
失活2-KDGDH酶的方法大體而言，使染色體基因無(wú)功能的方法在本領(lǐng)域中是已知的，許多這些技術(shù)可以被用來(lái)失活具有2-KDGDH活性的酶。這些方法中的一些包括遺傳工程技術(shù)，其它方法包括技術(shù)如篩選和誘變。
通過(guò)失活組成2-KDGDH酶復(fù)合體的三個(gè)亞基中的任一，可以使根據(jù)本發(fā)明的2-KDGDH酶無(wú)功能。這些亞基被稱為亞基A、具有脫氫酶活性的亞基B、和亞基C(細(xì)胞色素c蛋白)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，使亞基B無(wú)功能，此亞基的失活導(dǎo)致2-KDGDH酶失活。在另一種實(shí)施方案中，使亞基C無(wú)功能，此亞基的失活導(dǎo)致2-KDGDH酶失活。在另一種實(shí)施方案中，使亞基A無(wú)功能，此亞基的失活導(dǎo)致2-KDGDH酶失活。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使兩個(gè)亞基無(wú)功能，例如，亞基B和亞基C，這導(dǎo)致2-KDGDH酶失活。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，失活基因如刪除基因的表達(dá)產(chǎn)物，可以是截短的蛋白，只要該蛋白在生物活性上有變化。生物活性的變化可以是改變的活性，但是優(yōu)選地是生物活性的喪失。
一種優(yōu)選的失活方法是刪除至少一個(gè)基因，所述基因編碼2-KDGDH酶的亞基之一。在一種實(shí)施方案中，欲被刪除的基因編碼亞基B，其為脫氫酶。在另一種實(shí)施方案中，欲被刪除的基因編碼亞基C，其為細(xì)胞色素C蛋白。在另一種實(shí)施方案中，欲被刪除的基因編碼亞基A。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以刪除兩個(gè)基因，例如，編碼亞基B和亞基C的基因。優(yōu)選地，編碼亞基B的基因是通過(guò)刪除而失活的。在所有情況下，只要留在染色體中的序列對(duì)于待決基因的生物活性來(lái)說(shuō)是過(guò)短的，刪除可以是部分的。
根據(jù)本發(fā)明，刪除2-KDGDH酶亞基的一種方法包括構(gòu)建載體，載體包括所需亞基編碼序列的同源側(cè)翼區(qū)。側(cè)翼區(qū)可以包括5’和3’末端的從大約1bp至大約500bp。載體的側(cè)翼區(qū)可以大于500bp，在一些實(shí)施方案中，可以包括包含2-KDGDH操縱子的其它基因，其也導(dǎo)致這些基因的失活或刪除。載體構(gòu)建體可以被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，例如，通過(guò)轉(zhuǎn)化，隨后，被整合入宿主細(xì)胞染色體。最終的結(jié)果是，導(dǎo)入的DNA引起編碼2-KDGDH的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的刪除，因此導(dǎo)致無(wú)功能的2-KDGDH酶。
例如，如圖8所示，首先通過(guò)將含有2-KDGDH亞基B(2-KDGDH-B)基因的DNA片段克隆入載體，構(gòu)建失活序列盒。為了失活2-KDGDH基因，將抗生素抗性基因(即，氯霉素，CmR基因)克隆入2-KDGDH基因中發(fā)現(xiàn)的唯一的限制性酶切位點(diǎn)。將抗生素標(biāo)記插入2-KDGDH-B基因中斷了其正常編碼序列。用非-復(fù)制的R6K載體如pGP704，經(jīng)同源重組將失活的序列盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞染色體(Miller等人(1988)J.Bacterial 1702575-2583)。序列盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞染色體是通過(guò)宿主細(xì)胞含有CmR選出的。一旦確證2-KDGDH-B基因的失活，從2-KDGDH-B編碼區(qū)去除CmR，在編碼區(qū)中留下中斷區(qū)(interrupting spacer)(在本例子中，其包括一個(gè)拷貝的loxP位點(diǎn))，使編碼區(qū)失活(Palmeros等人，(2000)Gene 247255-264)。
在另一種實(shí)施方案中，失活是通過(guò)插入實(shí)施的。插入失活包括中斷染色體編碼區(qū)。例如，當(dāng)編碼亞基B的基因是欲失活的基因，DNA構(gòu)建體將包括編碼亞基B的核酸序列，其中編碼序列被選擇標(biāo)記(selective marker)中斷。選擇標(biāo)記將位于亞基B編碼序列的片段(sections)的每一側(cè)的側(cè)翼。DNA構(gòu)建體和宿主染色體中亞基B基因基本上同一的序列對(duì)齊(align)，在雙交換事件(double crossover event)中，通過(guò)插入選擇標(biāo)記，亞基B基因被失活。可選擇標(biāo)記是指能夠在宿主微生物中表達(dá)的基因，其允許容易地選出那些含有載體的宿主。這種可選擇標(biāo)記的例子包括但不限于抗生素抗性基因如紅霉素、卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素。上面通常描述的方法可以用編碼亞基A、亞基B或亞基C的序列實(shí)施。
可以在細(xì)菌生物體中用作載體的質(zhì)粒是公知的，參見(jiàn)Maniais等人，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，第二版(1989)和MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第二版(Sambrook等人，1989)和Harwood及Cutting編輯的MOLECULARBIOLOGY METHODS FOR BACILLUS(1990)中的Bron，S，第三章，Plasmids，John Wiley & Sons Ltd。
用于將編碼非天然發(fā)生蛋白或酶的多核苷酸重組導(dǎo)入腸桿菌科菌株的質(zhì)粒是RSF1010，其為可移動(dòng)(mobilizable)但不自動(dòng)轉(zhuǎn)移(selftransmissible)的質(zhì)粒，具有在寬范圍的細(xì)菌宿主，包括革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中復(fù)制的能力。(Frey等人，1989，The MolecularBiology of IncQ Plasmids.在Thomas，(編者)，PROMISCUOUSPLASMIDS OF GRAM NEGATIVE BACTERIA中，Academic Press，London，第79-94頁(yè))。Frey等人報(bào)道了發(fā)現(xiàn)影響PSF1010移動(dòng)特性的三個(gè)區(qū)(Frey等人(1992)Gene 113101-106)。
在另一種實(shí)施方案中，失活是通過(guò)以質(zhì)粒為載體，在單交換事件(single crossover event)中插入實(shí)施的。例如，編碼2-KDGDH亞基如亞基B的染色體基因，和包括SEQ ID NO.3序列或基因編碼序列一部分以及選擇標(biāo)記的質(zhì)粒并列，所述染色體基因具有SEQ ID NO.3公開(kāi)的核酸序列。選擇標(biāo)記可以位于基因編碼序列之內(nèi)，或在與該基因分離的質(zhì)粒部分上。載體可以被整合入細(xì)菌染色體，通過(guò)將載體插入編碼序列，使基因失活。
失活也可以通過(guò)基因突變發(fā)生。突變基因的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于化學(xué)誘變、定點(diǎn)突變、產(chǎn)生隨機(jī)突變、和雙鏈缺口方法(gapped-duplex approaches)。(USP 4,760,025；Moring等人，Biotech.2646(1984)；和Kramer等人，NucleicAcids Res.129441(1984))。另一公知方法包括應(yīng)用經(jīng)轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)誘變(random mutagenesis)(Miller J.H.(1992)A SHORT COURSE IN BACTERIAL GENETICS，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York 372-380頁(yè))。誘變發(fā)生之后，可以用各種方法選出具有所需性質(zhì)的突變體，例如，在選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性分離。
在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建致突變載體(mutagenic vector)，所述載體含有多克隆位點(diǎn)序列盒，其優(yōu)選地包括至少一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，所述位點(diǎn)對(duì)于載體是唯一的，以協(xié)助容易地進(jìn)行核酸操作。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體也包括一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明，在改變的細(xì)菌株中，2-KDGDH酶失活將優(yōu)選地是穩(wěn)定的和不可恢復(fù)的失活。
宿主細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的細(xì)菌宿主細(xì)胞是腸桿菌科細(xì)胞。優(yōu)選的腸桿菌科宿主是大腸桿菌、克雷伯菌屬和泛菌屬細(xì)胞。特別優(yōu)選的泛菌屬細(xì)胞是P.citrea和P.aggolmerans。這些微生物的來(lái)源包括公立保藏單位如ATCC和商業(yè)來(lái)源。例如，ATCC保藏編號(hào)21998、13182和39140。進(jìn)一步參照見(jiàn)USP 5,032,514和Truesdell等人，(1991)J.Bacteriol.1736651-6656。桿菌屬的菌種也可以作為宿主細(xì)胞。包括無(wú)功能2-KDGDH酶的改變的細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是重組的宿主細(xì)胞。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的細(xì)菌細(xì)胞包括操縱子，操縱子包括編碼三個(gè)蛋白亞基的三個(gè)基因，亞基被稱為亞基A、亞基B和亞基C，所述本發(fā)明的改變的菌體細(xì)胞包括失活的2-KDGDH酶，其中2-KDGDH酶在失活之前能夠催化2-KDG轉(zhuǎn)變?yōu)?，5-DKG。修飾如刪除任何一個(gè)亞基或任一亞基的一部分，可以導(dǎo)致內(nèi)源性2-KDGDH無(wú)功能。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的是亞基C和/或亞基B，以獲得本發(fā)明的改變的菌體細(xì)胞。優(yōu)選地，亞基B是通過(guò)或是刪除部分編碼區(qū)或是插入失活被修飾的。
在一種實(shí)施方案中，是脫氫酶蛋白的亞基B是由多核苷酸編碼的，所述多核苷酸具有SEQ ID NO.3列出的序列或具有和SEQ ID NO.3序列至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或99％同一性的核酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，是細(xì)胞色素c蛋白的亞基C是由多核苷酸編碼的，所述多核苷酸具有SEQ ID NO.5列出的序列或具有和SEQ ID NO.5序列至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或99％同一性的核酸序列。
作為2-KDGDH酶失活的結(jié)果，不論失活是否是由于例如2-KDGDH酶復(fù)合體中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)亞基的失活或刪除，2-KDG向2，5DKG的轉(zhuǎn)變將被減少，并且2-KDG將在細(xì)胞環(huán)境中累積。根據(jù)本發(fā)明的這方面，相比于相應(yīng)的未改變的細(xì)菌宿主細(xì)胞，改變的細(xì)菌細(xì)胞將具有增加的或更高水平的累積2-KDG，其中2-KDG是被短暫積累的。
附加的基因修飾如上所述，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是重組的宿主細(xì)胞。對(duì)宿主細(xì)胞的修飾可以在2-KDGDH失活之前、同時(shí)或之后被認(rèn)識(shí)到?？梢詫?duì)染色體基因進(jìn)行修飾，修飾可以包括失活，如刪除或中斷內(nèi)源性染色體基因、導(dǎo)致內(nèi)源性染色體基因表達(dá)增加的修飾、和包含異源基因。
可以被并入本發(fā)明包含的細(xì)菌宿主細(xì)胞的附加修飾的更具體例子包括但不限于i)對(duì)編碼葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的修飾；ii)對(duì)編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的修飾(Peekhaus等人，1997，F(xiàn)ems Micro.Lett.147233-238)；iii)對(duì)編碼KDG轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因的修飾；iv)導(dǎo)致基因過(guò)表達(dá)的基因修飾，例如，葡萄糖脫氫酶基因的過(guò)表達(dá)、葡萄糖酸脫氫酶基因的過(guò)表達(dá)、或參與細(xì)胞色素c的生物發(fā)生(biogenesis)的基因如ccm基因的過(guò)表達(dá)(Kranz等人，(1996)Mol.Microbiol.293283-396)；v)對(duì)多核苷酸的修飾，所述多核苷酸使分解代謝途徑從氧化途徑中解偶聯(lián)，如通過(guò)失活在第六位碳上磷酸化D-葡萄糖或D-葡萄糖酸的酶，更特異地是失活己糖激酶基因、葡萄糖激酶基因或葡萄糖酸激酶基因即gntK和/或glkA實(shí)施，參照WO 02/081440；和vi)對(duì)編碼酶的基因的修飾，所述酶以2-KDG作為底物，例如，2-酮基-還原酶或2-酮基激酶。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的改變的細(xì)菌株將包括失活的gntK和/或失活的glkA基因。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的改變的細(xì)菌株將包括失活的葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。
在一些實(shí)施方案中，包括失活2-KDGDH的改變的細(xì)菌株可以附加地包括其它失活基因，例如，兩個(gè)失活基因、三個(gè)失活基因、四個(gè)失活基因、五個(gè)失活基因、六個(gè)失活基因或更多。失活的基因可以是彼此相鄰的，或可以位于細(xì)菌染色體的分別的區(qū)中。在一些情況下，失活的染色體基因可以具有必要的功能，但是在實(shí)驗(yàn)室條件下，該基因?qū)τ诩?xì)菌株的存活能力不是必要的。優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)室條件包括但不限于條件如在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)，在搖瓶中生長(zhǎng)，在平板培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或類似條件。
在一種實(shí)施方案中，包括失活2-KDGDH的根據(jù)本發(fā)明的改變的細(xì)菌細(xì)胞可以進(jìn)一步包括失活的葡萄糖激酶基因。在另一種實(shí)施方案中，可以將宿主細(xì)胞設(shè)計(jì)為，含有編碼酶的基因，已知所述酶影響葡萄糖或其它普通代謝物從已知包含它們的生物體中轉(zhuǎn)變?yōu)?-KDG或2-KLG。影響普通代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)?-KDG或2-KLG的例子是D-葡萄糖脫氫酶(Adachi，O.等人，(1980)Agric.Biol.Chem.，44301-308；Ameyama，M.等人，(1981)Agric.Biol.Chem.45851-861；Smith等人(1989)Biochem.J.261973；和Neijssel等人，(1989)Antonie Van Leauvenhoek 56(1)51-61)；和D-葡萄糖酸脫氫酶(Mcintire，W等人，(1985)Biochem.J.，231651-654；Shinagawa，E.等人，(1976)Agric.Biol.Chem.40475-483；Shinagawa，E.等人，(1978)Agric.Biol Chem.421055-1057；和Matsushita等人(1979)，J.Biochem.851173)；5-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(Shinagawa，E.等人，(1981)Agric.Biol.Chem.，451079-1085和Stroshane(1977)Biotechnol.BioEng.19(4)459)；和2，5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶(USP Nos5,795,761；5,376,544；5，583,025；4,757,012；4,758,514；5,008,193；5,004,690；和5,032,514)。在另一種實(shí)施方案中，可以將宿主細(xì)胞設(shè)計(jì)為，含有編碼酶的基因，所述酶將2-KDG轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌虡I(yè)上有用的產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的改變的細(xì)菌株將是重組的泛菌屬菌株，優(yōu)選地是P.citrea菌株。在一些實(shí)施方案中，重組的菌株將任選地包括或是單獨(dú)地或是聯(lián)合的失活的葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因；失活的葡萄糖激酶基因；失活的葡萄糖酸激酶基因；失活的甘油激酶基因；和失活的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系。如果葡萄糖酸不被轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)細(xì)胞膜，可以有更多的可利用葡萄糖酸，用于在氧化途徑中轉(zhuǎn)變?yōu)?-KDG。
回收、鑒定和純化ASA中間產(chǎn)物檢測(cè)ASA中間產(chǎn)物、ASA和ASA立體異構(gòu)體如異抗壞血酸(D-異抗壞血酸)、L-異抗壞血酸和D-木糖型抗壞血酸(D-xyloascorbic acid)的方法包括用2，6二氯吲哚酚(Burton等人(1979)J.Assoc.Pub.Analysts 17105)或其它合適的試劑進(jìn)行氧化還原滴定；用陰離子交換進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)；和電-氧化還原方法(eletro-redox procedures)(Pachia，(1976)Anal.Chem.48364)。技術(shù)人員將意識(shí)到，利用這些檢測(cè)方法中使用的操作(controls)。選擇性地，中間產(chǎn)物也可以直接從發(fā)酵肉湯或生物反應(yīng)器中制備并顆?；蚍湃胍簯B(tài)制劑中。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以將根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生和累積的2-KDG進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫惪箟难幔瑓⒁?jiàn)例如，Reichstein和Grussner，Helv.Chim.Acta.，17，311-328(1934)。
基因轉(zhuǎn)移用于細(xì)菌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是公知的，這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合?；蜣D(zhuǎn)移是將基因或多核苷酸轉(zhuǎn)移到一個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞中的過(guò)程，其中細(xì)菌吸收了外源加入的DNA。CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(第一卷，Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons，Inc.1987，第九章)中教導(dǎo)了普通的轉(zhuǎn)化方法，包括磷酸鈣法、用DEAE-Dextran轉(zhuǎn)化和電穿孔。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知在特定宿主細(xì)胞中導(dǎo)入核酸的各種轉(zhuǎn)化方法。(也參見(jiàn)USP 5,032,514；Potter H.(1988)AnaL Biochem 174361-373；Sambrook，J.等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；和Ferrari等人，Genetics，BACILLUS中57-72頁(yè)，Harwood等人編輯，Plenum Publishing Corp))。
可以通過(guò)標(biāo)記基因表達(dá)的存在/不存在檢測(cè)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，標(biāo)記基因表達(dá)的存在/不存在可以提示所需核酸是否存在。然而，其表達(dá)應(yīng)該被證實(shí)。例如，如果編碼亞基B脫氫酶蛋白的核酸被插入標(biāo)記基因序列中，可以通過(guò)標(biāo)記基因功能的不存在來(lái)鑒定含有插入序列的重組細(xì)胞。選擇性地，標(biāo)記基因可以和編碼脫氫酶的核酸串聯(lián)，處于單一啟動(dòng)子的調(diào)控下。標(biāo)記基因響應(yīng)于誘導(dǎo)或選擇的表達(dá)通常也提示蛋白或酶的表達(dá)。一旦創(chuàng)建了如上所述的能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)變的細(xì)菌微生物，可以根據(jù)用于重組蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建體的性質(zhì)和根據(jù)宿主的生長(zhǎng)特征，用各種方式行使本發(fā)明方法。
細(xì)胞培養(yǎng)物和發(fā)酵(fermentations)
適于維持細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法是公知的，參考MANUAL OFMETHODS OF GENERAL BACTERIOLOGY，Eds.P.Gerhardt等人，American Society for Microbiology，Washington DC(1981)和T.D.Brock，BIOTECHNOLOGYA TEXTBOOK OF INDUSTRIALMICROBIOLOGY，第二版(1989)Sinauer Associates，Sunderland，MA。
細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)物一典型地，細(xì)胞培養(yǎng)物在25至32℃，優(yōu)選地在大約28或29℃，在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。用于本發(fā)明的代表性的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是普通的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，如同但不限于Luria Bertani(LB)肉湯、沙氏葡糖(Sabouraud Dextrose)(SD)肉湯或酵母培養(yǎng)基(Yeastmedium)(YM)肉湯。這些可以從，例如GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)得到?？梢詰?yīng)用其它限定的或合成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且，用于具體細(xì)菌微生物生長(zhǎng)的合適培養(yǎng)基對(duì)于微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將是已知的。發(fā)酵優(yōu)選的合適pH范圍是pH5至pH8之間。種植燒瓶(seedflasks)的優(yōu)選范圍是pH7至pH7.5，反應(yīng)器的優(yōu)選范圍是pH5至pH6。發(fā)酵微生物領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，為了最大化抗壞血酸中間產(chǎn)物的產(chǎn)量，必須優(yōu)化和控制影響發(fā)酵過(guò)程的許多因素。這些因素中的許多如pH、碳源濃度和溶解的氧水平可以影響酶促過(guò)程，這取決于用于抗壞血酸中間產(chǎn)物生產(chǎn)的細(xì)胞類型。
ASA中間產(chǎn)物的生產(chǎn)可以在促發(fā)酵環(huán)境中進(jìn)行，即，在體內(nèi)環(huán)境，或非促發(fā)酵環(huán)境中進(jìn)行，即，在體外環(huán)境；或在結(jié)合的體內(nèi)/體外環(huán)境中進(jìn)行。發(fā)酵或生物反應(yīng)器可以以分批方法或連續(xù)方法實(shí)施。
體內(nèi)生物催化環(huán)境生物催化起始于，在帶有合適碳源的環(huán)境中，培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的改變的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述碳源通常被腸桿菌科或其它細(xì)菌株利用。合適的碳源包括六碳糖，例如，葡萄糖，或六碳糖酸，或六碳糖和/或六碳糖酸的結(jié)合。其它碳源包括但不限于半乳糖、乳糖、果糖、或這樣的酶促衍生物。
此外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須包括合適的碳源底物，其包括但不限于單糖如葡萄糖、寡糖如乳糖或蔗糖、多糖如淀粉或纖維素和來(lái)自可更新進(jìn)料(feedstock)的未純化混合物如干酪乳清滲透物(cheese wheypermeate)、玉米漿(cornsteep liquor)、甜菜糖蜜(sugar beet molasses)和大麥芽。盡管預(yù)期了，本發(fā)明中應(yīng)用的碳源可以包括寬范圍的含碳底物，并且僅被生物體的選擇所限，優(yōu)選的碳底物包括葡萄糖、果糖和蔗糖及其混合物。通過(guò)應(yīng)用葡萄糖和果糖的混合物，結(jié)合此處描述的改變的細(xì)菌株，氧化途徑從分解代謝途徑解偶聯(lián)使得應(yīng)用葡萄糖改進(jìn)產(chǎn)量和轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧腁SA中間產(chǎn)物，而應(yīng)用果糖滿足宿主細(xì)胞的代謝需求。發(fā)酵培養(yǎng)基也必須含有合適的礦物質(zhì)、鹽、維生素、輔助因子和緩沖液，所述礦物質(zhì)、鹽、維生素、輔助因子和緩沖液適于培養(yǎng)物生長(zhǎng)并促進(jìn)抗壞血酸中間產(chǎn)物產(chǎn)生所需的酶促途徑。
分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵本發(fā)明也應(yīng)用分批發(fā)酵法，修改的分批發(fā)酵法、稱作補(bǔ)料分批(Fed-batch)發(fā)酵法，或連續(xù)發(fā)酵法。經(jīng)典的分批發(fā)酵是密閉體系，其中在發(fā)酵起始設(shè)置培養(yǎng)基組合物，并且在發(fā)酵期間培養(yǎng)基組合物不遭受人工改變。在發(fā)酵起始，用所需的細(xì)菌生物體或多種生物體種植培養(yǎng)基，使在不向體系中加入任何物質(zhì)的情況下發(fā)生發(fā)酵。然而，典型地，“分批”(batch)發(fā)酵是針對(duì)加入碳源的分批，并且經(jīng)常嘗試調(diào)控因素(controlling factors)如pH和氧濃度。在分批體系中，體系的代謝物和生物材料組合物不斷變化，直至發(fā)酵停止。在分批培養(yǎng)物中，細(xì)胞緩和地通過(guò)靜止停滯期(static lag phase)到達(dá)高生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(high growth logphase)，最終到達(dá)穩(wěn)定期(stationary phase)，其中生長(zhǎng)速度減低或停止。如果未經(jīng)處理，穩(wěn)定期的細(xì)胞將最終死亡。對(duì)數(shù)期的細(xì)胞通常對(duì)所需產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的大部分產(chǎn)量負(fù)責(zé)。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)分批體系的變化是補(bǔ)料分批體系。補(bǔ)料分批發(fā)酵法也適于本發(fā)明，包括典型的分批體系，例外之處是，在發(fā)酵進(jìn)行時(shí)累加加入底物。當(dāng)分解代謝物抑制傾向于抑制細(xì)胞代謝時(shí)，和需要在培養(yǎng)基中存在限制量的底物時(shí)，補(bǔ)料分批發(fā)酵體系是有用的。測(cè)定補(bǔ)料分批發(fā)酵體系中的實(shí)際底物濃度是困難的，因而根據(jù)可測(cè)定因素如pH、溶解的氧和廢氣如CO2分壓的變化來(lái)估計(jì)。分批發(fā)酵法和補(bǔ)料分批發(fā)酵法是本領(lǐng)域中普遍的和公知的，例子參見(jiàn)T.D.Brock，BIOTECHNOLOGYA TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.Sunderland，MA。
在一種實(shí)施方案中，碳底物在進(jìn)料溶液(feed solution)中的濃度是從大約55％至大約75％，這基于重量/重量比。優(yōu)選地，濃度是從大約60％至大約70％，這基于重量/重量比。最優(yōu)選地，應(yīng)用的濃度是60％至67％葡萄糖。
連續(xù)發(fā)酵是開(kāi)放體系，其中向生物反應(yīng)器中連續(xù)加入限定的發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)移除等量的條件培養(yǎng)基(conditioned media)用于處理。連續(xù)發(fā)酵通常將培養(yǎng)物維持在不變的高密度，其中細(xì)胞基本上處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)整一個(gè)因素或任意數(shù)目的因素，所述因素影響細(xì)胞生長(zhǎng)或終產(chǎn)物濃度。例如，一個(gè)方法將維持限制性營(yíng)養(yǎng)物(limiting nutrient)如碳源或氮水平在固定比例，并使所有其它參數(shù)是適度的。在其它體系中，盡管由培養(yǎng)基混濁度(media turbidity)測(cè)定的細(xì)胞濃度持續(xù)不變，可以連續(xù)改變?cè)S多影響生長(zhǎng)的因素。連續(xù)體系努力維持穩(wěn)定狀態(tài)生長(zhǎng)條件，因此，移去的培養(yǎng)基造成的細(xì)胞丟失必須平衡于發(fā)酵中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度。調(diào)整連續(xù)發(fā)酵法中營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因素的方法，以及最大化產(chǎn)物形成速度的技術(shù)，在工業(yè)微生物領(lǐng)域是已知的，Brock，supra中詳述了各種方法。
所需產(chǎn)物從ASA途徑的產(chǎn)量增加除了2-KDG在根據(jù)本發(fā)明的改變的細(xì)菌宿主細(xì)胞中累積增加之外，進(jìn)一步的實(shí)施方案可以導(dǎo)致分解代謝途徑從ASA氧化途徑解偶聯(lián)，以增加葡萄糖酸的可利用性，用于2-KDG的產(chǎn)生。
如圖2中所示，葡萄糖酸可以跨過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。然后，葡萄糖酸可以被磷酸化，例如變?yōu)槠咸烟撬?6-磷酸，并且可以用于戊糖途徑中的分解代謝。此外，葡萄糖酸可以在細(xì)胞質(zhì)中被酶促還原為5-KDG或2-KDG。通過(guò)失活編碼葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的核酸，失活或改變葡萄糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的水平，可以導(dǎo)致氧化ASA生成途徑中可利用的葡萄糖酸的量增加。此外，葡萄糖酸激酶基因的失活可以導(dǎo)致葡萄糖酸磷酸化降低，進(jìn)一步增加氧化ASA生成途徑中可利用的葡萄糖酸的量和異抗壞血酸的產(chǎn)量。
通過(guò)參照下列實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更充分理解行使本發(fā)明的方式和方法，實(shí)施例不以任何方式意圖于限制本發(fā)明的范圍或其涉及的權(quán)利要求的范圍。此處提及的所有參考文獻(xiàn)和專利出版物在此并入，作為參考。
6.實(shí)施例實(shí)施例1失活orfs 2418-2420，其編碼P.citrea中的2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)活性A.克隆KDGDH操縱子應(yīng)用菌株139-2a/Ps-克隆2-KDGDH操縱子。此菌株是菌株139-2a的衍生物，139-2a的ATCC保藏編號(hào)是39140，其中隱蔽質(zhì)粒(pS)是用WO98/59054公開(kāi)的方法去除的。也參考Truesdell等人，(1991)J.Bacteriol.1736651-6656。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第二版)，用兩個(gè)PCR引物，KDGF1和KDGR1，擴(kuò)增2.8-kb的DNA片段，片段含有來(lái)自P.citrea 139-2a/Ps-菌株染色體的2-KDGDH操縱子。
KDGF15′AGTTAGCCGCTCATTTCCTG 3′(SEQ ID NO.7)KDGR15′AGCCGCCTGGTTTTTAC 3′(SEQ ID NO.8)以大腸桿菌TOP10細(xì)胞為宿主，將DNA片段克隆入pZeroBlunt載體，載體具有l(wèi)ac啟動(dòng)子(lacP)(Invitrogen，Carlsbad CA)。這導(dǎo)致了質(zhì)粒pKDG2(6.32-kb)。在LA+Kan50平板上，(LB培養(yǎng)基，用1.5％瓊脂固化，加50ppm卡那霉素)得到三個(gè)KanR轉(zhuǎn)化株。當(dāng)用合適的限制性內(nèi)切酶消化時(shí)(EcoR I，Sca I+Spe I，Sal I+Spe I)，發(fā)現(xiàn)所有三個(gè)轉(zhuǎn)化株具有插入片段，所有三個(gè)轉(zhuǎn)化株的轉(zhuǎn)錄方向和lacP的方向相反。
B.構(gòu)建敲除質(zhì)粒(knockout plasmid)，敲除質(zhì)粒用于從P.citrea染色體刪除2-KDGDH操縱子
通常地，用質(zhì)粒經(jīng)同源重組失活基因的策略在此前被描述過(guò)，參見(jiàn)Miller等人，(1988)J. Bacteriol.1702575-2583。用這種普通方法失活2-KDGDH操縱子。
用Hpa I+Sca I酶消化根據(jù)上面的實(shí)施例1A得到的pKDG2質(zhì)粒，以從B亞基(2-KDGDH-B)的中間至C-末端去除0.993-kb的區(qū)域。然后，將側(cè)翼是兩個(gè)loxP位點(diǎn)的cat序列盒(1.080-kb)插入質(zhì)粒(Palmeros等人，(2000)Gene 247255-264)，生成質(zhì)粒pKDGCat1(6.41-kb；cat延伸方向和KDGDH操縱子相反)。用Not I，Sac I和Xba I酶消化驗(yàn)證質(zhì)粒。從質(zhì)粒pKDGCat1去除含有ColE1起始區(qū)(Ori region)的1.5-kbAatII+Spe I片段，然后用502-bp的AatII+Spe I DNA片段連接，所述502bp DNA片段含有復(fù)制(起始)區(qū)的最小R6K起點(diǎn)。用質(zhì)粒pGP704(Miller等人，(1988)J.Bacteriol.1702575-2583)作為PCR底物，用引物經(jīng)PCR得到R6K起始區(qū)DNA(ori DNA)。從而得到最終的敲除質(zhì)粒pKDGCatR6(5.37-kb)。用Sambrook等人MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第二版中描述的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌PIR1菌株(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在此最終敲除的構(gòu)建體中，在KDGDH操縱子的5’和3’末端可以得到960-bp和840-bp的同源區(qū)，以允許在P.citrea中同源重組。同源區(qū)由對(duì)亞基B的圖4和圖5中示例的orf表示。
C.轉(zhuǎn)化入P.citrea菌株以得到改變的菌株用HindIII消化證實(shí)最終的敲除質(zhì)粒pKDGcatR6(5.37kb)之后，將質(zhì)粒電穿孔(Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第二版)進(jìn)入P.citrea 139-2a/Ps-(pKD46)感受態(tài)細(xì)胞，并用公知技術(shù)在LA+Cm10平板上(LA是LB加瓊脂平板，帶有10ppm Cm)選擇氯霉素抗性(CmR)轉(zhuǎn)化株。為了區(qū)分單交換重組事件和雙交換重組事件，在LA+Kan3平板上檢查CmR轉(zhuǎn)化株的卡那霉素敏感度(KanS)。13個(gè)CmR轉(zhuǎn)化株中的9個(gè)是KanS，提示它們經(jīng)歷了雙交換重組事件，其導(dǎo)致2-KDGDH操縱子失活。用下面描述的內(nèi)部引物和外部引物(internal andexternal primers)，經(jīng)PCR檢查四個(gè)轉(zhuǎn)化株4、5、8和9號(hào)。
D.PCR證實(shí)敲除菌株為了證實(shí)KDGDH操縱子刪除，在含有功能性KDGDH操縱子的野生型中和假定的突變體(putative mutants)中(改變的菌株)，兩個(gè)外部引物均將擴(kuò)增相同長(zhǎng)度的條帶，假定的突變體中刪除了KDGDH操縱子。(參照上面的實(shí)施例1C，其中0.993-kb替換為1.08-kb cat-loxPDNA)。
因此，用一個(gè)外部引物和一個(gè)cat基因特異引物證實(shí)假定突變體的重組連接。與未改變的菌株相比，用cat3+KDGR2引物，所有四個(gè)轉(zhuǎn)化株擴(kuò)增出預(yù)期的1.14-kb條帶，未改變的菌株沒(méi)有擴(kuò)增。用KDGF2+cat4引物，轉(zhuǎn)化株擴(kuò)增預(yù)期的1.17-kb條帶。此結(jié)果顯示，四個(gè)轉(zhuǎn)化株如所預(yù)期，在KDG位置經(jīng)歷了雙交換重組事件，從而失活了操縱子。
KDGF2 5’GCGTCTCTGCCATTGCGTAGTTTC 3’(SEQ ID NO.9)KDGR2 5’GGGTGCGGATCGGTGTGGTTT3’(SEQ ID NO.10)CAT35’AAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCG 3’(SEQ ID NO.11)CAT45’CAACAGTACTGCGATGAGTGGCAG 3’(SEQ ID NO.12)E.去除pKD46質(zhì)粒由于改變的菌株仍然含有質(zhì)粒pKD46質(zhì)粒(Datsenko和Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.976640-6645)，它們被如下復(fù)原(be cured of)出此質(zhì)粒。使細(xì)胞生長(zhǎng)在不含羧芐青霉素(Carb)的液體培養(yǎng)基中，溫度是30℃，3次傳代(3天)，隨后鋪板和分離單個(gè)菌落。當(dāng)在LA+Carb200平板上檢測(cè)Carb敏感度時(shí)(Datsenko和Wanner，supra和Palmeros等人.(2000)Gene 247255-264)，所有單個(gè)菌落分離物丟失了pKD46質(zhì)粒。而且，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方案分離質(zhì)粒DNAs時(shí)(Sambrook等人，supra)，任何單一菌落分離物中均未檢測(cè)到質(zhì)粒。得到復(fù)原為pKD46的改變的泛菌屬細(xì)胞并將其指定為WKDG4。
實(shí)施例2用Pantoea citrea進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)如無(wú)其它指明，用于細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)的所有試劑和物質(zhì)來(lái)自DiffcoLaboratories(Detroit，Mich.)、Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wis.)或Sigma Chemical Company(St.Louis，Mo.)。種子培養(yǎng)(Seed Train)在空氣中解凍貯存在液氮中的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶含有所指的菌株WKDG4，將0.75ml加入含有500ml種子培養(yǎng)基(seedmedium)的無(wú)菌2-L-錐形燒瓶。于29℃和250rpm溫育燒瓶12小時(shí)。轉(zhuǎn)移標(biāo)準(zhǔn)是OD550大于2.5。種子燒瓶培養(yǎng)基(Seed flask medium)-如下制備培養(yǎng)基組合物KH2PO4(12.0g/L)；K2HPO4(4.0g/L)；MgSO4·7H2O(2.0g/L)；Difco Soytone(2.0g/L)；檸檬酸鈉(0.1g/L)；果糖(5.0g/L)；(NH4)2SO4(1.0g/L)；尼克酸(0.02g/L)；FeCl3·6H2O(5mL/L的0.4g/L貯存液)和痕量的鹽(5mL/L的下列溶液0.58g/L ZnSO4·7H2O，0.34g/L MnSO4·H2O，0.48g/LNa2MoO4·2H2O)。用20％NaOH將培養(yǎng)液的pH值調(diào)節(jié)至7.1±0.1單位。然后，用0.2μ過(guò)濾單位將得到的培養(yǎng)液無(wú)菌過(guò)濾。將無(wú)菌培養(yǎng)液加入預(yù)先高壓滅菌的燒瓶中。
生產(chǎn)發(fā)酵罐(Production Fermentor)-滅菌之前加入反應(yīng)器的物質(zhì)包括KH2PO43.5g/L)；MgSO4·7H2O(1.0g/L)；(NH4)2SO4(0.92g/L)；谷氨酸一鈉(15.0g/L)；ZnSO4·7H2O(5.79mg/L)；MnSO4·H2O(3.44mg/L)；Na2MoO4·2H2O(4.70mg/L)；FeCl3·6H2O(2.20mg/L)；氯化膽堿(0.112g/L)和Mazu DF-204(0.167g/L)抗泡沫劑。
將上面構(gòu)建的培養(yǎng)基在121℃滅菌45分鐘。罐滅菌之后，向發(fā)酵罐進(jìn)行下列添加尼克酸(16.8mg/L)；Ca-泛酸鹽(Ca-pantothenate)(3.36mg/L)；葡萄糖(25g/L)和果糖(25g/L)。
滅菌和加入滅菌后組分之后的終體積是6.0L。用來(lái)自如上制備的種植燒瓶的全部完整內(nèi)容物接種如此制備的罐和培養(yǎng)基，得到6.5L的體積。
生長(zhǎng)條件是29℃和pH6.0。如所需調(diào)整攪拌速度、反壓(backpressure)和氣流，以保持溶解的氧高于零。當(dāng)起始分批進(jìn)入培養(yǎng)基的糖被耗盡時(shí)，應(yīng)用如此處前述的補(bǔ)料分批法。在分批法期間用葡萄糖和果糖作為底物，在補(bǔ)料分批法期間僅應(yīng)用葡萄糖作為底物。
如下面的表1所觀察到，對(duì)于代表性的發(fā)酵過(guò)程，和等基因野生型菌株(139-2a/Ps-)相比，在補(bǔ)料分批發(fā)酵下，用菌株WKDG4在30小時(shí)時(shí)間段之后得到的2-KDG產(chǎn)量有顯著意義，所述野生型菌株僅短暫產(chǎn)生2-KDG，這發(fā)生在其進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)?，5-DKG之前。
表1-發(fā)酵產(chǎn)量
另一代表性發(fā)酵過(guò)程示例于圖9中，其中改變的菌株WKDG4和未改變的菌株139-2a/Ps-如上述生長(zhǎng)。如從圖中所觀察到，菌株139-2a/Ps-主要產(chǎn)生2，5-DKG，并在180g/L達(dá)到最大。2-KDG短暫累積至僅20g/L高的水平，在反應(yīng)終末，2-KDG累積至10g/L的水平。與之相對(duì)，改變的菌株(WKDG4)有非常不同的曲線圖。2，5-DKG未被檢測(cè)到，在反應(yīng)終末，2-KDG積累至如302g/L高的水平。
權(quán)利要求
1.增加細(xì)菌宿主細(xì)胞中2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)累積的方法，包括a)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中失活至少一個(gè)內(nèi)源性基因，以得到改變的細(xì)菌細(xì)胞，在碳源存在下，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞能夠從2-KDG的酶促轉(zhuǎn)變產(chǎn)生2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)，所述內(nèi)源性基因是2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)活性所需的；和b)在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)改變的細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生2-KDG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括回收2-KDG的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)變2-KDG為異抗壞血酸的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中細(xì)菌宿主細(xì)胞選自歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、醋桿菌屬(Acetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)、泛菌屬(Pantoea)、桿菌屬(Bacillus)和埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中細(xì)菌宿主細(xì)胞是泛菌屬細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一個(gè)內(nèi)源性基因編碼具有脫氫酶活性的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中具有脫氫酶活性的蛋白具有SEQ ID NO4序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中2-KDGDH由三個(gè)亞基組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中第一個(gè)亞基包括和SEQ IDNO2至少95％的氨基酸序列同一性，第二個(gè)亞基包括和SEQ ID NO4至少95％的氨基酸序列同一性，第三個(gè)亞基包括和SEQ ID NO6至少95％的氨基酸序列同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法得到的改變的細(xì)菌細(xì)胞。
11.在細(xì)菌宿主細(xì)胞中累積2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)的方法，包括a)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中失活操縱子，得到改變的細(xì)菌細(xì)胞，在葡萄糖存在下，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞能夠從2-KDG的酶促轉(zhuǎn)變產(chǎn)生2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)，所述操縱子編碼2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)，其中操縱子包括脫氫酶基因和細(xì)胞色素c基因；b)在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)改變的細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生2-KDG；和c)使2-KDG在改變的細(xì)菌細(xì)胞中累積。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括回收累積的2-KDG。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法得到的改變的細(xì)菌細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13所述的改變的細(xì)菌細(xì)胞，是歐文氏菌屬細(xì)胞、克雷伯菌屬細(xì)胞、泛菌屬細(xì)胞或埃希氏菌屬細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中脫氫酶基因編碼具有SEQID NO4氨基酸序列的蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中細(xì)胞色素c基因編碼和SEQID NO6有至少95％序列同一性的氨基酸序列的蛋白。
17.能夠從碳源產(chǎn)生2-酮基-D-葡萄糖酸的改變的細(xì)菌細(xì)胞，其經(jīng)過(guò)遺傳工程改造為包括無(wú)功能的2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)。
18.權(quán)利要求17所述的改變的細(xì)菌細(xì)胞，其中2-KDGDH酶由三個(gè)亞基組成，并且至少一個(gè)具有脫氫酶活性的亞基被失活。
19.權(quán)利要求17所述的改變的細(xì)菌細(xì)胞，其中細(xì)菌細(xì)胞選自歐文氏菌屬、腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、醋桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯菌屬、葡萄糖桿菌屬、泛菌屬、桿菌屬和埃希氏菌屬細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19所述的改變的細(xì)菌細(xì)胞，其中細(xì)菌細(xì)胞是泛菌屬細(xì)胞。
21.增加細(xì)菌培養(yǎng)物中2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)可利用性的方法，包括a)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中失活操縱子，以得到改變的細(xì)菌細(xì)胞，在葡萄糖存在下，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞能夠從2-KDG的酶促轉(zhuǎn)變產(chǎn)生2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)，所述操縱子編碼2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)，其中操縱子包括脫氫酶基因和細(xì)胞色素c基因；b)在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)改變的細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生2-KDG。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中2-KDG是從細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中2-KDG被轉(zhuǎn)變?yōu)楫惪箟难帷?br> 24.分離的多核苷酸，編碼具有2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶(2-KDGDH)活性的酶，其中所述酶由三個(gè)亞基組成，第一個(gè)亞基，亞基A具有和SEQ ID NO2至少96％同一性的氨基酸序列；第二個(gè)亞基，亞基B具有SEQ ID NO4的氨基酸序列；第三個(gè)亞基，亞基C和SEQ ID NO6有至少95％的序列同一性。
25.權(quán)利要求24所述的分離的多核苷酸，其中亞基A具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求24所述的分離的多核苷酸，其中亞基C具有SEQ IDNO6的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)失活內(nèi)源性膜結(jié)合2－酮基－D－葡萄糖酸脫氫酶(2－KDGDH)改變細(xì)菌宿主細(xì)胞以積累2－酮基－D－葡萄糖酸(2－KDG)的方法，2－酮基－D－葡萄糖酸脫氫酶在失活之前催化2－KDG轉(zhuǎn)變?yōu)?，5－二酮基葡萄糖酸(2，5－DKG)。
文檔編號(hào)C12P7/58GK1829800SQ200480021982
公開(kāi)日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2004年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者T·C·道奇, F·瓦耳, M·H·拉希德 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司