專利名稱：：莫納甜桌面甜味劑組合物及其制造方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及含有莫納甜(monatin)的新型甜味劑組合物以及制造這種組合物的方法。本發(fā)明還涉及含有莫納甜的特定立體異構體、莫納甜立體異構體的特定混合物和/或通過生物合成途徑在體內(例如細胞內)或體外生產莫納甜的甜味劑組合物。
背景技術：
：出于兒童肥胖、II型糖尿病和相關疾病增多的健康考慮，非熱量高強度甜味劑的使用正在增加。因此，需要有甜度明顯高于砂糖(蔗糖)等常規(guī)甜味劑的甜味劑。許多高強度甜味劑有令人不愉快的異位和/或非預料到的及低于期望值的甜度表現。為克服這些問題，工業(yè)上在繼續(xù)研究苦味抑制劑、異位掩蓋技術和甜味劑混合物，以期獲得類似于蔗糖的甜度表現。莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸)是一種天然產生的高強度甜味劑，它分離自在南非德蘭士瓦地區(qū)發(fā)現的一種植物Sclerochitonilicifolius。在等甜度時，與蔗糖或其它營養(yǎng)甜味劑不同，莫納甜不含碳水化合物或蔗糖且?guī)缀醪缓防铩８攀霰景l(fā)明涉及一種甜味劑組合物，該組合物含有莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸—也稱為4-氨基-2-羥基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者采用另一種編號系統(tǒng)，叫做4-羥基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸)，該化合物具有下式莫納甜是一種天然產生的高強度甜味劑。莫納甜有四種立體異構形式2R，4R(“R，R立體異構體”或“R，R莫納甜”)；2S，4S(“S，S立體異構體”或“S，S莫納甜”)；2R，4S(“R，S立體異構體”或“R，S莫納甜”)以及2S，4R(“S，R立體異構體”或“S，R莫納甜”)。本文中，除非另有說明，“莫納甜”是指莫納甜的所有四種立體異構體，以及莫納甜立體異構體的任何混合物(例如莫納甜的R，R和S，S立體異構體的混合物)。莫納甜具有極好的甜度特性。莫納甜的甜度曲線與已知高強度甜味劑一樣清楚或更加清楚。莫納甜的用量反應曲線更加呈線性，因此相比糖精等其它高強度甜味劑更類似于蔗糖。莫納甜出色的甜度曲線使莫納甜可理想地用于桌面甜味劑(tabletop)、食品、飲料和其它產品。莫納甜的不同立體異構體，其中包括R，R和S，S立體異構體，有可能用于甜味劑工業(yè)，無論是作為單獨的成分或在混合物中。相比其它高強度甜味劑，莫納甜以及莫納甜的立體異構體與其它甜味劑的混合物被認為具有優(yōu)良的味道特性和/或物理性質。例如，莫納甜比Equal或NutraSweet(阿斯巴特，也稱為“APM”)穩(wěn)定，相比SweetN′Low(糖精)有更加清楚的味道，并且比Splenda(三氯蔗糖)更甜。同時，莫納甜甜味劑不會有糖精那樣苦的后味，或者像其它高強度甜味劑那樣有金屬味道、酸味、澀味或使用之后感覺喉嚨發(fā)干。此外，莫納甜甜味劑不具有某些天然甜味劑(如蛇菊苷和甘草皂苷)那種甘草后味。此外，不同于阿斯巴特甜味劑，莫納甜甜味劑不需要告誡苯并酮尿癥患者注意苯丙氨酸。由于其強烈甜味，R，R立體異構體相比其它高強度甜味劑更具有商業(yè)競爭力。一方面，本發(fā)明提供了含有R，R莫納甜和/或S，S莫納甜的甜味劑組合物。例如，這種組合物的甜度甜度相當于砂糖(蔗糖)的甜度，因此可“匙對匙”或“杯對杯”地代替蔗糖使用?！疤鸲认喈斢凇笔侵赣薪涷灥母杏X鑒定員平均認為第一種組合物的甜度為第二組組合物甜度的80％-120％。表述“甜度相當于”涉及5名或更多有經驗的感覺鑒定員在下述甜度比較實驗中確定的結果，該實驗用含有2-10％蔗糖等價物的組合物(例如溶液)進行。因此，例如，如果莫納甜組合物的甜度相當于80-120mg/mL蔗糖的甜度，則100mg/mL含有莫納甜的組合物提供的“甜度相當于”100mg/mL蔗糖。我們采用一組熟悉甜度評價過程的經過訓練的感覺鑒定員來評價甜味劑相對蔗糖的甜度。所有樣品(在相同的緩沖液中)在22℃±1℃下一式兩份。測試溶液用3個隨機數字編號，并分別隨機給予鑒定員。提供以0.5％(w/v)蔗糖遞增的蔗糖參考標準(4.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求鑒定員通過比較測試溶液和蔗糖標準的甜度來評價甜度。評定時吸啜3口測試溶液，然后吸啜1口水，再吸啜3口蔗糖標準，然后在吸啜1口水，依此類推。鑒定員用1位小數評價甜度，例如6.8、8.5。在評價測試溶液之間休息5分鐘。要求鑒定員徹底漱口并食用一些餅干以降低任何可能的附帶結果。采用獲自鑒定員的信息，在用量反應曲線的特定點用蔗糖等價值(SEV)(例如，％蔗糖)除以％莫納甜就得到了甜味強度或效能。一些實施方案中，該組合物含有基本上由S，S或R，R莫納甜組成的莫納甜。其它實施方案中，該組合物主要含有S，S或R，R莫納甜?！爸饕笔侵附M合物中存在的莫納甜的立體異構體，該莫納甜所含的一種特定立體異構體的比例超過90％。一些實施方案中，該組合物基本上不含S，S或R，R莫納甜?！盎旧喜缓笔侵附M合物中存在的莫納甜的立體異構體，該組合物所含的一種特定立體異構體的比例低于2％。此外，或是或者，當用來描述用生物合成途徑制造的莫納甜時，“基本上不含”包含在生物合成途徑中作為副產物制造的一定量的立體異構體(例如，S，S莫納甜)，所述生物合成途徑涉及采用手性特異性酶(例如D-氨基酸脫氫酶或D-氨基酸轉氨酶)和/或手性特異性底物(例如具有一個R立體構型的碳原子)以制造不同的特定立體異構體(例如，R，R莫納甜)。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種甜味劑組合物，該組合物是富含用生物合成途徑制造的莫納甜某種立體異構體的混合物?！案缓{甜某種立體異構體的混合物”是指該混合物含有一種以上莫納甜立體異構體，且混合物中至少60％的莫納甜立體異構體為一種特定的立體異構體，如R，R、S，S、S，R或R，S。其它實施方案中，該混合物中一種特定的莫納甜立體異構體的含量超過65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。另一實施方案中，甜味劑組合物是富含R，R或S，S莫納甜的混合物?！案缓琑，R莫納甜的混合物”是指含有至少60％R，R莫納甜的莫納甜混合物。“富含S，S莫納甜的混合物”是指含有至少60％S，S莫納甜的莫納甜混合物。其它實施方案中，“富含某種莫納甜立體異構體的混合物”含有超過65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的R，R或S，S莫納甜。在另一方面，本發(fā)明還提供了甜味劑制品，例如，小包裝制品或即用型制品，其中含有R，R立體異構體和/或S，S立體異構體形式的莫納甜。例如，一種獨立包裝制品(通常約1克)提供的甜度相當于2茶匙砂糖(蔗糖)。本領域已知1“茶匙”蔗糖通常含有約4克蔗糖?；蛘?，一定體積即用型制品提供的甜度相當于相同體積的砂糖?；蛘?，一種莫納甜組合物的獨立包裝(例如1克)提供的甜度相當于約0.9-9.0克砂糖(蔗糖)。術語“約”包括任何測量中發(fā)生的實驗誤差范圍。除非另有說明，所有測量值具有“約”的含義即便未食用“約”這個詞。在另一方面，本發(fā)明提供了一種含有莫納甜的均勻的桌面甜味劑組合物。“均勻的”組合物是指一種均一的組合物。例如，“均勻的”桌面甜味劑組合物(例如液體)在整個組合物中都將含有相同濃度的莫納甜—獲自這種組合物的任何樣品將具有該濃度。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制造甜味劑組合物的方法。該方法包括在體內或體外通過生物合成制造莫納甜?！吧锖铣赏緩健卑ㄖ辽僖粋€生物轉化步驟。一些實施方案中，所述生物合成途徑是一種多步驟過程，且至少一個步驟是生物轉化步驟。其它實施方案中，所述生物合成途徑是一種涉及生物和化學轉化步驟的多步驟過程。一些實施方案中，所制得的莫納甜是一種富含莫納甜某種立體異構體的混合物。在本發(fā)明的另一方面，存在一些從選自以下的底物制造莫納甜的生物合成途徑葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、以及吲哚-3-丙酮酸鹽或酯和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(也稱為“莫納甜前體”、“MP”或莫納甜的α-酮式)。用來制造或產生莫納甜或其中間體的生物合成途徑的例子示于圖1-3和11-13，這些圖以框顯示潛在的中間產物和終產物。例如，從一種產物到另一種產物的轉化能用這些方法進行，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸鹽或酯(indole-3-pyruvate)、吲哚-3-丙酮酸鹽或酯到MP、MP到莫納甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸鹽或酯。這些轉化可用化學方法或生物學方法促進。術語“轉化”指在將第一種中間體轉化成第2種中間體的反應中使用化學方法或多肽。術語“化學轉化”指不由多肽活性促進的反應。術語“生物轉化”指由多肽活性促進的反應。轉化可體內或體外發(fā)生。當使用生物轉化時，多肽和/或細胞能固定于支持物如化學附著于聚合物支持物。轉化可用本領域普通技術人員已知的任何反應器完成，例如在分批或連續(xù)反應器中。用來進行生物轉化的多肽及其編碼序列的實例示于圖1-3和11-13。具有一個或多個修飾多肽的底物特異性和/或活性的點突變的多肽可用來制造莫納甜。表達這種多肽的分離的重組細胞可用來制造莫納甜。這些細胞可以是任何細胞，如植物、動物、細菌、酵母、藻類、古菌或真菌細胞。例如，制造莫納甜的細胞可具有一種或多種(如兩種或多種、或者三種或多種)以下活性色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無EC號，Hadar等，J.Bacteriol1251096-1104，1976和Furuya等，BiosciBiotechnolBiochem641486-93，2000)、D-色氨酸轉氨酶(Kohiba和Mito，《第8屆國際維生素B6和羰基催化討論會會議錄》(Proceedingsof8thInternationalSymposiumonVitaminB6andCarbonylCatalysis)，日本大阪，1990)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、合酶/裂解酶(EC4.1.3.-)，如4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)或4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。在另一個例子中，細胞包括一種或多種(例如2種或多種或者3種或多種)下列活性吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)，R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)，3-(4)-羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)，乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)，合酶/裂解酶(4.1.3.-)如4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)或4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)，合酶/裂解酶(4.1.2.-)，色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)，色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)，谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)，多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)，天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)，D-色氨酸轉氨酶，D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)，和/或D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)。此外，細胞可包括一種或多種(例如2種或多種或者3種或多種)下列活性色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)，色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)，谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)，多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)，天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)，L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)，色氨酸氧化酶，D-色氨酸轉氨酶，D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)，D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)，D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)，吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)，R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)，3-(4)-羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)，乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)，合酶/裂解酶(EC4.1.3.-)，如4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)或4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。進一步的例子是，細胞可包含一種或多種以下醛縮酶活性KHG醛縮酶、ProA醛縮酶、KDPG醛縮酶和/或相關多肽(KDPH)、轉羧基苯丙酮酸水合酶-醛縮酶、4-(2-羧苯基)-2-氧丁-3-烯醇鹽醛縮酶、反式-O-羥基苯亞甲基丙酮酸水合酶-醛縮酶、3-羥基天冬氨酸醛縮酶、苯偶姻醛縮酶、二氫新蝶呤醛縮酶、L-蘇-3-苯基絲氨酸苯甲醛-裂解酶(苯基絲氨酸醛縮酶)、4-羥基-2-氧戊酸醛縮酶、1、2-二羥基芐基丙酮酸醛縮酶、和/或2-羥基苯丙酮酸醛縮酶。能生成莫納甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接觸第一種多肽，其中第一種多肽將色氨酸和/或吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸可用作轉化成吲哚-3-丙酮酸的底物；本領域技術人員理解選擇用于此步驟的多肽理想地表現出適當特異性)，所得吲哚-3-丙酮酸接觸第2種多肽，其中第2種多肽將吲哚-3-丙酮酸轉化成2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接觸第3種多肽，其中第3種多肽將MP轉化成莫納甜。能用于這些轉化的示范多肽示于圖2和3。通過一步或多步生物轉化利用生物合成途徑制造莫納甜有一些優(yōu)點。例如，通過在該生物合成途徑中使用特定的多肽和/或某些底物能夠制得富含某種立體異構體的混合物，和/或制得基本上不含一種或多種立體異構體的莫納甜混合物。用莫納甜合成法產生的莫納甜組合物中可能含有一些雜質。僅用合成方法(即不包括至少一步生物轉化)制得的莫納甜組合物中所含的雜質不同于通過生物合成途徑制得的莫納甜組合物。例如，基于所用原料，僅用合成法制得的莫納甜組合物可含有石油化學的、有毒的和/或對人類消費者不利的其它危險污染物。這種污染物的例子有危險化學品，如LDA、氫-Pd/C、重氮甲烷、KCN、格氏試劑和Na/Hg。另一方面，希望通過生物合成途徑制造的莫納甜組合物可含有可食用或可飲用的雜質，但不含石油化學的、有毒的和/或其它有害物質。希望在通過一個或多個生物轉化的生物合成途徑中制造莫納甜的方法相比單純的合成方法能夠產生較少的有毒或有害污染物，和/或可提供較高百分比的特定立體異構體。例如，希望當用D-氨基酸脫氫酶，D-丙氨酸(天冬氨酸)轉氨酶、D-芳基轉氨酶或D-甲硫氨酸轉氨酶制造莫納甜時，我們可以獲得至少60％的R，R莫納甜和少于40％的S，S、S，R和/或R，S莫納甜。例如，當用上述D-酶類以及至少一種具有R-立體構型的碳原子的底物(例如莫納甜前體)制造莫納甜時還希望獲得至少95％的R，R莫納甜和少于5％的S，S、S，R和/或R，S莫納甜。相反，當僅通過合成法制造莫納甜時，我們只獲得約25％-50％所需立體異構體。一實施方案中，通過生物合成途徑制造莫納甜的方法，例如包括一步或多步生物轉化，未產生石油化學、有毒或危險污染物。“石油化學、有毒或危險污染物”是指任何石油化學的、有毒的、有害的和/或對人類消費者不利的物質，包括原料帶來的污染物或在僅用合成法制造莫納甜時產生的污染物。另一實施方案中，通過生物合成途徑制造莫納甜的方法，例如包括一步或多步生物轉化，指出了僅可食用或可飲用的物質?！翱墒秤没蚩娠嬘玫奈镔|”是指適合人類食用或飲用或對人類消費者安全的一種或多種化合物或物質?？墒秤没蚩娠嬘玫奈镔|的例子包括莫納甜、色氨酸、丙酮酸、谷氨酸、其它氨基酸以及人體內天然存在的其它化合物或物質。某些實施方案中，莫納甜甜味劑組合物包括甜味劑的桌面小包裝和立方體，以及即用型桌面“匙對匙”甜味劑，從體積上來看，它們具有與蔗糖(糖)幾乎相同的甜度，因此可用作桌面砂糖的替代品。這種桌面甜味劑可用來使咖啡和茶(熱的和冰的)、谷物、果汁和家庭烘焙食品(曲奇、松餅、蛋糕等)以及餐后甜點變甜。一實施方案中，桌面甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中所述組合物提供的甜度相當于約0.9-9.0克砂糖。另一實施方案中，1克莫納甜桌面甜味劑組合物提供的甜度相當于2茶匙砂糖。另一實施方案中，1克莫納甜桌面甜味劑組合物提供的甜度相當于約0.9-9.0克砂糖，且它所含的卡路里和碳水化合物少于1克砂糖。其它實施方案中，包含莫納甜或其鹽的桌面甜味劑組合物含有約0-200毫克S，S莫納甜或其鹽和約0-5毫克R，R莫納甜或其鹽。例如，1克該桌面甜味劑組合物可含有約3-200毫克S，S莫納甜或其鹽和約0-5毫克R，R莫納甜或其鹽。或者，例如，1克該桌面甜味劑組合物可含有約0-200毫克S，S莫納甜或其鹽和約3-5毫克R，R莫納甜或其鹽。其它實施方案中，1克該莫納甜桌面甜味劑組合物含有約200mg或更少的S，S莫納甜或其鹽，且基本上不含R，R、S，R或R，S莫納甜或其鹽。另一實施方案中，1克該莫納甜桌面甜味劑組合物含有約5mg或更少的R，R莫納甜或其鹽，且基本上不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽。其它實施方案中，含有莫納甜或其鹽的組合物還含有至少一種選自下組的成分填充劑、載體、纖維、糖醇、寡糖、糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑(flavorenhancer)、味道穩(wěn)定劑(flavorstablizer)、酸化劑、抗結劑和助流動劑。例如，所述莫納甜桌面甜味劑組合物還可含有用麥芽糊精成團的葡萄糖。一實施方案中，甜味劑組合物含有莫納甜和赤蘚醇(erthritol)。其它實施方案中，莫納甜組合物含有赤蘚醇。一實施方案中，莫納甜組合物含有多達99.7％赤蘚醇。另一實施方案中，莫納甜組合物含有海藻糖。另一實施方案中，莫納甜組合物含有環(huán)磺酸鹽(即環(huán)己烷氨基磺酸鹽，cyclamate)。其它實施方案中，桌面甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中所述莫納甜或其鹽基本上由R，R莫納甜或其鹽組成?；蛘撸鲎烂嫣鹞秳┙M合物含有莫納甜或其鹽，其中所述莫納甜或其鹽基本上由S，S莫納甜或其鹽組成。其它實施方案中，桌面甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中所述莫納甜或其鹽是富含R，R或S，S莫納甜或其鹽的混合物。例如，所述莫納甜桌面甜味劑組合物可含有至少95％R，R莫納甜或其鹽。其它實施方案中，桌面甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中所述甜度是有通過生物合成途徑制造的莫納甜或其鹽提供的。其它實施方案中，一種即用型甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中一定體積該組合物提供的甜度相當于相同體積的砂糖。另一實施方案中，1茶匙所述莫納甜即用型甜味劑組合物含有的卡路里和碳水化合物少于約1茶匙砂糖。其它實施方案中，一種即用型甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中，1克該組合物含有約3-25毫克S，S莫納甜或其鹽和約0-0.625毫克R，R莫納甜或其鹽?；蛘?，例如，所述莫納甜即用型甜味劑基本上由S，S莫納甜或其鹽或R，R莫納甜或其鹽組成。其它實施方案中，1克即用型莫納甜甜味劑組合物含有約5-25毫克S，S莫納甜或其鹽?；蛘撸?，1克即用型莫納甜甜味劑組合物含有約0.4-0.625R，R莫納甜或其鹽，且基本上不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽?；蛘?，例如，1克即用型莫納甜甜味劑組合物含有約0.5-1毫克R，R莫納甜或其鹽，且基本上不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽。其它實施方案中，一種甜味劑組合物含有富含莫納甜某種立體異構體的混合物，其中所述莫納甜混合物是通過生物合成途徑制造的。一實施方案中，所述生物合成途徑是一種多步驟途徑，且該多步驟途徑的至少步驟是化學轉化。另一實施方案中，所述富含莫納甜某種立體異構體的混合物主要是R，R莫納甜或其鹽。其它實施方案中，一種均勻的桌面甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中該組合物樣品中含有多于2毫克到200毫克莫納甜或其鹽，且所述樣品中的莫納甜或其鹽提供的甜度相當于約0.9-9.0克砂糖。例如，所述均勻的桌面甜味劑組合物樣品提供的甜度可相當于2茶匙砂糖。另一實施方案中，所述均勻的桌面甜味劑組合物樣品的重量約為1克或體積約為0.35mL。另一實施方案中，所述均勻的桌面甜味劑組合物樣品含有多于2毫克到5毫克莫納甜或其鹽。另一實施方案中，所述均勻的桌面甜味劑組合物基本上不含S，S莫納甜或其鹽，或基本上不含R，R莫納甜或其鹽。其它實施方案中，一種桌面甜味劑組合物含有莫納甜或其鹽，其中，所述均勻的桌面甜味劑組合物樣品含有多于2毫克到105毫克莫納甜或其鹽，且所述樣品中的莫納甜或其鹽提供的甜度相當于1茶匙砂糖。另一實施方案中，所述含有莫納甜或其鹽的桌面甜味劑組合物樣品的體積約為0.35ml，或是?；牧系牧⒎襟w。其它實施方案中，桌面甜味劑組合物含有在生物合成途徑中制造的莫納甜組合物，其中所述莫納甜組合物不含石油化學、有毒或危險污染物。例如，所述含有莫納甜或其鹽的莫納甜桌面甜味劑組合物可在生物合成途徑中制造并從重組細胞分離，其中所述重組細胞不含石油化學、有毒或危險污染物。其它實施方案中，提供了一種含有莫納甜或其鹽的甜味劑組合物的方法，其中，所述方法包括從至少一種選自葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和莫納甜前體的物質制造莫納甜或其鹽。其它實施方案中，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與赤蘚醇混合。其它實施方案中，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與海藻糖混合。其它實施方案中，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與環(huán)磺酸鹽混合。其它實施方案中，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與至少一種不是莫納甜或其鹽的其它成分混合。這種成分可包括填充劑、載體、纖維，糖醇、寡糖，蔗糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑、味道穩(wěn)定劑、酸化劑、抗結劑、助流動劑及其任何組合。一實施方案中，至少一種其它成分選自麥芽糊精、葡萄糖、赤蘚醇和纖維。其它實施方案中，在制造該甜味劑組合物的方法中，重約1克的該甜味劑組合物含有約0-200毫克S，S莫納甜或其鹽和約0-5毫克R，R莫納甜或其鹽，且該部分提供的甜度相當于2茶匙砂糖。其它實施方案中，在制造該甜味劑組合物的方法中，重約1克的該甜味劑組合物含有約0-25毫克S，S莫納甜或其鹽和約0-0.625毫克R，R莫納甜或其鹽，其中一定體積該組合物的甜度相當于相同體積的砂糖?；蛘?，在制造該甜味劑組合物的方法中，1克組合物含有約0-25毫克S，S莫納甜或其鹽和約0-0.625毫克R，R莫納甜或其鹽，其中1克組合物的甜度相當于約0.9-9.0克砂糖?；蛘?，在制造該甜味劑組合物的方法中，每1克組合物含有約5-200毫克S，S莫納甜或其鹽。其它實施方案中，制造該甜味劑組合物的方法還包括將S，S莫納甜或其鹽與至少一種選自以下的其它成分混合填充劑、載體、纖維、糖醇、寡糖、糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑、味道穩(wěn)定劑、酸化劑、抗結劑、助流動劑及其任何組合，其中每1克組合物含有約3-200毫克莫納甜或其鹽。其它實施方案中，制造該甜味劑組合物的方法還包括將R，R莫納甜或其鹽與至少一種選自以下的其它成分混合填充劑、載體、纖維、糖醇、寡糖、糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑、味道穩(wěn)定劑、酸化劑、抗結劑、助流動劑及其任何組合，其中每1克組合物含有約3-5毫克R，R莫納甜或其鹽每1克組合物。其它實施方案中，制造該甜味劑組合物的方法包括使每1克組合物含有約0.4-5毫克R，R莫納甜或其鹽。其它實施方案中，制造該甜味劑組合物的方法包括將莫納甜或其鹽與至少一種選自葡萄糖和麥芽糊精的填充劑混合物，其中每1克組合物含有約5毫克R，R莫納甜或其鹽。其它實施方案中，制造該甜味劑組合物的方法包括將莫納甜或其鹽與麥芽糊精混合，其中每1克組合物含有約0.5-1毫克R，R莫納甜或其鹽。其它實施方案中，在制造含有莫納甜組合物的甜味劑組合物的方法中，所述方法包括在生物合成途徑中制造莫納甜組合物，且其中所述莫納甜組合物不含石油化學、有毒或危險污染物?；蛘撸摲椒òㄔ谝欢嗖襟E途徑中從底物制造莫納甜組合物，其中所述多步驟途徑中的一個或多個步驟是生物轉化，且其中所述莫納甜組合物不含石油化學、有毒或危險污染物。其它實施方案中，在制造含有莫納甜組合物的甜味劑組合物的方法中，所述方法包括在生物合成途徑中制造莫納甜組合物，且其中所述莫納甜組合物由莫納甜或其鹽以及其它可食用或可飲用的物質構成?；蛘?，該方法包括在一多步驟途徑中從底物制造莫納甜組合物，其中所述多步驟途徑中的一個或多個步驟是生物轉化，且其中所述莫納甜組合物由莫納甜或其鹽以及其它可食用或可飲用的物質構成。其它實施方案中，在制造含有莫納甜組合物的甜味劑組合物的方法中，所述方法包括(a)在重組細胞的生物合成途徑中制造莫納甜或其鹽；(b)從所述重組細胞分離莫納甜組合物，其中，所述莫納甜組合物由莫納甜或其鹽以及其它可食用或可飲用的物質組成。精通本領域的技術人員通過這里的描述將顯見，本發(fā)明的具體實施方案涉及上述一個方面或上述一個方面與其它方面的組合。附圖簡述圖1顯示用于生成莫納甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑。一種途徑通過色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一種通過吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。隨后通過MP中間體生成莫納甜。框中所示化合物是生物合成途徑中生成的底物和產物。與箭頭相鄰的組合物是輔因子或可在底物轉化成產物期間使用的反應物。所用輔因子或反應物取決于生物合成途徑的特定步驟使用的多肽。輔因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不取決于多肽的反應，因此僅提供PLP可從底物進行到產物。圖2是使用MP中間體的生物合成途徑的更詳細圖。途徑中各步驟的底物以框顯示。允許底物間轉化的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過其普通名稱和酶分類(EC)號描述。圖3顯示將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑的更詳細圖。底物以框顯示，允許底物間轉化的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過其普通名稱和EC號描述。圖4顯示一種經化學方法產生MP的可能反應。圖5A和5B是色譜圖，顯示LC/MS鑒定的酶法生成的莫納甜。圖6是酶法合成莫納甜的電噴射質譜。圖7A和7B是LC/MS/MS子離子分析酶混合物中生成的莫納甜的色譜圖。圖8是色譜圖，顯示酶法生成莫納甜的高分辨質譜測量。圖9A-9C是色譜圖，顯示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成莫納甜的手性分離。圖10是柱狀圖，顯示IPTG誘導后細菌細胞中生成的相對量的莫納甜。(-)表示缺乏底物加入(不加入色氨酸或丙酮酸)。圖11-12是示意圖，顯示用于增加莫納甜產量的途徑，莫納甜產生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。圖13是示意圖，顯示能用于增加莫納甜產量的途徑，莫納甜產生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。圖14表示用莫納甜的R，R立體異構體獲得的用量反應曲線。圖15表示用莫納甜的R，R/S，S立體異構體獲得的用量反應曲線。圖16比較了莫納甜的R，R/S，S立體異構體混合物與糖精的用量反應曲線。圖17顯示了用合成法制造的莫納甜標準品的反相色譜。圖18顯示了莫納甜標準品的手性色譜。發(fā)明詳述莫納甜生物合成途徑的概述提供下列術語和方法的解釋以更好地描述本說明書并指導本領域普通技術人員實踐本發(fā)明。如本文所用，“含有”指“包括”。此外，單數形式包括復數參考物，除非上下文另有明確規(guī)定。如圖1-3和11-13所示，許多生物合成途徑能用于生成莫納甜或其中間體如吲哚-3-丙酮酸或MP。為將各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)轉化成各產物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫納甜)，可使用一些不同多肽。此外，這些反應可體內、體外完成，或通過體內反應和體外反應的組合，如包括非酶化學反應的體外反應。因此，圖1-3和11-13是示范，顯示能用于獲得所需產物的多種不同途徑。葡萄糖到色氨酸許多生物體能從葡萄糖合成色氨酸。含從葡萄糖和/或色氨酸生成莫納甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的構建物可克隆入這種生物體中。本文顯示色氨酸可轉化成莫納甜。在其它例子中，生物體用已知多肽改造以生成色氨酸或超量產生色氨酸。例如，美國專利號4,371,614描述用質粒轉化大腸桿菌菌株，質粒含野生型色氨酸操縱子。美國專利號4,371,614所述色氨酸的最大效價約為230ppm。類似地，WO8701130描述遺傳改造大腸桿菌菌株以生成色氨酸并討論增加發(fā)酵生產L-色氨酸。本領域技術人員認識到能從葡萄糖生成色氨酸的生物體也能利用其它可轉化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，結果類似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纖維素或甘油。色氨酸到吲哚-3-丙酮酸一些多肽可用于將色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括但不限于酶種類(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21。這些種類包括但不限于稱為色氨酸轉氨酶的多肽(也稱為L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸轉氨酶、色氨酸轉氨酶、5-羥基色氨酸-酮戊二酸轉氨酶、羥基色氨酸轉氨酶、L-色氨酸氨基轉移酶、L-色氨酸轉氨酶、L-色氨酸2-氧戊二酸轉氨酶)，它將L-色氨酸和2-氧戊二酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸轉氨酶，它將D-色氨酸和2-含氧酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脫氫酶(也稱為NAD(P)-L-色氨酸脫氫酶、L-色氨酸脫氫酶、L-Trp-脫氫酶、TDH和L-色氨酸NAD(P)氧化還原酶(脫氨))，它將L-色氨酸和NAD(P)轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脫氫酶，它使D-氨基酸和FAD轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸轉氨酶(也稱為L-色氨酸-α-酮異己酸轉氨酶和L-色氨酸苯基丙酮酸轉氨酶)，它將L-色氨酸和苯基丙酮酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也稱為蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸氧氧化還原酶(脫氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2轉化成2-含氧酸和NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶(也稱為蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸氧氧化還原酶(脫氨))，它將D-氨基酸和H2O和O2轉化成2-含氧酸和NH3和H2O2；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H2O和O2轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H2O2。這些種類也含有酪氨酸(芳族)轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)轉氨酶和有多種轉氨酶活性的廣(多底物)轉氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。轉氨酶種類中有這種活性的11個成員描述于下面的實施例1，包括SEQIDNOS11和12所示的新轉氨酶。因此，本發(fā)明提供分離的核酸和氨基酸序列，與SEQIDNOS11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性。本發(fā)明也涵蓋SEQIDNOS11和12的片段和融合，它們保持轉氨酶活性或編碼有轉氨酶活性的多肽。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000個SEQIDNO11的毗連核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350個SEQIDNO12的毗連核苷酸。所示序列(和其變體、片段和融合)可以是載體的一部分。載體能用于轉化宿主細胞，從而生成重組細胞，重組細胞可從色氨酸產生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能進一步生成MP和/或莫納甜。已知L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，序列可分離自一些不同來源，如地中海蝰(Viperalebetine)(spP81375)、眼睛王蛇(Ophiophagushannah)(spP81383)、紅口蝮(Agkistrodonrhodostonma)(spP81382)、西部菱斑響尾蛇(Crotalusatrox)(spP56742)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepaica)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、新月柄桿菌(Caulobactercresentus)、萊因哈德衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、小鼠(Musmusculus)、丁香假單胞菌(P.Syringae)、和紅球菌(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文獻且能分離自例如鬼傘屬(Coprinus)SF-1、有根腫病的大白菜、擬南芥和哺乳動物的肝。能將色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的1個L-氨基酸氧化酶類成員討論于下面的實施例3以及分子克隆的另外來源。許多D-氨基酸氧化酶基因在分子克隆的數據庫中是有用的。已知色氨酸脫氫酶，且可分離自例如菠菜、豌豆(Pisumsativum)、柔黃花牧豆樹(Prosopisjuliflora)、豌豆、牧豆樹、小麥、玉米、番茄、煙草、紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)和乳桿菌(Lactobacilli)。已知許多D-氨基酸脫氫酶基因序列。如圖11-13所示，如果氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶用于使色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸，能加入過氧化氫酶以減少或甚至去除過氧化氫的存在。吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的反應可通過多種多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽類的成員。1.1.1.110多肽類包括吲哚乳酸脫氫酶(也稱為吲哚乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3類包括乳酸脫氫酶(也稱為乳酸脫氫酶、乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.1.222類包含(R)-4-羥苯基乳酸脫氫酶(也稱為D-芳族乳酸脫氫酶、R-芳族乳酸脫氫酶和R-3-(4-羥苯基)乳酸NAD(P)+2-氧化還原酶)且1.1.1.237類包含3-(4-羥苯基丙酮酸)還原酶(也稱為羥苯基丙酮酸還原酶和4-羥苯基乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.3.-類包含乳酸氧化酶，1.1.1.111類包含(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(也稱為(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸NAD(P)+氧化還原酶)?？赡苓@些種類中的一些多肽能從吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。此轉化的例子提供于實施例2。化學反應也能用于將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸。這種化學反應包括能用一些方法完成的氧化步驟，例如空氣氧化，使用B2催化劑(ChinaChemicalReporter，13卷，28期，18頁(1)，2002)、金屬催化劑存在時稀釋高錳酸鹽和高氯酸鹽或過氧化氫。吲哚-3-丙酮酸到2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸轉化成MP。示范多肽種類包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。這些種類包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2種羧酸底物縮合的醛縮酶。肽類EC4.1.3.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電體，而EC4.1.2.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作為親電體。例如，EP1045-029中所述多肽(EC4.1.3.16、4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也稱為4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶、2-氧-4-羥基戊二酸醛縮酶或KHG醛縮酶)將乙醛酸和丙酮酸轉化成4-羥基-2-酮戊二酸，多肽4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17，也稱為4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛縮酶)縮合2種酮酸如2個丙酮酸到4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用這些裂合酶的反應。圖1-2和11-13顯示這些反應的示意圖，其中3-碳(C3)分子結合吲哚-3-丙酮酸。EC4.1.2.-和4.1.3.-的許多成員特別是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如絲氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇縮合需要此途徑的3個碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作為C3碳源且可轉化成丙酮酸。丙氨酸可通過許多利用PLP的轉氨酶來轉氨以產生丙酮酸，包括許多上述的轉氨酶?？赏ㄟ^β消除反應(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)獲得丙酮酸和氨，反應用于L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有足夠離去基團的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-絲氨酸、O-芐基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-芐基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-?；?L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介導的β-裂合酶反應中用作丙酮酸的來源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC4.1.99.2，也稱為酪氨酸-酚裂合酶)催化的反應。通過在(4.1.99.1-2)多肽上進行定點突變可增加β-裂合酶反應速度，如Mouratou等(J.Biol.Chem2741320-5，1999)和實施例8所述。這些修飾使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸鹽也能用作丙酮酸的來源，且通過加入乳酸脫氫酶和氧化輔因子或乳酸氧化酶和氧來氧化成丙酮酸。這些反應的例子描述于下。例如，如圖2和圖11-13所示，當丙酮酸用作C3分子時，ProA醛縮酶能接觸吲哚-3-丙酮酸。MP可用化學反應產生，如實施例5提供的醛醇縮合。MP到莫納甜MP到莫納甜的轉化可由下列1個或多個催化色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)或更多轉氨酶家族(2.6.1.-)的一般成員如天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸轉氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)轉氨酶(圖2)。轉氨酶類的11個成員描述于下(實施例1)，包括SEQIDNOS11和12所示新的種類成員，實施例7提供證明轉氨酶和脫氫酶活性的反應。此反應也能用化學反應進行。酮酸(MP)胺化通過還原性胺化用氨和氰硼氫化鈉進行。圖11-13顯示另外的多肽，它們能用于使MP轉化成莫納甜以及增加來自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫納甜產量。例如，如果天冬氨酸用作氨基供體，天冬氨酸轉氨酶能用于使天冬氨酸轉化成草酰乙酸(圖11)。草酰乙酸通過脫羧酶轉化成丙酮酸和二氧化碳，如草酰乙酸脫羧酶(圖11)。此外，如果賴氨酸用作氨基供體，賴氨酸ε轉氨酶可用于使賴氨酸轉化成ε-醛基賴氨酸(圖12)。ε-醛基賴氨酸自發(fā)轉化成1-哌啶6-羧酸鹽(圖12)。如果能催化還原性胺化反應的多肽(如谷氨酸脫氫酶)用于將MP轉化成莫納甜，可使用能再循環(huán)NAD(P)H和/或生成揮發(fā)性產物的多肽，如甲酸脫氫酶。設計生物合成途徑中的另外考慮取決于哪種多肽用于產生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜，能提供輔因子、底物和/或另外多肽給生產細胞以提高產物形成。此外，可設計遺傳修飾來提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜等產物的產量。類似的，使用宿主細胞可使莫納甜生產最優(yōu)化。去除過氧化氫過氧化氫(H2O2)是產物，如果產生，可對生產細胞、多肽或產生的產物(如中間體)有損害。上述L-氨基酸氧化酶產生H2O2作為產物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平減少以降低對細胞或產物的潛在損傷。過氧化氫酶能用于降低細胞中的H2O2水平(圖11-13)。生產細胞可表達編碼過氧化氫酶(EC1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化過氧化氫降解成水和氧氣。例如，過氧化氫酶可從轉染入生產細胞的載體中表達。能使用的過氧化氫酶例子包括但不限于tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus))、tr|Q9KBE8(耐鹽桿菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天蘭色鏈霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黃單胞菌)(SwissProt登錄號)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反應也能包含過氧化氫酶多肽。吡哆醛5’-磷酸(PLP)有效性的調節(jié)如圖1所示，PLP可用于本文所述1個或多個生物合成步驟。能補充PLP濃度，從而PLP不成為對反應總效率的限制。充分研究大腸桿菌中維生素B6(PLP的前體)的生物合成途徑且已結晶一些蛋白(Laber等，FEBSLetters，44945-8，1999)。其它代謝途徑中需要2個基因(epd或gapB和serC)，而3個基因(pdxA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成獨有的。大腸桿菌途徑中的起始物質之一是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。從共同的2和3碳中心代謝物合成此前體是由多肽1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前體是蘇氨酸衍生物，它形成自4-碳糖，D-赤蘚糖4-磷酸。轉化到磷酸-4-羥基-L蘇氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一個反應是DXP與HTP間的復雜分子內縮合和閉環(huán)反應，由pdxA和pdxJ的基因產物催化。如果PLP成為發(fā)酵生產莫納甜期間的限制營養(yǎng)物，1個或多個途經基因在生產宿主細胞中的表達增加可用于提高莫納甜產量。宿主生物體可包含多個其天然途徑基因的拷貝或非天然途徑基因的拷貝可摻入生物體基因組中。另外，補救途徑基因的多個拷貝能克隆入宿主生物體中。1個在所有生物體中保守的補救途徑使多種維生素B6的衍生物再循環(huán)成活性PLP形式。參與此途徑的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。過量表達1個或多個這些基因可增加PLP有效性。提高維生素B6水平可通過去除或阻抑宿主生物體中天然生物合成途徑基因的代謝調節(jié)。PLP阻抑多肽，此多肽參與黃桿菌屬(Flavobacterium)菌株238-7中前體蘇氨酸衍生物的生物合成。此細菌菌株無代謝控制，過度生成吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以類似方式遺傳操作產生莫納甜的宿主生物體可增加PLP生成而不過度表達生物合成途徑基因。銨利用能驅動色氨酸酶反應趨向合成方向(從吲哚生成色氨酸)，這是通過制備更能利用的氨或去除水。還原性胺化反應如由谷氨酸氫化酶催化的反應，也能通過銨過量來驅動。氨可作為碳酸或磷酸緩沖系統(tǒng)中的碳酸銨或磷酸銨鹽而得到。氨也能作為丙酮酸銨或甲酸銨提供。另外，如果反應偶聯(lián)產生氨的反應如谷氨酸脫氫酶或色氨酸脫氫酶，可提供氨。加入EC4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能產生氨，底物會水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通過酶水解其優(yōu)選底物也能使增加的合成產物的產量超過正常平衡量。除去產物和副產物色氨酸經色氨酸轉氨酶轉化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影響吲哚-3-丙酮酸的產率，因為反應生成谷氨酸并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酸可引起轉氨酶的抑制，反應會消耗大量共底物。此外，高谷氨酸濃度對下游分離過程有害。多肽谷氨酸脫氫酶(GLDH)將谷氨酸轉化成2-氧戊二酸，從而在反應中再循環(huán)共底物，反應由色氨酸轉氨酶催化。GLDH也產生還原等價物(NADH或NADPH)，能用于在需氧條件下產生細胞所用能量(ATP)。通過GLDH利用谷氨酸也減少副產物形成。另外，反應產生氨，它能用作細胞的氮源或作為圖1所示最后步驟中還原性胺化的底物。因此，過度表達GLDH多肽的生產細胞能用于增加產量和降低培養(yǎng)基和/或分離方法的成本。在色氨酸到莫納甜的途徑中，如果使用來自適當酶類的轉氨酶，步驟3的氨基供體(如谷氨酸或天冬氨酸)可反轉化成步驟1所需的氨基受體(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途徑的2個獨立的轉氨酶能提高此途徑的效率，其中1個轉氨酶的底物不競爭性地抑制其它轉氨酶的活性。所述途徑中的許多反應是可逆的且因此會到達底物和產物間的平衡?？赏ㄟ^從多肽中連續(xù)取出產物來增加此途徑的產量。例如，莫納甜用通透酶或其它轉運蛋白分泌入發(fā)酵液或者從生物催化反應器流中選擇性結晶莫納甜并伴隨底物再循環(huán)會提高反應產量。通過另外的酶反應或氨基供體基團的取代來去除副產物是另一種增加反應產量的方法。一些例子討論于實施例13且示于圖11-13。生成的副產物不能在反方向中反應，這是通過相變(蒸發(fā))或自發(fā)轉化成惰性的終產物如二氧化碳。底物庫的調節(jié)調節(jié)吲哚庫可通過增加色氨酸前體生成和/或改變包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代謝途徑。例如，減少或去除從吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸可通過功能性缺失宿主細胞中編碼EC4.1.1.74的基因。減少或去除從色氨酸生成吲哚可通過功能性缺失宿主細胞中編碼EC4.1.99.1的基因。另外，過量吲哚能用作體外或體內過程中的底物，結合增加量的編碼EC4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.andBioeng.，82604-6，1996)。此外，可進行遺傳修飾以增加中間體的水平，如D-赤蘚糖4-磷酸和分支酸。在大部分生物體中調節(jié)色氨酸生成。一種機制是通過反饋抑制途徑中的某些酶；隨著色氨酸水平增加，色氨酸的產率減少。因此，當使用經色氨酸中間體生成莫納甜的工程宿主細胞時，可使用對色氨酸濃度不敏感的生物體。例如，玫瑰長春花(Catharanthusroseus)品系抗多種色氨酸類似物的生長抑制，它通過反復暴露于高濃度5-甲基色氨酸來選擇(Schallenberg和Berlin，ZNaturforsch34541-5，1979)。可能由于基因突變，所得品系的色氨酸合酶活性受到產物抑制的影響小。類似地，用于莫納甜生成的宿主細胞可最優(yōu)化。最優(yōu)化色氨酸生成可使用定向進化，以形成對產物抑制不太敏感的多肽。例如，篩選能在培養(yǎng)基中不含色氨酸的平板上進行，但具有高水平的非代謝色氨酸類似物。美國專利號5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加發(fā)酵生物體中色氨酸產率的方法。色氨酸生物合成的最后步驟是加入絲氨酸到吲哚；因此能提高絲氨酸的有效性以增加色氨酸生成。可通過增加宿主生物體產生的丙酮酸量來提高發(fā)酵生物體產生的莫納甜量。一些酵母如絲孢酵母菌(Trichosporoncutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35338-42，2002)和光滑球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)(Li等，ApplMicrobiol.Biotechnol.57451-9，2001)超量產生丙酮酸且能用于實踐本文所述方法。此外，可對生物體進行遺傳修飾以促進丙酮酸生成，如在大腸桿菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.andBioeng.82604-6，1996)中。控制手性通過控制立體化學(手性)能改變莫納甜的味覺分布。例如，不同食物系統(tǒng)的濃度不同的混合物中需要不同的莫納甜異構體。手性可通過pH和多肽的組合控制。通過去質子化和再質子化α碳可在莫納甜的C-4位置(見上面編號的分子)外消旋，這能通過pH變化或與輔因子PLP反應來發(fā)生。在微生物中，pH不太可能變化到足以引起外消旋，但PLP是豐富的。控制多肽手性的方法取決于用于生成莫納甜的生物合成途徑。當莫納甜用圖2所示途徑形成時，可考慮下列各項。在生物催化反應中，碳-2的手性由酶確定，酶將吲哚-3-丙酮酸轉化成MP。多種酶(如來自EC4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸轉化成MP，因此可選擇形成所需異構體的酶。另外，將吲哚-3-丙酮酸轉化成MP的酶的對映特異性可用定向進化修飾或能改造催化抗體以催化所需反應。一旦生成MP(通過酶法或化學縮合)，可用轉氨酶立體特異性加入氨基，如本文所述的轉氨酶。能產生碳-4的R或S構象，這取決于使用D-還是L-芳族酸轉氨酶。大部分轉氨酶對L-異構體特異，然而，D-色氨酸轉氨酶存在于一些植物(Kohiba和Mito，《第8屆國際維生素B6和羰基催化討論會會議錄》，日本大阪，1990)。此外，鑒定了D-丙氨酸轉氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸轉氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸轉氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸轉氨酶(2.6.1.22)。一些轉氨酶僅接受在C2碳有特定構象的此反應的底物。因此，即使轉化成MP不是立體定向的，可通過適當選擇轉氨酶控制終產物的立體化學。由于反應是可逆的，未反應MP(不需要的異構體)可再循環(huán)回到其組分且可再形成MP的外消旋混合物。底物的激活磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸鹽(PEP)可用于本文所示反應。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反應速度和/或產量。在醛醇縮合中，加入磷酸基團穩(wěn)定親核底物的烯醇相互轉化異構體，使它更具反應性。在其它反應中，磷酸化底物通常提供更好的離去基團。類似地，可通過轉化成CoA衍生物或焦磷酸鹽衍生物激活底物。莫納甜在甜味劑組合物中的用途按重量計，莫納甜的S，S立體異構體比蔗糖甜約50-200倍。按重量計，莫納甜的R，R立體異構體比蔗糖甜約2000-2400倍。如上所述，莫納甜的甜度是由有經驗的感覺鑒定員在甜度比較過程中計算的，該過程將測試甜味劑溶液與一系列參考溶液之一的甜度進行比較。例如，溶液可用含有0.16％(v/w)檸檬酸和0.02％(v/w)檸檬酸鈉的緩沖液(pH3.0)制備。計算用量反應曲線的斜率作為甜度，即將％蔗糖除以％莫納甜。例如可見圖15(R，R/S，S莫納甜用量反應曲線)；圖14(R，R莫納甜用量反應曲線)。通過測量8％蔗糖等價值(“SEV”)時的斜率獲得了相比蔗糖甜度的上述莫納甜的甜度。莫納甜可以消費者喜歡的濃度溶于含水溶液。在某些基料中或與其它甜味劑混合時莫納甜立體異構體混合物的質量可能較好。將莫納甜與其它甜味劑混合可使甜味強度和/或曲線最大且成本最低。莫納甜可與其它甜味劑和/或其它成分組合以產生類似于蔗糖的時間曲線，或獲得其它益處。例如，莫納甜可與其它營養(yǎng)和非營養(yǎng)甜味劑混合以獲得特定的味道或卡路里目標。因此，甜味劑組合物可包括莫納甜與一種或多種以下甜味劑類型的組合(1)糖醇(如赤蘚醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、異麥芽糖、低糖糖漿等)；(2)其它高強度甜味劑(如阿斯巴特、三氯蔗糖、糖精、乙酰舒泛鉀、蛇菊苷、環(huán)磺酸鹽、紐甜(neotame)、甜蛋白(thaumatin)、阿力甜(alitame)、二氫查耳酮、莫尼糖蛋白、甘草皂素(glycyrrihizin)、羅漢果苷、葉甜素、馬檳榔甜素、brazzein、多肽菌素、Pentadin等)，以及(3)營養(yǎng)甜味劑(如蔗糖、塔格糖、轉化糖、果糖、玉米糖漿、高果糖玉米糖漿(HFCS)、葡萄糖/葡萄糖、海藻糖、異麥芽酮糖等)。莫納甜可作為味道修飾劑用于這種混合物以抑制后味、強化其它味道，如檸檬味，或改善暫時味道特征。數據還顯示，莫納甜與環(huán)磺酸鹽(在歐洲使用)有協(xié)同作用，但與阿斯巴特、糖精、乙酰舒泛鉀、三氯蔗糖或碳水化合物甜味劑的協(xié)同作用不明顯。由于，莫納甜不是碳水化合物，莫納甜可部分或完全代替含有碳水化合物的甜味劑。莫納甜在干燥形式下穩(wěn)定，并在單獨或與碳水化合物混合物時具有所需味道表現。它未顯示出不可逆轉的分解，但在低pH時傾向于形成內酯和/或內酰胺(在含水緩沖液中)并達到平衡。在溶液中，它可在4位緩慢外消旋，但這通常在高pH下發(fā)生。通常，莫納甜的穩(wěn)定性相當于或好于阿斯巴特(Equal)，莫納甜的味道表現相當于或好于其它品質的甜味劑，如阿斯巴特(Equal)、阿力甜和三氯蔗糖(Splenda)。相比糖精和蛇菊苷等其它高強度甜味劑，莫納甜沒有不好的后味。莫納甜甜味劑制品可用作桌面蔗糖替代物。通常，當制造桌面蔗糖替代物時，我們可以使用填充劑和/或載體來稀釋莫納甜以便于測量。一實施方案中，我們可制造方便的獨立包裝，這種獨立包裝提供的甜度相當于2茶匙(約8克)砂糖的甜度。由于S，S比蔗糖甜50-200倍，因此40-160毫克S，S莫納甜提供的甜度相當于8克砂糖。因此，一實施方案中，為實現+/-25％的甜度優(yōu)化，1克莫納甜獨立包裝制品可含有約40-200毫克S，S莫納甜。同樣，由于R，R比蔗糖甜2000-2400倍，3.3-4.0毫克R，R莫納甜提供的甜度相當于8克蔗糖。因此，另一實施方案中，為實現+/-25％的甜度優(yōu)化，1克莫納甜獨立包裝制品可含有約3.3-5.0毫克R，R莫納甜。另一實施方案中，每克這種包裝制品可含有40-200毫克S，S莫納甜、3.3-5.0毫克R，R莫納甜或其相同量或較少量的組合，以提供可與2茶匙砂糖相比的甜度。桌面甜味劑包裝通?？偣埠?克高強度甜味劑和一種或多種填充劑或載體的混合物?？墒褂枚喾N填充劑或填充劑的組合來制造這種制品。例如，一些實施方案中，莫納甜可與麥芽糊精和/或葡萄糖一起噴霧干燥。例如，葡萄糖提供較大密度，仍可用于甜味劑包裝(約1克)以使每份的熱量降至約0卡路里。一實施方案中，含有莫納甜的包裝制品(總重1克)含有葡萄糖(營養(yǎng)性)0-99.7wt％麥芽糊精0-99.7wt％3.3-5.0毫克R，R莫納甜，40-200毫克S，S莫納甜或其相同量或較少量的組合。其它實施方案中，即用型桌面甜味劑制品被設計成其甜度和體積相當于砂糖(蔗糖)的甜度和體積。這種制品可以“匙對匙”的方式代替砂糖，這在烘焙配方中尤其有用。與包裝制品(約1克)相比，這種即用型“匙對匙”制品通常含有更多的稀釋物，如填充劑和/或載體，這使其在家庭中便能定量，如用茶匙、湯匙或杯子。相比包裝形式，這種制品通常有較低的密度和較少顆粒。因此，這種即用型“匙對匙”制品可含有不同的成分以降低密度并使這種制品可等量代替蔗糖使用。例如，由于葡萄糖的密度較大，我們在制造這種即用型“匙對匙”制品便可單獨使用麥芽糊精。麥芽糊精的低密度使得甜味劑制品可等體積代替蔗糖使用而不會積累相同(高)水平的卡路里。當以一滿匙或一滿杯使用莫納甜甜味劑時這將更加有效，如用于烘焙。由于S，S比蔗糖甜50-200倍，5-20毫克S，S莫納甜提供的甜度相當于1克砂糖。因此，一實施方案中，為實現+/-25％的甜度優(yōu)化，每克即用型“匙對匙”制品可含有約5-25毫克S，S莫納甜。同樣，由于R，R比蔗糖甜2000-2400倍，0.4-0.5毫克R，R莫納甜提供的甜度相當于1克蔗糖。因此，另一實施方案中，為實現+/-25％的甜度優(yōu)化，即用型“匙對匙”制品可含有約0.4-0.625毫克R，R莫納甜。另一實施方案中，這種即用型制品可含有5-25毫克S，S莫納甜、0.4-0.625毫克R，R莫納甜或其相同量或較少量的組合，以提供可與蔗糖相比的甜度。另一實施方案中，每份0.5克即用型甜味劑制品含有約0.2-13毫克莫納甜，它被噴霧干燥到大約500毫克麥芽糊精上。其它實施方案中，我們可制造立方體形狀的莫納甜組合物以用于，例如，餐廳。這種立方體的重量約為8克，且與標準方糖的大小相等，即2.2cm×2.2cm×1cm。這些立方體制品含有的莫納甜的量類似于上述即用型制品，因此這種立方體的甜度相當于標準方糖?；蛘?，我們可以制造大小的立方體(4克，1.1cm×2.2cm×1cm)。這些制品提供的甜度相當于標準方糖(因此以重量計，其甜度約為蔗糖的2倍)。莫納甜桌面制品，如小包裝或即用型組合物，也可含有其它填充劑或載體。例如，所述制品可含有一種或多種纖維，如菊粉、阿拉伯半乳聚糖、水解瓜爾膠、聚葡萄糖、微晶纖維素、solkafloc、淀粉、變性淀粉、抗性淀粉、抗性麥芽糊精等。許多纖維高度溶于水、具有第粘度和溫和的味道。纖維是特別有用的填充劑，因為它們相比其它填充劑含有較少熱量。例如，每克菊粉僅提供1.3卡路里，而相同量的葡萄糖提供4卡路里。每克脫糖菊粉(含有＜2％單糖和二糖)僅提供1.1卡路里，因此是特別好的選擇。相比麥芽糊精，某些纖維(如菊粉)有助于形成更加像砂糖樣的外觀，它們通常被用于杯對杯的蔗糖替代品。纖維還可提供其它優(yōu)點，如營養(yǎng)強化、促進內臟健康、增加鈣質吸收等等。使用不可消化的碳水化合物，如纖維或抗性淀粉衍生物，還能降低蔗糖含量(例如對于糖尿病患者)。例如，我們可使用抗性淀粉、抗性麥芽糊精和菊粉以獲得低熱量、低糖和低胰島素源性載體和稀釋劑。同樣，莫納甜制品可含有一種或多種糖醇，如赤蘚醇、山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甘露醇和乳糖醇。一實施方案中，我們可用赤蘚醇代替其它載體或填充劑。赤蘚醇提供優(yōu)于葡萄糖或麥芽糊精的一些優(yōu)點。例如，相比葡萄糖和麥芽糊精，赤蘚醇提供的熱量很少或幾乎沒有一每克赤蘚醇提供0-0.2卡路里，而每克葡萄糖提供4卡路里，每克麥芽糊精提供2.8-3.2卡路里。見LynO′BrienNabors編的《甜味劑替代物》(ALTERNATIVESWEETENERS)，第三版，M.E.Embuscado和S.K.Patil編寫的第13章“赤蘚醇”(MarcelDekker，Inc，NewYork2001)。同時，當噴霧干燥麥芽糊精時，它看上去更像是粉末而不少砂糖。另一方面，赤蘚醇是單晶的，因此看上去像是蔗糖。因此，我們可將莫納甜直接加到赤蘚醇上。此外，所述制品還可含有寡糖，如果寡糖、麥芽寡糖、異麥芽寡糖、半乳寡糖、大豆寡糖和乳寡糖。該制品還可含有糖，如蔗糖、轉化糖、海藻糖、異構糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、D-木糖和異構乳糖等。如果制成片狀，可加入乳糖以增加片的體積和形狀。可用各種方法制造莫納甜和填充劑的組合物，其中包括干法混合、共噴霧干燥、共冷凍干燥、成團、混合、共干燥、擠出或其它方法。我們也可加入香料和酸化劑，如酒石，以改進制品混合物的味道、穩(wěn)定性和/或烘焙特性。我們還可加入味道增強劑或穩(wěn)定劑，如SucramaskTM。所述制品還可含有抗結劑或助流動劑，如二氧化硅(硅石)、硅酸鈣、硅酸鎂、碳酸鈣、鋁硅酸鈉、鋁硅酸鈣、鋁硅酸鉀、磷酸一鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、滑石、甘露醇等。一些實施方案中，莫納甜被用于烘焙。某些實施方案中，在烘焙配方中加入了蜂蜜或糖蜜以使其具有焦糖色外觀和良好質地。例如，一些配方可能會要求加入1湯匙糖蜜以模擬蔗糖的天然焦糖色。另一實施方案中，莫納甜可用來代替許多普遍用于糖果和其它無糖食品的多元醇。這些多元醇有輕瀉作用，而赤蘚醇還有降溫作用。赤蘚醇的輕瀉作用弱于其它多元醇。其它多元醇有和赤蘚醇一樣的降溫作用。與傳統(tǒng)多元醇(如麥芽糖醇)相比，赤蘚醇含有較少卡路里和較低糖分指數。莫納甜能進一步降低卡路里和糖分指數，且不會顯著增加生齲性。然而，當用高強度甜味劑代替多元醇或其它傳統(tǒng)甜味劑(如蔗糖)時，需要填充劑以維持產品的體積可口感。最常見的填充劑包括菊粉、麥芽糊精、聚葡萄糖和山梨糖醇。菊粉還能促進身體攝入膳食鈣質?？剐缘矸酆吐矸垡部捎米鞲邚姸忍鹞秳┑奶畛鋭┗蛳♂寗Ｄ{甜可與許多甜味劑、碳水化合物和填充劑混合使用。相比其它甜味劑，莫納甜桌面混合物將有較長的保存期、較高的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性以及較好的味道和市場銷售優(yōu)勢。實施例實施例1色氨酸轉氨酶的克隆和表達該實施例描述用于克隆色氨酸轉氨酶的方法，它可用于使色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸。實驗概述11個編碼轉氨酶的基因克隆入大腸桿菌中。這些基因是枯草芽孢桿菌D-丙氨酸轉氨酶(dat，Genbank登錄號Y14082.1bp28622-29470和Genbank登錄號NP388848.1分別為核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)酪氨酸轉氨酶(tatA，SEQIDNOS1和2分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細菌菌株2.4.1酪氨酸轉氨酶(tatA通過同源性確定，SEQIDNOS3和4分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球細紅菌35053酪氨酸轉氨酶(通過同源性確定，SEQIDNOS5和6，分別為核酸序列和氨基酸序列)碩大利什曼原蟲廣底物轉氨酶(bsat，通過與來自墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana)的肽片段的同源性確定，SEQIDNO7和8分別為核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢桿菌芳族轉氨酶(araT，通過同源性確定，SEQIDNOS9和10分別為核酸序列和氨基酸序列)、食淀粉乳桿菌芳族轉氨酶(araT，通過同源性確定，SEQIDNOS11和12，分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細菌35053多底物轉氨酶(通過同源性確定，SEQIDNOS13和14分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細菌菌株2.4.1多底物轉氨酶(msa，通過同源性確定，Genbank登錄號AAAE01000093.1，bp14743-16155和Genbank登錄號ZP00005082.1分別為核酸序列和氨基酸序列)、大腸桿菌天冬氨酸轉氨酶(aspC，Genbank登錄號AE000195.1bp2755-1565和Genbank登錄號AAC74014.1分別為核酸序列和氨基酸序列)和大腸桿菌酪氨酸轉氨酶(tyrB，SEQIDNOS31和32分別為核酸序列和氨基酸序列)?？寺?、表達了基因并測試它在色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸中的活性，與可商業(yè)購買的酶一起。所有11個克隆有活性。鑒定可包含具有所需活性的多肽的細菌菌株NCBI(全國生物技術信息中心)數據庫中沒有基因命名為色氨酸轉氨酶。然而，鑒定了有此酶活性的生物體。在細胞提取物或從純化蛋白中測量到L-色氨酸轉氨酶(TAT)活性，來源如下羊茅(Festucaoctoflora)的根瘤菌分離物、豌豆線粒體和細胞溶質、向日葵冠癭細胞、豌豆根瘤菌三葉草生物變種(R.leguminosarumbiovartrifoli)、草生歐文氏菌石頭花致病變種(E.herbicolapv.gypsophilae)、丁香假單胞菌薩氏致病變種(P.syringaepv.savastanio)、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillumlipferum)、巴西固氮螺菌(A.brasilense)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、團聚腸桿菌(Enterobacteragglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、麥芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠腦、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(L.Lactis)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、瑞士乳桿菌(L.Helveticus)、小麥苗、大麥、金色菜豆(Phaseolusaureus)(綠豆)、葡萄狀酵母(卡爾斯伯根糖酵母)、利什曼原蟲屬、玉米、番茄莖、豌豆植物、煙草、豬、生孢梭菌(C.Sporogenes)和灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)。實施例2吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸如圖1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸間的轉化是可逆反應，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸間的轉化也是這樣。由于在340nm來自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通?？筛欉胚?乳酸的氧化。0.1mL標準測定混合物含有100mM磷酸鉀，pH8.0、0.3mMNAD+、7單位乳酸脫氫酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。測定在UV-透明微量滴定板中進行2次，使用MolecularDevicesSpectraMaxPlus板閱讀器?；旌隙嚯暮途彌_液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暫混合后，各孔在340nm的吸光度以9秒間隔閱讀。反應在25℃保持5分鐘。從NAD+生成NADH后，在340nm的吸光度增加。進行單獨的負對照，沒有NAD+且沒有底物。來自腸膜明串珠菌(L.Mesenteroides)的D-LDH(Sigma目錄號L2395)似乎顯示與吲哚衍生物底物的活性大于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Baccilusstearothermophilus)的L-LDH(Sigma目錄號L5275)。類似方法使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物。丙酮酸還原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸與D-LDH氧化反應的Vmax約為乳酸的五分之一。也通過跟蹤在327的吸光度變化(烯醇-硼酸鹽衍生物)測量吲哚-3-丙酮酸的存在，使用含0.5mMEDTA和0.5mM砷酸鈉的50mM硼酸鈉緩沖液。與用于L和D-LDH多肽的負對照相比，觀察到小但可重復的吸光度變化。此外，可克隆廣特異性乳酸脫氫酶(酶活性與EC1.1.1.27、EC1.1.1.28和/或EC1.1.2.3相關)并用于從吲哚-3-乳酸產生吲哚-3-丙酮酸。廣特異性脫氫酶的來源包括大腸桿菌、淋病奈瑟氏球菌和植物乳桿菌(L.plantarum)。另外，生成吲哚-3-丙酮酸可通過吲哚-3-乳酸接觸來自生孢梭菌(C.sporogenes)的細胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)；或接觸克氏表鞭毛型錐蟲(Trypanosomacruziepimastigotes)細胞提取物，提取物含有已知對吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)；或食酸假單胞菌(P.Acidovorans)或大腸桿菌細胞提取物，提取物含有咪唑-5-基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)；或錦紫蘇(Coleusblumei)，它含有羥苯基丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)；或麥芽念珠菌，它含有D-芳族乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)。描述這種活性的參考文獻包括Nowicki等(FEBSMicrobiolLetters，71119-24，1992)、Jean和DeMoss(CanadianJ.Microbiol.141968、Coote和Hassall(Biochem.J.111237-9，1969)、Cortese等(C.R.SeancesSoc.Biol.Fil.162390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.CBiosci.43501-4，1988)和Bhatnagar等(J.GenMicrobiol135353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶如來自假單胞菌屬(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.CatalysisBEnzymatic18299-305，2002)可用于將吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。實施例3用L-氨基酸氧化酶將L-色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸該實施例描述的方法用于經氧化酶(EC1.4.3.2)將L-色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸，作為實施例1所述使用色氨酸轉氨酶的另一種選擇。L-氨基酸氧化酶純化自南美響尾蛇(Crotalusdurissus)(Sigma，St.Louis，MO，目錄號A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸氧化酶的登錄號包括CAD21325.1、AAL14831、NP490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。反應在微離心管中進行，總體積1mL，37℃振蕩孵育10分鐘。反應混合物含有5mML-色氨酸、100mM磷酸鈉緩沖液pH6.6、0.5mM砷酸鈉、0.5mMEDTA、25mM四硼酸鈉、0.016mg過氧化氫酶(83U，SigmaC-3515)、0.008mgFAD(Sigma)和0.005-0.125單位的L-氨基酸氧化酶。負對照含有色氨酸之外的所有成分，空白含有氧化酶之外的所有成分。過氧化氫酶用于去除在氧化脫氨期間形成的過氧化氫。四硼酸鈉和砷酸鈉用于穩(wěn)定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸鹽形式，它在327nm顯示最大吸光度。在反應混合物中制備0.1-1mM濃度的吲哚-3-丙酮酸標準。購得的L-氨基酸氧化酶具有每分鐘每毫克蛋白形成的比活540μg吲哚-3-丙酮酸。這與色氨酸轉氨酶的比活是相同的數量級。實施例4用醛縮酶將吲哚-3-丙酮酸轉化成2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸該實施例描述的方法可用于將吲哚-3-丙酮酸轉化成MP，使用醛縮酶(裂合酶)(圖2)。醛醇縮合是形成碳-碳鍵的反應，鍵在一種醛的β-碳或酮與另一種醛或酮的羰基碳間。在一個底物的羰基相鄰碳上形成碳負離子，并用作親核體攻擊第2個底物的羰基碳(親電碳)。最通常地，親電底物是醛，因此大部分醛縮酶屬于EC4.1.2.-類別。親核底物通常是丙酮酸。醛縮酶不常催化2個酮酸或2個醛間的縮合。然而，鑒定了催化2個羧酸縮合的醛縮酶。例如，EP1045-029描述從乙醛酸和丙酮酸生成L-4-羥基-2-酮戊二酸，使用假單胞菌培養(yǎng)物(EC4.1.3.16)。此外，4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC4.1.3.17)能催化2個酮酸的縮合。因此，類似的醛縮酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸與丙酮酸的縮合。克隆4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛縮酶，EC4.1.3.17)和4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛縮酶，EC4.1.3.16)催化反應很類似圖2的醛縮酶反應。設計引物的突出端與pET30Xa/LIC載體(Novagen，Madison，WI)相容。proA基因產物的活性結果當用IPTG誘導時，睪丸酮叢毛單胞菌proA和苜蓿根瘤菌SMc00502基因構建物有高水平表達。重組蛋白是高度可溶的，如通過SDS-PAGE分析總蛋白和細胞提取物樣品所確定。睪丸酮叢毛單胞菌莖因產物純化至＞95％純度。由于用His-結合柱體親和純化后苜蓿根瘤菌基因產物的產量很低，細胞提取物用于酶測定。兩種重組醛縮酶都催化從吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二價鎂和磷酸鉀的存在。當缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸鉀時，沒有明顯產物。缺乏酶時也形成少量產物(當酶存在時通常不到1個量數量級)。從反相C18柱洗脫的產物峰稍遲于吲哚-3-丙酮酸標準，此峰的質譜顯示292.1的碰撞誘導母離子([M+H]+)，母離子預期產物MP。質譜中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳離子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳離子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。產物也表現出其它含吲哚的化合物的UV光譜特征，如色氨酸，λmax為279-280且有約290nm的小肩。隨著反應溫度從室溫增加到37℃、底物量和鎂量的增加，睪丸酮叢毛單胞菌醛縮酶法生成的MP量提高。酶的合成活性隨著pH增加而減少，在pH7觀察到最多產物。在色氨酸標準基礎上，用20μg純化的蛋白在標準測定下生成的MP量約為10-40μg/mL反應。由于苜蓿根瘤菌和睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶編碼序列與上述其它基因的高度同源性，預期所有重組基因產物能催化此反應。此外，預期有類似活性的醛縮酶在59位和87位有蘇氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有組氨酸(H)的醛縮酶(以睪丸酮叢毛單胞菌的編號系統(tǒng)為基礎)。khg基因產物的活性結果當用IPTG誘導時，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌khg基因構建物有高水平表達，而苜蓿根瘤菌khg的表達水平較低。重組蛋白高度可溶的，如通過SDS-PAGE分析總蛋白和細胞提取物樣品判斷?？莶菅挎邨U菌和大腸桿菌khg基因產物純化到＞95％純度；用His-結合柱體親和純化后，苜蓿根瘤菌基因產物的產量不高。沒有跡象證明此酶活性需要鎂和磷酸鹽。然而，文獻報導在磷酸鈉緩沖液中進行測定，報導的酶是雙功能并對磷酸化底物如2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶測定如上所述進行，在一些情況中省略磷酸鹽。結果表明重組KHG醛縮酶法產生MP，但活性不如ProA醛縮酶。在一些情況中，KHG產生的MP水平幾乎與鎂和磷酸鹽單獨產生的量相同。磷酸鹽似乎不增加KHG活性。桿菌酶活性最高，比單獨鎂和磷酸鹽的活性約高20-25％，如SRM所確定(見實施例10)。根瘤菌酶活性量最低，這可能與表達中注意到的折疊和溶解度問題相關。所有3種酶有活性位點谷氨酸(枯草芽孢桿菌編號系統(tǒng)中的43位)以及與丙酮酸形成Shiff堿基所需的賴氨酸(130位)；然而，枯草芽孢桿菌酶在47位含有活性位點殘基蘇氨酸，而不是精氨酸?？莶菅挎邨U菌KHG較小且似乎在簇中不同于苜蓿根瘤菌和大腸桿菌酶，其它酶有活性位點蘇氨酸?；钚晕稽c的差異可能是枯草芽孢桿菌酶活性增加的原因。改進醛縮酶活性催化抗體可與天然醛縮酶一樣有效，接受廣范圍的底物，并能用于催化圖2所示反應。也能通過定向進化改進醛縮酶，例如上述用于KDPG醛縮酶的例子(與上述KHG高度同源)，KDPG醛縮酶通過DNA改組和易錯PCR逐步形成以去除對磷酸鹽的需求和反轉對映選擇性。KDPG醛縮酶多肽用于生化反應，因為它們高度特異于供體底物(本文是丙酮酸)，但對于受體底物(即吲哚-3-丙酮酸)相對靈活(Koeller和Wong，Nature409232-9，2001)。KHG醛縮酶有縮合丙酮酸與一些羧酸的活性。認為KHG醛縮酶的哺乳動物形式的特異性比細菌形式更廣，包括對4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸活性較高和接受4-羥基-2-酮戊二酸的2種立體異構體。細菌來源似乎對R異構體有10倍的優(yōu)先性?；蚪M數據庫中存在將近100個KHG同系物，在假單胞菌、副球菌、普羅威登斯菌、根瘤菌、摩根氏菌、大腸桿菌和哺乳動物組織中證明活性。這些酶能用作修改對映特異性的起始點，莫納甜生成需要對映特異性。利用丙酮酸和另一底物的醛縮酶能“進化”以修改多肽特異性、速度和選擇性，另一底物是酮酸和/或有大的疏水基團像吲哚。除了本文證明的KHG和ProA醛縮酶之外，這些酶的例子包括但不限于KDPG醛縮酶和相關多肽(KDPH)；來自類諾卡氏菌屬(Nocardioidessp)的轉羧基亞芐基丙酮酸水合酶-醛縮酶；4-(2-羧苯基)-2-氧丁-3-烯醇鹽醛縮酶(2’-羧基亞芐基丙酮酸醛縮酶)，它縮合丙酮酸與2-羧基苯甲醛(一種含芳環(huán)的底物)；來自惡臭假單胞菌(P.Putida)和食芳香物鞘氨醇單胞菌(Sphingomonasaromaticivorans)的反式-O-羥基苯亞甲基丙酮酸水合酶-醛縮酶，它也利用丙酮酸和含芳族的醛作為底物；3-羥基天冬氨酸醛縮酶(赤-3-羥基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)，它使用2-含氧酸作為底物且認為在生物體脫氮微球菌(Micrococcusdenitrificans)中；苯偶姻醛縮酶(苯甲醛裂合酶)，它利用含芐基的底物；二氫新蝶呤醛縮酶；L-蘇-3-苯基絲氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基絲氨酸醛縮酶)，它縮合甘氨酸與苯甲醛；4-羥基-2-氧戊酸醛縮酶；1，2-二羥基芐基丙酮酸醛縮酶和2-羥基亞芐基丙酮酸醛縮酶。通過篩選感興趣的克隆可選擇有所需活性的多肽，使用下列方法。色氨酸營養(yǎng)缺陷型用表達盒上攜帶感興趣克隆的載體轉化且生長于含少量莫納甜或MP的培養(yǎng)基。由于轉氨酶和醛縮酶反應是可逆的，細胞能從莫納甜的外消旋混合物生成色氨酸。類似地，通過利用MP或莫納甜作為碳源和能源的能力可篩選生物體(重組和野生型)。靶醛縮酶的一個來源是多種假單胞菌和根瘤菌菌株的表達文庫。假單胞菌有許多不尋常的分解代謝途徑用于降解芳族分子，它們也含有許多醛縮酶；而根瘤菌含有醛縮酶，已知在植物根際中生長，有許多描述用于構建莫納甜生物合成途徑的基因。實施例5化學合成莫納甜前體實施例4描述的方法使用醛縮酶將吲哚-3-丙酮酸轉化成MP。該實施例描述另一種化學合成MP的方法。MP用典型的醛醇類型縮合形成(圖4)。簡言之，典型的醛醇類型反應包括用強堿基產生丙酮酸酯的碳負離子，如LDA(二異丙基酰胺鋰)、六甲基二硅氮烷鋰或丁基鋰。產生的碳負離子與吲哚-丙酮酸反應以形成偶聯(lián)產物?？捎糜诒Ｗo吲哚氮的保護基團包括但不限于t-丁氧基羰基(Boc)和芐氧基羰基(Cbz)。羧酸的阻斷基團包括但不限于烷基酯(例如甲基、乙基、芐基酯)。當使用這些保護基團時，不可能控制所形成產物的立體化學。然而，如果R2和/或R3是手性保護基團(圖4)如(S)-2-丁醇、薄荷醇或手性胺，可使一種MP對映異構體的形成優(yōu)于另一種。實施例6色氨酸或吲哚-3-丙酮酸轉化成莫納甜體外方法使用轉氨酶和醛縮酶2種酶，從色氨酸和丙酮酸生成莫納甜。在第1個步驟中，α-酮戊二酸是轉氨反應中來自色氨酸氨基的受體，反應產生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛縮酶催化第2個反應，其中丙酮酸在Mg2+和磷酸鹽存在時與吲哚-3-丙酮酸反應，產生莫納甜(MP)2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的α-酮衍生物。轉移第1個反應中形成的谷氨酸的氨基生成所需產物莫納甜。純化和表征產物確定形成的異構體是S，S-莫納甜。描述另外的底物、酶和條件以及對此方法進行的改進。酶克隆、表達和純化來自睪丸酮叢毛單胞菌的醛縮酶、4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛縮酶，proA基因)(EC4.1.3.17)，如實施例4所述?？寺　⒈磉_和純化來自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和苜蓿根瘤菌的4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛縮酶)(EC4.1.3.16)，如實施例4所述。用于結合醛縮酶以生成莫納甜的轉氨酶是大腸桿菌aspC基因編碼的L-天冬氨酸轉氨酶、大腸桿菌tyrB基因編碼的酪氨酸轉氨酶、苜蓿根瘤菌TatA酶、碩大利什曼原蟲bsat基因編碼的廣底物轉氨酶或來自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶(IIa型)。實施例1描述非哺乳動物蛋白的克隆、表達和純化。來自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶(IIa型)獲得自Sigma(#G7005)。使用ProA醛縮酶和L-天冬氨酸轉氨酶的方法1升反應混合物中含有50mM醋酸銨，pH8.0、0.4mMMgCl2、3mM磷酸鉀、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸銨、50mM色氨酸、10mMα-酮戊二酸、160mg重組睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶(未純化細胞提取物，～30％醛縮酶)、233mg重組大腸桿菌L-天冬氨酸轉氨酶(未純化細胞提取物，～40％醛縮酶)。除了酶，所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。隨后加入酶，反應溶液30℃孵育并溫和振蕩(100rpm)3.5小時。酶加入后0.5和1小時，固體色氨酸等分樣品(各50微摩爾)加入反應。所有加入的色氨酸不溶解，但濃度維持于50mM或更高。3.5小時后，濾去固體色氨酸。使用確定的色氨酸量作為標準通過LC/MS分析反應混合物顯示溶液中的色氨酸濃度為60.5mM且莫納甜濃度為5.81mM(1.05g)。下列方法用于純化終產物。90％的清溶液應用于BioRadAG50W-X8樹脂柱(225mL；結合力為1.7meq/mL)。柱用水洗，收集300mL部分，直到280nm的吸光度＜5％首先流過部分的。然后柱用1M醋酸銨，pH8.4洗脫，收集4個300-mL部分。所有4個部分含有莫納甜并用旋轉蒸發(fā)器蒸發(fā)到105mL，蒸發(fā)器裝有溫水浴。隨著體積減小形成沉淀且在蒸發(fā)過程中濾去。通過LC/MS分析柱部分顯示99％色氨酸和莫納甜結合柱。蒸發(fā)過程中形成的沉淀含有＞97％色氨酸和＜2％莫納甜。上清中色氨酸與產物的比例約為2∶1。上清(7ml)應用于100mL快流DEAE瓊脂糖(AmershamBiosciences)柱，柱以前通過0.5L1MNaOH、0.2L水、1.0L1.0M醋酸銨，pH8.4和0.5L水洗轉化成醋酸鹽形式。上清以＜2mL/分鐘上樣，柱用3-4mL/分鐘的水洗直到280nm的吸光度～0。莫納甜用100mM醋酸銨，pH8.4洗脫，收集4個100-mL部分。部分的分析顯示流過部分的色氨酸與莫納甜比例為85∶15且洗脫部分的比例為7∶93。假定莫納甜在280nm的消光系數與色氨酸相同，洗脫部分含有0.146微摩爾產物。對于68％的回收，推斷總共1L的反應會生成約2.4微摩爾(約710mg)莫納甜。來自DEAE瓊脂糖柱的洗脫部分蒸發(fā)到＜20mL。通過應用到C8制備性反相柱進一步純化等分產物，所用色譜條件與實施例10所述用于分析-規(guī)模莫納甜特征的條件相同。WatersFractionlynxTM軟件用于在檢測m/z＝293離子基礎上觸發(fā)自動分部收集莫納甜。收集來自莫納甜的相應質子化分子離子的C8柱的部分，蒸發(fā)到干燥，隨后溶于小體積水。此部分用于產物的表征。所得產物用下列方法確定特征。UV/可見光譜學.UV/可見光譜測量酶法生成的莫納甜用Cary100BioUV/可見光分光光度計完成。溶于水的純化產物顯示280nm的最大吸收，肩部在288nm，是含吲哚的化合物的典型特征。LC/MS分析.用于莫納甜的混合物分析如實施例10所述完成，莫納甜獲得自體外生化反應。圖5描述體外酶合成混合物中莫納甜的典型LC/MS分析。圖5的下面一組闡明莫納甜的質子化分子離子在m/z＝293的所選離子色譜?；旌衔镏械拇四{甜鑒定通過圖6所述質譜確證。LC/MS分析純化產物顯示293的分子離子單峰和280nm的吸光度。質譜與圖6所示相同。MS/MS分析.如實施例10所述，也對莫納甜進行LC/MS/MS子離子實驗。圖7闡述莫納甜的子離子質譜。試驗性結構分配圖7中標記的所有片段離子。這些包括m/z＝275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳離子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳離子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳離子)、130(3-亞甲基-1H-吲哚-正碳離子)和118(吲哚正碳離子)的片段離子。預料的那樣，如果獲得自分子的吲哚部分，許多這些情況與MP獲得的(實施例4)相同。由于存在氨基而不是酮，一些比MP所見高1個質量單位。莫納甜的精確質量測量.圖8闡明獲得的純化莫納甜的質譜，使用AppliedBiosystems-PerkinElmerQ-Star雜合四極/飛行時間質譜儀。使用色氨酸作為內部質量校準標準，質子化莫納甜的測量質量是293.1144。在C14H17N2O5元素組成的基礎上，質子化莫納甜的計算質量是293.1137。此質量測量誤差小于每百萬分二(2ppm)，提供酶法生成莫納甜的元素組成的確證。NMR光譜學.NMR實驗在VarianInova500MHz儀器上進行。莫納甜樣品(～3mg)溶于0.5mlD2O。溶劑(D2O)起初用作4.78ppm的內部參考。由于水的峰大，運行1H-NMR抑制水峰。隨后，由于水峰的廣度，莫納甜的C-2質子用作參考峰，設在7.192ppm的發(fā)表值。對于13C-NMR，幾百次掃描的初始運行表明樣品太稀釋不能在規(guī)定時間獲得適當13C譜。因此，進行異核多級量子相干(HMQC)實驗，它能使其附著的氫和碳相關，也提供碳化學位移的信息。表2和3顯示1H和HMQC數據的概括。通過與發(fā)表值比較，NMR數據表明酶法生成的莫納甜是(S，S)、(R，R)或兩者的混合物。手性LC/MS分析.為確定體外生成的莫納甜是一種異構體而不是(R，R)和(S，S)對映異構體的混合物，手性LC/MS分析用實施例10所述儀器完成。手性LC分離用ChirobioticT(高級分離技術)手性色譜柱在室溫進行。在供應商發(fā)表的方案基礎上，最優(yōu)化色氨酸的R-(D)和S-(L)異構體的分離和檢測。LC流動相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。洗脫在70％A和30％b為等度。流速為1.0mL/分鐘，從200nm到400nm監(jiān)控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和莫納甜的儀器參數與實施例10所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z150-400區(qū)的質譜。質子化分子離子的所選離子色譜(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+＝205且用于莫納甜的[M+H]+＝293)，可直接鑒定混合物中的這些分析物。圖9顯示R-和S-色氨酸和莫納甜的色譜，它們由手性色譜分離并通過MS監(jiān)控。莫納甜色譜中的單峰表明該化合物是一種異構體，保留時間幾乎與S-色氨酸相同。表21H-NMR數據1Veleggaar等(J.C.S.PerkinTrans.13095-8，1992).2Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26).表313C-NMR數據(來自HMQC譜)1Veleggaar等(J.C.S.PerkinTrans.13095-8，1992).旋光測定.在RudolphAutopolIII旋光儀上測量旋光性。莫納甜制備為14.6mg/mL的水溶液。對于1g/mL水溶液，S，S莫納甜(鹽形式)的預期比旋光([α]D20)是-49.6(Veleggaar等)。觀察到純化、酶法生成莫納甜的[α]D20為-28.1，表明它是S，S異構體。改進最優(yōu)化包括試劑和酶濃度的反應條件，5-10mg/mL的產量用下列試劑混合物產生50mM醋酸銨，pH8.3、2mMMgCl2、200mM丙酮酸(鈉或銨鹽)、5mMα-酮戊二酸(鈉鹽)、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后達到1mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀、50μg/mL重組ProA醛縮酶(細胞提取物；總蛋白濃度為167μg/mL)、1000μg/mL大腸桿菌aspC基因編碼的L-天冬氨酸轉氨酶(細胞提取物；總蛋白濃度為2500μg/mL)和使?jié)舛龋?0mM的固體色氨酸(飽和；一些在整個反應中未溶解)?；旌衔镌?0℃孵育4小時并溫和攪拌或混合。取代α-酮戊二酸的濃度可減少到1mM并補充9mM天冬氨酸，莫納甜的產量相等。另外的氨基酸受體可用于第1個步驟，如草酰乙酸。當重組碩大利什曼原蟲廣底物轉氨酶用于取代大腸桿菌L-天冬氨酸轉氨酶時，獲得類似的莫納甜產量。然而，分子量為292的第2種未鑒定產物(主要產物的3-10％)也通過LC-MS分析檢測。當大腸桿菌tyrB編碼的酶、苜蓿根瘤菌tatA編碼的酶或來自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶(IIa型)作為轉氨酶加入時，產生0.1-0.5mg/mL的莫納甜濃度。當反應從吲哚-3-丙酮酸開始時，還原性胺化可用于最后步驟，此步有谷氨酸脫氫酶和NADH(如實施例7)。來自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和苜蓿根瘤菌的KHG醛縮酶也與大腸桿菌L-天冬氨酸轉氨酶一起使用以酶法生成莫納甜。使用下列反應條件50mMNH4-OAcpH8.3、2mMMgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后達到0.5mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀、20μg/mL重組枯草芽孢桿菌KHG醛縮酶(純化的)、大約400μg/mL來自細胞提取物的未純化大腸桿菌L-天冬氨酸轉氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反應在30℃振蕩孵育30分鐘。用枯草芽孢桿菌酶法生成的莫納甜量為80ng/mL，隨著醛縮酶量增加而提高。如果用飽和量的色氨酸和5mMα-酮戊二酸取代吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，莫納甜產量增加到360ng/mL。重復反應用50mMTrispH8.3中的3種30μg/mLKHG酶和飽和量的色氨酸，進行1小時以增加檢測。如實施例4，桿菌酶活性最高，產生約4000ng/mL莫納甜。大腸桿菌KHG產生3000ng/mL莫納甜，苜蓿根瘤菌酶產生2300ng/mL。實施例7MP和莫納甜間的相互轉化MP的胺化以形成莫納甜可通過轉氨酶催化如實施例1和6鑒定的酶，或通過需要還原輔因子如NADH或NADPH的脫氫酶。這些反應是可逆的且能以任何一個方向測量。當使用脫氫酶時，方向性主要通過銨鹽的濃度控制。脫氫酶活性.隨著NAD(P)+轉化成更發(fā)色的NAD(P)H，通過跟蹤340nm吸光度增加來監(jiān)控莫納甜的氧化脫氨。如實施例6所述酶法生成和純化莫納甜。典型的0.2mL測定混合物中含有含50mMTris-HCl，pH8.0到8.9、0.33mMNAD+或NADP+、2到22單位的谷氨酸脫氫酶(Sigma)和10-15mM底物。測定在UV-透明微量滴定板中進行2次，用MolecularDevicesSpectraMaxPlus板閱讀器。酶、緩沖液和NAD(P)+的混合物移吸入含底物的孔，短暫混合后，以10秒間隔監(jiān)控340nm的吸光度增加。反應在25℃孵育10分鐘。負對照不加入底物完成，谷氨酸用作正對照。來自牛肝的III型谷氨酸脫氫酶(Sigma#G-7882)催化莫納甜轉化為莫納甜前體，轉化率約為谷氨酸轉化為α-酮戊二酸的百分之一。轉氨活性.用來自大腸桿菌的L-天冬氨酸轉氨酶(AspC)、來自大腸桿菌的酪氨酸轉氨酶(TyrB)、來自碩大利什曼原蟲的廣底物轉氨酶(BSAT)和2個實施例1所述可商業(yè)購買的豬谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶進行莫納甜轉氨酶測定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作為氨基受體測試。測定混合物含有(0.5mL中)50mMTris-HCl，pH8.0、0.05mMPLP、5mM氨基受體、5mM莫納甜和25μg轉氨酶。測定在30℃孵育30分鐘，通過加入0.5mL異丙醇終止反應。莫納甜損失通過LC/MS監(jiān)控(實施例10)。注意到以草酰乙酸作為氨基受體的碩大利什曼原蟲BSAT活性量最高，接著是以α-酮戊二酸作為氨基受體的相同酶。草酰乙酸的相對活性是BSAT＞AspC＞豬IIa型＞豬I型＝TyrB。α-酮戊二酸的相對活性是BSAT＞AspC＞豬I型＞豬IIa型＞TyrB。實施例8從色氨酸和除了丙酮酸的C3來源生成莫納甜如上面實施例6所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能轉化成莫納甜，使用丙酮酸作為C3分子。然而，在一些情況中，丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源昂貴，或如果加入培養(yǎng)基對發(fā)酵有不利影響。丙氨酸可通過許多PLP-酶轉氨以產生丙酮酸。色氨酸酶樣酶進行β-消除反應的速度快于其它PLP酶如轉氨酶。來自此類別(4.1.99.-)的酶能從氨基酸產生氨和丙酮酸，氨基酸如L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有良好離去基團的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-絲氨酸、O-芐基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-芐基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-?；?L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。用EC4.1.99.-多肽生成莫納甜的方法可通過突變β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶改進，根據Mouratou等(J.Biol.Chem2741320-5，1999)的方法。Mouratou等描述將β-酪氨酸酶轉化成二羧氨基酸β-裂合酶的能力，此裂合酶沒有報導在自然界中產生。通過使纈氨酸(V)283轉化成精氨酸(R)和精氨酸(R)100變成蘇氨酸(T)來完成特異性變化。這些氨基酸變化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脫氨反應(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也能用作丙氨酸的來源用于隨后的醛醇縮合反應。另外，能提供乳酸和將乳酸轉化成丙酮酸的酶的細胞或酶反應器。能催化此反應的酶的例子包括乳酸脫氫酶和乳酸氧化酶。反應混合物包括50mMTris-ClpH8.3、2mMMgCl2、200mMC3碳源、5mMα-酮戊二酸、鈉鹽、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后達到0.5mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀pH7.5、25μg如實施例4制備的粗重組睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶、500μg如實施例1制備的粗L-天冬氨酸轉氨酶(AspC)、使?jié)舛龋?0mM的固體色氨酸(飽和；一些在整個反應中未溶解)。反應混合物在30℃混合孵育30分鐘。提供絲氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作為3-碳源。用或不用二級PLP酶(純化的)進行測定，PLP酶能進行β-消除反應和β-裂合酶反應(色氨酸酶(TNA)，雙突變體色氨酸酶，β-酪氨酸酶(TPL))。結果示于表4表4用另外的C3-碳源產生莫納甜從作為3-碳源的丙氨酸和絲氨酸產生的莫納甜通過LC/MS/MS子掃描分析確認，與實施例6中產生的莫納甜特征相同。丙氨酸是測試的最佳選擇之一，通過AspC酶轉氨。產生的莫納甜量通過加入色氨酸酶而增加，色氨酸酶能作為二級活性轉氨。通過加入色氨酸酶，用絲氨酸作為碳源產生的莫納甜量幾乎加倍，即使與轉氨酶相比僅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC可有一些單獨的β-消除活性的量。天冬氨酸的結果表明色氨酸酶對天冬氨酸的活性不隨著定點誘變增加，定點誘變與前面β-酪氨酸酶提示的相同。預期突變體β-酪氨酸酶具有產生莫納甜的較高活性。實施例9化學合成莫納甜丙氨酸加入吲哚-3-丙酮酸生成莫納甜，此反應能用Grignard或有機鋰試劑合成進行。例如，鎂在無水條件下加入3-氯-3-溴-丙氨酸，3-氯-3-溴-丙氨酸在羧基和氨基被適當阻斷。隨后加入吲哚-3-丙酮酸(適當阻斷)以形成偶聯(lián)產物，接著去除保護基團以形成莫納甜。特別有用的保護基團包括THP(四氫吡喃基醚)，它易附著和去除。實施例10檢測色氨酸莫納甜和MP該實施例描述的方法用于檢測莫納甜或其前體2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的存在。LC/MS分析用于體外或體內生化反應獲得的莫納甜、MP和/或色氨酸的混合物分析用Waters/Micromass液相色譜-串聯(lián)質譜(LCMS/MS)儀器進行，包括Waters2690液相色譜，裝有Waters996光電二極管陣列(PDA)吸光度監(jiān)控器，串聯(lián)置于色譜與MicromassQuattroUltima三重四極質譜儀間。LC分離用SupelcoDiscoveryC18反相色譜柱，2.1mm×150mm或XterraMSC8反相色譜柱，2.1mm×250mm室溫進行。LC流動相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。梯度洗脫是從5％B到35％B線性，0-9分鐘，從35％B到90％B線性，9-16分鐘，在90％B等度，16-120分鐘，從90％B到5％B線性，20-22分鐘，運行間有10分鐘再平衡階段。流速是0.25mL/分鐘，從200nm到4000nm監(jiān)控PDA吸光度。最優(yōu)化所有ESI-MS參數且在產生感興趣分析物的質子化分子離子([M+H]+)、生成特征性片段離子基礎上選擇。下列儀器參數用于LC/MS分析莫納甜毛細管3.5kV；圓錐40V；Hex1:20V；孔徑0V；Hex2:0V；來源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體50L/h；低質量分辨(Q1)15.0；高質量分辨(Q1)15.0；離子能量0.2；進入50V；碰撞能量2；出口50V；低質量分辨(Q2)15；高質量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)3.5；倍增器650。報導的質量/電荷比(m/z)和分子量的不確定性為±0.01％?；旌衔镏心{甜α-酮酸形式(MP)和莫納甜的初始檢測用LC/MS監(jiān)控完成，收集m/z150-400區(qū)的質譜。質子化分子離子的所選離子色譜(用于MP的[M+H]+＝292，用于莫納甜的[M+H]+＝293)可直接鑒定混合物中的這些分析物。MS/MS分析如下對莫納甜進行LC/MS/MS子離子實驗。子離子分析包括將感興趣的母離子(如對于莫納甜，m/z＝293)從第1個質量分析器(Q1)傳送到質譜的碰撞細胞，其中導入氬并使母離子化學解離成片段(子)離子。隨后用第2個質量分析器(Q2)檢測這些片段離子，它們可用于確證母離子結構分配。下列儀器參數用于LC/MS/MS分析莫納甜毛細管3.5kV；圓錐40V；Hex1:20V；孔徑0V；Hex2:0V；來源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體50L/h；低質量分辨(Q1)15.0；高質量分辨(Q1)15.0；離子能量0.2；進入-5V；碰撞能量14；出口1V；低質量分辨(Q2)15；高質量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)3.5；倍增器650。高通量測定莫納甜和色氨酸高通量分析(＜5分鐘/樣品)莫納甜和色氨酸的混合物用上述儀器完成，莫納甜和色氨酸來源于體外和體內反應，參數與LC/MS/MS所述相同。LC分離用4.6mm×50mmAdvancedSeparationTechnologiesChirobioticT柱在室溫進行。LC流動相為A)含0.25％乙酸的水；B)含0.25％乙酸的甲醇。用50％B等度洗脫0-5分鐘。流速為0.6mL/min。ESI-MS/MS系統(tǒng)的所有參數被最優(yōu)化，并基于色氨酸和內標2H5-色氨酸的質子化分子離子的最佳來源產生以及多反應監(jiān)測(MRM)實驗中碰撞誘導的氨基酸特異性片段離子的產生進行選擇(表1)。下列儀器參數用于LC/MS/MS分析莫納甜和色氨酸毛細管3.5kV；圓錐20V；Hex1:15V；孔徑1V；Hex2:0V；來源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體40L/h；低質量分辨(Q1)12.0；高質量分辨(Q1)12.0；離子能量0.2；進入-5V；碰撞能量14；出口1V；低質量分辨(Q2)15；高質量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)0.5；倍增器650。MRM參數信道間延遲0.03s；中間掃描延遲0.03s；停留0.05s。莫納甜的精確質量測量使用AppliedBiosystems-PerkinElmerQ-Star雜合四極/飛行時間質譜儀進行高分辨MS分子。使用色氨酸作為內部質量校準標準，測量質子化莫納甜的質量。在C14H17N2O5元素組成的基礎上，質子化莫納甜的計算質量是293.1137。用實施例A描述的生物催化法制得的莫納甜的測量質量為293.1144。此質量測量誤差小于每百萬分二(2ppm)，提供酶法生成莫納甜的元素組成的確證。實施例11在細菌中產生莫納甜該實施例描述的方法用于在大腸桿菌細胞中產生莫納甜。本領域技術人員理解類似方法可用于在其它細菌細胞中產生莫納甜。此外，可使用含莫納甜合成途徑中其它基因(圖2)的載體。極限培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基用于增加大腸桿菌細胞中的色氨酸產量(Zeman等，FoliaMicrobiol.35200-4，1990)，此培養(yǎng)基如下制備。700mL納米純水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4、13.6gKH2PO4、0.2gMgSO4*7H2O、0.01gCaCl2*2H2O和0.5mgFeSO4*7H2O。pH調至7.0，體積增加到850mL，培養(yǎng)基高壓滅菌。單獨制備50％葡萄糖溶液并無菌過濾。40mL加入基礎培養(yǎng)基(850mL)，終體積1L。10g/LL-色氨酸溶液在0.1M磷酸鈉pH7中制備并無菌過濾。通常加入十分之一體積到下面特定的培養(yǎng)物。也制備10％丙酮酸鈉溶液并無菌過濾。每升培養(yǎng)物通常使用10mL等分樣品。制備氨芐青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)貯存液，無菌過濾，使用前-20℃貯存。吐溫20(聚氧乙烯20-單月桂酸山梨聚糖)以0.2％(體積/體積)終濃度使用。氨芐青霉素以非致死濃度使用，通常為1-10μg/mL終濃度。大腸桿菌BL21(DE3)睪丸酮叢毛單胞菌proA/pET30Xa/LIC的新鮮平板(實施例4中描述)在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上制備。從單菌落中接種過夜培養(yǎng)物(5mL)且30℃生長于有卡那霉素的LB培養(yǎng)基。通常，1到50接種物用于trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基中的誘導。加入新鮮抗生素到50mg/L的終濃度。誘導前，搖瓶在37℃生長。每小時細胞取樣，直到獲得0.35-0.8的OD600。隨后用0.1mMIPTG誘導細胞，溫度降到34℃。誘導前(零時間點)收集樣品(1ml)并5000xg離心。上清在-20℃冷凍用于LC/MS分析。誘導后4小時，收集另外的1mL樣品，離心以從細胞沉淀中分離培養(yǎng)液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸鈉、氨芐青霉素和吐溫。誘導后細胞生長48小時，另取1mL樣品且如上制備。在48小時時，加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生長約70小時后(誘導后)，3500rpm4℃離心整個培養(yǎng)物體積20分鐘。輕輕倒出上清，培養(yǎng)液和細胞都在-80℃冷凍。過濾培養(yǎng)液部分并通過LC/MS分析。如實施例10所述監(jiān)控[M+H]+＝293峰的高度和面積。減去培養(yǎng)基的背景水平。數據也對于細胞生長標準化，這是通過繪出[M+H]+＝293峰的高度圖，峰高除以培養(yǎng)物在600nm的光密度。當丙酮酸、氨芐青霉素和吐溫在誘導后4小時而不是誘導時加入時，產生較高水平的莫納甜。其它添加物如PLP、另外的磷酸鹽或MgCl2不增加莫納甜產量。當使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸時且當色氨酸在誘導后而不是接種或誘導時加入時，獲得較高效價的莫納甜。誘導前和誘導后4小時(底物加入時)，發(fā)酵液或細胞提取物中通常沒有可檢測水平的莫納甜。負對照僅用有pET30a載體的細胞以及培養(yǎng)物進行，培養(yǎng)物中不加入色氨酸和丙酮酸。親代MS掃描證明(m+1)/z＝293的化合物不來源于較大分子，子掃描(如實施例10進行)類似于體外產生的莫納甜。用0、0.2％(體積/體積)和0.6％終濃度吐溫-20研究吐溫的效果。搖瓶產生的最高莫納甜量是0.2％吐溫。氨芐青霉素濃度在0和10μg/mL間變化。細胞培養(yǎng)液中的莫納甜量在0和1μg/mL間迅速增加(2.5倍)，當氨芐青霉素濃度從1增加到10μg/mL時，莫納甜量增加1.3倍。顯示典型結果的時程實驗示于圖10。甚至當值對于細胞生長標準化時，分泌到細胞培養(yǎng)液的莫納甜量增加。通過使用色氨酸的摩爾消光系數，培養(yǎng)液中的莫納甜量估計小于10μg/mL。重復相同實驗用含沒有proA插入的載體的細胞。許多數字為負，表明這些培養(yǎng)物中m/z＝293的峰高度小于單獨培養(yǎng)基中的峰高度(圖10)。當色氨酸和丙酮酸缺乏時，數字一致地較低，證明莫納甜生成是醛縮酶催化酶反應的結果。細菌細胞中的莫納甜體內生成在800mL搖瓶實驗和發(fā)酵罐中重復。通過陰離子交換層析和制備性反相液相色譜純化250mL莫納甜樣品(在無細胞的培養(yǎng)液中)。蒸發(fā)此樣品，用于高分辨質量分析(如實施例6所述)。高分辨MS表明生成的代謝物是莫納甜。體外測定說明轉氨酶需要以高于醛縮酶的水平存在(參見實施例6)，因此來自大腸桿菌的天冬氨酸轉氨酶超量表達，結合醛縮酶基因以增加產生的莫納甜量。設計引物以將睪丸酮叢毛單胞菌proA導入有aspC/pET30Xa/LIC的操縱子，引物如下5’引物ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQIDNO67)和3’引物CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQIDNO68)。5’引物包含BamHI位點，3’引物包含SalI位點用于克隆。PCR如實施例4所述進行并凝膠純化。aspC/pET30Xa/LIC構建物用BamHI和SalI消化，PCR產物也如此。消化物用Qiagen自旋柱純化。根據廠商說明用Roche迅速DNA連接試劑盒(Indianapolis，IN)將proAPCR產物連接到載體。用NovabluesSingles(Novagen)進行化學轉化，如實施例1所述。菌落在含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長且質粒DNA用Qiagenspinminiprep試劑盒純化。通過限制酶消化分析篩選克隆并由Seqwright(Houston，TX)確定序列。構建物亞克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。ProA/pET30Xa/LIC構建物也轉化入BL21(DE3)pLysS。在上述標準條件下初始比較BLR(DE3)搖瓶樣品證明加入第2個基因(aspC)使產生的莫納甜量提高7倍。為加速生長，使用BL21(DE3)-衍生宿主菌株。proA克隆和2個基因操縱子克隆在上面的Trp-1培養(yǎng)基中誘導，pLysS宿主也有加入培養(yǎng)基的氯霉素(34mg/L)。進行搖瓶實驗，有和沒有加入0.2％吐溫-20和1mg/L氨芐青霉素。用體外生成的純化莫納甜作為標準計算培養(yǎng)液中的莫納甜量。SRM分析如實施例10所述進行。在零、4小時、24小時、48小時、72小時和96小時生長時細胞取樣。結果示于表5，顯示培養(yǎng)液中生成的最大量。在大多數情況下，2個基因構建物產生的值高于單獨proA構建物。細胞膜更易滲漏的pLysS菌株分泌的莫納甜水平較高，盡管這些菌株通常以較慢的速度生長。加入吐溫和氨芐青霉素是有益的。表5大腸桿菌產生的莫納甜量實施例12酵母中莫納甜的產生該實施例描述用于在真核細胞中生成莫納甜的方法。本領域技術人員理解類似方法可用于在任何感興趣細胞中生成莫納甜。此外，除了該實施例所述或兩者擇一的辦法，可使用其它基因(例如圖2所列)。pESC酵母抗原表位標記載體系統(tǒng)(Stratagene，LaJolla，CA)用于克隆和表達大腸桿菌aspC和睪丸酮叢毛單胞菌proA基因入釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中。pESC載體含有相反鏈上的GAL1和GAL10啟動子，有2個不同多克隆位點，可同時表達2個基因。pESC-His載體也含有His3基因用于互補宿主(YPH500)中的組氨酸營養(yǎng)缺陷型。GAL1和GAL10啟動子受葡萄糖抑制且由半乳糖誘導；Kozak序列用于在酵母中最佳表達。pESC載體是穿梭載體，能在大腸桿菌中產生初始構建物(bla基因用于選擇)；然而，多克隆位點中沒有細菌核糖體結合部位。設計下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位點加下劃線，Kozak序列粗體顯示)aspC(BamHI/SalI)，GAL15’CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’(SEQIDNO69)和5’-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQIDNO70)。proA(EcoRI/NotI)，GAL105’-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQIDNO71)和5’-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQIDNO72)。由于導入Kozak序列，兩種成熟蛋白的第2個密碼子從芳族氨基酸變成纈氨酸。用來自實施例1和實施例4所述克隆的pET30Xa/LICminiprepDNA作為模板擴增感興趣的基因。使用EppendorfMaster循環(huán)梯度熱循環(huán)儀進行PCR，和下列用于50μL反應的方案1.0μL模板、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U擴增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1XExpandTM緩沖液。所用熱循環(huán)儀程序包括94℃5分鐘的熱啟動，接著是29個下列步驟的重復94℃30秒，50℃1分鐘45秒，72℃2分鐘15秒。29個重復后，樣品在72℃維持10分鐘，隨后于4℃貯存。純化PCR產物是通過在1％TAE-瓊脂糖凝膠上分離，接著用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。pESC-His載體DNA(2.7μg)如上用BamHI/SalI消化并凝膠純化。aspCPCR產物用BamHI/SalI消化并用QIAquickPCR純化柱純化。用Roche迅速DNA連接試劑盒根據廠商的方案進行連接。根據廠商的說明，在0.2cmBiorad一次性小杯中將脫鹽的連接物電穿孔入40μlElectromasxDH10B感受態(tài)細胞(Invitrogen)，使用附加脈沖控制器的Biorad基因脈沖器II。在1mLSOC培養(yǎng)基中恢復1小時后，轉化子平板培養(yǎng)于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。用于克隆的質粒DNA制品用QIAprepSpinMiniprep試劑盒完成。質粒DNA通過限制酶切消化篩選，用設計用于載體的引物測序(Seqwright)以確認。aspC/pESC-His克隆用EcoRI和NotI消化，proAPCR產物也如此。DNA如上純化和連接。2個基因構建物轉化入DH10B細胞中并通過限制酶切消化和DNA測序篩選。構建物轉入釀酒酵母菌株YPH500，使用S.c.EasyCompTM轉化試劑盒(Invitrogen)。轉化反應在含2％葡萄糖的SC-His極限培養(yǎng)基(InvitrogenpYES2手冊)上平板培養(yǎng)。通過菌落PCR用上面的PCR引物篩選單獨酵母菌落中proA和aspC基因的存在。沉淀細胞(2μl)懸浮于20μL含1μl消解酶的Y-裂解緩沖液(ZymoResearch)并于37℃加熱10分鐘。隨后4μL此懸浮液用于50μLPCR反應，使用上述PCR反應混合物和程序。5mL培養(yǎng)物在SC-His+葡萄糖中30℃和225rpm生長過夜。逐步調整細胞在棉子糖上生長以便將半乳糖誘導前的延滯期減至最小。生長約12小時后，測量600nm的吸光度，旋下適當體積的細胞且重懸浮于新鮮SC-His培養(yǎng)基中產生0.4的OD。連續(xù)使用下列碳源1％棉子糖+1％葡萄糖，0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖，2％棉子糖和最后的1％棉子糖+2％半乳糖用于誘導。誘導培養(yǎng)基中生長約16小時后，50mL培養(yǎng)物分成雙份25mL培養(yǎng)物，下列僅加入雙份之一(終濃度)1g/LL-色氨酸、5mM磷酸鈉pH7.1、1g/L丙酮酸鈉、1mMMgCl2。來自非誘導培養(yǎng)基和來自加入莫納甜途徑的底物之前16小時培養(yǎng)液和細胞沉淀的樣品保存作為負對照。此外，僅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的構建物用作另一種負對照。細胞可在誘導后總共生長69小時。酵母細胞偶爾在較低OD誘導，僅在加入色氨酸和丙酮酸前生長4小時。然而，這些莫納甜底物似乎抑制生長且在較高OD加入更有效。來自培養(yǎng)物的細胞沉淀用5mLYeastBusterTM+50μlTHP(Novagen)每克(濕重)細胞遵循廠商的方案裂解，加入前面例子所述的蛋白酶抑制劑和benzonase核酸酶。過濾培養(yǎng)液和細胞提取物并通過SRM分析，如實施例10所述。使用此方法，培養(yǎng)液樣品中沒有檢測到莫納甜，表明細胞不能在這些條件下分泌莫納甜。這些條件下的質子動力可能不足或一般的氨基酸轉運子可用色氨酸飽和。蛋白表達水平不能用SDS-PAGE檢測變化。當色氨酸和丙酮酸加入培養(yǎng)基時，具有2個功能基因的培養(yǎng)物的細胞提取物中可短暫檢測到莫納甜(約60μg/mL)。任何負對照細胞提取物中不能檢測到莫納甜。用4.4mg/mL總蛋白(約為通常用于大腸桿菌細胞提取物的兩倍)進行2次莫納甜的體外測定，使用實施例6所述最優(yōu)化測定。進行其它測定，加入32μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶或400μg/mLAspC轉氨酶，以確定哪個酶在細胞提取物中限制。負對照不加入酶或僅加入AspC轉氨酶(沒有酶時在某種程度上可發(fā)生醛醇縮合)。正對照用部分純化的酶(30-40％)進行，使用16μg/mL醛縮酶和400μg/mL轉氨酶。體外結果通過SRM分析。細胞提取物分析顯示當色氨酸在誘導后加入培養(yǎng)基時，它被有效轉運入細胞中，使色氨酸水平比沒有另外加入色氨酸的高2個數量級。體外莫納甜的分析結果示于表6(數字表示ng/mL)。表6用酵母細胞提取物產生莫納甜用有和沒有底物加入生長培養(yǎng)基的全二基因構建物細胞提取物獲得陽性結果。這些結果與正對照相比，表明酶表達水平接近酵母中1％的總蛋白。當aspC構建物(截短的proA)的細胞提取物用醛縮酶測定時，產生的莫納甜量顯著大于單獨細胞提取物測定，表明重組AspC轉氨酶包含約1-2％酵母總蛋白。由于細胞中存在天然轉氨酶，用醛縮酶測定時未誘導培養(yǎng)物的細胞提取物有小量活性。當用AspC轉氨酶測定時，來自未誘導細胞的提取物活性增加到用AspC(大約200ng/ml)的負對照生成的莫納甜量。相反，補充轉氨酶時二基因構建物細胞提取物測定中觀察到的活性增加大于加入醛縮酶時觀察到的活性。由于2個基因都應以相同水平表達，表明當轉氨酶水平高于醛縮酶水平時，產生的莫納甜量最大，與實施例6所示結果一致。加入丙酮酸和色氨酸不僅抑制細胞生長，而且也明顯抑制蛋白表達。加入pESC-Trp質?？捎糜诩m正YPH500宿主細胞的色氨酸營養(yǎng)缺陷型，是一種提供色氨酸而對生長、表達和分泌效果更少的方法。實施例13采用偶聯(lián)反應改進酶方法理論上，如果沒有副反應或底物降解或產生中間體，從圖1所述酶反應中形成的最大產物量直接與各反應的平衡常數、色氨酸和丙酮酸的濃度成比例。色氨酸不是高度可溶的底物，大于200mM的丙酮酸濃度似乎對產量有負作用(參見實施例6)。理想地，莫納甜濃度相對于底物最大化以降低分離成本?？蛇M行物理分離，這樣莫納甜從反應混合物中取出，防止逆反應發(fā)生。原料和催化劑可隨后再生。由于莫納甜的大小、電荷和疏水性與一些試劑和中間體類似，物理分離困難，除非對莫納甜的親和性高(如親和層析技術)。然而，莫納甜反應可偶聯(lián)其它反應，這樣系統(tǒng)的平衡移向莫納甜生成。以下是改進莫納甜產量的方法的例子，莫納甜獲得自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。采用草酰乙酸脫羧酶(EC4.1.1.3)的偶聯(lián)反應圖11是反應的說明。色氨酸氧化酶和過氧化氫酶用于在吲哚-3-丙酮酸生成的方向驅動反應。過氧化氫酶過量使用，因而過氧化氫不能在逆方向中起作用或者損害酶或中間體。氧在過氧化氫酶反應期間再生。另外，吲哚-3-丙酮酸可用作底物。天冬氨酸用作MP胺化的氨基供體，使用天冬氨酸轉氨酶。理想地，與MP對莫納甜反應相比，使用對色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反應特異性低的轉氨酶，這樣天冬氨酸不用于再胺化吲哚-3-丙酮酸?？杉尤氩蒗Ｒ宜崦擊让?來自假單胞菌屬)以將草酰乙酸轉化成丙酮酸和二氧化碳。由于CO2是揮發(fā)性的，它不能用于與酶反應，減少或甚至防止逆反應。此步驟中產生的丙酮酸也能用于醛醇縮合反應?？墒褂闷渌擊让?，已知同系物存在于伴放線放線桿菌(A.actinomycetemcomitans)、風產液菌(Aquifexaeolicus)、閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、棕色固氮菌、脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)、一些博德特氏菌屬(Bordetella)、空腸彎曲桿菌(C.jejuni)、微溫綠菌(Chlorobiumtepidum)、橙色綠屈撓菌(Chloroflexusaurantiacus)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、具核梭桿菌(F.nucleatum)、肺炎克氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亞菌(Mannheimiahaemolytica)、鞭毛甲基桿菌KT(MethylobacillusflagellatusKT)、多殺巴斯德氏菌(P.Multocida)Pm70、微熱石袍菌(Petrotogamiotherma)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)、一些假單胞菌屬、一些火球菌屬(Pyrococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、一些沙門氏菌屬(Salmonella)、一些鏈球菌屬(Streptococcus)、微溫熱著色菌(Thermochromatiumtepidum)、海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)、梅毒密螺旋體(Treponemapallidum)和一些弧菌屬(Vibrio)種。用來自大腸桿菌的天冬氨酸轉氨酶(AspC)、來自大腸桿菌的酪氨酸轉氨酶(TyrB)、來自碩大利什曼原蟲的廣底物轉氨酶(BSAT)和2個實施例1所述可商業(yè)購買的豬谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶進行色氨酸轉氨酶測定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作為氨基受體測試。比較用莫納甜的活性(實施例7)相對用色氨酸的活性的比例，用于確定哪一個酶對莫納甜轉氨酶反應的特異性最高。這些結果表明相對色氨酸反應對莫納甜反應特異性最高的酶是豬II-A型谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶GOAT(SigmaG7005)。此特異性不取決于使用哪一個氨基受體。因此，此酶用于具有草酰乙酸脫羧酶的偶聯(lián)反應。從吲哚-3-丙酮酸起始的典型反應包括(終濃度)50mMTris-ClpH7.3、6mM吲哚-3-丙酮酸、6mM丙酮酸鈉、6mM天冬氨酸、0.05mMPLP、3mM磷酸鉀、3mMMgCl2、25μg/mL轉氨酶、50μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶和3單位/mL脫羧酶(SigmaO4878)。反應可在26℃進行1小時。在一些情況中，省略脫羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作為負對照)。也測試上述取代GOAT的轉氨酶以證實早期特異性實驗。過濾樣品并通過LC/MS分析，如實施例10所述。結果證明GOAT酶法生成最高量的莫納甜每mg蛋白，而產生最少量的色氨酸作為副產物。此外，加入脫羧酶可增加2-3倍。與其它轉氨酶相比，大腸桿菌AspC酶也生成大量莫納甜。提高莫納甜產量是通過1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小時到1小時)，2)在厭氧環(huán)境中進行反應或有脫氣緩沖液，3)允許反應過夜進行和4)使用沒有多次凍融的新鮮制備的脫羧酶。丙酮酸濃度＞12mM會抑制脫羧酶。吲哚-3-丙酮酸濃度高于4mM時，與吲哚-3-丙酮酸的副反應加速。如果也增加醛縮酶量，用于反應的吲哚-3-丙酮酸量可增加。發(fā)現高水平的磷酸鹽(50mM)和天冬氨酸(50mM)抑制脫羧酶。在1小時反應中，加入的脫羧酶量能減少到0.5U/mL，而莫納甜產量沒有降低。當溫度從26℃提高到30℃和從30℃提高到37℃時，產生的莫納甜量增加；然而，37℃時吲哚-3-丙酮酸的副反應也加速。生成的莫納甜量隨著pH從7增加到7.3而增大，且從pH7.3-7.8相對穩(wěn)定。從色氨酸起始的典型反應包括(終濃度)50mMTris-ClpH7.3、20mM色氨酸、6mM天冬氨酸、6mM丙酮酸鈉、0.05mMPLP、3mM磷酸鉀、3mMMgCl2、25μg/mL轉氨酶、50μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶和4單位/mL脫羧酶、5-200mU/mLL-氨基酸氧化酶(SigmaA-2805)、168U/mL過氧化氫酶(SigmaC-3515)和0.008mgFAD。反應可在30℃進行30分鐘。加入脫羧酶觀察到改進。當使用50mU/mL氧化酶時，產生最大量的莫納甜。改進類似于當吲哚-3-丙酮酸用作底物時觀察到的。此外，當1)色氨酸水平低(即低于轉氨酶的Km且因此不能與MP競爭活性位點)和2)氧化酶與醛縮酶和轉氨酶的比例維持的水平不能積聚吲哚-3-丙酮酸時，產生的莫納甜量增加。無論從吲哚-3-丙酮酸還是色氨酸起始，當使用2-4倍的所有酶量且同時維持相同酶比例時，孵育時間為1-2小時的測定中產生的莫納甜量增加。使用任一底物，達到約1mg/mL莫納甜濃度。如果從吲哚-3-丙酮酸起始，產生的色氨酸量通常低于20％的產物量，顯示出使用偶聯(lián)反應的益處。隨著中間體濃度和副反應的進一步最優(yōu)化和控制，產率和產量能大幅提高。采用賴氨酸ε轉氨酶(EC2.6.1.36)的偶聯(lián)反應在一些生物體中發(fā)現賴氨酸ε轉氨酶(L-賴氨酸6-轉氨酶)，包括紅球菌、分枝桿菌(Mycobacterium)、鏈霉菌(Streptomyces)、諾卡氏菌(Nocardia)、黃桿菌、產朊假絲酵母(C.utilis)和鏈霉菌。生物體利用此酶作為生成一些β-內酰胺抗生素中的和一步驟(Rius和Demain，J.Microbiol.Biotech.，795-100，1997)。此酶將賴氨酸轉化成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-醛賴氨酸)，這是通過PLP-介導的賴氨酸的C-6轉氨，α-酮戊二酸用作氨基受體。ε-醛賴氨酸不穩(wěn)定且自發(fā)經歷分子內脫水以形成環(huán)狀分子1-哌啶6-羧酸鹽。這有效抑制任何逆反應發(fā)生。圖12描述反應流程。也能使用另外的酶賴氨酸-丙酮酸6-轉氨酶(EC2.6.1.71)。1mL典型反應包含50mMTris-ClpH7.3、20mM吲哚-3-丙酮酸、0.05mMPLP、6mM磷酸鉀pH8、2-50mM丙酮酸鈉、1.5mMMgCl2、50mM賴氨酸、100μg轉氨酶(賴氨酸ε轉氨酶LAT-101，BioCatalyticsPasadena，CA)和200μg睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶。產生的莫納甜量隨著丙酮酸濃度增加而增加。用這些反應條件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脫羧酶(約0.1mg/mL)的偶聯(lián)反應觀察到的低10倍。+＝293的峰在莫納甜預期時間洗脫且質譜包含一些用其它酶方法觀察到的相同片段。第2個有正確質量與電荷比(293)洗脫的峰稍早于實施例6中生成的S，S莫納甜通常觀察到的，可能表明存在另一種莫納甜的異構體。此酶法生成的色氨酸很少。然而，可能對丙酮酸有一些活性(產生丙氨酸作為副產物)。同樣，已知酶不穩(wěn)定?？赏ㄟ^定向進化實驗進行改進以增加穩(wěn)定性，減少與丙酮酸的活性并提高與MP的活性。這些反應也能偶聯(lián)上述L-氨基酸氧化酶/過氧化氫酶。其它偶聯(lián)反應圖13顯示另一種能提高來自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的莫納甜產量的偶聯(lián)反應。甲酸脫氫酶(EC1.2.1.2或1.2.1.43)是普通酶。一些甲酸脫氫酶需要NADH而另一些能利用NADPH。谷氨酸脫氫酶在前面的例子中催化莫納甜前體和莫納甜間的相互轉化，使用以銨為基礎的緩沖液。甲酸銨和甲酸脫氫酶的存在是輔因子再生的有效系統(tǒng)，二氧化碳生成是降低逆反應速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalysis1037，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.634651-6，1997)。此外，大量甲酸銨能溶于反應緩沖液。加入甲酸脫氫酶和甲酸銨可改進谷氨酸脫氫酶反應(或類似的還原性胺化)生成的莫納甜產量。其它方法能用于驅動平衡趨向莫納甜生成。例如，如果氨丙烷在MP轉化成莫納甜中用作氨基酸供體，轉化用Ω-氨基酸轉氨酶(EC2.6.1.18)如美國專利5,360,724和5,300,437所述，所得產物之一或許是丙酮，它是比底物氨丙烷更易揮發(fā)的產物?？芍芷谛蕴岣叨唐诘臏囟纫约斌E蒸發(fā)揮丙酮，從而緩解平衡。丙酮的沸點為47℃，如果使用短時間段，此溫度不可能降解中間體。大部分對α-酮戊二酸有活性的轉氨酶也對莫納甜前體有活性。類似地，如果乙醛酸/芳族酸轉氨酶(EC2.6.1.60)與作為氨基供體的甘氨酸一起使用，生成的乙醛酸相對不穩(wěn)定且沸點比甘氨酸低很多。實施例14含有莫納甜的包裝制品制造了含有莫納甜的包裝制品，其提供的甜度相當于約2茶匙蔗糖(約8克)。A.含有S，S莫納甜的包裝制品(每克)787毫克葡萄糖200毫克S，S莫納甜10毫克酒石3毫克硅酸鈣B.含有R，R和S，S莫納甜的包裝制品(每克)700毫克葡萄糖292毫克麥芽糊精4毫克R，R莫納甜4毫克S，S莫納甜C.含有R，R和S，S莫納甜的包裝制品(每克)992mg用麥芽糊精*成團的葡萄糖4mgR，R莫納甜4mgS，S莫納甜*例如CPCInternational，Inc.的UnidexAgglomeratedDextose02540(2034)。D.含有R，R莫納甜的包裝制品(每克)500毫克葡萄糖495毫克麥芽糊精5毫克R，R莫納甜E.含有R，R莫納甜的一半大小的立方體(每克)999毫克麥芽糊精1毫克R，R莫納甜實施例15含有莫納甜的包裝制品的配方以下是如何將莫納甜包裝制品(如上述那些)用作烘焙和其它配方的蔗糖替代品的例子。相比用蔗糖制造的相同的產品，用以下配方制造的含有莫納甜的產品是可接受的并具有良好質量。檸檬水將2湯匙檸檬汁和3包(3克)莫納甜包裝制品與3/4杯水在長玻璃容器中混合至溶解。加冰。用莫納甜變甜的檸檬水與用6茶匙(24克)蔗糖變甜的檸檬水的甜味幾乎相同且甚至更好，并具有明顯較低的卡路里(約0卡路里，而蔗糖為96卡路里)。攪打奶油(Topping)1/3杯冰水1茶匙檸檬汁茶匙香草1/3杯脫脂奶粉3包莫納甜蔗糖替代品(每份實施例C)將水、檸檬汁和香草混合。拌入脫脂奶粉。攪打10分鐘或直到硬性發(fā)泡。加入莫納甜蔗糖替代品包裝并攪打2分鐘。無糖海綿蛋糕配方配料％w/w蛋糕粉20.42水18.62全蛋18.2聚葡萄糖17.23高比例起酥油13.44山梨糖醇粉末8.62脫脂奶粉1.66發(fā)酵粉1.24鹽0.31R，R莫納甜(按個人口味)0.010-0.040每100克蛋糕使用10-40毫克R，R莫納甜(例如由3-10包桌面莫納甜甜味劑提供)。實施例16含有莫納甜的現成制品制造即用型“匙對匙”制品以代替砂糖使用。由于莫納甜制品的體積與蔗糖相同，我們可將這些制品直接加入飲料或食品，或直接用于烘焙，其用量與砂糖相等。A.含有S，S莫納甜的現成制品(每克)188毫克水解淀粉800毫克麥芽糊精10毫克S，S莫納甜2毫克葡糖酸鈉B.含有R，R莫納甜的現成制品(每克)999.5毫克麥芽糊精0.5毫克R，R莫納甜C.含有S，S/R，R混合物的現成制品(每克)972.5毫克麥芽糊精20毫克酒石4毫克硅酸鈣3.1毫克S，S莫納甜0.4毫克R，R莫納甜實施例17含有莫納甜的現成制品的配方以下是如何將莫納甜的“匙對匙”現成制品(如上述那些)用作烘焙和其它配方的蔗糖替代品的例子。相比用蔗糖制造的相同的產品，用以下配方制造的含有莫納甜的產品是可接受的并具有良好質量。法式派派皮1杯碾碎的全麥餅干1杯碎核桃1條奶油，熔化將派皮配料混合并拍入9寸派盤。300°烘30分鐘。餡料2塊未加糖的巧克力2條奶油1杯莫納甜現成制品(每份實施例16B)2茶匙香草4個巴氏滅菌蛋將未加糖的巧克力熔化并冷卻至室溫。將奶油和莫納甜蔗糖替代品打發(fā)，在其中加入香草和熔化的巧克力。邊攪打邊加入雞蛋，每加入一個蛋后攪打4分鐘再加入第二個。倒入冷卻的派皮中并冷藏過夜。藍莓松餅注意出于質地、顏色以及甜味考慮，蔗糖是重要的烘焙原料。在該配方中，使用了少量蜂蜜以補償配方中缺乏蔗糖造成的缺陷，并且有助于產生焦糖色和良好質地。2杯萬能面粉2茶匙發(fā)酵粉3/4茶匙鹽杯人造黃油，軟化1杯莫納甜現成制品杯蜂蜜2個全蛋(大)1茶匙香草杯脫脂乳1杯藍莓，新鮮的或冷凍的烘箱預熱至350°F。用紙折成10個松餅杯。將面粉、發(fā)酵粉、鹽一起過篩；備用。將人造黃油、莫納甜甜味劑和蜂蜜一起用電動攪拌機攪打直到松軟。加入雞蛋，每加入一個蛋后攪打均勻再加入第二個。拌入香草。交替拌入面粉混合物和牛奶，以面粉混合物開始和結束。拌入藍莓。舀入用紙折成的松餅杯，并烘至金黃褐色，同時插入中央的牙簽取出是干凈的，約25-30分鐘。在網架上的烤盤中冷卻10分鐘。從烤盤中取出松餅。在網架上完全冷卻。共制成10個松餅。草莓香蕉飲1杯橙汁1杯脫脂原味酸奶1根冰凍香蕉1杯冰凍草莓6包莫納甜制品或杯莫納甜現成制品將所有配料置于攪拌機中并攪拌至柔滑。分成2份。相比用杯蔗糖以相同配方制造的飲品相比，這種飲品所含的卡路里降低了約33％。菠蘿橙子冰糕1罐15盎司的菠蘿碎片1罐6盎司的冰凍濃縮橙汁，解凍3杯脫脂乳3/4杯蒸發(fā)脫脂乳1/3杯莫納甜現成制品(每份實施例B)茶匙香草將脫脂乳、未除去水分的菠蘿、蒸發(fā)脫脂乳、濃縮橙汁、莫納甜蔗糖替代品和香草一起在大碗中攪拌直到莫納甜蔗糖替代品溶解。在4或5夸脫的冰淇淋機中按照制造商的說明冷凍。制成15(杯)份。檸檬幕司1罐12盎司的蒸發(fā)乳2湯匙檸檬皮屑2個檸檬榨出的汁1杯莫納甜現成制品(每份實施例A)12片全麥餅干，碾碎將牛奶倒入果凍圓盤并放置在冰箱中直到形成冰絲，約2小時。將牛奶轉移到冰凍過的碗中并攪打。邊混合邊慢慢加入檸檬皮屑和果汁。加入莫納甜蔗糖替代品并繼續(xù)攪打直到有軟峰形成。將其轉移到分食容器中并灑上全麥餅干屑?？衫鋮s或冷凍食用。實施例18含有莫納甜的甜點和糖果產品即用型莫納甜組合物可用于商業(yè)制造提供給消費者的包裝食品。速溶巧克力布丁配料表配料％w/w冷溶脹淀粉(Ultratex4)5.00脫脂奶粉14.00可可粉2.5麥芽糊精3.5巧克力香精0.4黃蓍膠0.20鹽0.15卵磷脂粉0.25磷酸二鈉0.17R，R莫納甜(按個人口味)0.005-0.010用水補足至100每100克布丁中含有5-10毫克R，R莫納甜(例如由2-3包桌面莫納甜甜味劑提供)。無糖巧克力涂層配料4.0-10％乳固體15.0-20％巧克力香精或巧克力漿0-10％可可脂0-2％可可粉5-10％甘露醇0.3-0.5％卵磷脂12-25％聚葡萄糖(如聚葡萄糖K)0.10-0.5％S，S莫納甜或0.007-0.015％R，R莫納甜或它們的混合物20-60％植物油每100毫克涂層使用約2-4包桌面甜味劑。無糖巧克力配料2-3湯匙可可粉2湯匙奶油(非替代品)2湯匙液態(tài)重攪打奶油1/4茶匙純香草精1湯匙花生醬(顆?；蛉峄?6包桌面莫納甜實施例19評價莫納甜在桌面甜味劑中的使用在咖啡和冰茶中比較其它已知甜味劑甜味劑(阿斯巴特和三氯蔗糖)來評價含有R，R莫納甜或R，R莫納甜/赤蘚醇混合物的莫納甜桌面制品。評價的關鍵感官參數包括甜味質量、后味、苦味及其后味。進行定性評價。產品配方(i)咖啡使用標準咖啡來評價甜味劑性能(表7)。表7.咖啡配方按照以下濃度在咖啡中加入甜味劑阿斯巴特0.025％(w/v)三氯蔗糖0.0082％(w/v)R，R莫納甜*0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克麥芽糊精R，R莫納甜/赤蘚醇0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克赤蘚醇(ii)冰茶用冰茶制品來評價甜味劑性能(表8)。表8.冰茶配方按照以下濃度在咖啡中加入甜味劑阿斯巴特0.0450％(w/v)三氯蔗糖0.0170％(w/v)R，R莫納甜*0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克麥芽糊精R，R莫納甜/赤蘚醇0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克赤蘚醇感官評價采用一小組(n＝6)有經驗的感覺鑒定員來評價這些咖啡和茶飲品，這些鑒定員將先品嘗咖啡產品然后再品嘗茶產品。這些評定的結果總結在表9中。表9.咖啡和茶的感官評價(每份200ml)討論莫納甜能給桌面甜味劑制品帶來意想不到的好處，其中包括明顯的感官益處。當用于加入咖啡的桌面制品時，感覺到咖啡的香味水平明顯提高。加入低濃度赤蘚醇進一步增強了這種益處，赤蘚醇能夠平衡平衡并緩和香味同時縮短甜味出現的時間。在冰茶尤其是酸化的茶(即加入檸檬)中，莫納甜增強了檸檬的香味。同時，將赤蘚醇與莫納甜混合能帶來其它的香味益處。莫納甜具有改進的感官特性(例如較少的后味、較少的怪味)和/或改進的溶解性和穩(wěn)定性。使咖啡變甜的莫納甜幾乎不含熱量，而用2茶匙(約8克)蔗糖使咖啡變甜卻含有32卡路里。實施例20莫納甜和糖精的甜度用量反應曲線用20名感覺鑒定員來評估莫納甜和糖精的甜味，判斷一式兩份進行。用pH3.2的檸檬酸/檸檬酸鹽緩沖液制備測試和參考溶液。見圖16。相比糖精，R，R/S，S莫納甜的結果更呈線形，這與其味道特征更像蔗糖一致。高出10％SEV的部分說明不存在(或水平較低)“混合物抑制”怪味和后味。莫納甜的用量反應曲線的形狀類似于阿斯巴特、三氯蔗糖和阿力甜，因此它們都是“高質量”甜味劑。在以R，R/S，S莫納甜作為主要甜味劑的模型系統(tǒng)(pH3.2)中將觀察到以下特征(1)甜味出現的輕微延遲；(2)甜味迅速消失；(3)輕微“阿斯巴特樣”后味，輕微甜后味，后味中無苦味；和(4)在未調味的系統(tǒng)中殘留清涼感覺。實施例21pH3時隨溫度增加莫納甜的穩(wěn)定性將合成的莫納甜樣品置于pH3，25℃、50℃和100℃的環(huán)境下。室溫pH3時，觀察到48小時內損失14％莫納甜。這種損失是由于形成內酯。50℃pH3時，48小時內損失23％莫納甜。這種損失是由于形成內酯并在約15.5分鐘后有未知化合物聚集。100℃pH3時，24小時內幾乎所有莫納甜都損失了。主要的可檢測成分是15.5分鐘時出現的未知物質。實施例2240℃pH2.5、3.0、4.0時莫納甜和阿斯巴特的感官穩(wěn)定性監(jiān)測在pH2.5、3.0和4.0制備并儲藏于40℃的莫納甜溶液100天內的感官穩(wěn)定性。將這些溶液損失的甜味與在相同條件下制造并儲存的阿拉伯糖溶液損失的甜味進行比較。在40℃儲存之后測量莫納甜(8％SEV，約55ppm，含有約96％2R，4R/2S，4S對映體對和4％2R，4S/2S，4R對映體對的合成混合物)在pH值為2.5、3.0和4.0的磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性。比較莫納甜和相同緩沖液中阿斯巴特(400ppm)的穩(wěn)定性。用與莫納甜和阿斯巴特相同的磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液制備三種蔗糖參考溶液。所有制備的溶液避光儲存。緩沖液組成pH2.5磷酸(75％溶液)0.127％(w/v)一水合檸檬酸三鈉0.005％(w/v)pH3.0磷酸(75％溶液)0.092％(w/v)一水合檸檬酸三鈉0.031％(w/v)pH4.0磷酸(75％溶液)0.071％(w/v)一水合檸檬酸三鈉0.047％(w/v)通過一小組(n＝8)經過訓練的熟悉甜味評定過程的感覺鑒定員來評估每種甜味劑相對蔗糖的甜度，該過程一式兩份進行。所有樣品(用同樣的緩沖液配制)在22℃±1℃下一式兩份。測試溶液用3個隨機數字編號，并分別隨機給予鑒定員。提供以0.5％(w/v)蔗糖遞增的蔗糖參考標準(4.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求鑒定員通過比較測試溶液和蔗糖標準的甜度來評價甜度。評定時吸啜3口測試溶液，然后吸啜1口水，再吸啜3口蔗糖標準，然后在吸啜1口水，依此類推。鑒定員用1位小數評價甜度，例如6.8、8.5。在評價測試溶液之間休息5分鐘。要求鑒定員徹底漱口并食用一些餅干以降低任何可能的附帶結果。表10和11顯示了在磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液中進行的穩(wěn)定性研究的結果。在每個pH于40℃避光儲存100天后，莫納甜甜度的殘留百分比大于阿斯巴特的殘留百分比。在pH4.0時，莫納甜溶液甜味的損失幾乎穩(wěn)定，因為在第17-100天測得的甜度變化很小，而阿斯巴特溶液的甜味卻繼續(xù)損失。表10莫納甜的感官穩(wěn)定性40℃儲存100天后的甜度A.B.C.表11穩(wěn)定性在規(guī)定pH于40℃儲存100天后剩余甜度的量如表12所見，各種緩沖液可有效維持pH。表12如果假設有偽第一順序中斷反應，在可將logn保留百分比對時間作圖(logn％RTNv.t)以估算任何給定條件下甜度損失的半衰期(t)和速度常數(k)。如此便可得出如下表13總結的莫納甜和阿斯巴特甜度損失動力學。表13每個pH于40℃儲存100天后，莫納甜甜度的保留百分比大于阿斯巴特的保留百分比。在pH4.0時，莫納甜溶液甜味的損失幾乎穩(wěn)定，因為在第17-100天測得的甜度變化很小，而阿斯巴特溶液的甜味卻繼續(xù)損失。估計莫納甜和阿斯巴特的半衰期說明，莫納甜的甜度損失速度低于阿斯巴特。在pH2.5、3.0和4.0時估算的莫納甜甜度的半衰期分別為65天、115天和230天。相同條件下估算的阿斯巴特的半衰期為55天、75天和140天。因此，在酸性條件并于40℃出，莫納甜可比阿斯巴特更加穩(wěn)定地輸送甜味。實施例23制造赤蘚醇/莫納甜顆粒在40℃下在小的容器內制備2000克赤蘚醇、16克R，R莫納甜和5升水的溶液。在流化床的籃子中加入58千克赤蘚醇。流化床的空氣溫度設為65℃。以25kg/hr的速度在流化床中噴灑莫納甜/赤蘚醇溶液17分鐘。需要再加熱20分鐘以使粉末干燥。產品通過1250mm的篩子。也可參見EP0325790B1(Mitsubishi，Nikken1993)。計算出的莫納甜/赤蘚醇產品的相對甜度(與蔗糖相比)約為1.10。用兩份莫納甜/赤蘚醇樣品和一份莫納甜/麥芽糊精樣品進行三角試驗。三角試驗是本領域已知的。預計用莫納甜/赤蘚醇制成的即用型立方體的顏色和結晶質量與蔗糖接近。實施例24莫納甜立體異構體的層析樣品制備—在微離心管中放入約50-75μg凍干物質。在其中加入1.0mLHPLC級甲醇。將溶液渦漩攪拌30分鐘，離心并取出等分量上清進行分析。反相HPLC—用2.1×250mmXterraTMMSC85μm(WatersCorporation)HPLC柱進行層析獲得兩個分離的非對映體峰(R，R/S，S和R，S/S，R)。用Micromass的UltimaTM三重四極質譜儀進行檢測。流動相進行以下梯度時間(分鐘)091620210.05％TFAA％9565101095甲醇，0.05％TFAB％53590905流速mL/min0.250.250.250.250.25手性HPLC—用250×4.6mmChirobioticT(AdvancedSeparationsTechnologies，Inc.)HPLC柱進行層析獲得兩個清楚的莫納甜立體異構體(R，R和S，S)。用Micromass的UltimaTM三重四極質譜儀進行檢測。流動相由甲醇和0.2％乙酸以及0.05％氨水構成。質譜(MS/MS)—通過選擇反應監(jiān)控(SRM，SelectedReactionMonitoring)實驗檢測莫納甜的存在。質子化的莫納甜分子離子([M+H]+)的m/z＝293.3。斷裂該分子離子產生m/z＝257.3的顯著離子，這是將分子離子多次脫水得到的。這種轉變是莫納甜特有的并選擇作為轉變(293.3至257.3)在SRM實驗過程中加以監(jiān)測。這種檢測方法可用于莫納甜的反相和手性分離。結果—用反相HPLC評價R，S/S，R和S，S/R，R標準樣品。通過衍生和酶法拆分制備樣品。標準溶液的色譜圖示于圖17。反相分析之后進行手性層析以評估樣品內存在的特定異構體。標準S，S和R，R莫納甜溶液的手性層析示于圖18。實施例25莫納甜在高溫(80℃)和中性pH下的穩(wěn)定性使用pH7下的100毫升75ppm的莫納甜溶液作為原料溶液。所述合成的莫納甜樣品包含約96％的2R、4R/2S、4S對映體對和4％的2R、4S/2S、4R對映體對。在整個試驗過程中，將所述樣品保溫在80℃和pH7的條件下，在0、1、2、3、4小時和1、2、4、7、14、21和35天時抽取樣品。所有試驗條件均一式兩份進行。使用LC-MS并使用反相色譜法進行分離和定量—建立合成莫納甜的兩個測定的非對映體峰的響應曲線。5-150ppm的范圍與溶解在去離子水中的合成莫納甜標準物并列。使用3.9×150mm的NovapakC18(WatersCorporation)HPLC柱來完成兩個非對映體峰的分離。串聯(lián)使用紫外-可見(UV)和質譜儀(MS)來進行檢測和定量。莫納甜及其內酯的峰各自在279nm處具有Uvmax，這有助于精確檢測。通過正離子電噴模式獲得293.3m/z和275.3m/z的選擇性離子監(jiān)控(SIM)掃描來進行定量。結果—在中性pH(對烘焙和餐后甜點來說是常見的)下，即使在7-35天之后，莫納甜的降解程度也不明顯。莫納甜隨時間變化而消失的程度取決于pH，這是因為所述主要副產物是環(huán)化以及可能出現的很少量的外消旋作用。在80℃和pH7的實驗過程中，在使用LC-MS進行定量檢測所達到的精確度范圍內沒有檢測到外消旋RR/SS莫納甜或其內酯的濃度出現變化?；谶@一數據，可知在高溫和中性pH條件下，莫納甜的穩(wěn)定性對于烘焙來說是可以接受的?？紤]到應用本文所述原理的許多可能實施方式，應意識到所述實施方式僅是本公開的具體實施例，決不是限制本公開的范圍。例如，從本公開所述內容來看，莫納甜甜味劑組合物可以制成液體濃縮形式而不僅僅是固體形式，這一點對本領域技術人員來說是顯而易見的；其中，所選體積的液體濃縮液(例如1mL或0.35mL)將具有和所選量(例如2茶匙)的顆粒糖相當的甜度。序列表<110>嘉吉有限公司(Cargill，Incorporated)<120>多肽和生物合成途徑<130>6682-64349<150>60/374,831<151>2002-04-23<160>74<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1170<212>DNA<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)<400>1atgttcgacgccctcgcccgccaagccgacgatcccttgcttttcctgatcggcctgttc60aggaaggatgagcgccccggaaaggtcgatctcggcgtaggagtctatcgcgacgagacc120ggacgcacgccgatcttccgggccgtcaaggcggcggaaaagcggcttctcgaaacacag180gacagcaaggcctatatcggccccgaaggggacctcgtctttctcgatcggctctgggaa240ctcgtcggcggcgacacgatcgagcggagccatgttgcgggcgtccagacgcccggcggc300tccggcgcgctccgtttggcggcggacctcatcgcccgcatgggcggccgaggcatctgg360ctcgggctgccgagctggccgaaccacgcgccgatcttcaaggcggccgggctcgatatc420gccacctacgacttcttcgacattccgtcgcagtcggtcatcttcgataatctggtgagc480gcgctggaaggcgccgcatccggcgatgcggtgctgctgcatgcaagctgccacaacccg540accggcggcgtcctgagcgaagcacaatggatggagatcgccgcgctggtggccgagcgc600ggcctgctgccgctcgtcgatctcgcctatcaggggttcggccgcggcctcgaccaggat660gtcgcgggcctccggcatcttctcggcgtggtcccggaagcgctcgtcgcggtttcctgc720tcgaagtccttcgggctttatcgcgagcgcgcgggcgcgatcttcgcgcggaccagctcg780actgcctcggcggacagggtgcgctcaaacctcgcgggcctcgcacgcaccagctattcc840atgccgccggatcacggcgcagccgtcgtgcggacgatccttgacgacccggaactcagg900cgcgactggacggaggagctcgagacgatgcggctcaggatgacgggcctccggcggtcg960cttgccgagggactccgcacccgctggcagagcctcggcgcagtcgccgatcaggagggc1020atgttctccatgctgccgctttccgaagcggaggttatgcggctcaggaccgagcacggc1080atctatatgccggcatccggccgcatcaacatcgccgggctgaagacggcggaagccgcc1140gagattgccggcaagttcaccagtctctga1170<210>2<211>389<212>PRT<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)<400>2MetPheAspAlaLeuAlaArgGlnAlaAspAspProLeuLeuPheLeu151015IleGlyLeuPheArgLysAspGluArgProGlyLysValAspLeuGly202530ValGlyValTyrArgAspGluThrGlyArgThrProIlePheArgAla354045ValLysAlaAlaGluLysArgLeuLeuGluThrGlnAspSerLysAla505560TyrIleGlyProGluGlyAspLeuValPheLeuAspArgLeuTrpGlu65707580LeuValGlyGlyAspThrIleGluArgSerHisValAlaGlyValGln859095ThrProGlyGlySerGlyAlaLeuArgLeuAlaAlaAspLeuIleAla100105110ArgMetGlyGlyArgGlyIleTrpLeuGlyLeuProSerTrpProAsn115120125HisAlaProIlePheLysAlaAlaGlyLeuAspIleAlaThrTyrAsp130135140PhePheAspIleProSerGlnSerValIlePheAspAsnLeuValSer145150155160AlaLeuGluGlyAlaAlaSerGlyAspAlaValLeuLeuHisAlaSer165170175CysHisAsnProThrGlyGlyValLeuSerGluAlaGlnTrpMetGlu180185190IleAlaAlaLeuValAlaGluArgGlyLeuLeuProLeuValAspLeu195200205AlaTyrGlnGlyPheGlyArgGlyLeuAspGlnAspValAlaGlyLeu210215220ArgHisLeuLeuGlyValValProGluAlaLeuValAlaValSerCys225230235240SerLysSerPheGlyLeuTyrArgGluArgAlaGlyAlaIlePheAla245250255ArgThrSerSerThrAlaSerAlaAspArgValArgSerAsnLeuAla260265270GlyLeuAlaArgThrSerTyrSerMetProProAspHisGlyAlaAla275280285ValValArgThrIleLeuAspAspProGluLeuArgArgAspTrpThr290295300GluGluLeuGluThrMetArgLeuArgMetThrGlyLeuArgArgSer305310315320LeuAlaGluGlyLeuArgThrArgTrpGlnSerLeuGlyAlaValAla325330335AspGlnGluGlyMetPheSerMetLeuProLeuSerGluAlaGluVal340345350MetArgLeuArgThrGluHisGlyIleTyrMetProAlaSerGlyArg355360365IleAsnIleAlaGlyLeuLysThrAlaGluAlaAlaGluIleAlaGly370375380LysPheThrSerLeu385<210>3<211>1260<212>DNA<213>類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)<400>3atgcgctctacgacggctcctggtccgagtggggcatgtatgacgatctcaaggtcgcga60aaggatgacgaaggaatgctgaccgccctgaagccgcagcccgcggacaagatcctgcaa120ctgatccagatgttccgcgaggatgcgcgcgcggacaagatcgatctgggcgtgggcgtc180tacaaggacccgaccgggctcaccccggtcatgcgggccgtgaaggcggccgagaagcgg240ctctgggaggtcgagaccaccaagacctacaccggccttgccgacgagccggcctacaat300gccgcgatggcgaagctgatcctcgcgggcgcggtcccggccgaccgggtggcctcggtc360gccacccccggcggcacgggcgcggtgcgtcaggcgctcgagctgatccgcatggcctcg420cccgaggccaccgtctggatctcgaacccgacctggccgaaccatctgtcgatcgtgaaa480tatctcggcatcccgatgcgggaataccgctatttcgacgccgagaccggcgccgtcgat540gccgagggcatgatggaggatctggcccaggtgaaggcgggcgacgtggtgctgctgcac600ggctgctgccacaacccgaccggcgccaacccgaacccggtgcagtggctggccatctgc660gagagcctggcccggacaggcgcggtgccgctgatcgacctcgcctatcagggcttcggc720gacgggctcgagatggatgcggcggcgacgcggcttctggccaccagactgcccgaggtg780ctgatcgcggcctcctgctcgaagaacttcggcatctaccgcgagcgcacgggcatcctg840atcgccatcggcgaggcggcgggccggggcacggtgcaggccaacctcaacttcctgaac900cggcagaactactccttcccgccggaccatggcgcgcggctcgtgaccatgatcctcgag960gacgagacgctgagcgccgactggaaggcggaactcgaggaggtgcggctcaacatgctg1020acactgcgccgccagcttgccgatgcgctgcaggccgagaccggctcgaaccgcttcggc1080ttcgtggccgagcatcgcggcatgttctcgcgcctcgggatcacgcccgccgaggtggag1140cggctgcggaccgagcacggggtctacatggtgggcgattcgcggctgaacatcgcgggg1200ctgaaccggacgaccgtgccggtgctggcgcgcgcggtggccaaggtgctgcgcggctga1260<210>4<211>419<212>PRT<212>類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)<400>4MetArgSerThrThrAlaProGlyProSerGlyAlaCysMetThrIle151015SerArgSerArgLysAspAspGluGlyMetLeuThrAlaLeuLysPro202530GlnProAlaAspLysIleLeuGlnLeuIleGlnMetPheArgGluAsp354045AlaArgAlaAspLysIleAspLeuGlyValGlyValTyrLysAspPro505560ThrGlyLeuThrProValMetArgAlaValLysAlaAlaGluLysArg65707580LeuTrpGluValGluThrThrLysThrTyrThrGlyLeuAlaAspGlu859095ProAlaTyrAsnAlaAlaMetAlaLysLeuIleLeuAlaGlyAlaVal100105110ProAlaAspArgValAlaSerValAlaThrProGlyGlyThrGlyAla115120125ValArgGlnAlaLeuGluLeuIleArgMetAlaSerProGluAlaThr130135140ValTrpIleSerAsnProThrTrpProAsnHisLeuSerIleValLys145150155160TyrLeuGlyIleProMetArgGluTyrArgTyrPheAspAlaGluThr165170175GlyAlaValAspAlaGluGlyMetMetGluAspLeuAlaGlnValLys180185190AlaGlyAspValValLeuLeuHisGlyCysCysHisAsnProThrGly195200205AlaAsnProAsnProValGlnTrpLeuAlaIleCysGluSerLeuAla210215220ArgThrGlyAlaValProLeuIleAspLeuAlaTyrGlnGlyPheGly225230235240AspGlyLeuGluMetAspAlaAlaAlaThrArgLeuLeuAlaThrArg245250255LeuProGluValLeuIleAlaAlaSerCysSerLysAsnPheGlyIle260265270TyrArgGluArgThrGlyIleLeuIleAlaIleGlyGluAlaAlaGly275280285ArgGlyThrValGlnAlaAsnLeuAsnPheLeuAsnArgGlnAsnTyr290295300SerPheProProAspHisGlyAlaArgLeuValThrMetIleLeuGlu305310315320AspGluThrLeuSerAlaAspTrpLysAlaGluLeuGluGluValArg325330335LeuAsnMetLeuThrLeuArgArgGlnLeuAlaAspAlaLeuGlnAla340345350GluThrGlySerAsnArgPheGlyPheValAlaGluHisArgGlyMet355360365PheSerArgLeuGlyIleThrProAlaGluValGluArgLeuArgThr370375380GluHisGlyValTyrMetValGlyAspSerArgLeuAsnIleAlaGly385390395400LeuAsnArgThrThrValProValLeuAlaArgAlaValAlaLysVal405410415LeuArgGly<210>5<211>1260<212>DNA<213>類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)<400>5atgcgctctacgacggctcctggtccgagtggggcatgtatgacgatctcaaggtcgcga60aaggatgacgaaggaatgctgaccgccctgaagccgcagcccgcggacaagatcctgcaa120ctgatccagatgttccgcgaggatgcgcgcgcggacaagatcgatctgggcgtgggcgtc180tacaaggacccgaccgggctcaccccggtcatgcgggccgtgaaggccgccgagaagcgg240ctctgggaggtcgagaccaccaagacctacaccggccttgccggcgagcccgcctacaat300gccgcgatggcgaagctgatcctcgcaggcgcggtcccggccgaccgggtggcctcggtc360gccacccccggcggcacgggcgcggtgcgtcaggcgctcgagctgatccgcatggcctcg420cccgaggccactgtctggatctcgaacccgacctggccgaaccatctgtcgatcgtgaaa480tatctcggcatcccgatgcgggaataccgctatttcgacgccgagaccggcgccgtcgat540gccgagggcttgatggaggatctggcccaggtgaaggcgggcgacgtggtgctgctgcac600ggctgctgccacaacccgaccggcgccaacccgaacccggtgcagtggctggccgtctgc660gagagcctggcccggacaggcgcggtgccgctgatcgacctcgcctatcagggcttcggc720gacgggctcgagatggatgcggcggcgacgcggcttctggccaccagactgcccgaggtg780ctgatcgcggcctcctgctcgaagaacttcggcatctaccgcgagcgaacgggcatcctg840atcgccatcggcgaggcggcgggccggggcacggtgcaggccaacctcaacttcctgaac900cggcagaactactccttcccgccggaccatggcgcgcggctcgtgaccatgatcctcgag960gacgagacgctgagcgccgactggaaggcggaactcgaggaggtgcggctcaacatgctg1020acgctgcgccgccagcttgccgatgcgctgcaggccgagaccggctcgaaccgcttcggc1080ttcgtggccgagcatcgcggcatgttctcgcgcctcgggatcacgcccgccgaggtggag1140cggctgcggaccgagcacggggtctacatggtgggcgattcgcggctgaacatcgcgggg1200ctgaaccggacgaccgtgccggtgctggcgcgcgcggtggccaaggtgctgcgcggctga1260<210>6<211>419<212>PRT<213>類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)<400>6MetArgSerThrThrAlaProGlyProSerGlyAlaCysMetThrIle151015SerArgSerArgLysAspAspGluGlyMetLeuThrAlaLeuLysPro202530GlnProAlaAspLysIleLeuGlnLeuIleGlnMetPheArgGluAsp354045AlaArgAlaAspLysIleAspLeuGlyValGlyValTyrLysAspPro505560ThrGlyLeuThrProValMetArgAlaValLysAlaAlaGluLysArg65707580LeuTrpGluValGluThrThrLysThrTyrThrGlyLeuAlaGlyGlu859095ProAlaTyrAsnAlaAlaMetAlaLysLeuIleLeuAlaGlyAlaVal100105110ProAlaAspArgValAlaSerValAlaThrProGlyGlyThrGlyAla115120125ValArgGlnAlaLeuGluLeuIleArgMetAlaSerProGluAlaThr130135140ValTrpIleSerAsnProThrTrpProAsnHisLeuSerIleValLys145150155160TyrLeuGlyIleProMetArgGluTyrArgTyrPheAspAlaGluThr165170175GlyAlaValAspAlaGluGlyLeuMetGluAspLeuAlaGlnValLys180185190AlaGlyAspValValLeuLeuHisGlyCysCysHisAsnProThrGly195200205AlaAsnProAsnProValGlnTrpLeuAlaValCysGluSerLeuAla210215220ArgThrGlyAlaValProLeuIleAspLeuAlaTyrGlnGlyPheGly225230235240AspGlyLeuGluMetAspAlaAlaAlaThrArgLeuLeuAlaThrArg245250255LeuProGluValLeuIleAlaAlaSerCysSerLysAsnPheGlyIle260265270TyrArgGluArgThrGlyIleLeuIleAlaIleGlyGluAlaAlaGly275280285ArgGlyThrValGlnAlaAsnLeuAsnPheLeuAsnArgGlnAsnTyr290295300SerPheProProAspHisGlyAlaArgLeuValThrMetIleLeuGlu305310315320AspGluThrLeuSerAlaAspTrpLysAlaGluLeuGluGluValArg325330335LeuAsnMetLeuThrLeuArgArgGlnLeuAlaAspAlaLeuGlnAla340345350GluThrGlySerAsnArgPheGlyPheValAlaGluHisArgGlyMet355360365PheSerArgLeuGlyIleThrProAlaGluValGluArgLeuArgThr370375380GluHisGlyValTyrMetValGlyAspSerArgLeuAsnIleAlaGly385390395400LeuAsnArgThrThrValProValLeuAlaArgAlaValAlaLysVal405410415LeuArgGly<210>7<211>1239<212>DNA<213>碩大利什曼原蟲(Leishmaniamajor)<400>7atgtccatgcaggcggccatgaccacggcggagcgctggcagaagattcaggcacaagct60cccgatgtcatcttcgatctcgcaaaacgcgccgccgctgccaagggccccaaggccaac120ctcgtcattggtgcctaccgcgacgagcagggccgtccctatccgctacgcgtggtccgc180aaggctgagcagcttctcttggacatgaatctcgactacgagtacctacccatctcgggc240taccagcccttcatcgatgaggcggtaaagattatctacggcaataccgtcgagctggag300aacctggttgcggtgcagacgctgagcgggaccggtgctgtctctctcggggcgaagctg360ctgactcgcgtcttcgacgctgagacgacgcccatctacctttccgaccccacgtggccc420aaccactacggcgtcgtgaaggctgctggctggaagaacatctgcacgtacgcctactac480gaccccaagacggtcagcctgaatttcgagggcatgaagaaagacattctggcggcgccg540gacggctccgtgttcattctgcaccagtgcgcgcacaaccccaccggcgtggacccgtcg600caggagcagtggaacgagatcgcgtcactgatgctggccaagcaccatcaggtgttcttc660gactccgcctaccaaggctatgcgagcggcagcctcgacacggacgcgtatgctgcccgc720ctgtttgcccgccgcggcatcgaggtactgctggcgcagtcgttctccaagaacatgggc780ttgtacagcgagcgtgcaggcacgctgtcgctgctcctcaaggacaagacgaagcgcgcg840gatgtaaagagcgtgatggattcgctgatccgtgaggagtacacgtgccccccagcccac900ggtgcccgcttagcccacctaatcctgagcaacaacgaactgcgaaaggagtgggaggca960gagctatcagccatggcagagcgcatccgtacgatgcgccgcaccgtgtacgacgagctg1020ctgcgcctgcagacgcccgggagctgggaacatgtcattaaccagattggcatgttttcc1080ttcctcgggctgtcaaaggcgcagtgcgaatactgccaaaaccacaacatcttcatcaca1140gtgtcgggccgcgctaacatggcaggtctgacgcatgagacggcgctgatgctagcacag1200acgatcaacgatgctgtgcgcaatgtgaatcgtgagtga1239<210>8<211>412<212>PRT<213>碩大利什曼原蟲(Leishmaniamajor)<400>8MetSerMetGlnAlaAlaMetThrThrAlaGluArgTrpGlnLysIle151015GlnAlaGlnAlaProAspValIlePheAspLeuAlaLysArgAlaAla202530AlaAlaLysGlyProLysAlaAsnLeuValIleGlyAlaTyrArgAsp354045GluGlnGlyArgProTyrProLeuArgValValArgLysAlaGluGln505560LeuLeuLeuAspMetAsnLeuAspTyrGluTyrLeuProIleSerGly65707580TyrGlnProPheIleAspGluAlaValLysIleIleTyrGlyAsnThr859095ValGluLeuGluAsnLeuValAlaValGlnThrLeuSerGlyThrGly100105110AlaValSerLeuGlyAlaLysLeuLeuThrArgValPheAspAlaGlu115120125ThrThrProIleTyrLeuSerAspProThrTrpProAsnHisTyrGly130135140ValValLysAlaAlaGlyTrpLysAsnIleCysThrTyrAlaTyrTyr145150155160AspProLysThrValSerLeuAsnPheGluGlyMetLysLysAspIle165170175LeuAlaAlaProAspGlySerValPheIleLeuHisGlnCysAlaHis180185190AsnProThrGlyValAspProSerGlnGluGlnTrpAsnGluIleAla195200205SerLeuMetLeuAlaLysHisHisGlnValPhePheAspSerAlaTyr210215220GlnGlyTyrAlaSerGlySerLeuAspThrAspAlaTyrAlaAlaArg225230235240LeuPheAlaArgArgGlyIleGluValLeuLeuAlaGlnSerPheSer245250255LysAsnMetGlyLeuTyrSerGluArgAlaGlyThrLeuSerLeuLeu260265270LeuLysAspLysThrLysArgAlaAspValLysSerValMetAspSer275280285LeuIleArgGluGluTyrThrCysProProAlaHisGlyAlaArgLeu290295300AlaHisLeuIleLeuSerAsnAsnGluLeuArgLysGluTrpGluAla305310315320GluLeuSerAlaMetAlaGluArgIleArgThrMetArgArgThrVal325330335TyrAspGluLeuLeuArgLeuGlnThrProGlySerTrpGluHisVal340345350IleAsnGlnIleGlyMetPheSerPheLeuGlyLeuSerLysAlaGln355360365CysGluTyrCysGlnAsnHisAsnIlePheIleThrValSerGlyArg370375380AlaAsnMetAlaGlyLeuThrHisGluThrAlaLeuMetLeuAlaGln385390395400ThrIleAsnAspAlaValArgAsnValAsnArgGlu405410<210>9<211>1182<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)<400>9atggaacatttgctgaatccgaaagcaagagagatcgaaatttcaggaatacgcaaattc60tcgaatcttgtagcccaacacgaagacgtcatttcacttacaatcggccagcctgatttt120ttcacaccgcatcatgtgaaagctgccgcaaaaaaagccattgatgaaaacgtgacgtca180tatactccgaatgccggctacctggagctgagacaagctgtgcagctttatatgaagaaa240aaagcggatttcaactatgatgctgaatctgaaattatcatcacaacaggcgcaagccaa300gccattgatgctgcattccggacgattttatctcccggtgatgaagtcattatgccaggg360cctatttatccgggctatgaacctattatcaatttgtgcggggccaagcctgtcattgtt420gatactacgtcacacggctttaagcttaccgcccggctgattgaagatgctctgacaccc480aacaccaagtgtgtcgtgcttccttatccgtcaaaccctaccggcgtgactttatctgaa540gaagaactgaaaagcatcgcagctctcttaaaaggcagaaatgtcttcgtattgtctgat600gaaatatacagtgaattaacatatgacagaccgcattactccatcgcaacctatttgcgg660gatcaaacgattgtcattaacgggttgtcaaaatcacacagcatgaccggttggagaatt720ggatttttatttgcaccgaaagacattgcaaagcacattttaaaggttcatcaatacaat780gtgtcgtgcgcctcatccatttctcaaaaagccgcgcttgaagctgtcacaaacggcttt840gacgatgcattgattatgagagaacaatacaaaaaacgtctggactatgtttatgaccgt900cttgtttccatgggacttgacgtagttaaaccgtccggtgcgttttatatcttcccttct960attaaatcatttggaatgacttcatttgattttagtatggctcttttggaagacgctggc1020gtggcactcgtgccgggcagctcgttctcaacatatggtgaaggatatgtaaggctgtct1080tttgcatgctcaatggacacgctgagagaaggcctagaccgtttagaattatttgtatta1140aaaaaacgtgaagcaatgcagacgataaacaacggcgtttaa1182<210>10<211>393<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)<400>10MetGluHisLeuLeuAsnProLysAlaArgGluIleGluIleSerGly151015IleArgLysPheSerAsnLeuValAlaGlnHisGluAspValIleSer202530LeuThrIleGlyGlnProAspPhePheThrProHisHisValLysAla354045AlaAlaLysLysAlaIleAspGluAsnValThrSerTyrThrProAsn505560AlaGlyTyrLeuGluLeuArgGlnAlaValGlnLeuTyrMetLysLys65707580LysAlaAspPheAsnTyrAspAlaGluSerGluIleIleIleThrThr859095GlyAlaSerGlnAlaIleAspAlaAlaPheArgThrIleLeuSerPro100105110GlyAspGluValIleMetProGlyProIleTyrProGlyTyrGluPro115120125IleIleAsnLeuCysGlyAlaLysProValIleValAspThrThrSer130135140HisGlyPheLysLeuThrAlaArgLeuIleGluAspAlaLeuThrPro145150155160AsnThrLysCysValValLeuProTyrProSerAsnProThrGlyVal165170175ThrLeuSerGluGluGluLeuLysSerIleAlaAlaLeuLeuLysGly180185190ArgAsnValPheValLeuSerAspGluIleTyrSerGluLeuThrTyr195200205AspArgProHisTyrSerIleAlaThrTyrLeuArgAspGlnThrIle210215220ValIleAsnGlyLeuSerLysSerHisSerMetThrGlyTrpArgIle225230235240GlyPheLeuPheAlaProLysAspIleAlaLysHisIleLeuLysVal245250255HisGlnTyrAsnValSerCysAlaSerSerIleSerGlnLysAlaAla260265270LeuGluAlaValThrAsnGlyPheAspAspAlaLeuIleMetArgGlu275280285GlnTyrLysLysArgLeuAspTyrValTyrAspArgLeuValSerMet290295300GlyLeuAspValValLysProSerGlyAlaPheTyrIlePheProSer305310315320IleLysSerPheGlyMetThrSerPheAspPheSerMetAlaLeuLeu325330335GluAspAlaGlyValAlaLeuValProGlySerSerPheSerThrTyr340345350GlyGluGlyTyrValArgLeuSerPheAlaCysSerMetAspThrLeu355360365ArgGluGlyLeuAspArgLeuGluLeuPheValLeuLysLysArgGlu370375380AlaMetGlnThrIleAsnAsnGlyVal385390<210>11<211>1176<212>DNA<213>嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)<400>11atgccagaattagctaatgatttaggattaagcaaaaagatcactgatgtaaaagcttca60ggaattagaatctttgataacaaagtttcagctattcctggcattatcaaattgactttg120ggtgaaccagatatgaatactcctgagcatgttaagcaagcggctattaagaatattgca180gataatgattcacactatgctccacaaaagggaaagcttgaattaagaaaagctatcagt240aaatatttgaaaaagattactggaattgaatatgatccagaaacagaaatcgtagtaaca300gttggtgcaactgaagcaattaacgctaccttgtttgctattactaatccgggtgacaag360gttgcaattcctacgccagtcttttctctatattggcccgtggctacacttgctgatgcc420gattatgttttgatgaatactgcagaagatggttttaagttaacacctaagaagttagaa480gaaactatcaaagaaaatccaacaattaaagcagtaattttgaattatccaactaaccca540actggtgttgaatatagcgaagatgaaattaaagctttggctaaggtaattaaagataat600catctgtacgtaattaccgatgaaatttacagtactttgacttacggtgtaaaacacttt660tcaattgccagcttaattccagaaagagcaatttatatctctggtttatctaaatcacat720gcgatgactggttatcgtttaggctatgttgccggacctgcaaaaattatggcagaaatt780ggtaaagttcatggccttatggtgacgactacgacggattcatcacaagctgccgcaatt840gaagcacttgaacacggacttgatgaccctgagaaatatagggaagtttatgaaaagcgt900cgtgactatgttttaaaggaattagccgagatagagatgcaagcagttaagccagaaggt960gcattttatatctttgctaaaattccagctaagtatggcaaagacgatatgaaatttgcc1020ttggatttagcttttaaagaaaaagtgggtatcactccaggtagtgcatttggtcctggt1080ggtgaaggtcatattagattatcttatgcatcaagtgatgaaaacttgcatgaggcaatg1140aagcgaatgaagaaagttttacaagaggacgaataa1176<210>12<211>391<212>PRT<213>嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)<400>12MetProGluLeuAlaAsnAspLeuGlyLeuSerLysLysIleThrAsp151015ValLysAlaSerGlyIleArgIlePheAspAsnLysValSerAlaIle202530ProGlyIleIleLysLeuThrLeuGlyGluProAspMetAsnThrPro354045GluHisValLysGlnAlaAlaIleLysAsnIleAlaAspAsnAspSer505560HisTyrAlaProGlnLysGlyLysLeuGluLeuArgLysAlaIleSer65707580LysTyrLeuLysLysIleThrGlyIleGluTyrAspProGluThrGlu859095IleValValThrValGlyAlaThrGluAlaIleAsnAlaThrLeuPhe100105110AlaIleThrAsnProGlyAspLysValAlaIleProThrProValPhe115120125SerLeuTyrTrpProValAlaThrLeuAlaAspAlaAspTyrValLeu130135140MetAsnThrAlaGluAspGlyPheLysLeuThrProLysLysLeuGlu145150155160GluThrIleLysGluAsnProThrIleLysAlaValIleLeuAsnTyr165170175ProThrAsnProThrGlyValGluTyrSerGluAspGluIleLysAla180185190LeuAlaLysValIleLysAspAsnHisLeuTyrValIleThrAspGlu195200205IleTyrSerThrLeuThrTyrGlyValLysHisPheSerIleAlaSer210215220LeuIleProGluArgAlaIleTyrIleSerGlyLeuSerLysSerHis225230235240AlaMetThrGlyTyrArgLeuGlyTyrValAlaGlyProAlaLysIle245250255MetAlaGluIleGlyLysValHisGlyLeuMetValThrThrThrThr260265270AspSerSerGlnAlaAlaAlaIleGluAlaLeuGluHisGlyLeuAsp275280285AspProGluLysTyrArgGluValTyrGluLysArgArgAspTyrVal290295300LeuLysGluLeuAlaGluIleGluMetGlnAlaValLysProGluGly305310315320AlaPheTyrIlePheAlaLysIleProAlaLysTyrGlyLysAspAsp325330335MetLysPheAlaLeuAspLeuAlaPheLysGluLysValGlyIleThr340345350ProGlySerAlaPheGlyProGlyGlyGluGlyHisIleArgLeuSer355360365TyrAlaSerSerAspGluAsnLeuHisGluAlaMetLysArgMetLys370375380LysValLeuGlnGluAspGlu385390<210>13<211>1413<212>DNA<213>類球紅細菌(R.sphaeroides)<400>13atgcgcgagcctcttgccctcgagatcgacccgggccacggcggcccgctgttcctcgcc60atcgccgaggcgatcaccctcgacatcacccgcgggcggctgaggcccggagcgagactg120cccggcacacgcgcgctggcgcgggcgctcggcgtgcatcgcaacacggtggatgccgcc180tatcaggagttgctgacccagggctggctgcaggccgagcccgcgcggggcaccttcgtg240gcgcaggatctgccgcaggggatgctggtgcacaggcccgcgcccgcgccggtcgagccg300gtcgcgatgcgcgcggggctcgccttctccgatggcgcgccggaccccgagctggtgccc360gacaaggcgctggcgcgggcctttcgccgggcgctcctgtcgcccgccttccgcgccgga420gcggattacggcgatgcccgcggcacctcctcgctgcgggaggcgctggcagcctatctc480gcctcggaccggggcgtggtcgcggatcctgcgcggctgctgatcgcgcggggcagccag540atggcgctgttcctggtagcccgggcggcgctggcgccgggagaggcgatcgcggtcgag600gagccgggctatccgctggcctgggaggcgttccgcgcagcgggagcggaggtgcgcggc660gtgccggtggatggcggcggcctcaggatcgacgcgctcgaggccgcgctggcccgggat720ccgcgaatccgggcggtctatgtcacgccccatcaccagtatccgacgaccgtcaccatg780ggcgcggcgcggcggttgcagcttctggaactggcagagcgccaccggctcgcgctgatc840gaggacgactacgaccacgaataccgcttcgagggccgtccggtgctgccgctggctgcc900cgcgcgccggaaggtctgccgctgatctatgtgggctcgctgtcgaaactgctctcgccc960ggtatccggctgggatacgcgctggcgcccgagcggctgctgacccgcatggccgcggcg1020cgcgccgccatcgaccggcagggcgacgcgccgctcgaggcggcgctggccgagctgatc1080cgcgacggcgatctgggccgtcatgcccgcaaggcgcgcagggtctaccgggcgcggcgg1140gatctgctggcggagcgtctcacggcgcagctggccgggcgcgccgccttcgatctgccg1200gccgggggcctcgcgctgtggctgcgctgcgcgggcgtctcggccgagacctgggccgaa1260gccgcagggcaggcggggctcgccctgctgccgggcacgcgcttcgcgctggagagcccg1320gcgccgcaggccttccggctgggctatgcggcgctggacgaggggcagatcgcccgggcg1380gtggagatcctcgcccggagcttccccggctga1413<210>14<211>470<212>PRT<213>類球紅細菌(R.sphaeroides)<400>14MetArgGluProLeuAlaLeuGluIleAspProGlyHisGlyGlyPro151015LeuPheLeuAlaIleAlaGluAlaIleThrLeuAspIleThrArgGly202530ArgLeuArgProGlyAlaArgLeuProGlyThrArgAlaLeuAlaArg354045AlaLeuGlyValHisArgAsnThrValAspAlaAlaTyrGlnGluLeu505560LeuThrGlnGlyTrpLeuGlnAlaGluProAlaArgGlyThrPheVal65707580AlaGlnAspLeuProGlnGlyMetLeuValHisArgProAlaProAla859095ProValGluProValAlaMetArgAlaGlyLeuAlaPheSerAspGly100105110AlaProAspProGluLeuValProAspLysAlaLeuAlaArgAlaPhe115120125ArgArgAlaLeuLeuSerProAlaPheArgAlaGlyAlaAspTyrGly130135140AspAlaArgGlyThrSerSerLeuArgGluAlaLeuAlaAlaTyrLeu145150155160AlaSerAspArgGlyValValAlaAspProAlaArgLeuLeuIleAla165170175ArgGlySerGlnMetAlaLeuPheLeuValAlaArgAlaAlaLeuAla180185190ProGlyGluAlaIleAlaValGluGluProGlyTyrProLeuAlaTrp195200205GluAlaPheArgAlaAlaGlyAlaGluValArgGlyValProValAsp210215220GlyGlyGlyLeuArgIleAspAlaLeuGluAlaAlaLeuAlaArgAsp225230235240ProArgIleArgAlaValTyrValThrProHisHisGlnTyrProThr245250255ThrValThrMetGlyAlaAlaArgArgLeuGlnLeuLeuGluLeuAla260265270GluArgHisArgLeuAlaLeuIleGluAspAspTyrAspHisGluTyr275280285ArgPheGluGlyArgProValLeuProLeuAlaAlaArgAlaProGlu290295300GlyLeuProLeuIleTyrValGlySerLeuSerLysLeuLeuSerPro305310315320GlyIleArgLeuGlyTyrAlaLeuAlaProGluArgLeuLeuThrArg325330335MetAlaAlaAlaArgAlaAlaIleAspArgGlnGlyAspAlaProLeu340345350GluAlaAlaLeuAlaGluLeuIleArgAspGlyAspLeuGlyArgHis355360365AlaArgLysAlaArgArgValTyrArgAlaArgArgAspLeuLeuAla370375380GluArgLeuThrAlaGlnLeuAlaGlyArgAlaAlaPheAspLeuPro385390395400AlaGlyGlyLeuAlaLeuTrpLeuArgCysAlaGlyValSerAlaGlu405410415ThrTrpAlaGluAlaAlaGlyGlnAlaGlyLeuAlaLeuLeuProGly420425430ThrArgPheAlaLeuGluSerProAlaProGlnAlaPheArgLeuGly435440445TyrAlaAlaLeuAspGluGlyGlnIleAlaArgAlaValGluIleLeu450455460AlaArgSerPheProGly465470<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15ggtattgagggtcgcatgaaggttttagtcaatgg35<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16agaggagagttagagccttatgaaatgctagcagcct37<210>17<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17ggtattgagggtcgcatgttcgacgccctcgcccg35<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18agaggagagttagagcctcagagactggtgaacttgc37<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19ggtattgagggtcgcatggaacatttgctgaatcc35<210>20<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20agaggagagttagagccttaaacgccgttgtttatcg37<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21ggtattgagggtcgcatgcgcgagcctcttgccct35<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22agaggagagttagagcctcagccggggaagctccggg37<210>23<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23ggtattgagggtcgcatgtccacgcaggcggccat35<210>24<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24agaggagagttagagcctcactcacgattcacattgc37<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25ggtattgagggtcgcatgccagaattagctaatga35<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26agaggagagttagagccttattcgtcctcttgtaaaa37<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27ggtattgagggtcgcatgcgctctacgacggctcc35<210>28<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28agaggagagttagagcctcagccgcgcagcaccttgg37<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29ggtattgagggtcgcatgtttgagaacattaccgc35<210>30<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30agaggagagttagagccttacagcactgccacaatcg37<210>31<211>1194<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>31gtgtttcaaaaagttgacgcctacgctggcgacccgattcttacgcttatggagcgtttt60aaagaagaccctcgcagcgacaaagtgaatttaagtatcggtctgtactacaacgaagac120ggaattattccacaactgcaagccgtggcggaggcggaagcgcgcctgaatgcgcagcct180catggcgcttcgctttatttaccgatggaagggcttaactgctatcgccatgccattgcg240ccgctgctgtttggtgcggaccatccggtactgaaacaacagcgcgtagcaaccattcaa300acccttggcggctccggggcattgaaagtgggcgcggatttcctgaaacgctacttcccg360gaatcaggcgtctgggtcagcgatcctacctgggaaaaccgcgtagcaatattcgccggg420gctggattcgaagtgagtacttacccctggtatgacgaagcgactaacggcgtgcgcttt480aatgacctgttggcgacgctgaaaacattacctgcccgcagtattgtgttgctgcatcca540tgttgccacaacccaacgggtgccgatctcactaatgatcagtgggatgcggtgattgaa600attctcaaagcccgcgagcttattccattcctcgatattgcctatcaaggatttggtgcc660ggtatggaagaggatgcctacgctattcgcgccattgccagcgctggattacccgctctg720gtgagcaattcgttctcgaaaattttctccctttacggcgagcgcgtcggcggactttct780gttatgtgtgaagatgccgaagccgctggccgcgtactggggcaattgaaagcaacagtt840cgccgcaactactccagcccgccgaattttggtgcgcaggtggtggctgcagtgctgaat900gacgaggcattgaaagccagctggctggcggaagtagaagagatgcgtactcgcattctg960gcaatgcgtcaggaattggtgaaggtattaagcacagagatgccagaacgcaatttcgat1020tatctgcttaatcagcgcggcatgttcagttataccggtttaagtgccgctcaggttgac1080cgactacgtgaagaatttggtgtctatctcatcgccagcggtcgcatgtgtgtcgccggg1140ttaaatacggcaaatgtacaacgtgtggcaaaggcgtttgctgcggtgatgtaa1194<210>32<211>397<212>PRT<213>大腸桿菌(E.coli)<400>32ValPheGlnLysValAspAlaTyrAlaGlyAspProIleLeuThrLeu151015MetGluArgPheLysGluAspProArgSerAspLysValAsnLeuSer202530IleGlyLeuTyrTyrAsnGluAspGlyIleIleProGlnLeuGlnAla354045ValAlaGluAlaGluAlaArgLeuAsnAlaGlnProHisGlyAlaSer505560LeuTyrLeuProMetGluGlyLeuAsnCysTyrArgHisAlaIleAla65707580ProLeuLeuPheGlyAlaAspHisProValLeuLysGlnGlnArgVal859095AlaThrIleGlnThrLeuGlyGlySerGlyAlaLeuLysValGlyAla100105110AspPheLeuLysArgTyrPheProGluSerGlyValTrpValSerAsp115120125ProThrTrpGluAsnArgValAlaIlePheAlaGlyAlaGlyPheGlu130135140ValSerThrTyrProTrpTyrAspGluAlaThrAsnGlyValArgPhe145150155160AsnAspLeuLeuAlaThrLeuLysThrLeuProAlaArgSerIleVal165170175LeuLeuHisProCysCysHisAsnProThrGlyAlaAspLeuThrAsn180185190AspGlnTrpAspAlaValIleGluIleLeuLysAlaArgGluLeuIle195200205ProPheLeuAspIleAlaTyrGlnGlyPheGlyAlaGlyMetGluGlu210215220AspAlaTyrAlaIleArgAlaIleAlaSerAlaGlyLeuProAlaLeu225230235240ValSerAsnSerPheSerLysIlePheSerLeuTyrGlyGluArgVal245250255GlyGlyLeuSerValMetCysGluAspAlaGluAlaAlaGlyArgVal260265270LeuGlyGlnLeuLysAlaThrValArgArgAsnTyrSerSerProPro275280285AsnPheGlyAlaGlnValValAlaAlaValLeuAsnAspGluAlaLeu290295300LysAlaSerTrpLeuAlaGluValGluGluMetArgThrArgIleLeu305310315320AlaMetArgGlnGluLeuValLysValLeuSerThrGluMetProGlu325330335ArgAsnPheAspTyrLeuLeuAsnGlnArgGlyMetPheSerTyrThr340345350GlyLeuSerAlaAlaGlnValAspArgLeuArgGluGluPheGlyVal355360365TyrLeuIleAlaSerGlyArgMetCysValAlaGlyLeuAsnThrAla370375380AsnValGlnArgValAlaLysAlaPheAlaAlaValMet385390395<210>33<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>33ggtattgagggtcgcgtgtttcaaaaagttgacgc35<210>34<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>34agaggagagttagagccttacatcaccgcagcaaacg37<210>35<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>35ggtattgagggtcgcatggagtccaaagtcgttga35<210>36<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>36agaggagagttagagccttacacttggaaaacagcct37<210>37<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>37ggtattgagggtcgcatgaaaaactggaaaacaag35<210>38<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>38agaggagagttagagccttacagcttagcgccttcta37<210>39<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>39ggtattgagggtcgcatgcgaggggcattattcaa35<210>40<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>40agaggagagttagagcctcagcccttgagcgcgaag36<210>41<211>1416<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>41atggaaaactttaaacatctccctgaaccgttccgcattcgtgttattgagccagtaaaa60cgtaccacccgcgcttatcgtgaagaggcaattattaaatccggtatgaacccgttcctg120ctggatagcgaagatgtttttatcgatttactgaccgacagcggcaccggggcggtgacg180cagagcatgcaggctgcgatgatgcgcggcgacgaagcctacagcggcagtcgtagctac240tatgcgttagccgagtcagtgaaaaatatctttggttatcaatacaccattccgactcac300cagggccgtggcgcagagcaaatctatattccggtactgattaaaaaacgcgagcaggaa360aaaggcctggatcgcagcaaaatggtggcgttctctaactatttctttgataccacgcag420ggccatagccagatcaacggctgtaccgtgcgtaacgtctatatcaaagaagccttcgat480acgggcgtgcgttacgactttaaaggcaactttgaccttgagggattagaacgcggtatt540gaagaagttggtccgaataacgtgccgtatatcgttgcaaccatcaccagtaactctgca600ggtggtcagccggtttcactggcaaacttaaaagcgatgtacagcatcgcgaagaaatac660gatattccggtggtaatggactccgcgcgctttgctgaaaacgcctatttcatcaagcag720cgtgaagcagaatacaaagactggaccatcgagcagatcacccgcgaaacctacaaatat780gccgatatgctggcgatgtccgccaagaaagatgcgatggtgccgatgggcggcctgctg840tgcatgaaagacgacagcttctttgatgtgtacaccgagtgcagaaccctttgcgtggtg900caggaaggcttcccgacatatggcggcctggaaggcggcgcgatggagcgtctggcggta960ggtctgtatgacggcatgaatctcgactggctggcttatcgtatcgcgcaggtacagtat1020ctggtcgatggtctggaagagattggcgttgtctgccagcaggcgggcggtcacgcggca1080ttcgttgatgccggtaaactgttgccgcatatcccggcagaccagttcccggcacaggcg1140ctggcctgcgagctgtataaagtcgccggtatccgtgcggtagaaattggctctttcctg1200ttaggccgcgatccgaaaaccggtaaacaactgccatgcccggctgaactgctgcgttta1260accattccgcgcgcaacatatactcaaacacatatggacttcattattgaagcctttaaa1320catgtgaaagagaacgcggcgaatattaaaggattaacctttacgtacgaaccgaaagta1380ttgcgtcacttcaccgcaaaacttaaagaagtttaa1416<210>42<211>1371<212>DNA<213>弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)<400>42atgaattatccggcagaacccttccgtattaaaagcgttgaaactgtatctatgatcccg60cgtgatgaacgcctcaagaaaatgcaggaagcgggttacaatactttcctgttaaattcg120aaagatatttatattgacctgctgacagacagtggcactaacgcaatgagcgacaagcag180tgggccggaatgatgatgggtgatgaagcgtacgcgggcagcgaaaacttctatcatctg240gaaagaaccgtgcaggaactgtttggctttaaacatattgttccgactcaccaggggcgt300ggcgcagaaaacctgttatcgcagctggctattaaacctgggcaatatgttgccgggaat360atgtatttcactaccacccgttatcaccaggaaaaaaatggtgcggtgtttgtcgatatc420gttcgtgacgaagcgcacgatgccggtctgaatattgcgtttaaaggtgatatcgatctt480aaaaaattacaaaagctgattgatgaaaaaggcgcagagaatattgcgtatatctgcctg540gcggtgacggttaacctcgcgggcggccaaccggtctcgatggctaacatgcgtgcggtg600cgtgaactgacagaagcgcatggcattaaagtgttctacgacgctacccgctgcgtagaa660aacgcctactttatcaaagagcaagagcagggctttgagaacaagagcatcgccgagatc720gtgcatgagatgttcagctacgccgacggttgtaccatgagtggtaaaaaagactgtctg780gtgaacatcggcggcttcctgtgcatgaacgatgacgaaatgttctcttctgccaaagag840ttagtcgtggtctacgaagggatgccatcttacggcggcctggccggacgtgatatggaa900gcgatggcgattggcctgcgtgaagccatgcagtacgaatatattgagcaccgcgtgaag960caggttcgctacctgggcgataagctgaaagccgctggcgtaccgattgttgaaccggta1020ggcggtcacgcggtattcctcgatgcgcgtcgcttctgcgagcatctgacgcaagatgag1080ttcccggcacaaagtctggctgccagcatctatgtggaaaccggcgtgcgcagtatggag1140cgcggaattatctctgcgggccgtaataacgtgaccggtgaacaccacagaccgaaactg1200gaaaccgtgcgtctgactattccacgtcgtgtttatacctacgcacatatggatgttgtg1260gctgacggtattattaaactttaccagcacaaagaagatattcgcgggctgaagtttatt1320tacgagccgaagcagttgcgtttctttactgcacgctttgattacatctaa1371<210>43<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>43ggtattgagggtcgcatggaaaactttaaacatct35<210>44<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>44agaggagagttagagccttaaacttctttaagttttg37<210>45<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>45ggtattgagggtcgcatgaattatccggcagaacc35<210>46<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>46agaggagagttagagccttagatgtaatcaaagcgtg37<210>47<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>47ccagggcaccggcgcagagcaaatctatatt31<210>48<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>48tgcgccggtgccctggtgagtcggaatggt30<210>49<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>49tcctgcacgcggcaaagggttctgcactcggt32<210>50<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>50ctttgccgcgtgcaggaaggcttcccgaca30<210>51<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>51aggggaccggcgcagaaaacctgttatcg29<210>52<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>52tctgcgccggtcccctggtgagtcggaacaat32<210>53<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>53gttagtccgcgtctacgaagggatgccat29<210>54<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>54gtagacgcggactaactctttggcagaag29<210>55<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>55ggtattgagggtcgcatgtacgaactgggagttgt35<210>56<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>56agaggagagttagagccttagtcaatatatttcaggc37<210>57<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>57ggtattgagggtcgcatgtccggcatcgttgtcca35<210>58<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>58agaggagagttagagcctcagacatatttcagtccca37<210>59<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>59ggtattgagggtcgcatgcgactgaacaacctcgg35<210>60<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>60agaggagagttagagcctcagttctccacgtattcca37<210>61<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>61ggtattgagggtcgcatgagcgtggttcaccggaa35<210>62<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>62agaggagagttagagcctcaatcgatatatttcagtc37<210>63<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>63ggtattgagggtcgcatgagcctggttaatatgaa35<210>64<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>64agaggagagttagagccttatgactttaacgcgttga37<210>65<211>684<212>DNA<213>睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni)<400>65atgtacgaactgggagttgtctaccgcaatatccagcgcgccgaccgcgctgctgctgac60ggcctggccgccctgggctccgccaccgtgcacgaggccatgggccgcgtcggtctgctc120aagccctatatgcgccccatctatgccggcaagcaggtctcgggcaccgccgtcacggtg180ctgctgcagcccggcgacaactggatgatgcatgtggctgccgagcagattcagcccggc240gacatcgtggtcgcagccgtcaccgcagagtgcaccgacggctacttcggcgatctgctg300gccaccagcttccaggcgcgcggcgcacgtgcgctgatcatcgatgccggcgtgcgcgac360gtgaagacgctgcaggagatggactttccggtctggagcaaggccatctcttccaagggc420acgatcaaggccaccctgggctcggtcaacatccccatcgtctgcgccggcatgctggtc480acgcccggtgacgtgatcgtggccgacgacgacggcgtggtctgcgtgcccgccgcgcgt540gccgtggaagtgctggccgccgcccagaagcgtgaaagcttcgaaggcgaaaagcgcgcc600aagctggcctcgggcatcctcggcctggatatgtacaagatgcgcgagcccctggaaaag660gccggcctgaaatatattgactaa684<210>66<211>227<212>PRT<213>睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni)<400>66MetTyrGluLeuGlyValValTyrArgAsnIleGlnArgAlaAspArg151015AlaAlaAlaAspGlyLeuAlaAlaLeuGlySerAlaThrValHisGlu202530AlaMetGlyArgValGlyLeuLeuLysProTyrMetArgProIleTyr354045AlaGlyLysGlnValSerGlyThrAlaValThrValLeuLeuGlnPro505560GlyAspAsnTrpMetMetHisValAlaAlaGluGlnIleGlnProGly65707580AspIleValValAlaAlaValThrAlaGluCysThrAspGlyTyrPhe859095GlyAspLeuLeuAlaThrSerPheGlnAlaArgGlyAlaArgAlaLeu100105110IleIleAspAlaGlyValArgAspValLysThrLeuGlnGluMetAsp115120125PheProValTrpSerLysAlaIleSerSerLysGlyThrIleLysAla130135140ThrLeuGlySerValAsnIleProIleValCysAlaGlyMetLeuVal145150155160ThrProGlyAspValIleValAlaAspAspAspGlyValValCysVal165170175ProAlaAlaArgAlaValGluValLeuAlaAlaAlaGlnLysArgGlu180185190SerPheGluGlyGluLysArgAlaLysLeuAlaSerGlyIleLeuGly195200205LeuAspMetTyrLysMetArgGluProLeuGluLysAlaGlyLeuLys210215220TyrIleAsp225<210>67<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>67actcggatccgaaggagatatacatatgtacgaactgggact42<210>68<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>68cggctgtcgaccgttagtcaatatatttcaggc33<210>69<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>69cgcggatccataatggttgagaacattaccg31<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>70acgcgtcgacttacagcactgccacaatcg30<210>71<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>71ccggaattcataatggtcgaactgggagttgt32<210>72<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>72gaatgcggccgcttagtcaatatatttcaggcc33<210>73<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>73ggtattgagggtcgc15<210>74<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>74agaggagagttagagcc1權利要求1.一種含有莫納甜或其鹽的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述組合物提供的甜度相當于約0.9-約9.0克砂糖。2.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，1克份的所述組合物提供的甜度相當于2茶匙砂糖。3.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有的卡路里和碳水化合物少于約1克砂糖。4.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約0-約200毫克S，S莫納甜或其鹽，和約0-約5毫克R，R莫納甜或其鹽。5.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約3-約200毫克S，S莫納甜或其鹽，和約0-約5毫克R，R莫納甜或其鹽。6.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約0-約200毫克S，S莫納甜或其鹽，和約3-約5毫克R，R莫納甜或其鹽。7.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約200毫克或更少的S，S莫納甜或其鹽，且其中所述莫納甜或其鹽基本上不含R，R、S，R或R，S莫納甜或其鹽。8.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約5毫克或更少的R，R莫納甜或其鹽，且其中所述莫納甜或其鹽基本上不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽。9.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其還含有至少一種選自下組的成分填充劑、載體、纖維、糖醇、寡糖、糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑、味道穩(wěn)定劑、酸化劑、抗結劑和助流動劑。10.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其還含有赤蘚醇。11.如權利要求10所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述組合物含有多達99.7％的赤蘚醇。12.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其還含有海藻糖。13.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其還含有環(huán)磺酸鹽。14.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其還含有與麥芽糊精成團的葡萄糖。15.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽基本上由R，R莫納甜或其鹽組成。16.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽基本上由S，S莫納甜或其鹽組成。17.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽富含立體異構R，R莫納甜或其鹽。18.如權利要求1所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽富含立體異構S，S莫納甜或其鹽。19.如權利要求17所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽含有至少95％的R，R莫納甜或其鹽。20.如權利要求2所述的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述甜度是由在生物合成途徑中產生的莫納甜或其鹽提供的。21.一種含有莫納甜或其鹽的即用型甜味劑組合物，其特征在于，一定體積所述組合物提供的甜度相當于相同體積的砂糖。22.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其特征在于，1茶匙所述組合物含有的卡路里和碳水化合物少于約1茶匙砂糖。23.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約3-約25毫克S，S莫納甜或其鹽，和約0-約0.625毫克R，R莫納甜或其鹽。24.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽基本上由S，S莫納甜或其鹽，或者R，R莫納甜或其鹽組成。25.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約5-約25毫克S，S莫納甜或其鹽。26.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約0.4-約0.625R，R莫納甜或其鹽，且其中所述莫納甜或其鹽基本上不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽。27.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其特征在于，1克所述組合物含有約0.5-約1毫克R，R莫納甜或其鹽，且其中所述莫納甜或其鹽基本上不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽。28.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其還含有赤蘚醇。29.如權利要求28所述的即用型甜味劑組合物，其特征在于，所述組合物含有多達99.7％赤蘚醇。30.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其還含有海藻糖。31.如權利要求21所述的即用型甜味劑組合物，其還含有環(huán)磺酸鹽。32.一種含有富含立體異構莫納甜混合物的甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜混合物是通過生物合成途徑產生的。33.如權利要求32所述的甜味劑組合物，其特征在于，所述生物合成途徑是多步驟途徑，且所述多步驟途徑中的至少一步是化學轉化。34.如權利要求32所述的甜味劑組合物，其特征在于，所述混合物主要含有R，R莫納甜或其鹽。35.一種含有莫納甜或其鹽的均勻的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述組合物樣品含有多于2毫克到約200毫克的莫納甜或其鹽，且其中所述樣品中的莫納甜或其鹽提供的甜度相當于約0.9-約9.0克砂糖。36.如權利要求35所述的組合物，其特征在于，所述樣品中的莫納甜或其鹽提供的甜度相當于2茶匙砂糖。37.如權利要求35所述的組合物，其特征在于，所述樣品重約1克。38.如權利要求35所述的組合物，其特征在于，所述樣品含有多于2毫克到約5毫克的莫納甜或其鹽。39.如權利要求38所述的組合物，其特征在于，所述組合物基本上不含S，S莫納甜或其鹽。40.如權利要求35所述的桌面甜味劑，其特征在于，所述組合物基本上不含R，R莫納甜或其鹽。41.一種含有莫納甜或其鹽的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述組合物樣品含有多于2毫克到約105毫克莫納甜或其鹽，且其中所述樣品中的莫納甜或其鹽提供的甜度相當于1茶匙砂糖。42.如權利要求35或41所述的桌面甜味劑，其特征在于，所述樣品的體積約為0.35ml。43.如權利要求35或41所述的桌面甜味劑，其特征在于，所述樣品是?；牧系牧⒎襟w。44.一種含有在生物合成途徑中產生的莫納甜組合物的桌面甜味劑組合物，其中，所述莫納甜組合物不含石油化學、有毒或危險污染物。45.一種含有莫納甜或其鹽的桌面甜味劑組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽是在生物合成途徑中產生的，并分離自重組細胞，且其中所述重組細胞不含石油化學、有毒或危險污染物。46.一種制造含有莫納甜或其鹽的甜味劑組合物的方法，其特征在于，所述方法包括從至少一種選自下組的底物生產莫納甜或其鹽葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸鹽或酯和莫納甜前體。47.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與赤蘚醇混合。48.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與海藻糖混合。49.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與環(huán)磺酸鹽混合。50.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與至少一種不是莫納甜或其鹽的其它成分混合。51.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述至少一種其它成分選自填充劑、載體、纖維、糖醇、寡糖、糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑、味道穩(wěn)定劑、酸化劑、抗結劑、助流動劑及其任何組合。52.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述至少一種其它成分選自麥芽糊精、葡萄糖、赤蘚醇和纖維。53.如權利要求50所述的方法，其特征在于，重約1克的一份所述甜味劑組合物含有約0-約200毫克S，S莫納甜或其鹽，和約0-約5毫克R，R莫納甜或其鹽，且該份提供的甜度相當于2茶匙砂糖。54.如權利要求50所述的方法，其特征在于，1克所述甜味劑組合物含有約0-約25毫克S，S莫納甜或其鹽，和約0-約0.625毫克R，R莫納甜或其鹽，且一定體積的該組合物的甜度相當于相同體積的砂糖。55.如權利要求50所述的方法，其特征在于，1克所述組合物含有約0-約25毫克S，S莫納甜或其鹽，和約0-約0.625毫克R，R莫納甜或其鹽，其中1克所述組合物的甜度相當于約0.9-約9.0克砂糖。56.如權利要求53所述的方法，其特征在于，每1克所述組合物含有約5-約200毫克S，S莫納甜或其鹽。57.如權利要求56所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將S，S莫納甜或其鹽與至少一種其它成分混合，所述其它成分選自填充劑、載體、纖維、糖醇、寡糖、糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑、味道穩(wěn)定劑、酸化劑、抗結劑、助流動劑及其任何組合，其中每1克所述組合物含有約3-約200毫克莫納甜或其鹽。58.如權利要求53所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將R，R莫納甜或其鹽與至少一種其它成分混合物，所述其它成分選自填充劑、載體、纖維、糖醇、寡糖、糖、非莫納甜高強度甜味劑、營養(yǎng)甜味劑、調味品、味道增強劑、味道穩(wěn)定劑、酸化劑、抗結劑、助流動劑及其任何組合，其中每1克所述組合物含有約3-5毫克R，R莫納甜或其鹽。59.如權利要求50所述的方法，其特征在于，每1克所述組合物含有約0.4-約5毫克R，R莫納甜或其鹽。60.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與至少一種選自葡萄糖和麥芽糊精的填充劑混合，其中每1克所述組合物含有約5毫克R，R莫納甜或其鹽。61.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與麥芽糊精混合，其中每1克所述組合物含有約0.5-約1毫克R，R莫納甜或其鹽。62.一種制造含有莫納甜組合物的甜味劑組合物的方法，所述方法包括(a)在重組細胞的生物合成途徑中產生莫納甜或其鹽；(b)從所述重組細胞中分離所述莫納甜組合物，其中，所述莫納甜組合物由莫納甜或其鹽以及其它可食用或可飲用的材料組成。63.一種含有莫納甜和赤蘚醇的莫納甜組合物。全文摘要本發(fā)明涉及含有莫納甜的新型甜味劑組合物以及制造這種組合物的方法。本發(fā)明還涉及含有莫納甜的特定立體異構體、莫納甜立體異構體的特定混合物和/或通過生物合成途徑在體內(例如細胞內)或體外生產的莫納甜的甜味劑組合物。文檔編號A23G3/00GK1832690SQ200480022249公開日2006年9月13日申請日期2004年8月2日優(yōu)先權日2003年8月1日發(fā)明者P·M·西克斯,T·W·阿布拉罕,D·C·卡梅隆,M·J·古森,M·G·林德利,S·C·麥克法蘭,J·R·米利斯,J·羅薩扎,趙利山,D·P·維那申請人:嘉吉有限公司